殺鱗翅目昆蟲的新型vip3-like基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)害蟲，尤其是對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重的鱗翅目害蟲的材料和方法，公開了一種從蘇云金桿芽胞桿菌野生菌株BtHS66中分離克隆得到一個(gè)新型營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白基因vip3-like，該基因編碼毒素蛋白由942個(gè)氨基酸殘基組成，其與現(xiàn)有公開的蛋白質(zhì)序列同源性不超過30%。新型Vip3-like蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲小菜蛾表現(xiàn)出高效的殺蟲活性，新型vip3-like基因可以用于構(gòu)建工程菌株或者培育轉(zhuǎn)基因作物，不僅可以拓寬殺蟲譜，還可以延緩害蟲對(duì)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的Cry1和Cry2蛋白產(chǎn)生抗性。
【專利說明】殺鱗翅目昆蟲的新型viP3-like基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]在本發(fā)明屬生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，亦屬于微生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的新型營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白基因vip3-like的鑒定和克隆，涉及vip3~like基因在異源宿主細(xì)胞(工程菌)中的誘導(dǎo)表達(dá)，涉及Vip-1ike蛋白純化和對(duì)鱗翅目昆蟲殺蟲活性的測(cè)定，以及該毒素蛋白在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是迄今為止最安全和應(yīng)用最為廣泛殺蟲細(xì)菌。百年來(lái)的應(yīng)用和研究表明，Bt殺蟲的主要活性物質(zhì)殺蟲晶體蛋白對(duì)各種昆蟲、線蟲、原生動(dòng)物和癌細(xì)胞有生物活性(Schn印f E., Crickmore N., Rie J.V.,Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., and Dean D.H., 1998，Bacillusthuringiensis and its pesticidal crystal proteins, Microbiol.Mo 1.Biol.Rev.,62: 3: 775-806)。近年來(lái)，編碼殺蟲晶體蛋白的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入少數(shù)重要的農(nóng)作物中而植物自身能夠持續(xù)產(chǎn)生抗蟲蛋白防治農(nóng)業(yè)害蟲，如轉(zhuǎn)Si基因抗蟲棉，在美國(guó)和中國(guó)等國(guó)家獲得了大面積的種植，獲得了良好的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)效益。
[0003]在我國(guó)轉(zhuǎn)價(jià)殺蟲基因抗蟲棉曾經(jīng)力挽狂瀾，挽救了棉花種植業(yè)。但正如多年使用同一種農(nóng)藥控制害蟲會(huì)產(chǎn)生抗藥性，長(zhǎng)期大面積種植同一種抗蟲轉(zhuǎn)基因作物也可能導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生相應(yīng)的抗性。目前抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲基因主要是crylAb、cryIAc, cry2A及其同源基因，大量研究表明CrylAc、CrylFa和CrylJa等蛋白結(jié)合相同或相似的受體蛋白，容易產(chǎn)生交互抗性。CryIA和Cry2A蛋白不競(jìng)爭(zhēng)同一受體蛋白，研究表明它們也可能因?yàn)榭剐詸C(jī)制復(fù)雜性而產(chǎn)生交互抗性(Hernandez CS, Ferre J, Common receptorfor Bacillus thuringiensis toxins CrylAcj CrylFaj and CrylJa in Helicoverpaarmigera， Helicoverpa zea， and Spodoptera exigua.Appl Environ Microbiol 71
(9):5627-5629, 2005;Jurat-Fuentes JLj Gould FLj Adang MJj Dual resistance toBacillus thuringiensis CrylAc and Cry2Aa toxins in Heliothis virescens suggestsmultiple mechanisms of resistance.Appl Environ Microbiol 69 (10):5898-5906，2003)。當(dāng)前，商業(yè)化抗蟲轉(zhuǎn)基因作物絕大多數(shù)利用CirJA和基因，農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)Cit殺蟲蛋白抗性風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)嚴(yán)重威脅轉(zhuǎn)基因作物的安全和推廣應(yīng)用。為了解決目前大量單一使用CrylA和Cry2A等同源性殺蟲蛋白帶來(lái)的抗性風(fēng)險(xiǎn),抗蟲作物育種亟需開發(fā)與Cry蛋白基因有著不同殺蟲機(jī)制的新型殺蟲基因。
