Hsa長效融合蛋白及其快速組裝及分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種HSA長效融合蛋白及其快速組裝及分離純化方法。該融合蛋白包含兩個多肽區(qū)，第一區(qū)是由促胰島素分泌肽Exendin-4的重復(fù)序列組成，第二區(qū)是由人血清白蛋白HSA的序列組成，第一區(qū)的C-末端與第二區(qū)的N-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連，或第一區(qū)N-末端與第二區(qū)C-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連。促胰島素分泌肽Exendin-4的重復(fù)次數(shù)為1-4次，重復(fù)序列之間直接通過甘氨酸和絲氨酸相連。本發(fā)明利用Bglbrick的方法，能夠隨意的在HSA的N端或C端添加任意個數(shù)的Exendin-4，經(jīng)過表達，純化，得到高純度的融合蛋白。
【專利說明】HSA長效融合蛋白及其快速組裝及分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種HSA (人血清白蛋白，Human serum albumin)長效融合蛋白及其快速組裝及分離純化方法，具體為利用Bglbrick方法進行HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化，屬于長效融合蛋白藥物【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]Biobrick/Bglbrick方法是基于連接或聚合思想的不同尺度的DNA體外組裝方法，此方法的誕生，加速了合成生物學(xué)功能元件庫、生物合成途徑乃至酵母染色體的人工構(gòu)建，促進了代謝工程，基因組編輯、誘導(dǎo)性多功能肝細胞等領(lǐng)域的迅速發(fā)展。
[0003]Biobrick/Bglbrick方法是依賴于同尾酶的方法，同尾酶(如Bgl II和BamH 1、Xba I和 Spe I )是指一類識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能產(chǎn)生相同粘性末端的限制性內(nèi)切酶。當(dāng)酶切后的兩個片段相連時，原來的酶切位點將不復(fù)存在，也就不能被原有的限制酶所識別，達到“焊死”狀態(tài)。因此，該種方法僅利用一種同尾酶，就可以實現(xiàn)DNA片段的多次組裝。雖然Biobrick/Bglbrick兩種方法在連接處均會產(chǎn)生癥痕,但后者癥痕處翻譯后為甘氨酸與絲氨酸，對于融合蛋白表達無影響，所以Bglbrick是推薦使用的方法。
[0004]Exendin-4:促胰島素分泌肽又稱艾塞那肽，從生長在美國西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中發(fā)現(xiàn)的一個激素物質(zhì)，由39個氨基酸組成，GLP-1相似性高達53%，并且生物學(xué)效應(yīng)也幾乎完全一致。其能夠增加胞內(nèi)cAMP濃度，刺激葡萄糖依賴的胰島素分泌，SP在血糖濃度高時刺激胰島素分泌，低濃度和正常濃度時不刺激胰島素分泌，抑制細胞凋亡，刺激細胞的增殖與新生，還具有降低饑餓及餐后血糖濃度和胰高血糖素濃度；減緩胃排空、抑制食物吸收，節(jié)葡萄糖在外周組織的轉(zhuǎn)運等生物學(xué)效應(yīng)。Exendin-4在刺激胰島素分泌的作用時依賴于血糖濃度，不會因為持續(xù)分泌而發(fā)生低血糖反應(yīng)；能夠降低食欲；對神經(jīng)細胞具有保護作用；對二肽?；拿?1V的高耐受性使其在體內(nèi)的半衰期為2-3h，遠長于GLP-1的l_2min，穩(wěn)定性和生物活性明顯高于GLP-1，有更好的治療效果等優(yōu)點。Exendin-4雖然具有比GLP-1長的半衰期,但半衰期仍較短。天然產(chǎn)物含量較少，而化學(xué)合成的Exendin-4存在成本較高，價格昂貴，步驟多，收率低，合成過程涉及有害化學(xué)物質(zhì)等缺點。蛋白藥物在體內(nèi)存留時間的長短，極大的影響到藥物的使用劑量和治療效果，近幾年國內(nèi)外學(xué)者主要從化學(xué)修飾、基因融合等方面延長蛋白藥物的半衰期，化學(xué)修飾中最廣泛應(yīng)用的修飾劑是PEG，可以使半衰期延長幾倍幾十倍甚至上百倍，但大部分蛋白的免疫原性會有所降低，蛋白的生物活性也會不同程度的下降。
[0005]人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血衆(zhòng)中的主要蛋白成分,也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，對維持體內(nèi)滲透壓和血漿體積起著非常重要的作用；正常情況下腎清除率較低。人血清白蛋白的分子量為66kD，是非糖基化蛋白，在體內(nèi)的半衰期長達兩周左右，因而是一種理想的生物活性蛋白載體。因此本發(fā)明提供了一種快速制備HSA長效融合蛋白及其分離純化的方法以延長藥物的半衰期，使這些藥物的治療效果等得到明顯的改善。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種HSA長效融合蛋白及其快速制備和分離純化的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0008]一種HSA長效融合蛋白，包含兩個多肽區(qū)，第一區(qū)是由促胰島素分泌肽Exendin-4(見序列表中序列I)的重復(fù)序列組成，第二區(qū)是由人血清白蛋白HSA (見序列表中序列2)的序列組成，第一區(qū)的C-末端與第二區(qū)的N-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連，或第一區(qū)N-末端與第二區(qū)C-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連；第一區(qū)的促胰島素分泌肽Exendin-4的重復(fù)次數(shù)為1_4次，Exendin-4的重復(fù)序列之間直接通過甘氨酸和絲氨酸相連。
