周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法，包括周期型馬來絲蟲pcDNA3.1（+）-BmCPI/BmGAPDH重組質(zhì)粒的抽提、基因轉(zhuǎn)染、陽性克隆的篩選、陽性克隆的提取和擴(kuò)大培養(yǎng)、陽性克隆的凍存、檢測(cè)陽性克隆，抽提細(xì)胞總RNA，分子水平檢測(cè)重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)、蛋白水平檢測(cè)重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析、周期性馬來絲蟲重組蛋白的提取和純化等步驟。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、效果好。
【專利說明】周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]絲蟲病的流行不僅給人民的健康帶來嚴(yán)重危害，也成為因病致貧的重要原因之一。目前治療絲蟲病的主要方法是采用化學(xué)藥物，藥物雖能降低感染率和發(fā)病率，但由于頻繁應(yīng)用，尚不能排除絲蟲有潛在抗藥性的危險(xiǎn)，加上重復(fù)化療和長期的監(jiān)測(cè)措施需要昂貴的費(fèi)用和大批專業(yè)技術(shù)人員。因此，為尋找控制絲蟲病輔助或替代方法，絲蟲疫苗的研究日益成為人們關(guān)注的問題。
[0003]盡管核酸疫苗在感染性疾病及腫瘤的防治中顯示出巨大的潛能。但在實(shí)際應(yīng)用中，由于DNA疫苗存在著一些亟待解決的問題而限制了它的廣泛應(yīng)用和進(jìn)一步發(fā)展，主要是安全性問題限制了在人體上的應(yīng)用，如質(zhì)粒DNA整合到宿主基因組中會(huì)引起癌基因的活化或抑癌基因的失活；抗體在機(jī)體內(nèi)的長期表達(dá)可能導(dǎo)致宿主的免疫耐受或自身免疫反應(yīng)等；以及質(zhì)粒DNA意外導(dǎo)入非靶細(xì)胞內(nèi)會(huì)影響細(xì)胞的正常功能。其次，DNA疫苗因體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率欠佳等原因，核酸疫苗所激發(fā)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度相對(duì)較弱，尤其在大動(dòng)物以及人體內(nèi)不足以引起足夠的免疫保護(hù)效果。
[0004]蛋白疫苗是將編碼某種外源性抗原的基因?qū)胧荏w菌(如大腸桿菌)或細(xì)胞，使其在受體菌或細(xì)胞中高效表達(dá)，再以這種生物合成的基因表達(dá)產(chǎn)物制成的一類亞單位疫苗。蛋白質(zhì)成功表達(dá)的關(guān)鍵是 選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)是最為成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，操作簡(jiǎn)單，可大量表達(dá)蛋白，但是缺乏真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，表達(dá)產(chǎn)物不能自發(fā)折疊卷曲生成有一定空間結(jié)構(gòu)和特定生物功能的蛋白質(zhì)，常以包涵體形式存在，經(jīng)過變性復(fù)性后，表達(dá)產(chǎn)物又容易失去免疫活性。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具備完整的蛋白質(zhì)組裝和修飾系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)象多接近天然蛋白質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種制備方便，效果好的周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
[0007]—種周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法，其特征是:包括下列步驟:
[0008](一)周期型馬來絲蟲pcDNA3.1 ( + ) -BmCPI/BmGAPDH重組質(zhì)粒的抽提:
[0009](I)將含有重組質(zhì)粒的菌種室溫融化后取50ul加入到含有50ul、100mg/ml氨芐西林鈉的100ml LB溶液中置于37°C恒溫、250rpm的搖床培養(yǎng)12_16h，之后放置4°C冰箱冷卻；
[0010](2)菌液培養(yǎng)12-16h后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其0D600值，如果0D600數(shù)值在
0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長的對(duì)數(shù)生長期，則可以用來進(jìn)行質(zhì)粒的抽提；
[0011](3)取上述培養(yǎng)后的菌至50ml離心管內(nèi)，5000rpm離心I分鐘,收集沉淀,棄上清；[0012](4)每管加入5ml溶液I (懸浮液)，重懸細(xì)胞沉淀；
[0013](5)之后每管加入5ml溶液II (裂解液)，顛倒離心管4_6次，室溫放置3_5分鐘，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明；
[0014](6)每管加入5ml溶液III (結(jié)合液)，隨即顛倒離心管4_6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生，然后5000rpm室溫離心10-20分鐘；
[0015](7)將上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)，5000rpm室溫離心2分鐘,倒棄收集管內(nèi)液體；
[0016](8)在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入7ml溶液IV (洗滌液)，5000rpm室溫離心2分鐘，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體，之后再5000rpm室溫離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)；