[0004] Vip蛋白在Bt營(yíng)養(yǎng)期生長(zhǎng)階段開始分泌，它們不形成蛋白晶體，和蛋白晶體在進(jìn)化上沒有同源性。Vip的殺蟲活性很高，達(dá)到了納克級(jí)水平，為一類新型殺蟲蛋白，被認(rèn)為是第二代生物殺蟲劑。最早在價(jià)菌株中發(fā)現(xiàn)的Vip是Estruch等(1996)發(fā)現(xiàn)的Vip3Aa和Vip3Ab。Vip在細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)期生長(zhǎng)階段就開始分泌，但不形成蛋白晶體，這一特性與殺蟲晶體蛋白在芽孢形成的同時(shí)伴孢產(chǎn)生完全不同(Estruch JJ, Warren Gff, Mullins MA,Nye GJ, Craig JA, andKoziel MG, 1996, Vip3A, a novel Bacillus thuringiensisvegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities againstlepidopteran insects, Proc Natl Acad Sci USA, 93 (11):5389-5394.)? Vip 與 Cry蛋白相比，Vip的殺蟲譜更廣，對(duì)某些農(nóng)業(yè)害蟲的活性更強(qiáng)。Vipl和Vip2共同作用，對(duì)鞘翅目螢葉甲科昆蟲具有納克級(jí)特異性殺蟲活性，Vip3A不僅對(duì)鱗翅目昆蟲具有廣譜殺蟲活性，而且對(duì)一些抗沒?殺蟲晶體蛋白的昆蟲，如小地老虎(blackcutworm, BCff)有特效。生測(cè)結(jié)果表明:Vip3Aa對(duì)BCW的毒性要比CrylAc高260倍，也達(dá)到了納克級(jí)水平(陳建武等，2002)。
[0005]基于Vip在農(nóng)作物蟲害防治和抗性控制管理中的重要意義，各國(guó)科學(xué)家爭(zhēng)相發(fā)展各種方法發(fā)掘基因資源。Estruch等在1996年利用分子雜交的方法發(fā)現(xiàn)了 vip3A基因，檢測(cè)率為15%。1999年，Rice利用PCR技術(shù)對(duì)^>24基因的存在進(jìn)行檢測(cè)，在對(duì)125株Si菌株進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其中29株含有基因，檢測(cè)率上升到23%。至今，已經(jīng)有100多個(gè)基因被鑒定分離出來(lái)，1998年Crickmore等提出以編碼Vip蛋白質(zhì)氨基酸序列的同源性作為分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)Vip進(jìn)行分類(Crickmore et al, 1998),并將目前已經(jīng)克隆的基因在第一分類上分為 4 類:和 (Crickmore N, ZeiglerDR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, and Dean DH, 1998,Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystalproteins, Microbiol Mol Biol Rev, 62(3):807-813.；http://www.lifesc1.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/價(jià)/index, html)。
[0006]Vip3蛋白對(duì)多種夜蛾科害蟲，尤其是小地老虎有很高殺蟲活性，而且Vip蛋白與Cry蛋白共同作用還能表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，對(duì)一些可能對(duì)殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生抗性的害蟲具有高效的毒殺作用(蔡啟良，劉子鐸，孫明，喻子牛，蘇云金芽胞桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip與Cry蛋白的協(xié)同作用.微生物學(xué)通報(bào)(05):43-48, 2003)。最為重要的是Vip蛋白殺蟲機(jī)制不同于Cry蛋白，Vip蛋白和Cry蛋白之間難以產(chǎn)生交互抗性，因此轉(zhuǎn)vip基因植物研究受到了科學(xué)家的青睞，并已有不少成功的報(bào)道和專利(Zhu C，Ruan L, PengD, Yu Z, Sun M, Vegetative insecticidal protein enhancing the toxicity ofBacillus thuringiensis subsp kurstaki against Spodoptera exigua.Lett ApplMicrobiol 42 (2):109-114, 2006)。到目前為止，已經(jīng)利用基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因棉花等多種轉(zhuǎn)基因作物。麥考根(Mycogen)和先正達(dá)(Syngenta)等國(guó)外生物科技公司已成功地將Vip3A導(dǎo)入玉米、大豆、棉花和煙草等重要的農(nóng)作物中，這些高效多價(jià)抗蟲轉(zhuǎn)基因作物不僅拓寬了抗蟲譜，同時(shí)也延緩了害蟲抗性的產(chǎn)生。在國(guó)家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)的資助下，我國(guó)也開展了轉(zhuǎn)基因作物相關(guān)研究。浙江大學(xué)沈志成教授課題組將vip3A和crjdAb基因融合導(dǎo)入到我國(guó)最重要的糧食作物水稻中，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)二化螟和稻縱卷葉螟都有抗性(2006，中國(guó)專利，CN1818067A)。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所與山西省農(nóng)科院棉花研究所等單位聯(lián)合進(jìn)行轉(zhuǎn)的棉花的培育(Wu J, TianY, Development of insect-resistant transgenic cotton with chimeric TVip3Aaccumulating in chloroplasts.Methods Mol Biol 958:247-258， 2013; Wu J, Luo X,Zhang X, Shi Y, Tian Y, Development of insect-resistant transgenic cotton withchimeric TVip3A* accumulating in chloroplasts.Transgenic Res 20 (5):963-973,2011)。另外，轉(zhuǎn)基因作物安全研究也在國(guó)內(nèi)外廣泛開展，發(fā)現(xiàn)其對(duì)環(huán)境生物和人類健康均無(wú)明顯的影響，可以安全地用于農(nóng)作物害蟲的控制(Brake J, Faust M, Stein J,Evaluation of transgenic hybrid corn (VIP3A) in broiler chickens.Poult Sci 84
