專利名稱：一種克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克隆水稻基因的方法，具體地說，涉及一種克隆水稻復(fù)雜性狀相 關(guān)聯(lián)基因的方法。
背景技術(shù)：
隨著越來越多的植物基因組測(cè)序的完成，從大量的基因組數(shù)據(jù)中克隆和挖掘相關(guān) 功能基因成為了人們當(dāng)前的重要工作。農(nóng)作物農(nóng)藝性狀大部分為復(fù)雜性狀，如產(chǎn)量、稻米品 質(zhì)、千粒重、花期、穗長、株高和抗旱性等，都由多個(gè)基因共同作用來控制，且每一個(gè)基因的 貢獻(xiàn)都比較小。針對(duì)這部分性狀的研究，目前多半采用全基因組數(shù)量性狀位點(diǎn)作圖方法來 尋找基因組中對(duì)該性狀有貢獻(xiàn)的位點(diǎn)，但要進(jìn)一步走到克隆相關(guān)基因，卻還要面臨難以逾 越的障礙，包括精細(xì)定位、數(shù)量性狀的鑒定和單個(gè)基因無法表現(xiàn)等。在自然界長期進(jìn)化中，每一種植物都擁有豐富的生態(tài)表現(xiàn)型，從這些生態(tài)型中挖 掘有利基因成為當(dāng)前分子生物學(xué)的重要內(nèi)容。目前人們已經(jīng)開發(fā)了許多分子生物技術(shù)手 段，利用它們產(chǎn)生的標(biāo)記來表現(xiàn)物種的多態(tài)性。例如簡單重復(fù)序列(SSR)、擴(kuò)增片段長度多 態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)、插入缺失標(biāo)記QnDel)和單核苷酸多態(tài)性 (SNP)等，但這些技術(shù)手段仍難以具體到控制植物發(fā)育的基因上?；蚪M測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促使多個(gè)植物的基因組測(cè)序工作的完成，針對(duì)基因組序列 已經(jīng)知曉的情況下，人們開發(fā)了一些加快基因組功能研究的新技術(shù)。定向誘導(dǎo)基因組局部 突變(TILLING)方法可以直接用來發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)突變?cè)斐傻幕蜃儺?HenikoffS，Till BJ, Comai L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiology. 2004，135(2) :630-636.)，也被用來了解自然群體中個(gè)體的多態(tài)性，被稱為 EC0-TILLING。但從當(dāng)前的研究報(bào)告來看，其多態(tài)性僅僅是用來進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證的基礎(chǔ)，然后利 用序列分析該位點(diǎn)的多態(tài)性，是單核苷酸多態(tài)性技術(shù)的一種延伸。到目前為止，唯一利用該 技術(shù)在葫蘆植物中尋找到一個(gè)簡單遺傳的抗病基因(Nieto C，Piron F, Dalmais M，Marco CF, Moriones E, Gome ζ -Gu ill amon ML, Truniger V, Gomez P, Garcia—Mas J, Aranda MA, Bendahmane A.EcoTILLING for the identification of allelic variants ofmelon eIF4E, a factor that controls virus susceptibility. BMC Plant Biology. 2007. 7 34.)，而利用EC0-TILLING技術(shù)克隆復(fù)雜性狀相關(guān)的功能基因是目前需要克服的關(guān)鍵技術(shù) 難題。另外，人們也發(fā)展了一些分析方法試圖解釋復(fù)雜性狀，從而將生物學(xué)標(biāo)記與形態(tài) 性狀聯(lián)系起來。盡管這些技術(shù)手段能夠從一些方面反映這些標(biāo)記在自然狀態(tài)中與某些形態(tài) 性狀相關(guān)聯(lián)，但這些標(biāo)記目前多是基因組中隨機(jī)存在的標(biāo)記，到定位到具體的相關(guān)基因還 有相當(dāng)長的距離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效、低成本、快速克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)基因的 方法。