一種水稻轉(zhuǎn)錄因子在改良水稻高產(chǎn)性狀中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻轉(zhuǎn)錄因子在改良水稻高產(chǎn)性狀中的應用，屬于基因工程領域。其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64與水稻轉(zhuǎn)錄因子Os01g60960.1基因融合構建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而提高水稻的產(chǎn)量。對于詳細闡明調(diào)控水稻高產(chǎn)機理有重要的理論價值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，提高水稻的產(chǎn)量，因此在生產(chǎn)實踐中也具有重要意義。
【專利說明】一種水稻轉(zhuǎn)錄因子在改良水稻高產(chǎn)性狀中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1基因的應用。
【背景技術】
[0002]水稻(Oryza sativa L.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是一個重要的功能基因研究的模式植物。與其相關的遺傳學和分子生物學研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達調(diào)控的重要方式。當前水稻增產(chǎn)的研究較依賴于有限的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢正在逐漸減弱，而水稻轉(zhuǎn)基因技術有可能發(fā)掘水稻進一步增產(chǎn)的潛力。
[0003]在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚珠。從分子生物學的角度來說，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個有次序的、選擇性的基因表達過程。而轉(zhuǎn)錄因子在基因表達的精確調(diào)控中起到了關鍵性的作用。
[0004]0s01g60960.1是LBD家族的一員，但是由于LBD基因是新發(fā)現(xiàn)的植物所特有的一個基因家族，有關LOB結構域在高等植物發(fā)育中的確切功能尚不清楚。但是，對已克隆的幾個LBD基因功能的初步分析還是為我們了解其功能提供了部分線索。LOB是第一個分離的屬于LBD基因家族的基因，其在轉(zhuǎn)座子插入引發(fā)的功能喪失的情況下不能觀察到明顯的表型突變，表明LOB在擬南芥的發(fā)育過程中存在一定程度的功能冗余。但以花椰菜病毒的35S強啟動子與LOB編`碼序列構建的融合表達載體轉(zhuǎn)化野生型植株，可觀察到植株矮小、葉片向上卷曲、葉柄和花梗變短、花器官畸形等明顯表型的變化(Shuai et al.,2002)。擬南芥中另一個LBD基因家族成員——AS2，其突變體as2呈現(xiàn)出葉片不對稱發(fā)育或畸形、葉脈發(fā)育不完全等表型，則揭示了部分LBD基因可能參與了高等植物器官的形態(tài)建成(Serrano-Cartagena et al., 1999 ；0ri et al., 2000 ；Sun et al., 2000 ；Semiartiet al.,2001:Xu et al., 2003) ?異位過表達AS2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株出現(xiàn)了較短的初生根、狹小而上卷的子葉、葉片和花萼遠軸面形成毛刺狀增生物、花梗向下彎曲等表型；同時，組織顯微觀察還揭示AS2的過表達干擾了側生器官正常近遠軸極性的建立，導致遠軸面的細胞類型被近軸面的細胞類型部分替代(Lin et al.，2003 ；Nakazawa et al.，2003)。AS2在擬南芥中親緣關系最近的同源基因ASLl (亦稱LBD36)，同樣是LBD基因家族成員，其過表達會引起花和角果下垂的表型(Chalfun-Junior et al.,2005 ；Nakazawa et al., 2003) ?ASLl的功能喪失突變體asll沒有觀察到明顯的異常表型，但asll/as2雙突變體表現(xiàn)出花萼窄小、內(nèi)部花器官暴露、花萼和花瓣向外卷曲、提前開花等突變表型，這表明ASLl、As2同時參與了花器官的發(fā)育并在該階段存在一定的功能冗余(Chalfun-Junior et al.,2005)。
[0005]水稻中克隆的第一個LBD 基因-ARLl (ADVENTITIOUS ROOTLESS I)，或稱
CRLl (CROWN R00TLESS1)，其功能喪失突變表現(xiàn)為不能形成正常的不定根/從生根、生長素敏感性的喪失、根生長的向地性的喪失等表型，但地上部沒有明顯的形態(tài)異常(Liu etal.,2005 ；Inukai et al.，2005)。最近研究也分離了水稻中的一個LBD基因家族成員，初步命名為DHl (DEGENERATED HULL I), dhl突變體呈現(xiàn)穎花的穎殼缺失或穎殼發(fā)育的提前終止、雌雄蕊數(shù)目異常、部分雄性不育等表型；過量表達DHl的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)為植株矮小、節(jié)間和穎花的枝?？s短、葉片向下低垂等表型(李愛宏，2006，私人通訊)。這些結果表明水稻中的LBD基因，與擬南芥相比，在側生器官的發(fā)育方面可能有著更加重要的作用。
[0006]VP64是4個VP16功能域基序融合在一起組成的，是一類增強子。VP16最早在動物病毒基因中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已被廣泛應用到植物中，主要用于植物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究中。轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)的作用大體上可以分成兩種:一種為轉(zhuǎn)錄增強子，另一種為轉(zhuǎn)錄抑制子。當轉(zhuǎn)錄因子和VP16功能域基序融合之后，它就會增強轉(zhuǎn)錄因子的功能，從而在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)更明顯的表型變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種水稻轉(zhuǎn)錄因子在改良水稻高產(chǎn)性狀中的應用。
[0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白為(VP16)4-Linker-0s01g60960.1 ；
[0009]其中，Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成，其序列如SEQ ID N0.9所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白；0s01g60960.1為水稻轉(zhuǎn)錄因子 0s01g60960.1。
[0010]所述水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0011]其中，(VP16)4即 VP64,是由 4 個 VP16 功能域基序(Asp Ala Leu Asp Asp PheAspLeu Asp Met Leu)以Gly Ser兩個氨基酸間隔融合在一起組成的增強子,其序列如SEQID N0.10所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
`[0012]本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。
[0013]所述載體的構建方法如下:
[0014](I)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0s01g60960.1基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物對，其為正向引物 F: 5’ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3’ 和反向引物R:5’-CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3’ ；