(3):503-512, 2005 ；Peng D, Chen S, Ruan L, Li L, Yu Z, Sun M, Safety assessmentof transgenic Bacillus thuringiensis with VIP insecticidal protein gene byfeeding studies.0rganization 83, 2007; Raybould A, Vlachos D, Non-targetorganism effects tests on Vip3A and their application to the ecological riskassessment for cultivation of MIR162 maize.Transgenic Res 20 (3):599-611,2011)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要內(nèi)容是從蘇云金芽胞桿菌野生菌Si HS66中克隆和體外表達(dá)了一種對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲有毒殺作用的新型vip-like基因。該新型vip-like基因在大腸桿菌細(xì)胞(工程菌)中的誘導(dǎo)表達(dá)，并成功將目標(biāo)蛋白的分離純化，并測(cè)試其對(duì)鱗翅目昆蟲殺蟲活性，進(jìn)一步明確新型vip-like基因在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供了一種蘇云金芽胞桿菌新型噸7殺蟲基因序列，具有如SQE NO I所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明提供了一種對(duì)鱗翅目昆蟲有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其特征是由權(quán)利要求1的基因序列所編碼，具有如SQE NO 2所不的氣基酸序列。
[0010]本發(fā)明提供了一種 制備權(quán)利要求1所述的ViP基因的方法。
[0011]本發(fā)明提供了一種制備權(quán)利要求1所述的vip基因的工程菌株pQEvip3的方法。
[0012]本發(fā)明還提供一種利用工程菌株pQEvip3表達(dá)該新型Vip蛋白的方法 本發(fā)明還提供一種制備該ViP蛋白及以小菜蛾為靶標(biāo)昆蟲進(jìn)行生物測(cè)定的方法。
[0013]本發(fā)明所述基因所編碼的殺蟲活性蛋白對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有很強(qiáng)的毒殺活性，可以制成各種生物殺蟲劑。該vip基因可以用于構(gòu)建工程菌株或者培育轉(zhuǎn)基因作物，對(duì)人畜安全，可降低化學(xué)農(nóng)藥的使用，對(duì)環(huán)境友好，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案:
菌株Si HS66是從海南省吊羅山原始熱帶雨林區(qū)采集的土壤樣品中篩選分離獲得，其伴胞晶體蛋白表現(xiàn)出很強(qiáng)的殺鱗翅目昆蟲毒性。然后對(duì)HS66伴胞晶體蛋白進(jìn)行掃描電鏡觀察、SDS-PAGE電泳分析，以及質(zhì)粒脈沖場(chǎng)電泳分析，基本確定HS66是與標(biāo)準(zhǔn)菌株HDl和HD73不同的殺鱗翅目昆蟲的新型Si菌株。為了明確HS66含有的殺蟲基因，第二代測(cè)序技太I(xiàn)llumina用于HS66基因組草圖測(cè)定。Illumina測(cè)序獲得了 206個(gè)scaffold,然后利用本地沒?毒素蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和本地blast軟件進(jìn)行cry、cyt和vip等毒素蛋白基因的鑒定。驚喜的發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型的vip基因，其ORF大小為2，832bp，編碼943個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與現(xiàn)有的Vip3Ad蛋白同源性最高(27%)。然后利用PCR技術(shù)克隆該新型vip基因，并插入到大腸桿菌表達(dá)載體pQE_30a，在宿主細(xì)胞E.coli M15中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。表達(dá)蛋白對(duì)二齡小菜蛾幼蟲表現(xiàn)出很高的殺蟲活性，進(jìn)一步明確了該vip基因可以用于生物農(nóng)藥的創(chuàng)制、工程菌株的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的培育，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的生物防控。
[0015]具體技術(shù)方法如下:
1.菌株沒i HS66的篩選與鑒定土壤樣品采集:土壤采樣時(shí)間選擇夏秋季節(jié)(5月-10月)，選擇吊羅山向陽(yáng)坡，為了增加獲取新菌株的概率，采樣點(diǎn)盡量選擇植被保護(hù)完整、生態(tài)環(huán)境沒有人為干預(yù)少、土壤腐殖質(zhì)豐富的地方最佳。Si菌株篩選采用醋酸鈉-溫度篩選法，稱取5g左右土壤放入20ml BPA(牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%)培養(yǎng)基中，充分振蕩，30°C搖床培養(yǎng)4-5h，75°C水浴151^11，取11111上清稀釋至10-3、10-4和10-5，各吸取20(^1^均勻涂布于NB ((牛肉膏
0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉3.4%)培養(yǎng)平板，30°C倒置培養(yǎng)3d，挑取形態(tài)各異的單菌落劃平板。芽孢桿菌培養(yǎng)3-5天形成芽孢后，進(jìn)一步利用石炭酸復(fù)紅染色和光學(xué)顯微鏡分離株的是否含有伴胞晶體蛋白，光學(xué)顯微鏡下觀察到無(wú)色芽孢為芽孢桿菌，產(chǎn)生伴胞晶體的芽孢桿菌認(rèn)定為Si菌株。然后進(jìn)一步用電子顯微鏡觀察伴胞晶體蛋白形狀(圖1)。
[0016]為了明確篩選得到的野生價(jià)菌株的殺蟲活性，以小菜蛾二齡幼蟲作為靶標(biāo)昆蟲進(jìn)行生物測(cè)定，篩選獲得I株Si菌株對(duì)小菜蛾幼蟲表現(xiàn)出很好的殺蟲效果，命名為SiHS66。為了進(jìn)一步鑒定該Si菌株是否為新型Si菌株，利用脈沖場(chǎng)瓊脂糖電泳(PFGE)來(lái)分析其大質(zhì)粒數(shù)量和分子量和SDS-PAGE電泳分析其伴胞晶體帶型，發(fā)現(xiàn)Si HS66與標(biāo)準(zhǔn)菌株差別明顯(圖1，2)。