本發(fā)明人針對(duì)已經(jīng)完成測(cè)序的基因組植物，利用EC0-TILLING分析方法，直接將 CEL I酶酶切后的產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，其產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉(zhuǎn)化為遺傳學(xué)標(biāo)記， 并對(duì)自然群體的復(fù)雜性狀進(jìn)行連鎖不平衡分析，來尋找并克隆與復(fù)雜性狀相關(guān)的基因。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明所述克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)基因的方法，其采用以 基因組序列已公開的水稻自然群體為基礎(chǔ)，采集水稻品種間復(fù)雜性狀數(shù)據(jù)，以這些材料的 DNA為模板在瓊脂糖電泳上進(jìn)行EC0-TILLING方法分析，將產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉(zhuǎn)化為遺傳學(xué) 標(biāo)記，然后利用關(guān)聯(lián)分析軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，確定與性狀相關(guān)聯(lián)的基因并克隆基因。本發(fā)明選擇已經(jīng)完成了基因組測(cè)序并已公開的水稻自然群體，能夠方便地提取基 因組序列。所述復(fù)雜性數(shù)據(jù)是該植物在自然栽培條件下或人工模擬自然條件下所采集得到 的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)，如產(chǎn)量、品質(zhì)、千粒重、花期、株高、穗長和抗旱性等，這些數(shù)據(jù)在個(gè)體間呈 連續(xù)分布。所述的EC0-TILLING方法是抽提自然群體中個(gè)體基因組DNA，根據(jù)基因組注釋數(shù) 據(jù)下載各基因家族序列，將研究的目標(biāo)基因家族設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，然后以一個(gè)常規(guī)品種材 料為對(duì)照品種進(jìn)行PCR產(chǎn)物兩兩混合，經(jīng)過變性復(fù)性使雙鏈雜交，最后使用芹菜汁中抽提 純化后的CELI酶對(duì)錯(cuò)配產(chǎn)生的拱環(huán)進(jìn)行酶切，產(chǎn)生不同大小的片段。所述的遺傳學(xué)標(biāo)記是經(jīng)過CEL I酶酶切后產(chǎn)生的多態(tài)性條帶。CEL I酶酶切后的產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳，其產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉(zhuǎn)化為遺傳 學(xué)標(biāo)記。由于自然群體中個(gè)體之間基因組序列有差異，EC0-TILLING方法就可以將這種差 異在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)出數(shù)量不同或大小不同的DNA條帶。以對(duì)照材料為帶型0，將產(chǎn)生的 不同類型的條帶依次進(jìn)行編號(hào)，作為后面分析用的標(biāo)記，具體見圖1。所述的關(guān)聯(lián)分析軟件是指按照連鎖不平衡分析原理設(shè)計(jì)的軟件，用來檢測(cè)不同位 點(diǎn)等位基因間非隨機(jī)連鎖程度。水稻栽培品種主要有秈稻和粳稻兩種亞型，其群體結(jié)構(gòu)q 值為2，可以直接使用免費(fèi)開放使用的軟件有TASSEL軟件(Http//www. maizeRenetics. net)禾口 EINGENSTART 軟件(http //genepath. med. harvard, edu/ reich/Software. htm) 來分析與性狀相關(guān)聯(lián)的基因。本發(fā)明克隆基因采用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行，例如Sambrook等編著的《分子克 隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。先抽提所采集性狀材料的RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)換 成第一鏈cDNA，根據(jù)該基因的基因組注釋數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，采用保真度高的DNA聚合酶以第 一鏈cDNA為模板將基因的全長擴(kuò)增出來，從而得到該基因。