[0015](2)以野生日本晴水稻總cDNA為模板，進行PCR獲得0s01g60960.1全序列；
[0016](3)將PCR產(chǎn)物克隆到連接pDONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列；
[0017](4)以雙元表達載體左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubipromoter-VP64_Gateway 表達單兀、35S promoter-asRED 表達單兀和 35S promoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID N0.5所示；
[0018](5)通過LR反應將0s01g60960.1構建到其目地基因的N端融合了 VP64標簽的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得載體ubi:VP64-0s01g60960.1，載體全序列如SEQID N0.6 所示。
[0019]攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York,第 411-463 頁；Geiserson 和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0020]本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。
[0021]本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構建方法，具體為，采用農(nóng)桿菌介導的方法，將前述載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0022]本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因在改良水稻高產(chǎn)性狀。
[0023]本發(fā)明還提供了用于擴增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1基因的引物對，其為正向引物F:5’ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3’ 和反向引物 R:5’ -CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3’ 。
[0024]本發(fā)明還進一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1基因在調(diào)控水稻高產(chǎn)性狀中的應用。
[0025]前述的應用，是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量。
[0026]本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1基因融合構建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到水稻中，從而改良水稻高產(chǎn)性狀，提高水稻的產(chǎn)量。對于詳細闡明調(diào)水稻高產(chǎn)機理具有重要的理論價值，因此在生產(chǎn)實踐中也具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明實施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜；
[0028]圖2為本發(fā)明實施例1中ubi:VP64-0s01g60960.1載體圖譜；
[0029]圖3為本發(fā)明PCR檢測VP64_0s01g60960.1轉(zhuǎn)基因陽性株系，其中WT為野生型水稻 ‘kitaake’，V2590H-24、V2590H-44 為 VP64_0s01g60960.I 轉(zhuǎn)基因水稻株系；
[0030]圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因材料高產(chǎn)性狀的表型比較，其中左邊第一盆WT為野生型水稻‘kitaake’，左邊第二盆V2590H-24、左邊第三盆V2590H-44為轉(zhuǎn)基因水稻株系；
[0031]圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因材料高產(chǎn)性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，其中WT為野生型水稻‘kitaake’，V2590H-24、V2590H-44 為轉(zhuǎn)基因水稻株系。
【具體實施方式】
[0032]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0033]實驗過程中所用到的載體來源:
[0034]pDONER 購自 invitrogen ;
[0035]35S promoter-asRED 中國農(nóng)科院提供；
[0036]ubi promoter-VP64 中國農(nóng)科院提供；
[0037]35S promoter-hyg 中國農(nóng)科院提供；
[0038]ubi:VP64-0s01g60960.1 通過 Gateway 克隆方法構建到 ubi promoter_VP64 載體上;
[0039]工程菌EHA105由中國農(nóng)科院提供。[0040]實施例10s01g60960.1基因的分離和植物表達載體構建
[0041]在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0s01g60960.1基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物，根據(jù)其序列設計 PCR 擴增引物(Fl:5’ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3’和反向引物 Rl:5’ -CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3’)。以野生型日本晴水稻總cDNA為模板，進行PCR獲得0s01g60960.1全序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0042]按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。此過程中包含兩輪PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物(Fl和Rl),而第二輪的模板用第一輪的 PCR 產(chǎn)物，并且引物用完整的 adaptor attB 引物(attB5’ adaptor:5’ -GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3’，attB3’ adaptor:5’-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3’)。將PCR產(chǎn)物克隆到連接pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。通過LR反應將0s01g60960.1構建到nVP64_hyg_asRED (圖1,載體全序列如SEQ IDN0.5所示)上，獲得載體ubi:VP64-0s01g60960.1 (圖2，載體全序列如SEQ ID N0.6 所示)。