[0017](9)將質(zhì)粒純化柱置于50ml離心管上,加入2ml溶液V (洗脫液)至管內(nèi)柱面上，放置2分鐘，然后5000rpm室溫離心2分鐘，所得液體中加入IOml溶液VI (DNA純化結(jié)合液)混勻后加到原質(zhì)粒純化柱內(nèi)；
[0018](10)再次室溫離心2分鐘后,倒棄收集管內(nèi)液體；
[0019](11)在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入15ml溶液IV (洗滌液)，5000rpm室溫離心2分鐘，近一步洗去雜質(zhì)后，倒棄收集管內(nèi)液體；
[0020](12) 5000rpm室溫離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)；
[0021](13)將質(zhì)粒純化柱置于50ml離心管上，加入2ml溶液V (洗脫液)至管內(nèi)柱面上，放置2分鐘；
[0022](14) 5000rpm室溫離心2分鐘，所得液體即為轉(zhuǎn)細(xì)胞級(jí)超純質(zhì)粒；
[0023](15)取DNA水溶液，用雙蒸水稀釋400倍，以雙蒸水作空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上讀取樣品的測(cè)定濃度及A260/A280的值，并將其貯存于_20°C用于基因轉(zhuǎn)染；
[0024]所述溶液I為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的懸浮液；溶液II為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的裂解液；溶液III為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的結(jié)合液；溶液IV為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的洗滌液；溶液V為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的洗脫液；溶液VI為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的DNA純化結(jié)合液；
[0025](二)Hela細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代
[0026](I)從_80°C冰箱中取出凍存Hela細(xì)胞的EP管，并直接投入37°C恒溫水浴鍋中，不時(shí)搖動(dòng)使其融化；
[0027](2)當(dāng)完全融化時(shí)，從37°C溫水中取出EP管，1200轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘；
[0028](3)棄上清，用含有10%體積小牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種到培養(yǎng)瓶中，放在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0029](4)當(dāng)Hela細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的70%~80%滿時(shí)，傳代，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用2ml PBS緩沖液洗滌兩次；
[0030](5)加入0.25%W/V胰酶ImL消化lmin，待瓶底細(xì)胞開始脫落時(shí)倒掉胰酶，加入8mL含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，用移液槍吹打瓶底細(xì)胞使其脫落并混勻，吸取4mL至另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；
[0031](三)基因轉(zhuǎn)染[0032](I)提前24小時(shí)在96孔板中接種細(xì)胞55孔，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，接種量為使第二天長成25%單層，置C02孵箱中37 °C培養(yǎng)過夜；
[0033](2)將培養(yǎng)液換成含抗生素G418的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增:0μ g/ml，100 μ g/ml,200 μ g/ml,300 μ g/ml,400 μ g/ml,500 μ g/ml,600 μ g/ml,700 μ g/ml，800 μ g/ml, 900 μ g/ml 和 1000 μ g/ml ；
[0034](3)培養(yǎng)10-14天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn)，最后獲得最佳篩選濃度為400 μ g/ml，篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)比該濃度提高一個(gè)級(jí)別，維持時(shí)使用篩選濃度的一半；
[0035](4)轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞用0.25%ff/V胰酶消化、計(jì)數(shù)并鋪板，使其在轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞融合度為80— 90%，細(xì)胞鋪板在2mL含胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中；在六孔板中按以下方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，a、b作為對(duì)照:
[0036]a.No DNA transfection control (DNA 轉(zhuǎn)染空白對(duì)照)
[0037]b.pcDNA3.1 (+)
[0038]c.pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH ；