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)基因的方法，能夠高效、低成本、快 速地發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)的基因。傳統(tǒng)使用的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)作圖方法克隆相關(guān)基 因，雖能夠找到相關(guān)染色體區(qū)段，但仍需構(gòu)建更大的遺傳群體進(jìn)行精細(xì)定位，并對(duì)相關(guān)單株 進(jìn)行性狀鑒定，精細(xì)定位后，還需對(duì)QTL區(qū)間候選基因逐個(gè)進(jìn)行功能鑒定，工作量大，成本
4高，周期長。由于復(fù)雜性狀由多個(gè)基因共同控制，每一個(gè)基因的效應(yīng)較低，精細(xì)定位準(zhǔn)確鑒 定單株十分困難。例如水稻的抗旱性鑒定，單個(gè)基因的替換常使水稻的抗旱性喪失。而利 用本發(fā)明的方法，只需要將自然群體中所收集的各種生態(tài)型的品種進(jìn)行相關(guān)的形態(tài)性狀的 調(diào)查，然后對(duì)不同基因家族進(jìn)行EC0-TILLING分析，利用TASSEL和EINGENSTART軟件分析 相關(guān)基因，并從相應(yīng)的生態(tài)型品種中進(jìn)行克隆。這樣免去構(gòu)建需要龐大工作量的遺傳群體 和精細(xì)定位，也不用考慮遺傳群體中單個(gè)個(gè)體的性狀丟失，明顯縮短基因克隆時(shí)間，降低成 本。本發(fā)明方法對(duì)加快植物復(fù)雜性狀相關(guān)基因的克隆具有重要意義。本發(fā)明還可以對(duì)microRNA—類基因進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)該方法也完全適用于以 基因組序列為基礎(chǔ)的非蛋白質(zhì)編碼基因的克隆和功能發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)基因的方法也同樣適用于其他農(nóng)作物或植物的 復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)基因的克隆。


圖1為從芹菜汁中提取的CEL I酶在SDS-PAGE上電泳圖。1，D2000標(biāo)記；2_8，粗 提的CEL I酶稀釋5倍后分別上樣4-10 μ 1。圖2為所收集的水稻抗旱品種的EC0-TILLING瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖2Α為CEL I酶切前PCR電泳結(jié)果，圖2Β為CEL I酶切后電泳結(jié)果。圖2Β下方的數(shù)字代表該帶型所轉(zhuǎn) 化的標(biāo)記號(hào)。圖3-1、3-2、3-3、3_4為所鑒定的4個(gè)與抗旱相關(guān)的基因在5個(gè)不同品種在干旱脅 迫處理后相對(duì)表達(dá)量結(jié)果?！扒啊北硎疚催M(jìn)行處理直接取樣，“中”表示20% PEG 6000處理 3小時(shí)取樣，“后”表示脅迫后復(fù)水8小時(shí)后取樣抽提RNA，然后分別對(duì)這4個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí) 熒光定量PCR。其中，242代表超級(jí)旱稻2-9，195代表SALAK，220代表頂30358，冊(cè)3代表滬 旱3號(hào)，Sl代表深水稻1。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。下列實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下面實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1用本發(fā)明的方法克隆與水稻抗旱性相關(guān)聯(lián)的基因水稻的抗旱性是典型的復(fù)雜性狀，有多個(gè)基因控制并與環(huán)境協(xié)作，通過QTL定位 作圖方法發(fā)現(xiàn)了 200多個(gè)位點(diǎn)控制水稻抗旱性。收集了國內(nèi)外150份各種抗旱品種，在人 工抗旱鑒定設(shè)施上對(duì)這些品種進(jìn)行抗旱性狀的鑒定并克隆相關(guān)基因。1.水稻品種田間試驗(yàn)及性狀調(diào)查表型試驗(yàn)在田間梯度水分鑒定島上進(jìn)行。所有供試品種種子(150種品種)浸種催 芽至露白后播種育秧，并按正常田間管理方式插秧，單行種植。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3重復(fù)， 種植2行，每行18株，按行株距20cmX 20cm種植。試驗(yàn)于5月沈日播種，6月23日移栽， 7月31號(hào)開始干旱脅迫，8月31號(hào)恢復(fù)灌水?？疾旎巨r(nóng)藝性狀、抗旱指數(shù)和抗旱級(jí)別。