[0009]一種HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，為利用Bglbrick方法進行HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化，包括HSA cDNA的PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建；含有Exendin-4重組質(zhì)粒的構(gòu)建；HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒的快速組裝；HSA長效融合蛋白的酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建；HSA長效融合蛋白的表達及融合蛋白的分離純化。
[0010]上述方法包括如下步驟:
[0011](I)通過PCR從含有HSA cDNA的質(zhì)粒中擴增獲得HSA cDNA,同時在HSAcDNA片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，并將HSA cDNA片段連接在(克隆到)pPICZ a A表達載體上；
[0012](2)通過人工合成Exendin-4片段，同時在片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，并將片段連接在(克隆到)pPICZ a A表達載體上;
[0013](3)通過 Xho I BamH I 和 Xho I Bgl II 或 Xho I Bgl II 和 Xho I BamH I 兩種組合對得到的兩種載體質(zhì)粒切割及片段的連接，進行HSA長效融合蛋白表達載體的快速組裝；即將得到的兩種質(zhì)粒分別通過Xho I Bgl II和Xho I BamH I雙酶切，回收的片段連接構(gòu)建出HSA長效融合蛋白表達載體`；同樣的方法構(gòu)建其他的HSA融合蛋白表達載體；
[0014](4) HSA長效融合蛋白表達載體在宿主表達系統(tǒng)中進行表達，HSA長效融合蛋白表達載體被整合到宿主的染色體中；用同樣的方法將其他的HSA融合體整合到宿主的染色體中；
[0015](5) HSA長效融合蛋白的發(fā)酵液直接通過親和層析純化，制備到高純度融合蛋白。
[0016]步驟(4)中，所述的宿主表達系統(tǒng)可以為細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞表達系統(tǒng)，宿主表達系統(tǒng)可優(yōu)選酵母，酵母可進一步優(yōu)選畢赤酵母，如畢赤酵母ΚΜ71Η。
[0017]步驟(5)中，所述的親和層析純化時,所采用的親和層析柱填料為HiTrap BlueHP，能夠有效的結(jié)合HSA。
[0018]本發(fā)明上述方法的具體操作步驟包括:
[0019](I) HSA cDNA的PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建:
[0020]利用PCR從含有HSA cDNA質(zhì)粒中擴增出HSA cDNA (見序列表中序列3)，同時在HSA cDNA片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，所用的引物為:
[0021]HSA-F:5，-CTCGAGAAAAGAAGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3，
[0022]HSA-R:[0023]5’ -GCGGCCGCTTAGGATCCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3，
[0024]50 μ I的反應(yīng)體系中加入:25μ I的2XQ5mix高保真聚合酶，100 μ mol/L的引物HSA-F和HSA-R各I μ I，含有HSA cDNA的質(zhì)粒0.3 μ g,加水補齊至50 μ I ；PCR反應(yīng)條件為:98 °C充分變性30秒，98 °C變性10秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，循環(huán)30次；72°C延伸2分鐘。 [0025]通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用DNA膠回收試劑盒純化出1784bp的目標(biāo)條帶；純化好的目標(biāo)片段，目標(biāo)片段進行T-A克隆到pMD18-T中，在15μ1的反應(yīng)體系中加入Ιμ?的pMD18-T載體，6.5μ1的DNA片段，7.5μ1 Solution I在16°C下進行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取菌落,接種于5mll00y g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對陽性克隆的單菌落進行DNA測序；測序正確的陽性克隆用通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離后，DNA膠回收試劑盒回收，純化好的目標(biāo)片段和載體pPICZ a A按照1:7的摩爾比用Τ4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Τ0Ρ10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍存于-20°C;重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-HSA (目標(biāo)基因的核苷酸序列見序列表中序列4)，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZ a A-HSA ；
[0026](2)含有Exendin-4重組質(zhì)粒的構(gòu)建:
[0027]通過人工合成Exendin-4的核苷酸序列片段(人工合成Exendin-4的核苷酸序列，見序列表中序列5)，同時在片段N端和C端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，將合成好的片段和載體pPICZ a A按照1:7的摩爾比用Τ4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Τ0Ρ10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍存于-20°C;重組質(zhì)粒命名為pPICZ αΑ-Ε4 (目標(biāo)基因的核苷酸序列，見序列表中序列5)，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZ α Α_Ε4 ；
[0028](3) HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒的快速組裝:
[0029]分別接種陽性重組子TOPlO-pPICZ a A-HSA 及 TOPlO-pPICZ α Α_Ε4 于 5ml 含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；分別通過Xho I Bgl II和Xho I BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離后，DNA膠回收試劑盒回收大片段和小片段，純化好的大小片段按照1:7的摩爾比用T4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍于-20°C ;重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-E4-HSA (陽性重組子中目標(biāo)基因的核苷酸序列，見序列表中序列6)，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZ a A_E4_HSA ；pPICZ a A-HSA和pPICZaA_E4分別通過Xho I BamH I和Xho I Bgl II雙酶切，回收小片段和大片段，用同上的方法構(gòu)建出質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-HSA-E4(陽性重組子中目標(biāo)基因的核苷酸序列，見序列表中序列7);陽性重組子命名為T0P10-pPICZaA-HSA-E4 ;用同樣的方法能夠完成不同HSA長效融合蛋白質(zhì)粒的快速組裝；
[0030](4) HSA長效融合蛋白的酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建:
[0031]取一支凍存的TOPlO-pPICZ a A-E4-HSA 或 TOPlO-pPICZ a A-HSA-E4，接種到5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71H，通過酵母菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71H-pPICZ a A_E4_HSA (目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列8 )或KM71H-pPICZaA-HSA-E4 (目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列9)，用以上相同的構(gòu)建方法得到其他HSA長效融合蛋白的酵母表達系統(tǒng)；
[0032](5) HSA長效融合蛋白的表達:
[0033]將KM71H_pPICZa A-E4-HSA 或 KM71H_pPICZ a A-HSA-E4 接種至裝有50mlBMGY250ml三角瓶中，200rpm30°C培養(yǎng)18h，將培養(yǎng)物1500 Xg離心5min收獲菌體，重懸菌體于100mlBMMY500ml三角瓶中，使其起始OD6tltl 一 1.0，每12小時補加一次甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)5天，離心收集上清，SDS-PAGE法觀察融合蛋白E4-HSA或HSA-E4的表達；其他HSA長效融合蛋白的酵母表達方法同上；
[0034]( 6 )融合蛋白的分離純化:
[0035]將誘導(dǎo)完成的發(fā)酵液離心收獲上清，稀釋后直接通過HiTrap Blue HP柱，獲得高純度融合蛋白E4-HAS (蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列8)或HSA-E4 (蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列9)。
[0036]用上述方法制備的HSA長效融合蛋白，包括由促胰島素分泌肽Exendin-4的一個或多個重復(fù)序列構(gòu)成的第一區(qū)和與由`人血清白蛋白序列構(gòu)成的第二區(qū)；促胰島素分泌肽的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間由甘氨酸和絲氨酸連接；或與人血清白蛋白同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，與促胰島素分泌肽的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，中間由甘氨酸和絲氨酸連接。
[0037]本發(fā)明用BglBrick方法進行HSA長效融合蛋白快速組裝以及從表達重組融合蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液中進行分離純化，本發(fā)明分別構(gòu)建HSA和Exendin-4的表達載體,利用BglBrick的方法,能夠隨意的在HSA的N端或C端添加任意個數(shù)的Exendin-4,得到的融合表達載體在宿主系統(tǒng)中進行表達，被整合到宿主的染色體中；將整合有融合蛋白基因的畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵表達，隨后將含融合蛋白的發(fā)酵液通過親和層析進行純化，制備得到高純度的融合蛋白。
[0038]本發(fā)明方法能夠快速的構(gòu)建不同種類的HSA長效融合蛋白，而且制備所得的融合蛋白純度較高，同時本發(fā)明操作簡單、方便、省時。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1-1為本發(fā)明HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法示意圖；圖1-2為pPICZ a A-E4-HSA構(gòu)建示意圖。
