胰島素修飾物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胰島素修飾物，包括胰島素以及連接在所述胰島素B鏈末端的脂肪酸鏈；所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素，所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸被切除，胰島素與脂肪酸鏈之間以酰胺鍵連接。這種胰島素修飾物在進(jìn)入體內(nèi)之后，能因脂肪酸長鏈的疏水作用而形成疏水團(tuán)，促進(jìn)胰島素蛋白的縱向排序，構(gòu)成由分子間作用力主導(dǎo)的鏈狀聚多聚體。這種聚多聚體比起單體胰島素，半衰期大大提高，具有良好的緩釋效果；同時這種胰島素修飾物中不含有具有免疫原性的其他蛋白質(zhì)，安全性能較高。本發(fā)明還公開了上述胰島素修飾物的制備方法。
【專利說明】胰島素修飾物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種胰島素修飾物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]1999 年的一項統(tǒng)計(數(shù)據(jù)來自 Veterinary Medical Database VMDB)表明犬貓?zhí)悄虿“l(fā)病率在1970到1998這28年間從0.2%上升到I %，且上升趨勢越見明顯。幾乎100%的犬和50%的貓，都是I型(胰島素依賴性)糖尿病?；钾埖牧?0%是II型(非胰島素依賴性)糖尿病。在眾多治療糖尿病的方法中，胰島素注射是最主要和最直接的方法。自1922年成功應(yīng)用于臨床之后，胰島素歷經(jīng)了 80年的發(fā)展。最初的第一代胰島素是從動物(豬/牛)體內(nèi)提取，到1942年第二代胰島素是通過大腸桿菌等系統(tǒng)生物合成人序列的胰島素，而現(xiàn)在的第三代重組胰島素類似物，通過對胰島素序列進(jìn)行氨基酸替換，或特定位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾而賦予了藥物特殊的優(yōu)化功能。它治療了眾多糖尿病患者，同時也為醫(yī)藥行業(yè)帶來了極為豐厚的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003]胰島素衍生物因其能通過各種化學(xué)修飾實現(xiàn)緩控釋等功能，一直被研究較多，但是胰島素衍生物用于動物糖尿病的治療一直未見報道。
[0004]目前應(yīng)用于寵物糖尿病常用的胰島素藥物除人用胰島素制劑(NPH低精蛋白鋅混懸液，PZI魚精蛋白胰島素，Lente鋅胰島素混懸液，Glargine甘精胰島素類似物等)外，主要有兩種專為動物設(shè)計的胰島素制劑。一種是美國默克醫(yī)藥集團(tuán)的豬鋅胰島素混懸液(商品名為Vetsulin)，該胰島素制劑為35%無定型性和65%結(jié)晶性豬胰島素組成的混懸液。另一種是德國勃林格翰醫(yī)藥公司的魚精蛋白重組人胰島素懸浮液(商品名為Prozinc)。這兩種動物專用胰島素藥物均已獲FDA美國藥監(jiān)局獲批上市。
[0005]這兩種胰島素藥物的主要局限性在于，它們的緩釋效果非常有限。Vetsulin通過控制胰島素晶型配比實現(xiàn)一定程度的緩釋，因為胰島素結(jié)晶態(tài)比無定型態(tài)溶解速度慢，因此藥物在進(jìn)入體內(nèi)之后能實現(xiàn)兩次釋放過程，從而延長藥效；ProzinC通過加入魚精蛋白實現(xiàn)緩釋，因為魚精蛋白是堿性蛋白，能保持胰島素進(jìn)入體內(nèi)后的電中性，延緩其作用過程。但是上述兩種緩釋機(jī)制的效果有限，其起效時間在14-24小時之間，作為寵物用產(chǎn)品便利性不夠。另外Vetsulin結(jié)晶狀態(tài)的不穩(wěn)定,Prozinc魚精蛋白的免疫原性都可能影響藥物的安全使用。
[0006]因此，目前尚未有一種用于動物糖尿病的治療的具有良好的緩釋效果和較高安全性能的胰島素修飾物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于此，有必要提供一種用于動物糖尿病的治療的具有良好的緩釋效果和較高安全性能的胰島素修飾物，及其制備方法和應(yīng)用。
[0008]一種胰島素修飾物，包括胰島素以及連接在所述胰島素B鏈末端的脂肪酸鏈；[0009]所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素，所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸被切除，所述脂肪酸鏈與所述胰島素B鏈第29位的賴氨酸如下通式表示:
[0010]Lys-NH-CO-Glu-NH-CO- (CH2)^-COOH，其中，Lys 為胰島素B鏈第 29位的賴氨酸，Glu為連接在所述脂肪酸鏈末端的谷氨酸，Lys與Glu之間以酰胺鍵連接，Glu通過酰胺鍵連接在所述脂肪酸鏈末端，m為6~32的整數(shù)。
[0011]一種胰島素修飾物的制備方法，包括如下步驟:
[0012]提供胰島素，并使用羧基肽酶A將所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸切除，得到修飾過的胰島素，所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素；
[0013]將結(jié)構(gòu)式為(CH2)ni(COOH)2的化合物A溶解在甲醇中，在堿存在的條件下進(jìn)行皂化反應(yīng)，接著將產(chǎn)物溶于HCl酸化的庚烷中，重結(jié)晶后得到結(jié)構(gòu)式為CH3OOC(CH2)mCOOH的化合物B，其中，m為6~32的整數(shù)；