[0039](5)對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250ul不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋4ug~5ugDNA，多孔操作時(shí)批量制備；
[0040](6)對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250ul不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋IOulLipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，Lipofect稀釋后,在5min內(nèi)同稀釋的DNA混合,保溫時(shí)間過長會(huì)降低活性，可以批量制備；
[0041](7)混合稀釋的DNA和稀釋的Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,在室溫保溫15min ；
[0042](8)使用2ml/孔的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染開始前洗滌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基；
[0043](9)將稀釋的復(fù)合物加入到細(xì)胞當(dāng)中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻在37°C、5%的C02中保溫 24-48h ；
[0044](四)陽性克隆的篩選
[0045](I)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代，再培養(yǎng)24h后六孔板中的培養(yǎng)基更換為預(yù)試驗(yàn)中確定的400 μ g/ml濃度的G418選擇培養(yǎng)基,然后按照下面不同生長情況的細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選:
[0046]a.No DNA transfection control (DNA 轉(zhuǎn)染空白對(duì)照)
[0047]b.pcDNA3.1 (+)
[0048]c.pcDNA3.1 (+)-BmCPI/GAPDH
[0049]加入按配制好的G418篩選培養(yǎng)基，篩選時(shí)比預(yù)實(shí)驗(yàn)提高一個(gè)等級(jí)濃度；
[0050](2)根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每2~3天更換一次篩選培養(yǎng)基；當(dāng)觀察到a、b、c中大部分細(xì)胞大部分死亡或a中細(xì)胞全部死亡時(shí)，把培養(yǎng)基G418濃度減半維持篩選作為維持培養(yǎng)基，待其逐漸增大，此時(shí)血清濃度可加大為15% ；
[0051](3)當(dāng)在顯微鏡下見到有陽性克隆形成時(shí)，準(zhǔn)備挑取克隆；
[0052](五)陽性克隆的提取和擴(kuò)大培養(yǎng)
[0053](I)觀察細(xì)胞克隆，用標(biāo)記筆在培養(yǎng)板底面對(duì)要分離的陽性克隆做標(biāo)記；
[0054](2)撤去培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞克??；
[0055](3)用無菌鑷夾取一個(gè)克隆培養(yǎng)環(huán)，蘸取滅過菌的凡士林，凡士林面沖下，壓放在培養(yǎng)板中生長旺盛的陽性單克隆上，使凡士林均勻分布在克隆培養(yǎng)環(huán)底面，克隆環(huán)圈在所需克隆團(tuán)上；
[0056](4)在六孔板同一個(gè)孔上重復(fù)步驟(3)，用圈套2到3個(gè)其它所需克隆團(tuán)；
[0057](5)加0.25%胰酶充滿環(huán)內(nèi)，20秒后棄去胰酶；
[0058](6)蓋上六孔板，37°C，15分鐘；
[0059](7)每個(gè)環(huán)中加0.1ml至0.2ml的培養(yǎng)基；
[0060](8)依次對(duì)每個(gè)克隆用吸管吹打以分散細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液分別移入24孔板的孔中，每個(gè)細(xì)胞克隆都應(yīng)配備各自的吸管或槍頭；
[0061](9)再用0.1ml至0.2ml的培養(yǎng)基沖洗克隆環(huán)，再將這些培養(yǎng)基分別移入相應(yīng)的24孔板中；
[0062](10)將培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基加至0.5ml，蓋好，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0063](11)當(dāng)克隆細(xì)胞長滿24孔板時(shí)，即可消化傳代至六孔板中，加2ml培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)
大培養(yǎng)；
[0064](12)六孔板中細(xì)胞長滿后即傳代至培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，直至凍存；
[0065](六)陽性克隆的凍存
[0066]陽性克隆細(xì)胞(pcDNA3.1 (+)、pcDNA3.1⑴-BmCPI/BmGAPDH)在篩選培養(yǎng)基中生長狀態(tài)穩(wěn)定后開始對(duì)它們進(jìn)行凍存:
[0067](I)選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，在凍存前一天更換一次培養(yǎng)基；
[0068](2)倒掉培養(yǎng)基，PBS輕輕沖洗細(xì)胞克隆后，用0.25%ff/V的胰酶消化細(xì)胞，把消化好的細(xì)胞收集于離心管中離心，倒掉培養(yǎng)基和胰酶；
[0069](3)加入凍存液，凍存液中的細(xì)胞的最終濃度為5X106，用移液槍吹打，然后分裝入細(xì)胞凍存管中封好，放入_80°C冰箱中凍存；所述凍存液包括10%體積分?jǐn)?shù)的DMSO凍存培養(yǎng)基和10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清；
[0070](七)檢測(cè)陽性克隆，抽提細(xì)胞總RNA，分子水平檢測(cè)重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá):