[0040]圖2為HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒的快速組裝結(jié)果，其中HSA兩端分別連接不同個數(shù) E4,l-4:pPICZ a A/(Ε4) ^4-HSA ；5-8:pPICZ a A/HSA-(Ε4) ；9-10:pPICZ α A/(E4) !_2 - HSA- (E4)卜2。
[0041]圖3為HSA長效融合蛋白的表達結(jié)果，其中，1:pPICZ a A/HSA-E4 ；2:pPICZ a A/HSA- (Ε4)2；3:pPICZaA/HSA-(Ε4)3;4:pPICZ α A/HSA-(Ε4)4；5:pPICZαΑ/Ε4 - HSA ；6:pPICZ α A/ (Ε4) 2 - HSA ；7:pPICZ α A/ (Ε4) 3 _ HSA ；8:pPICZ α A/ (Ε4) 4 - HSA ；9:pPICZ α A/Ε4 - HSA-E4 ; 10:pPICZ α A/ (Ε4) 2 - HSA- (Ε4) 2。
[0042]圖4為HSA長效融合蛋白的純化結(jié)果，其中，1:pPICZ a A/HSA-E4 ；2:pPICZ a A/HSA- (E4)2。
【具體實施方式】
[0043]如圖1-1和圖1-2所示，為本發(fā)明HAS長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法和pPICZ a A-E4-HSA構(gòu)建示意圖。本發(fā)明利用BglBrick方法進行HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化，通過PCR從含有HSA cDNA的質(zhì)粒中擴增獲得HSAcDNA，同時在HSAcDNA片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點；通過人工合成Exendin-4片段，同時在片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點；分別將兩個片段連接在pPICZ a A表達載體上，通過Xho I BamH I和Xho I Bgl II兩種組合對載體質(zhì)粒切割及片段的連接，可以進行HSA長效融合蛋白表達載體的快速組裝；HSA長效融合蛋白表達載體在宿主系統(tǒng)中進行表達，HSA長效融合蛋白表達載體被整合到宿主的染色體中；HSA長效融合蛋白的發(fā)酵液直接通過親和層析純化，制備得到高純度融合蛋白。
[0044]一、HSA cDNA的PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0045]利用PCR從含有HS A cDNA質(zhì)粒中擴增出HSA cDNA (見序列表中序列3)，同時在HSA cDNA片段N端和C端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，所用的引物為:
[0046]HSA-F: 5，-CTCGAGAAAAGAAGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3，
[0047]HSA-R: 5，-GCGGCCGCTTAGGATCCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3，
[0048]50 μ I的反應(yīng)體系中加入:25μ I的2XQ5mix高保真聚合酶，100 μ mol/L的引物HSA-F和HSA-R各I μ I，含有HSA cDNA的質(zhì)粒0.3 μ g,加水補齊至50 μ I (2 X Q5mix高保真聚合酶購自NEB公司)Thermal Cycler PCR反應(yīng)儀上，PCR條件為:98°C充分變性30秒，98 °C變性10秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，循環(huán)30次；72°C延伸2分鐘。
[0049]通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用DNA膠回收試劑盒回收出1.Skb的目標(biāo)條帶，純化好的目標(biāo)片段，末端加多A堿基后和載體pMDlS-Τ在15μ I的反應(yīng)體系中加入:1μ I的PMD18-T載體，6.5μ I的DNA片段，7.5μ I Solution I在16°C下進行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37 °C培養(yǎng)過夜；挑取菌落,接種于5mll00y g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對陽性克隆的單菌落進行DNA測序；測序正確的陽性克隆用通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離后，DNA膠回收試劑盒回收，純化好的目標(biāo)片段備用；載體PPICZ a A通過Xho I和Not I雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用DNA膠回收試劑盒回收出3.6kb的目標(biāo)條帶，純化好的目標(biāo)片段備用；HSA的cDNA片段和pPICZ a A載體片段按照1:7的摩爾比用T4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍于-20°C ;重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-HSA (見序列表中序列4)，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZ a A-HSA。