抗旱指數(shù)=(待測(cè)品種干旱脅迫處理產(chǎn)量/待測(cè)品種未干旱脅迫處理處 理)X (對(duì)照品種未干旱脅迫處理產(chǎn)量/對(duì)照品種脅迫處理產(chǎn)量)。其抗旱級(jí)別分為1-9 級(jí)，1級(jí)表示抗旱指數(shù)> 1. 30，3級(jí)為1. 00-1. 29，5級(jí)為0. 90-0. 99，7級(jí)為0. 70-0. 89，9級(jí) 為抗旱指數(shù)< 0. 69。2.水稻DNA抽提按照CTAB 法(Cetyl trie thy lammonium bromide)提取水稻葉片總 DNA。DNA 沉 淀物用lmol/L NaCl溶解，并用RNase A過夜處理；用95%乙醇、76%乙醇、95%乙醇依次 處理，純化DNA ；TE溶解DNA，-20°C保存。對(duì)所選材料進(jìn)行DNA濃度測(cè)定，并根據(jù)PCR反應(yīng) 體系，統(tǒng)一稀釋到約20ng/ul。3. CEL I酶的粗提試驗(yàn)用芹菜由超市購得。取芹菜鮮嫩莖，去根莖，洗凈，擦干。榨汁機(jī)榨取芹菜汁 液并去除殘?jiān)尤隑ufferA，2600g離心20min，棄沉淀。取上清緩慢加入固體(NH4) 2S04粉 末至濃度為25%，并輕輕攪拌30min，13000-16200g離心45min，棄沉淀。取上清緩慢加入 固體(NH4) 2S04粉末至濃度為80%，并輕輕攪拌30min，13000-16200g離心1. 5h，棄上清。加 入BufTerB并懸浮沉淀。BufferB透析過夜，前三次每隔Ih換一次透析液，最后一次透析過 夜。最后將提取物分裝儲(chǔ)存于_80°C備用。BufferA IOOmmo 1/L Tris-HCl, pH 7. 7，100 μ mol/L PMSF (苯甲基磺酰氟)。BufferB IOOmmol/L Tris-HCl, pH 7. 7,0. 5mol/L KC1，100 μ mol/LPMSF。4. EC0-TILLING技術(shù)的PCR反應(yīng)體系及后期處理從水稻基因組數(shù)據(jù)庫中下載轉(zhuǎn)錄因子AP2/EREBP、heat shocktranscription factor (HSF)、GROWTH-RE⑶LATING FACTOR(GRF)、Alfin-like、CCAAT-HAP3 和 ZIM 家族 220 個(gè)基因啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)并合成引物。其20yL PCR反應(yīng)體系2yL 10X反應(yīng)緩沖液，IyL 2匪ol/μ LdNTP混和液， 1 μ L 10ymol/y L F 弓丨物，1 μ LlO μ mol/μ L R 弓丨物，IU ExTaq(購自 Takara 公司)DNA 聚 合酶，4 μ L 20ng/ul DNA 模板，11 μ LddH2O。PCR 擴(kuò)增程序-MV 4min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ； 10°C保存。擴(kuò)增時(shí)根據(jù)不同引物的Tm值調(diào)節(jié)退火溫度，擴(kuò)增反應(yīng)在Hykiid MBS 0. 2S PCR 儀上進(jìn)行。對(duì)照品種為日本晴，與其它品種兩兩混合。雜交程序95°C IOmin ；95°C降至 850C (-20C /s) ；85°C 降至 25°C (_0. 1°C /s) ；10°C保存。雜交反應(yīng)在 Hykiid MBS 0. 2S PCR 儀上進(jìn)行。CEL I酶切體系及反應(yīng)條件10 μ L雜交PCR產(chǎn)物，3 μ L 10Χ反應(yīng)緩沖液 (IOOmmol/L Tris-HCl,pH 7. 7,0. 5mol/L KCl)，1 μ L CEL 1,16μ L ddH20?；靹蚝笾糜赑CR 儀中45°C反應(yīng)30min。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠分離。5. EC0-TASSEL分析與抗旱相關(guān)聯(lián)基因?qū)㈦娪痉蛛x開的電泳條帶按照各種帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，帶型統(tǒng)計(jì)方法按照?qǐng)D2所 示，對(duì)每一個(gè)品種進(jìn)行標(biāo)記，然后將這些數(shù)據(jù)和抗旱級(jí)別數(shù)據(jù)按照TASSEL(Http://WWW. maizegenetics. net)軟件要求輸入，分別對(duì)轉(zhuǎn)錄因子 AP2/EREBP、HSF、GRF、Alfin-like, CCAAT-HAP3和ZIM家族220個(gè)基因啟動(dòng)子多態(tài)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以P < 0. 