[0071](I)六孔板中細(xì)胞棄上清，PBS清洗后每孔加入Iml Trizol試劑，用移液槍吹打溶解細(xì)胞后移入新的1.5ml Ep管中；
[0072](2) 15_30°C溫育5min，確保核蛋白復(fù)合物的徹底分離；
[0073](3)加入 0.1ml 氯仿，充分振蕩 15s，15_30°C 溫育 3min，2_8°C 12000rpm 離心15min ；
[0074](4)將上層液體轉(zhuǎn)移至另一 Ep管內(nèi)，加入0.3ml異丙醇，15-30°C溫育IOmin ;2-8°C 12000rpm 離心 IOmin ；
[0075](5)棄上清，用 0.5ml75%DEPC-乙醇沖洗沉淀一次，2-8°C 12000rpm 離心 15min。
[0076](6)干燥 5-10min，加入 20 μ I DEPC-DDW，55_60°C溫育 lOmin，即為提取的 RNA，保存于-80°C備用；
[0077](7)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應(yīng)混合物:
[0078](l-5ug)總 RNA;
[0079]2ul oligo (dT) 15 ；
[0080]2ul dNTP (2.5mM each)；
[0081]補(bǔ)RNase-free ddH20 定容至 14.5ul ；[0082](8)70°C加熱5min后在冰上冷卻2min ;簡(jiǎn)短離心收集反應(yīng)液后加入以下各組分:
[0083]4ul5 XFirst-Strand buffer (含有 DTT) ；0.5ul RNasin0
[0084](9)加 lul、200U 的 TIANScript M_MLV，輕輕用移液器混勻。
[0085](10)42°C溫溫 50min ;
[0086](11)95°C加熱5min終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或_20度冷凍保存。
[0087](12) PCR 擴(kuò)增基因；計(jì)算弓丨物 Tm 值，Pl Tm=62.02，P2 Tm=64.94，在 0.5mlEppendorf管中按下表建立25 μ I的PCR反應(yīng)體系:
[0088]表1 PCR反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.一種周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法，其特征是:包括下列步驟: (一)周期型馬來絲蟲PCDNA3.1 ( + ) -BmCPI/BmGAPDH重組質(zhì)粒的抽提: (1)將含有重組質(zhì)粒的菌種室溫融化后取50ul加入到含有50ul、100mg/ml氨芐西林鈉的100ml LB溶液中置于37°C恒溫、250rpm的搖床培養(yǎng)12_16h，之后放置4°C冰箱冷卻； (2)菌液培養(yǎng)12-16h后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其0D600值，0D600數(shù)值在0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長的對(duì)數(shù)生長期，則可以用來進(jìn)行質(zhì)粒的抽提； (3)取上述培養(yǎng)后的菌至50ml離心管內(nèi)，5000rpm離心I分鐘，收集沉淀，棄上清； (4)每管加入5ml溶液I，重懸細(xì)胞沉淀； (5)之后每管加入5ml溶液II，顛倒離心管4-6次，室溫放置3_5分鐘，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明； (6)每管加入5ml溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生，然后5000rpm室溫離心10-20分鐘； (7)將上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)，5000rpm室溫離心2分鐘,倒棄收集管內(nèi)液體； (8)在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入7ml溶液IV，5000rpm室溫離心2分鐘，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體，之后再5000 rpm室溫離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)； (9)將質(zhì)粒純化柱置于50ml離心管上,加入2ml溶液V至管內(nèi)柱面上,放置2分鐘,然后5000rpm室溫離心2分鐘,所得液體中加入IOml溶液VI混勻后加到原質(zhì)粒純化柱內(nèi)； (10)再次室溫離心2分鐘后,倒棄收集管內(nèi)液體； (11)在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入15ml溶液IV，5000rpm室溫離心2分鐘，近一步洗去雜質(zhì)后，倒棄收集管內(nèi)液體； (12)5000rpm室溫離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)； (13)將質(zhì)粒純化柱置于50ml離心管上,加入2ml溶液V至管內(nèi)柱面上,放置2分鐘； (14)5000rpm室溫離心2分鐘，所得液體即為轉(zhuǎn)細(xì)胞級(jí)超純質(zhì)粒； (15)取DNA水溶液，用雙蒸水稀釋400倍，以雙蒸水作空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上讀取樣品的測(cè)定濃度及A260/A280的值，并將其貯存于_20°C用于基因轉(zhuǎn)染； 所述溶液I為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的懸浮液；溶液II為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的裂解液；溶液III為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的結(jié)合液；溶液IV為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的洗滌液；溶液V為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的洗脫液；溶液VI為質(zhì)粒大量抽提試劑盒的DNA純化結(jié)合液； (二)Hela細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代 (1)從_80°C冰箱中取出凍存Hela細(xì)胞的EP管，并直接投入37°C恒溫水浴鍋中，不時(shí)搖動(dòng)使其融化； (2)當(dāng)完全融化時(shí)，從37°C溫水中取出EP管，1200轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘； (3)棄上清，用含有10%體積小牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種到培養(yǎng)瓶中，放在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)； (4)當(dāng)Hela細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底的70%~80%滿時(shí)，傳代，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用2mlPBS緩沖液洗滌兩次；(5)加入0.25%ff/V胰酶ImL消化lmin，待瓶底細(xì)胞開始脫落時(shí)倒掉胰酶，加入8mL含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，用移液槍吹打瓶底細(xì)胞使其脫落并混勻，吸取4mL至另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)； (三)基因轉(zhuǎn)染 (1)提前24小時(shí)在96孔板中接種細(xì)胞55孔，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，接種量為使第二天長成25%單層，置C02孵箱中37 °C培養(yǎng)過夜； (2)將培養(yǎng)液換成含抗生素G418的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增:0μg/ml，100 μ g/ml,200 μ g/ml,300 μg/ml,400 μ g/ml,500 μ g/ml,600 μg/ml,700 μ g/ml,800 μ g/ml,900 μ g/ml 和 1000 μ g/ml ； (3)培養(yǎng)10-14天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn)，最后獲得最佳篩選濃度為400μ g/ml，篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時(shí)比該濃度提高一個(gè)級(jí)別，維持時(shí)使用篩選濃度的一半； (4)轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞用0.25%W/V胰酶消化、計(jì)數(shù)并鋪板，使其在轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞融合度為80— 90%，細(xì)胞鋪板在2mL含胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中；在六孔板中按以下方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，a、b作為對(duì)照: a.DNA轉(zhuǎn)染空白對(duì)照
b.pcDNA3.1 (+)
c.pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH ； (5)對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250ul不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋4ug~5ugDNA，多孔操作時(shí)批量制備； (6)對(duì)于每孔細(xì)胞，使用250ul不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋IOulLipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，Lipofect稀釋后，在5min內(nèi)同稀釋的DNA混合，保溫時(shí)間過長會(huì)降低活性，可以批量制備； (7)混合稀釋的DNA和稀釋的Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,在室溫保溫15min； (8)使用2ml/孔的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染開始前洗滌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基； (9)將稀釋的復(fù)合物加入到細(xì)胞當(dāng)中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻在37°C、5%的C02中保溫24-48h ； (四)陽性克隆的篩選 (1)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后按1:10的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6孔板中傳代，再培養(yǎng)24h后六孔板中的培養(yǎng)基更換為預(yù)試驗(yàn)中確定的400 μ g/ml濃度的G418選擇培養(yǎng)基,然后按照下面不同生長情況的細(xì)胞用篩選培養(yǎng)基對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選: a.DNA轉(zhuǎn)染空白對(duì)照
b.pcDNA3.1 (+)