[0017]2.菌株價(jià)HS66基因組序列測(cè)定
提取沒i HS66基因組DNA，檢測(cè)合格的基因組DNA樣品用來(lái)構(gòu)建文庫(kù):首先采用超聲法Covaris或者Bioruptor將大片段DNA (如基因組DNA、BAC或長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物)隨機(jī)打斷并產(chǎn)生主帶小于或等于800 bp的一系列DNA片段,然后用T4 DNA Polymerase、Klenow DNAPolymerase和T4 PNK將打斷形成的粘性末端修復(fù)成平末端，再通過3’端加堿基“A”，使得DNA片段能與3’端帶有 “T”堿基的特殊接頭連接，用電泳法選擇需回收的目的片段連接產(chǎn)物，再使用PCR技術(shù)擴(kuò)增兩端帶有接頭的DNA片段；最后，用合格的文庫(kù)進(jìn)行cluster制備和測(cè)序(圖3)。
[0018]3.Bt HS66基因組序列分析和新型vip基因鑒定
用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)分離的特異Si菌株基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得序列使用軟件ABySS進(jìn)行深度組裝形成若干scaffolds或contigs。在ncbi_blast_2.2.27序列比對(duì)平臺(tái)下，進(jìn)行序列相似性分析，確定相似基因組序列，依此作為新測(cè)基因組拼接的依據(jù)。利用DIYA基因組自動(dòng)拼接工具中的拼接子程序diya_assemble_pseudocontig.pi,分別對(duì)照已知基因組進(jìn)行組裝獲得基因組草圖。利用GLIMMER和MetaGeneMark工具，對(duì)基因組進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)和可能的編碼基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用KEGG automatic annotation server(KAAS)對(duì)前面預(yù)測(cè)得到的基因進(jìn)行功能注釋。同時(shí)進(jìn)一步開發(fā)構(gòu)建本地blast對(duì)目標(biāo)毒素基因進(jìn)行分析，鑒定新型Si殺蟲蛋白基因20多個(gè)。其中包括I個(gè)新型的營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(Vip)，其開放閱讀框(ORF)大小為2832bp，編碼943個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其分子量大小為含有命名為105kDa，命名為Vip3-like蛋白。
[0019]4.VipJ-1ike基因表達(dá)與殺蟲活性測(cè)定
根據(jù)基因組序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)EV3F/EV3R擴(kuò)增基因完整的編碼序列，高保真ExTaq酶用于PCR擴(kuò)增，PCR片段克隆到pQE-30a大腸表達(dá)載體上，并將正確的重組子pQEvip3轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主細(xì)胞M15中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(圖4，5)。40C，12，OOOrmp離心10min收集菌體蛋白，充分懸浮于等體積的TE溶液，加入溶菌酶至終濃度為20ug/mL，37°C，220rmp振蕩培養(yǎng)30min，然離心收集菌體和蛋白，用等體積冰冷的IM的NaCl洗滌3次，然后超聲波破碎細(xì)胞破處理20min(model VC-130, Sonics and Materials Inc, USA)。由于表達(dá)的融合蛋白含有 6xhistidine (His)-tagged 標(biāo)簽，利用試劑盒Fusion Protein Purification Kit (Toyobo,Shanghai, china)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。BSA蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，1wry方法用來(lái)測(cè)定表達(dá)蛋白的濃度。表達(dá)的蛋白溶于50ml^9N%C03(pH10.0)中溶液中，然后稀釋成8個(gè)濃度測(cè)定，分別涂布在中國(guó)白菜葉片上，接種二齡小菜蛾幼蟲。生物測(cè)定表明Vip3-like蛋白對(duì)小菜蛾有很聞殺蟲活性。
[0020]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1菌株價(jià)HS66伴胞晶體蛋白掃描電鏡觀察和SDS-PAGE分析 注:A:伴胞晶體掃描電鏡圖，日本日立S3400型掃描顯微鏡，電壓20.0 kV, 5.7mm X 20k SE ；B:芽孢期價(jià)菌株蛋白SDS-PAGE分析 圖2 Si菌株大質(zhì)粒DNA脈沖場(chǎng)電泳分析 圖3 Bt HS66基因組測(cè)序建庫(kù)方法和測(cè)序流程 圖4 Vip3-like基因PCR擴(kuò)增及其亞克隆瓊脂糖電泳圖示
注:M 為 DNA Loading Marker，A 圖為引物 EV3F/EV3R擴(kuò)增 2.832kb 的 PCR產(chǎn)物；B 圖表達(dá)載體pQE-30a用BamHI和SalI限制內(nèi)切酶完全消化的DNA片段；C圖Vip3_like基因片段與表達(dá)載體pQE-30a重組質(zhì)粒DNA電泳；D圖利用限制內(nèi)切酶進(jìn)行表達(dá)重組子篩選，4、6和8號(hào)重組子為正確重組子，BamHI和SalI進(jìn)行雙酶切分別獲得載體pQE_30a和Vip3_like的正確大小的DNA帶。
[0021]圖5 SD S-PAGE電泳分析Vip3_like基因在大腸桿菌M15中表達(dá)
M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；孔道I為M15細(xì)胞含有質(zhì)粒pET-30a，在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；孔道2和3分別為M15細(xì)胞含有pQEVip3-like重組質(zhì)粒在沒有或有IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