001為顯著相關(guān)，具體結(jié)果見表1。表1干旱處理下轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子與抗旱性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)基因的方法，其特征在于，其采用以基因組序列已公 開的水稻自然群體為基礎(chǔ)，采集水稻品種間復(fù)雜性狀數(shù)據(jù)，以這些材料的DNA為模板在瓊 脂糖電泳上進(jìn)行EC0-TILLING方法分析，將產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉(zhuǎn)化為遺傳學(xué)標(biāo)記，然后利 用關(guān)聯(lián)分析軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，確定與性狀相關(guān)聯(lián)的基因并克隆基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的EC0-TILLING方法是抽提自然群體 中個(gè)體基因組DNA，根據(jù)基因組注釋數(shù)據(jù)下載各基因家族序列，將研究的目標(biāo)基因家族設(shè)計(jì) 引物進(jìn)行PCR，然后以一個(gè)常規(guī)品種材料為對(duì)照品種，進(jìn)行PCR產(chǎn)物兩兩混合，經(jīng)過變性復(fù) 性使雙鏈雜交，最后使用芹菜汁中抽提純化后的CEL I酶對(duì)錯(cuò)配產(chǎn)生的拱環(huán)進(jìn)行酶切，產(chǎn)生 不同大小的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的遺傳學(xué)標(biāo)記是經(jīng)過CELI酶酶切 后產(chǎn)生的多態(tài)性條帶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，CELI酶酶切后在3%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述復(fù)雜性數(shù)據(jù)是在自然栽培 條件下或人工模擬自然條件下所采集得到的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)產(chǎn)量、品質(zhì)、千粒重、花期、株 高、穗長和抗旱性，這些數(shù)據(jù)在個(gè)體間呈連續(xù)分布。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述的關(guān)聯(lián)分析軟件為TASSEL 軟件和EINGENSTART軟件。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述對(duì)照品種采用水稻日本晴。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)基因的方法。其采用以基因組序列已公開的水稻自然群體為基礎(chǔ)，采集水稻品種間復(fù)雜性狀數(shù)據(jù)，以這些材料的DNA為模板在瓊脂糖電泳上進(jìn)行ECO-TILLING方法分析，將產(chǎn)生的多態(tài)性條帶轉(zhuǎn)化為遺傳學(xué)標(biāo)記，然后利用關(guān)聯(lián)分析軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，確定與性狀相關(guān)聯(lián)的基因并克隆基因。本發(fā)明的克隆水稻復(fù)雜性狀相關(guān)基因的方法，能夠高效、低成本、快速地發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)的基因。本發(fā)明的方法對(duì)加快植物復(fù)雜性狀相關(guān)基因的克隆具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102094001SQ200910200208
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者余舜武, 吳金紅, 廖鳳賢, 羅利軍, 黎佳佳 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心