c.pcDNA3.1(+)-BmCPI/GAPDH 加入按配制好的G418篩選培養(yǎng)基，篩選時(shí)比預(yù)實(shí)驗(yàn)提高一個(gè)等級(jí)濃度； (2)根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每2~3天更換一次篩選培養(yǎng)基；當(dāng)觀察到a、b、c中大部分細(xì)胞大部分死亡或a中細(xì)胞全部死亡時(shí)，把培養(yǎng)基G418濃度減半維持篩選作為維持培養(yǎng)基，待其逐漸增大，此時(shí)血清濃度可加大為15% ； (3)當(dāng)在顯微鏡下見到有陽性克隆形成時(shí)，準(zhǔn)備挑取克?。?五)陽性克隆的提取和擴(kuò)大培養(yǎng) (1)觀察細(xì)胞克隆，用標(biāo)記筆在培養(yǎng)板底面對(duì)要分離的陽性克隆做標(biāo)記； (2)撤去培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞克?。? (3)用無菌鑷夾取一個(gè)克隆培養(yǎng)環(huán)，蘸取滅過菌的凡士林，凡士林面沖下，壓放在培養(yǎng)板中生長旺盛的陽性單克隆上，使凡士林均勻分布在克隆培養(yǎng)環(huán)底面，克隆環(huán)圈在所需克隆團(tuán)上； (4)在六孔板同一個(gè)孔上重復(fù)步驟(3)，用圈套2到3個(gè)其它所需克隆團(tuán)； (5)加0.25%胰酶充滿環(huán)內(nèi)，20秒后棄去胰酶； (6)蓋上六孔板，37°C，15分鐘； (7)每個(gè)環(huán)中加0.1ml至0.2ml的培養(yǎng)基； (8)依次對(duì)每個(gè)克隆用吸管吹打以分散細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液分別移入24孔板的孔中，每個(gè)細(xì)胞克隆都應(yīng)配備各自的吸管或槍頭； (9)再用0.1ml至0.2ml的培養(yǎng)基沖洗克隆環(huán)，再將這些培養(yǎng)基分別移入相應(yīng)的24孔板中； (10)將培養(yǎng)孔中的培 養(yǎng)基加至0.5ml，蓋好，繼續(xù)培養(yǎng)； (11)當(dāng)克隆細(xì)胞長滿24孔板時(shí)，即可消化傳代至六孔板中，加2ml培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng); (12)六孔板中細(xì)胞長滿后即傳代至培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，直至凍存； (六)陽性克隆的凍存 陽性克隆細(xì)胞(pcDNA3.l(+)、pcDNA3.l(+)-BmCPI/BmGAPDH)在篩選培養(yǎng)基中生長狀態(tài)穩(wěn)定后開始對(duì)它們進(jìn)行凍存: (1)選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，在凍存前一天更換一次培養(yǎng)基； (2)倒掉培養(yǎng)基，PBS輕輕沖洗細(xì)胞克隆后，用0.25%ff/V的胰酶消化細(xì)胞，把消化好的細(xì)胞收集于離心管中離心，倒掉培養(yǎng)基和胰酶； (3)加入凍存液，凍存液中的細(xì)胞的最終濃度為5X 106，用移液槍吹打，然后分裝入細(xì)胞凍存管中封好，放入_80°C冰箱中凍存；所述凍存液包括10%體積分?jǐn)?shù)的DMSO凍存培養(yǎng)基和10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清； (七)檢測(cè)陽性克隆，抽提細(xì)胞總RNA，分子水平檢測(cè)重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá): (1)六孔板中細(xì)胞棄上清，PBS清洗后每孔加入ImlTrizol試劑，用移液槍吹打溶解細(xì)胞后移入新的1.5ml Ep管中； (2)15-30°C溫育5min，確保核蛋白復(fù)合物的徹底分離； (3)加入0.1ml 氯仿，充分振蕩 15s，15_30°C溫育 3min，2_8°C 12000rpm 離心 15min ； (4)將上層液體轉(zhuǎn)移至另一Ep管內(nèi)，加入0.3ml異丙醇，15-30°C溫育IOmin;2-8°C 12000rpm 離心 IOmin ； (5)棄上清，用0.5ml75%DEPC-乙醇沖洗沉淀一次，2_8°C 12000rpm離心15min。 (6)干燥5-10min，加入 20 μ I DEPC-DDW，55_60°C溫育 IOmin,即為提取的 RNA，保存于-80°C備用； (7)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈在冰浴的無核酸酶的離心管中加入如下反應(yīng)混合物:
(l-5ug)總 RNA ；2ul oligo (dT)15 ；
2ul dNTP (2.5mM each)；
補(bǔ) RNase-free ddH20 定容至 14.5ul ；(8)70°C加熱5min后在冰上冷卻2min;簡(jiǎn)短離心收集反應(yīng)液后加入以下各組分:
4ul5 XFirst-Strand buffer (含有 DTT) ；0.5ul RNasin0 (9)加lul、200U的TIANScriptM_MLV，輕輕用移液器混勻。
(10)42°C溫溫50min ； (11)95°C加熱5min終止反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或_20度冷凍保存。 (12)PCR 擴(kuò)增基因；計(jì)算引物 Tm 值，Pl Tm=62.02, P2 Tm=64.94，在 0.5ml Eppendorf管中按下表建立25 μ I的PCR反應(yīng)體系: PCR反應(yīng)體系
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法，其特征是:步驟(一)(6)中5000rpm室溫離心15分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的周期型馬來絲蟲復(fù)合多價(jià)蛋白疫苗的制備方法，其特征是:步驟(一)(6)中5000rpm室溫離心20分鐘。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK103834687SQ201410064467
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】方政, 王慧, 方浩, 陸施娟, 徐倩, 胡迎青, 童海燕, 徐邦生 申請(qǐng)人:南通大學(xué)