[0050] 二、含有Exendin-4重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0051]通過人工合成Exendin-4片段(見序列表中序列5)，同時在片段N端和C端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，合成好的片段備用；載體pPICZaA通過Xho I和Not I雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用DNA膠回收試劑盒回收出3.6kb的目標(biāo)條帶，純化好的目標(biāo)片段備用；Exendin-4片段和載體pPICZ a A片段按照1:7的摩爾比用T4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍于-20°C;重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-E4 (目標(biāo)基因的核苷酸序列，見序列表中序列5)，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZ a A_E4。
[0052]三、E4-HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒的快速組裝
[0053]分別接種陽性重組子TOPlO-pPICZ a A-HSA 及 TOPlO-pPICZ a A_E4 于 5ml 含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；分別通過Xho I Bgl II和Xho I BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離后，DNA膠回收試劑盒回收5.4kb大片段和149bp小片段，純化好的大小片段按照1:7的摩爾比用T4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/mlZeocin?的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25μ g/mlZeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍于-20°C ;重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-E4-HSA (見序列表中序列6)，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZa A-E4-HSA。其快速組裝結(jié)果，如圖2中的I所示。
[0054]pPICZ a A-HSA 和 pPICZ a A-E4 分別通過 Xho I BamH I 和 Xho I Bgl II 雙酶切，回收小片段和大片段，用同上的方法構(gòu)建出質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-HSA-E4(陽性重組子中目標(biāo)基因的核苷酸序列，見序列表中序列7);陽性重組子命名為T0P10-pPICZaA-HSA-E4 ;其快速組裝結(jié)果，如圖2中的5所示。用同樣的方法能夠完成不同HSA長效融合蛋白質(zhì)粒的快速組裝。
[0055]四、HSA長效融合蛋白的酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建
[0056]取一支凍存的TOPlO-pPICZ a A-E4-HSA 或TOPlO-pPICZ a A-HSA-E4，接種到 5ml 含有25 μ g/ml ZeocinTM的LB培養(yǎng)基的試管中37°C培養(yǎng)過夜，用常規(guī)方法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71H，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100 μ g/ml Zeocin?的YPDS平板，于30°C，培養(yǎng)2-3天；挑取YPDS平板上長出的菌落，通過酵母菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子，陽性重組子命名為KM71H-pPICZaA-E4-HSA (目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列8)或KM71H-pPICZa A-HSA-E4 (目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列9)。
[0057]五、HSA長效融合蛋白的表達
[0058]將KM71H-pPICZ a A-E4-HSA 或 KM71H_pPICZ a A-HSA-E4 接種至裝有 50mlBMGY( 1%的酵母浸出物、2%蛋白胨、50mM磷酸鉀，pH6.0、1.34%無氨基酸的酵母氮基、4 X 10_5%生物素、1%的甘油)250ml三角瓶中，200rpm30°C培養(yǎng)18h，將培養(yǎng)物1500 Xg離心5min收獲菌體，重懸菌體于100mlBMMY (1%的酵母浸出物、2%蛋白胨、IOOmM磷酸鉀，？冊.0、1.34%無氨基酸的酵母氮基、4X 10_5%生物素、0.5%甲醇)500ml三角瓶中，使其起始OD6tltl ^ 1.0，每12小時補加一次甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)5天，離心收集上清，SDS-PAGE法觀察融合蛋白E4-HSA或HSA-E4的表達，如圖3中的5或I所示。
[0059]六、融合蛋白的分離純化
[0060]將誘導(dǎo)完成的融合蛋白E4-HSA發(fā)酵液9500rpm離心收獲上清，20mM PB緩沖液稀釋5倍后直接通過HiTrap Blue HP柱，用20mM PBl.5M NaCl洗脫，能夠獲得高純度融合蛋白E4-HAS (蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列8)或HSA-E4 (蛋白的氨基酸序列，見序列表中序列9)。
[0061]采用本發(fā)明的方法能夠快速的構(gòu)建不同種類的HSA長效融合蛋白，其含有第一區(qū)由1-4個與促胰島素分泌肽Exendin-4的重復(fù)序列組成，第二區(qū)是由人血清白蛋白HSA的序列組成，第一區(qū)的C-末端與第二區(qū)的N-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連，或第一區(qū)N-末端與第二區(qū)C-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連；第一區(qū)的促胰島素分泌肽Exendin-4的重復(fù)序列直接通過甘氨酸和絲氨酸相連。