[0022]圖6同源建模分析Vip3_like蛋白三維結(jié)構(gòu) (http://swissmode1.expasy.0rg//SffISS-M0DEL.html)
【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1
掃描電鏡觀察價(jià)晶體蛋白
Bt菌株在G-Tris培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至芽孢完全形成，4°C，12，OOOg離心10 min收集500 μ L菌體，然后用IM冰冷的NaCl洗滌菌體3次，最后菌體懸浮于500 μ L冰冷超純水中。取10 yL芽孢和伴胞晶體混合物小心平鋪在潔凈的蓋玻片上，4°C低溫真空干燥，然后用1%四氧化鋨(OsO4)進(jìn)行樣品固定，樣品被置于金屬樣品臺(tái)上，放入真空蒸發(fā)器中噴鍍一層約20 nm厚的金屬膜。準(zhǔn)備好的樣品置于S3-400N掃描電鏡(HITACHI Ltd,Japan), 20 kV電壓條件下進(jìn)行圖像觀察記錄。
[0023]實(shí)施例2
SDS-PAGE電泳分析Bt菌株晶體蛋白
一般7.5%或者12%的SDS-PAGE可用于分析價(jià)菌晶體蛋白組成，5ul制備好的伴胞晶體蛋白與 5ul 的 2XSDS-PAGE sample Buffer[0.075M Tris.Cl, (pH 6.8) ；0.02MEDTA ；2% SDS ；0.02% bromophenol blue ；0.25 M dithiothreitol (DTT); 50%glycerol]混合，100°C沸水中煮5 min，然后12，OOOg離心5min，上清立即上樣，在100V電壓下，利用Min1-Protein II, cell slab vertical apparatus 裝置(BioRad,USA)電泳大約 I h,然后用Coomassie blue R250進(jìn)行染色,蛋白質(zhì)大小根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。
[0024]實(shí)施例3
Bt菌株質(zhì)粒DNA提取純化
在LB培養(yǎng)基，30°C，220 rmp振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為2左右，離心收集菌體懸浮于GTEBuffer [2.5 mM Glucose , 25mM Tris - Cl 10 mM EDTA (pH8)]中，加入溶菌酶至終濃度為10 mg/mL，37°C水浴I h。然后加入2倍體積的SDS (1.0%)和NaOH (0.8 M)溶液，輕輕上下倒置6-8次,然后加入1/2體積冰冷的3 M sodium acetate (pH 4.8)溶液,立刻輕輕上下倒置6-8次，冰上放置4 h以上，然后經(jīng)過等體積苯酚:氯仿:異戊醇(25: 24: I)抽提，，96%乙醇沉淀獲得Si菌株的質(zhì)粒DNA。然后利用氯化銫CsCl梯度密度超速離心純化質(zhì)粒DNA。
[0025]實(shí)施例4
Bt質(zhì)粒DNA脈沖場(chǎng)電泳分析
應(yīng)用于 CHEF Mapper? XA Pulsed Field Electrophoresis System (BioRad,USA)對(duì)Bt質(zhì)粒profiles進(jìn)行分析。低熔點(diǎn)瓊脂糖的濃度為l%(Amresco, USA),電泳緩沖液為
0.5XTBE( 45 mM Tris.Cl，I mM EDTA)，電泳槽溫度控制為15°C，電壓為5 V/cm，轉(zhuǎn)換角度為120度，起始脈沖時(shí)間1.19 S，終止脈沖時(shí)間44.69 s,電泳時(shí)間為20 h。電泳完成后瓊脂糖膠塊用0 .5 μ g/ml EB浸泡30 min,再用冰冷的純水清浸泡2 h,期間換水3次，最后在紫外光成像儀下觀察。
[0026]實(shí)施例5
Bt HS66的基因組DNA提取
Bt單菌落接種于7mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 °C，220rpm培養(yǎng)過夜，1%轉(zhuǎn)接于盛有50mL的LB培養(yǎng)基的250mL體積的三角瓶中，30°C，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)至OD6tltl=L O~2.0 ;離心收集 IOmL 菌體，2mL J Buffer (0.1M Tris HCl (pH 8.0)、0.IM EDTA (pH 8.0)、0.15ΜNacl)洗漆沉淀；將沉淀輕懸于2mL J Buffer中加入80uL新鮮配制的溶菌酶(50mg/mL)，混勻，37°C溫育 45min ;再加入 15uLRNase (10mg/mL)，50°C 作用 15min ;接著加入 200 μ LSDS (20%)，70°C處理20min ;緩慢冷卻至37°C，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25: 24: I)及氯仿:異戊醇(24: I)各抽提一次，再加入等體積異戊醇混勻置一20°C沉淀上清20min，12，OOOrmp 離心 lOmin。70% 乙醇洗漆沉淀 2 次，風(fēng)干后溶 IOOuL TE Buffer (IOmM TrisHCl (pH 8.0)、ImM EDTA (pH 8.0))中，取5uL DNA樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，EB染色后紫外分析儀檢測(cè)。
[0027]實(shí)施例6
菌株HS66基因組測(cè)序及其序列組裝:
先將 5ug 混合價(jià)質(zhì)粒 DNA 用試劑盒 paired-end DNA sample preparation kit(PE-102-1001; Illumina Inc.)處理，由于流體動(dòng)力切割作用質(zhì)粒DNA被打斷成800bp片段。再用 QIAquick PCR purification kit (28104; Qiagen)純化將 DNA 片段末端磷酸化，然后末端加A與測(cè)序接頭連接，連接產(chǎn)物利用瓊脂糖膠回收純化。利用引物PE1.0和PE2.0進(jìn)行10循環(huán)PCR進(jìn)行5'端延伸富集文庫(kù)DNA。最后用QIAquick PCR purificationkit進(jìn)行適當(dāng)?shù)募兓蜐饪s，流體細(xì)胞用paired-end cluster generation kit (PE-103-1001; Illumina Inc.)按照設(shè)備要求制備和測(cè)序Inc.)。獲得序列De novo組裝由軟件ABySS(參數(shù)kmer 25; η, 10)完成，運(yùn)用SOAPdenovo短序列組裝軟件(http://soap, genomics, org.cn/soapdenov0.html )對(duì)處理后的reads數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，經(jīng)多次調(diào)整后主要參數(shù)K設(shè)置為83。把reads比對(duì)到Contig上，根據(jù)reads的Paired-End和overlap關(guān)系，對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行局部組裝和優(yōu)化，最終獲得由207個(gè)scaffold (contig)組成的基因組草圖。
[0028]實(shí)施例7
基因組標(biāo)準(zhǔn)信息分析流程:
基本流程:(1)數(shù)據(jù)過濾。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及統(tǒng)計(jì)；(2)組裝。運(yùn)用SOKPdenovol.05短序列組裝軟件,對(duì)處理后的reads數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝；(3)組裝結(jié)果評(píng)價(jià)。若有近源參考序列，可以對(duì)基因組和基因區(qū)覆蓋度進(jìn)行評(píng)價(jià)；(4)Non-CodingRNA注釋。通過與參考序列rRNA比對(duì)找到rRNA,或rRNAmmer軟件預(yù)測(cè)rRNA ;通過tRNAscan軟件預(yù)測(cè)tRNA區(qū)域和tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過Rfam軟件預(yù)測(cè)sRNA ； (5)重復(fù)序列注釋。通過RepeatMasker軟件(使用Repbase數(shù)據(jù)庫(kù))和RepeatProteinMasker軟件(使用RepeatMasker自帶的轉(zhuǎn)座子蛋白庫(kù))兩種方法來(lái)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)座子；通過TRF (Tandem RepeatFinder)軟件預(yù)測(cè)串聯(lián)重復(fù)序列；(6)基因預(yù)測(cè)。采用Glimmerf.0軟件從組裝結(jié)果中獲得基因序列；(7)基因功能注釋。將基因的序列與各數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息；(8)環(huán)形圖。根使用(G-C)/ (G+ C)的計(jì)算方法來(lái)進(jìn)行GC skew分析，同時(shí)根據(jù)COG的注釋結(jié)果和基因的位置信息繪出COG注釋的基因在基因組上的分布情況；(9)共線性分析。通過目標(biāo)菌蛋白集(核酸集)與參考菌蛋白集(核酸集)兩兩比對(duì)，將目標(biāo)菌的基因組序列根據(jù)參考菌的基因組序列進(jìn)行排序構(gòu)圖；(10)基因島預(yù)測(cè)。將目標(biāo)基因組與基于SIG1-HMM軟件所預(yù)測(cè)的全部基因島序列作為的基因島庫(kù)進(jìn)行BLAT比對(duì)，得到目標(biāo)基因組中可能的GIs5(Il)前噬菌體預(yù)測(cè)。將目標(biāo)基因組與Prophinder軟件和ACLAME數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出的前噬菌體座位的前噬菌體庫(kù)作BLAT作比對(duì)，從而判定目標(biāo)基因組中可能的前噬菌體；(12)CRISPR預(yù)測(cè)。使用CRISPRFinder軟件，識(shí)別 CRISPRs，得到 DRs 和 Spacers。
[0029]實(shí)施例8
基于價(jià)HS66基因組序列鑒定新型的vip3-like基因
為了方便c/y基因鑒定，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)孫明教授課題組開發(fā)了 BtToxin_scanner生物信息學(xué)軟件，此軟件組合應(yīng)用了本地BLAST、HMMER 3.0和LIBSVM三種開源軟件，并構(gòu)建了一個(gè)本地cry基因數(shù)據(jù)庫(kù)整合到整個(gè)計(jì)算中去，這樣大大方便了 cry基因的鑒定(http://beam, hzaubmb.0rg/BtToxin_ scanner/)。本人同時(shí)構(gòu)建了一個(gè)本地的Bt數(shù)據(jù)庫(kù)，包括Cry、Vip、Cyt、S蛋白等Bt毒素蛋白序列，進(jìn)行本地blast分析，鑒定新型毒素蛋白，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)假定蛋白與Vip3Ad蛋白具有同源性，氨基酸序列相似達(dá)到27%。
[0030]實(shí)施例9
PCR擴(kuò)增新型vip3-like基因
50μ L反應(yīng)體系中包括0.5ng基因組DNA為模板，dNTP的濃度為200umol，弓丨物58V3F(ATGGTTACTACAAAAATGATACCTAGA) /58V3R (TTAAATTTGATCCGATTCGTATAAC) 為 2 umol,Taq DNA polymerase.為2U。PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min，然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(940C -lmin, 53°C _lmin，72°C _3 min)，最后在 70°C再延伸 lOmin。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5μ I PCR產(chǎn)物，在I %瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)PCR片段大小。PCR產(chǎn)物用上海生工SanPr印柱式DNA膠回收試劑盒純化,然后和載體pMD 18 T Easy Vector連接,重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌 ToplO 感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子在含有 Amp (100ug/ml), 5-bromo-4-chloro-3-1ndolyl-β -D-galactopyranoside (X-Gal) (64 ug/ml)和 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) (0.2 mM)的LB培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)過夜，任意挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取重組菌株的質(zhì)粒，送往深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。