[0014]將所述化合物B和足量的具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物C溶解在THF中，在催化劑存在的條件下，攪拌20h后真空蒸發(fā)除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯中并依次用鹽酸和水洗滌，接著用硫酸鎂干燥，過濾后保留液相并真空干燥，得到固體殘余為具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物D，
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種胰島素修飾物，其特征在于，包括胰島素以及連接在所述胰島素B鏈末端的脂肪酸鏈； 所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素，所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸被切除，所述脂肪酸鏈與所述胰島素B鏈第29位的賴氨酸如下通式表示: Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH2)m-COOH,其中，Lys 為胰島素 B 鏈第 29 位的賴氨酸，Glu 為連接在所述脂肪酸鏈末端的谷氨酸，Lys與Glu之間以酰胺鍵連接，Glu通過酰胺鍵連接在所述脂肪酸鏈末端，m為6~32的整數(shù)。
2.一種胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 提供胰島素，并使用羧基肽酶A將所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸切除，得到修飾過的胰島素，所述胰島素為豬胰島素或犬胰島素； 將結(jié)構(gòu)式為(CH2)ni(COOH)2的化合物A溶解在甲醇中，在堿存在的條件下進(jìn)行皂化反應(yīng)，接著將產(chǎn)物溶于HCl酸化的庚烷中，重結(jié)晶后得到結(jié)構(gòu)式為CH3OOC(CH2)mCOOH的化合物B，其中，m為6~32的整數(shù)； 將所述化合物B和足量的具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物C溶解在THF中，在催化劑存在的條件下，攪拌20h后真空蒸發(fā)除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙酯中并依次用鹽酸和水洗滌，接著用硫酸鎂干燥，過濾后保留液相并真空干燥，得到固體殘余為具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，使用羧基肽酶A將所述胰島素B鏈第30位的丙氨酸切除，得到修飾過的胰島素的操作為: 將胰島素鋅鹽溶解在水中并用質(zhì)量濃度為33%的NaOH調(diào)節(jié)pH為9.3，接著按照所述胰島素鋅鹽與EDTA的質(zhì)量比為100:1加入EDTA，混勻后在室溫、攪拌的條件下，按照羧基肽酶A和所述胰島素鋅鹽質(zhì)量比為0.5:100，加入所述羧基肽酶A的懸浮液，15h后加水稀釋并用濃醋酸調(diào)節(jié)PH為3.6，接著加入甲醇和醋酸鋅的水溶液，最后用濃氨水調(diào)節(jié)pH為6.0,過濾后保留沉淀，即為所述修飾過的胰島素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，所述得到固體殘余為具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物D的操作中，所述化合物B和所述化合物C的摩爾比為0.91:1.1，所述催化劑為N，N- 二異丙基乙胺，所述催化劑與所述化合物C的摩爾比為1:1; 所述化合物D與所述谷氨酸-1-甲酯的摩爾比為1:1，所述催化劑與所述化合物D的摩爾比為1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，所述得到具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物H的操作中，所述化合物E、所述化合物F和所述化合物G的摩爾比為1:1:1o
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胰島素修飾物的制備方法，其特征在于，所述分離純化后得到所述胰島素修飾物的操作中，所述修飾過的胰島素和所述化合物H的質(zhì)量比為200:37.9。
7.一種胰島素修飾物的二價金屬離子復(fù)合物，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的胰島素修飾物形成的六聚體，所述六聚體結(jié)合了二價金屬離子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的胰島素修飾物的二價金屬離子復(fù)合物，其特征在于，每個所述六聚體結(jié)合2個鋅離子、3個鋅離子或4個鋅離子。
9.一種用于治療糖尿病的藥物組合物，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的胰島素修飾物以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物用于治療貓犬糖尿病。
【文檔編號】C07K14/62GK103467594SQ201310416494
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】汪士奇, 何巧, 秋云海 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院