[0043]實施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0044]取水稻‘kitaake’成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒之后接種到誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導法將ubi:VP64-0s01g60960.1轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和0.D.值為0.7的農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d,每IOd繼代一次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達根系后煉苗，并計算轉(zhuǎn)化所獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)`移至大田生長。
[0045]其中，誘導培養(yǎng)基配方為:N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2.5mg/L2, 4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5.8~5.9后加入植物凝膠4g/L。
[0046]共培養(yǎng)基配方為:N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2.5mg/L2, 4D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,調(diào)pH至5.2后加入植物凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮)100~ZOOyg/mL。
[0047]篩選培養(yǎng)基配方為:Ν6大量+Β5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2.5mg/L2, 4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5.8~5.9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司)。
[0048]分化培養(yǎng)基配方為:MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0.05mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin (激動素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5.8~5.9后加入植物凝膠4g/L。
[0049]實施例3轉(zhuǎn)基因陽性株系的鑒定
[0050]為了檢測0s01g60960.1基因是否整合至水稻基因組中，分別提取野生型和轉(zhuǎn)基因水稻葉片DNA，在基因兩端的植物表達載體上設計一段引物進行PCR反應，鑒定轉(zhuǎn)基因植株，對PCR產(chǎn)物進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻均擴增出目的條帶(圖3)，而野生型水稻中無此目的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析為正確的目的基因序列，由此確定0s01g60960.1基因已通過農(nóng)桿菌介導的方法插入到水稻基因組中。
[0051]實施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析和考種分析
[0052]將轉(zhuǎn)基因和野生型水稻進行比較，從表型上可以明顯的看出轉(zhuǎn)基因植株比野生型高，并且在花周期上表現(xiàn)出適當晚花(圖4)。通過考種的數(shù)據(jù)分析結果可以明顯的看出轉(zhuǎn)基因水稻的單株產(chǎn)量與野生型相比有明顯的提高(圖5)。其中一個株系野生型的平均單株產(chǎn)量為7.25g，轉(zhuǎn)基因植株的平均單株產(chǎn)量為13.61g。
[0053]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的 基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.一種水稻轉(zhuǎn)錄因子在改良水稻高產(chǎn)性狀中的應用，其特征在于所述水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一種用于改良水稻高產(chǎn)性狀的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白(VP16)4-Linker-0s01g60960.1，其中，Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成；其序列如SEQ ID N0.9所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.如權利要求2所述的一種用于改良水稻高產(chǎn)性狀的融合蛋白，其特征在于，所述VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白；VP16的氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
4.含有編碼權利要求2所述融合蛋白的基因的載體，其特征在于，所述載體nVP64-hyg-asRED 的全序列如 SEQ ID N0.5 所示。
5.如權利要求4所述載體的構建方法如下: (O在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0s01g60960.1基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物對，其為正向引物 F: 5’ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3’ 和反向引物 R:5’-CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3’ ； (2)以野生日本晴水稻總cDNA為模板，進行PCR獲得0s01g60960.1全序列； (3)將PCR產(chǎn)物克隆到連接pDONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列； (4)以雙元表達載體左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubipromoter-VP64-Gateway `表達單兀、35S promoter-asRED 表達單兀和 35Spromoter_hyg 表達單元與之融合構建，得到載體nVP64-hyg-asRED的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示； (5)通過LR反應將0s01g60960.1構建到其目地基因的N端融合了 VP64標簽的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得載體ubi:VP64-0s01g60960.1，載體核苷酸序列如SEQID N0.6 所示。
6.一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導的方法，將載體nVP64-hyg-asRED轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選、分化、生根、轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
7.一種用于擴增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s01g60960.1基因的引物對，其特征在于:其為正向引物F:5’ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3’ 和反向引物 R:5’ -CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3’ 。
【文檔編號】C07K19/00GK103820480SQ201410083584
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月9日 優(yōu)先權日:2014年3月9日
【發(fā)明者】邊鳴鏑, 左澤乘, 周婷婷, 石武良, 姜文洙, 周連霞, 都興林, 楊振明, 陳正道, 關可興 申請人:吉林大學