[0031]實(shí)施例10
制備疋co7i CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞:
挑取疋co7i JMllO或JM109單菌落，接種于10 mL LB，37°C搖床培養(yǎng)過夜(37°C, 220rpm);按照1:100比例進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，取Iml過夜培養(yǎng)液于盛有100 mL LB的三角瓶中，370C，220 rpm振蕩培養(yǎng)大約2.5小時(shí)，菌液OD6tltl為0.6左右；菌液質(zhì)冰水中30 min,將冷卻菌液轉(zhuǎn)入100 mL離心管,4 °C, 4, 000 rmp離心5 min,棄去上清液；細(xì)胞重新懸浮于50mL冰冷的0.1M CaCl2中，冰浴30分鐘后，4，000 rmp離心10min，棄去上清液;將菌體細(xì)胞重新懸浮于5 mL冰冷的0.1M CaCl2中，200ul并分裝于EP管中，-4°C保存10天，如果感受態(tài)細(xì)胞放一 70°C放置，可以保存較長(zhǎng)時(shí)間； 注:所有操作須無(wú)菌操作，在冰上操作。
[0032]轉(zhuǎn)化程序:從一 70°C冰箱取出感受態(tài)細(xì)胞，置冰上融化。向感受態(tài)細(xì)胞懸液加入連接好的DNA分子，DNA分子最大量不要超過10 ng，濃度不超過0.1 μ8?ΝΑ/100μ1，輕輕混勻，冰上靜止301^11。421:水浴1.5 min，然后冰上放置3 min，然后快速加入I ml of LB或者SOC培養(yǎng)基，37°C輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)I h。4，OOOg離心30 s收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞，傾去部分上清，100-200 μ I轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在含相應(yīng)抗生素的平板上，倒置培養(yǎng)過夜。
[0033]實(shí)施例11
大腸桿囷重組質(zhì)粒DNA提取:
一般過夜活化培養(yǎng)菌株，抗生素使用一般Amp為100ug/ml ;Kan為10ug/ml ；10k rpm,l-2min離心收集菌體1.0-5.0ml，然后短暫離心吸除多余培養(yǎng)基；菌體重新用槍頭吹打充分懸浮在150μ1 S I中(S I保存在4°C冰箱中，加入RNase可以去除RNA);加入150μ1的S II，輕輕上下倒置混勻5次左右，至液體變清澈透明；加入250μ1的S III，立刻輕輕上下倒置5次左右，冰上放置5-10min ;12k rpm離心10 min然后將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入500μ1異丙醇或2倍體積的無(wú)水乙醇上下倒置混勻；12k rpm離心5min,小心傾去上清，加入700ul 70%乙醇(漂洗液)(勿劇烈震蕩)，12k rpm離心l_2min，小心傾去上清；重復(fù)漂洗操作，短暫離心，小心用槍頭吸取多余的漂洗液；自然干燥30min左右，加入50uL TE或ddH20，渦旋溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034]實(shí)施例12
vip3~like基因大腸桿菌異源表達(dá):
根據(jù)基因組序列，設(shè)計(jì)引物對(duì)EV3F/EV3R擴(kuò)增基因完整的編碼序列，為了方便克隆在正向引物和反向引物的5'端分別引入限制內(nèi)切酶酶切和fe7I序列。0.5ng的DNA模板，表達(dá)引物EV3F/EV3R各為0.2uM，加入dNTP (dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至濃度250uM，5uI^9l0XPCR buffer, 0.5U Ex Taq酶，補(bǔ)雙蒸水至50uL。反應(yīng)按如下程序:進(jìn)入循環(huán)前94 °C預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)反應(yīng)(每個(gè)循環(huán)為:94°C變性I min ;50°C退火 lmin ; 72 °C延伸 4min)。最后在 72 °C延伸 10 min。然后利用 Gel Extraction MiniKit純化的PCR產(chǎn)物，用限制內(nèi)切酶漢I和I 37°C分別消化純化的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體PEQ30質(zhì)粒3h，65°C水浴15min失活，然后將消化產(chǎn)物混合，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中，挑取重組菌落質(zhì)粒DNA。篩選得到的表達(dá)子pQEvip3通過測(cè)序確定沒有產(chǎn)生突變，密碼子不產(chǎn)生移碼突變，并將正確的重組子轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主細(xì)胞M15中，在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為0.6左右，然后加入IPTG至終濃度為0.4mM,在20°C，220rmp振蕩培養(yǎng)20h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
[0035]EV3F:5’ -GGATCCATGGTTACTACAAAAATGATACCTAGA-3>
BamWl
EV3R:5’ -GTCGACTTAAATTTGATCCGATTCGTATAAC-3>
Sail
實(shí)施例13
vip3~like基因產(chǎn)物提取純化:
4°C，12，OOOrmp離心10min收集菌體蛋白，充分懸浮于等體積的TE溶液，加入溶菌酶至終濃度為20ug/mL，37°C，220rmp振蕩培養(yǎng)30min，然離心收集菌體和蛋白，用等體積冰冷的IM的NaCl洗滌3次，然后超聲波破碎細(xì)胞破處理20min (model VC-130, Sonics andMaterials Inc, USA)。由于表達(dá)的融合蛋白含有6x histidine (His)-tagged標(biāo)簽,利用試劑盒 Fusion Protein Purification Kit (Toyobo, Shanghai, china)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。BSA蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)濃度，1wry方法用來(lái)測(cè)定表達(dá)蛋白的濃度。表達(dá)的蛋白溶于50mM的Na2CO3(ρΗΙΟ.0)中溶液中，然后稀釋成8個(gè)濃度測(cè)定進(jìn)行生物活性測(cè)定。
[0036]實(shí)施例14 小菜蛾的人工飼養(yǎng)
小菜蛾利用溫室種植的中國(guó)白菜進(jìn)行人工飼養(yǎng)，人工飼養(yǎng)環(huán)境的相對(duì)濕度為65%左右，溫度保持為26°C上下，光照周期為14h:10h。小菜用將飽含10%葡萄糖溶液(或蜂蜜溶液)的脫脂棉球放入成蟲飼養(yǎng)籠中，供成蟲取食，每天更換一次。蛹羽化后，成蟲當(dāng)天即交配產(chǎn)卵，一條雌性的小菜蛾可以生產(chǎn)250到300枚卵。收集卵直接置于人工飼養(yǎng)中國(guó)白菜的葉片上，第5-6天開始孵化，孵化成幼蟲即可以取食葉片，適時(shí)不斷更換菜葉，5-6天即可以發(fā)育成2-3齡幼蟲直接用于生物測(cè)定。
[0037]實(shí)施例15 棉鈴蟲的人工飼養(yǎng)
準(zhǔn)備好750ml熱水，分成三份，一份350ml、第二份300份、第三份100ml。用350ml熱水溶解面粉和麥芽胚的混合物加入攪拌器，然后依次加入成份3-8，攪拌混勻。瓊脂加入300ml熱水，并在微波爐加熱(注意器皿是塑料，千萬(wàn)不要用金屬器皿)，沸騰2-3次，防止溢出塑料燒杯。酵母粉加入100mL熱水中，然后加入到已經(jīng)沸騰的瓊脂中。在微波爐加熱瓊脂和酵母粉混合物2-3分鐘。將瓊脂和酵母混合物加到攪拌器中。當(dāng)混合物攪拌2min之后，停止攪拌冷卻5-10分鐘，然后加入成份10-12?；靹蛩谐煞荩瑢?dǎo)入一個(gè)容器，置入4度冷卻至少3小時(shí)。將人工飼料切成小塊置入單個(gè)小瓶，每個(gè)小瓶放入I頭棉鈴蟲。養(yǎng)蟲室的溫度:(27 ±1) °C，濕度:80%~90%，光周期為14:1Oh (光照:黑暗)，光強(qiáng):2000~30001x。帶卵紗布放入盛有培養(yǎng)基的保鮮盒中度過卵期，孵化成幼蟲。透明玻璃瓶，一次性放入人工飼料，將I頭初孵幼蟲挑入飼養(yǎng)至化蛹。將飼養(yǎng)瓶中的蛹挑入培養(yǎng)皿內(nèi)集中度過蛹期。將有蛹培養(yǎng)皿放入成蟲籠中，令成蟲羽化后隨時(shí)進(jìn)行交配產(chǎn)卵。卵會(huì)8天內(nèi)孵化成幼蟲。
[0038]實(shí)施例16
Vip蛋白對(duì)昆蟲毒性測(cè)定:
粗蛋白取菌液8個(gè)不同濃度梯度被測(cè)液，加入0.1%吐溫20或Triton XlOO0選取新鮮的甘藍(lán)葉片(大小一致，20g左右，含有中脈)，用器皿切割成直徑為9cm左右的圓菜葉片，均勻地浸入上述待測(cè)樣品溶液中，20s，取出后上室溫下涼干(中間翻轉(zhuǎn)一次)。塑料培養(yǎng)皿中放入一張大小相仿的濾紙，用蒸餾水濕潤(rùn)，再放入晾干的葉片。用毛筆輕輕接入二齡幼蟲,每個(gè)培養(yǎng)皿中放入小菜蛾5頭,每處理重復(fù)3-6次,蓋上培養(yǎng)皿,膠布纏好,防止幼蟲逃逸。放置25 °C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為12: 12。每天觀察，檢查菜葉是否腐爛或干枯，是否有水蒸氣凝結(jié)，棉鈴蟲生物測(cè)定，將表達(dá)蛋白與人工飼料混勻，自然風(fēng)干，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。選取爬行較快、活躍初孵幼蟲(從卵孵化5天)放入細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔I頭。2天、4天分別調(diào)查死、活蟲數(shù)，利用spss軟件進(jìn)行毒力回歸分析，計(jì)算LC50值。得出表達(dá)的Vip3-like蛋白對(duì)二齡小菜蛾和棉鈴蟲的殺蟲活性LC50分別為58.94ng/ml和107.23ng/ml ο
[0039]序列表
【權(quán)利要求】
1.一種蘇云金芽胞桿菌新型殺蟲基因序列，具有如SQE NO I所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的vip3-like基因序列，包含了該基因序列的部分序列或同源序列。
3.—種對(duì)鱗翅目昆蟲有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其特征是由權(quán)利要求1的基因序列所編碼，具有如SQE NO 2所不的氣基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，包含了該蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列或同源序列。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的vip3-like基因的方法。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的vip3-like基因的工程菌株的方法。
7.一種如權(quán)利要求1所述的vip3-like基因的用途，該基因的產(chǎn)物對(duì)小菜蛾和棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲有高效殺蟲活性，該基因可以用于構(gòu)建工程菌株或者培育轉(zhuǎn)vip3~like基因作物，可以拓寬其殺蟲譜，延緩昆蟲對(duì)Cryl和Cry2蛋白產(chǎn)生抗性。
【文檔編號(hào)】C07K14/325GK103952418SQ201410128118
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】張文飛, 王銳萍, 吳仲琦, 鈐江朝 申請(qǐng)人:海南師范大學(xué)