[0062]如圖2所示為HSA兩端分別連接不同個數(shù)E4的HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒的快速組裝結(jié)果，其中 1-4:pPICZaA/ (E4) - HSA ;5_8:pPICZ a A/HSA-(E4)卜4 ;9_10:pPICZ a A/(E4) - HSA-(E4) ^20表明采用Bglbrick方法能夠完成不同種類HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒的快速組裝。`
[0063]如圖3所示，為HSA長效融合蛋白的表達結(jié)果，其中，I: pPICZ a A/HSA-E4 ；2:pPICZaA/HSA-(E4)2；3:pPICZaA/HSA-(E4)3；4:pPICZaA/HSA-(E4)4；5:pPICZaA/E4 - HSA ；6:pPICZa A/(E4)2 -HSA ；7:pPICZ a A/ (E4) 3 - HSA ；8:pPICZ a A/(E4) 4 - HSA ；9:pPICZ a A/E4 - HSA-E4 ；10:pPICZ a A/(E4) 2 - HSA-(E4) 2。表明采用 Bglbrick 方法快速構(gòu)建的不同種類HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒均能夠在畢赤酵母KM71H中表達出相應(yīng)融合蛋白。
[0064]如圖4所示，為HSA長效融合蛋白的純化結(jié)果，其中，I:pPICZ a A/HSA-E4 ；2:pPICZ a A/HSA-(E4)2。表明采用HiTrap Blue HP柱能夠快速的分離出高純度的融合蛋白。
【權(quán)利要求】
1.一種HSA長效融合蛋白，其特征在于:包含兩個多肽區(qū)，第一區(qū)是由促胰島素分泌肽Exendin-4的重復(fù)序列組成，第二區(qū)是由人血清白蛋白HSA的序列組成，第一區(qū)的C-末端與第二區(qū)的N-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連，或第一區(qū)N-末端與第二區(qū)C-末端通過甘氨酸和絲氨酸兩個氨基酸相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HSA長效融合蛋白，其特征在于:所述的促胰島素分泌肽Exendin-4的重復(fù)次數(shù)為1_4次，重復(fù)序列之間直接通過甘氨酸和絲氨酸相連。
3.—種HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，包括如下步驟: (1)通過PCR從含有HSAcDNA的質(zhì)粒中擴增獲得HSA cDNA,同時在HSAcDNA片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，并將HSA cDNA片段連接在pPICZ a A表達載體上； (2)通過人工合成Exendin-4片段，同時在片段N末端和C末端分別添加XhoI Bgl II和BamH I Not I酶切位點，并將片段連接在pPICZ a A表達載體上； (3)通過Xho I BamH I 和 Xho I Bgl II 或 Xho I Bgl II和 Xho I BamH I 兩種組合對得到的兩種載體質(zhì)粒切割及片段的連接，進行HSA長效融合蛋白表達載體的快速組裝； (4)HSA長效融合蛋白表達載體在宿主表達系統(tǒng)中進行表達，HSA長效融合蛋白表達載體被整合到宿主的染色體中； (5)HSA長效融合蛋白的發(fā)酵液直接通過親和層析純化，制備到高純度融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，其特征在于:所述的宿主表達系統(tǒng)為細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞表達系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，其特征在于:所述的宿主表達系統(tǒng)為酵母。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，其特征在于:所述的酵母為畢赤酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，其特征在于:所述的酵母為畢赤酵母ΚΜ71Η。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，其特征在于:所述的親和層析純化所采用的親和層析柱填料為HiTrap Blue HP。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HSA長效融合蛋白的快速組裝及分離純化方法，其特征在于，具體步驟包括: (I)HSA cDNA的PCR擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建: 利用PCR從含有HSA cDNA質(zhì)粒中擴增出HSA cDNA，同時在HSA cDNA片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，所用的引物為:HSA-F:5’_CTCGAGAAAAGAAGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’
HSA-R:
.5， -GCGGCCGCTTAGGATCCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3， .50 μ I的反應(yīng)體系中加入:25μ I的2XQ5mix高保真聚合酶，ΙΟΟμπιοΙ/L的引物HSA-F和HSA-R各I μ 1，含有HSA cDNA的質(zhì)粒0.3 μ g，加水補齊至50 μ I ；PCR反應(yīng)條件為:98°C充分變性30秒，98 °C變性10秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，循環(huán)30次；72°C延伸2分鐘；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用DNA膠回收試劑盒純化出1784bp的目標(biāo)條帶；純化好的目標(biāo)片段，目標(biāo)片段進行T-A克隆到pMDlS-T中，在.15μ I的反應(yīng)體系中加入1μ I的pMD18-T載體，6.5μ I的DNA片段，7.5μ I Solution I在16°C下進行連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有.100 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37 °C培養(yǎng)過夜；挑取菌落,接種于5mll00y g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對陽性克隆的單菌落進行DNA測序；測序正確的陽性克隆用通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離后，DNA膠回收試劑盒回收，純化好的目標(biāo)片段和載體pPICZ a A按照1:7的摩爾比用T4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37 °C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍存于_20°C ;重組質(zhì)粒命名為pPICZ aA-HSA，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZa A-HSA ； (2)含有Exendin-4重組質(zhì)粒的構(gòu)建: 通過人工合成Exendin-4的核苷酸序列片段，同時在片段N末端和C末端分別添加Xho I Bgl II和BamH I Not I酶切位點，將合成好的片段和載體pPICZ a A按照1:7的摩爾比用Τ4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有.25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/mlZeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍存于_20°C ;重組質(zhì)粒命名為pPICZ α Α-Ε4，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZ α Α_Ε4 ； (3)HSA長效融合蛋白表達質(zhì)粒的快速組裝: 分別接種陽性重組子TOPlO-pPICZ a A-HSA及TOPlO-pPICZ α Α-Ε4于5ml含有.25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；分別通過Xho I Bgl II和Xho I BamH I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離后，DNA膠回收試劑盒回收大片段和小片段，純化好的大小片段按照1:7的摩爾比用T4連接酶連接，連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有25 μ g/ml Zeocin?的LB瓊脂平板，37 °C培養(yǎng)過夜；挑取單菌落，接種于5ml含有25 μ g/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過Xho I和Not I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存于含有30%甘油的LB中，凍于-20°C ;重組質(zhì)粒命名為pPICZ a A-E4-HSA，陽性重組子命名為TOPlO-pPICZaA-E4-HSA ； pPICZ a A-HSA 和 pPICZ α A-E4 分別通過 Xho I BamH I 和 Xho I Bgl II 雙酶切，回收小片段和大片段，用同上的方法構(gòu)建出質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pPICZ CIA-HSA-E4 ;陽性重組子命名為 TOPlO-pPICZ a A-HSA-E4 ； (4)HSA長效融合蛋白的酵母表達系統(tǒng)構(gòu)建: 取一支凍存的 TOPlO-pPICZ a A-E4-HSA 或 TOPlO-pPICZ a A-HSA-E4，接種到 5ml 含有25yg/ml Zeocin?的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)Sac I酶切后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71H，通過酵母菌液PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71H-pPICZaA-E4-HSA 或 KM71H_pPICZ aA-HSA-E4 ； (5)HSA長效融合蛋白的表達: 將 KM71H-pPICZ a A-E4-HSA 或 KM71H_pPICZ a A-HSA-E4 接種至裝有 50mlBMGY250ml三角瓶中，200rpm30°C培養(yǎng)18h，將培養(yǎng)物1500Xg離心5min收獲菌體，重懸菌體于100mlBMMY500ml三角瓶中，使其起始OD6tltl ^ 1.0，每12小時補加一次甲醇至終濃度0.5%，誘導(dǎo)5天，離心收集上清，SDS-PAGE法觀察融合蛋白E4-HSA或HSA-E4的表達； (6)融合蛋白的分離純化: 將誘導(dǎo)完成的發(fā)酵液離心收獲上清，稀釋后直接通過HiTrap Blue HP柱，獲得高純度融合蛋白E4-HSA 或HSA-E4 。
【文檔編號】C07K19/00GK103613670SQ201310594414
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】劉剛, 邵妤, 陳惠鵬, 金晶, 王微, 曲國龍, 闞乃鵬, 譚俊杰, 朱晨 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所