一種殺蟲(chóng)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殺蟲(chóng)蛋白Cry1m7，所述殺蟲(chóng)蛋白為1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或2)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸序列所獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了所述殺蟲(chóng)蛋白的編碼基因、表達(dá)載體、工程菌、所述蛋白在殺蟲(chóng)藥劑中的應(yīng)用以及所述蛋白的編碼基因在轉(zhuǎn)化植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種高毒力的殺蟲(chóng)蛋白Cry1m7及其編碼基因；本發(fā)明所提供的殺蟲(chóng)蛋白可以用于殺死亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲(chóng)，提高轉(zhuǎn)基因作物的殺蟲(chóng)能力。
【專利說(shuō)明】-種殺蟲(chóng)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種殺蟲(chóng)蛋及其編碼基因與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蟲(chóng)害是造成農(nóng)作物嚴(yán)重減產(chǎn)的一個(gè)主要因素，防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)最常見(jiàn)的手段就是使 用廣譜化學(xué)殺蟲(chóng)劑和一些生物殺蟲(chóng)劑。化學(xué)殺蟲(chóng)劑多具有廣譜、高毒的特點(diǎn)，在殺死目標(biāo) 害蟲(chóng)的同時(shí)往往將很多益蟲(chóng)一起殺死，嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡，并對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染；另一方 面，農(nóng)藥殘留對(duì)人類、牲畜的健康也造成嚴(yán)重威脅。生物殺蟲(chóng)劑具有易降解、與環(huán)境高度相 容的特點(diǎn)，但在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加生產(chǎn)成本。為了彌補(bǔ)化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物殺蟲(chóng) 劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中的弊端，科學(xué)家們將能編碼殺蟲(chóng)蛋白的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，培育出 多種轉(zhuǎn)基因植物。自1996年至今，已經(jīng)有多種轉(zhuǎn)Bt基因殺蟲(chóng)作物獲得批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生 產(chǎn)，但這些抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物多使用CrylA類殺蟲(chóng)蛋白基因，殺蟲(chóng)蛋白基因的單一化、大面積 使用加速害蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生，制約了轉(zhuǎn)CrylA類抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用年限。因此，需要不 斷尋找高毒力、且與已經(jīng)使用的殺蟲(chóng)蛋白基因無(wú)交互抗性的新的基因以延緩害蟲(chóng)抗性的產(chǎn) 生。
[0003] 目前，人們已經(jīng)克隆了數(shù)百種Bt殺蟲(chóng)蛋白基因，但這些殺蟲(chóng)蛋白基因真正能應(yīng)用 于生產(chǎn)的卻屈指可數(shù)，其原因主要是毒力較低，容易使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性；其次，多數(shù)基因存在 不同程度的交互抗性。賀明霞等的研究結(jié)果表明CrylIe與CrylAbXrylAc及CryIFa三種 毒素不存在交互抗性，但CrylAb和CrylAc的交互抗性較高，CrylFa與CrylAb和CrylAc也 存在一定程度的交互抗性（He，2013)。Gassmann等的研究結(jié)果表明孟山都公司培育的殺蟲(chóng) 玉米轉(zhuǎn)化事件M0N88017中所使用的殺蟲(chóng)蛋白基因 Cry3Bbl與先正達(dá)公司培育的殺蟲(chóng)玉米 轉(zhuǎn)化事件MIR604中所使用的殺蟲(chóng)蛋白基因 mCry3A存在交互抗性，這使西方玉米根蟲(chóng)在兩 種玉米商業(yè)化使用三年內(nèi)就對(duì)兩種殺蟲(chóng)蛋白基因產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性，對(duì)玉米生產(chǎn)造成嚴(yán)重 損失（Gassmann，2014)。除此之外，殺蟲(chóng)蛋白基因克隆資源的日漸匱乏也給基因克隆造成很 大難度。以上因素都增加了具有應(yīng)用潛力殺蟲(chóng)蛋白基因克隆的難度。
[0004] CrylI類Bt蛋白對(duì)害蟲(chóng)有很好的殺蟲(chóng)活性。CrylIal基因編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋 白對(duì)鱗翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)具有毒害作用，已用于培育抗馬鈴薯塊莖蛾的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯如 SpuntaG2及抗大豆食心蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因大豆。CrylIe基因編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)鱗翅目害 蟲(chóng)如小菜蛾、玉米螟有很高的抗性，且與商業(yè)化應(yīng)用的一些抗蟲(chóng)基因不存在交互抗性。轉(zhuǎn) CrylIe基因抗蟲(chóng)玉米高抗亞洲玉米螟，而且可以有效殺死對(duì)CrylAc蛋白產(chǎn)生抗性的棉鈴 蟲(chóng)，具有重大應(yīng)用價(jià)值（Zhang，2013)。但CrylIe蛋白的毒力比殺蟲(chóng)蛋白CrylAc低，在某種 程度上限制了其應(yīng)用。因此，有必要對(duì)其進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高CrylIe殺蟲(chóng)蛋白的毒力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有研究中存在的上述缺陷，提供一種毒力顯著高于 Crylle、CrylIa的一種新型殺蟲(chóng)蛋白基因及其編碼蛋白。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種殺蟲(chóng)蛋白Crylm7,所述殺蟲(chóng)蛋白由 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列組成。
[0007] 應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列在不影 響其活性的條件下，對(duì)該序列進(jìn)行取代、缺失或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸序列以獲得具有同 等活性的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人以 CrylIe (GenBank :AF211190. 1)和 CrylIal (GenBank : X62821. 1)為參考序列，進(jìn)行結(jié)構(gòu)域改造，得到重組殺蟲(chóng)蛋白Crylm7。
[0009] 本發(fā)明還提供了編碼所述蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 /Jn 〇
[0010] 本發(fā)明所提供的基因包括所述蛋白相應(yīng)的編碼核酸序列。應(yīng)當(dāng)理解的是，由于密 碼子具有簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子所具有的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用 適合特定物種表達(dá)的密碼子。在本發(fā)明中，所述核苷酸序列采用了玉米偏愛(ài)性密碼子。 [0011] 本發(fā)明還提供了所述基因的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體包括誘導(dǎo)表達(dá)載體和 植物表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明還提供了含有所述基因的工程菌。
[0013] 本發(fā)明還提供了基因 Crylm7在轉(zhuǎn)化植物中的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用是在植物體內(nèi)表達(dá)所述殺蟲(chóng)蛋白的編碼基因，提高植物的抗 害蟲(chóng)能力。
[0015] 進(jìn)一步地，所述植物包括玉米、水稻、棉花、大豆、高粱。
[0016] 進(jìn)一步地，所述害蟲(chóng)為鱗翅目害蟲(chóng)，包括但不限于亞洲玉米螟、棉鈴蟲(chóng)和粘蟲(chóng)。
[0017] 本發(fā)明還提供了殺蟲(chóng)蛋白Crylm7在殺蟲(chóng)藥劑中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明所獲得的有益效果在于：提供了一種高毒力的殺蟲(chóng)蛋白Crylm7及其編碼 基因；本發(fā)明所提供的殺蟲(chóng)蛋白可以用于殺死亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲(chóng)，提高轉(zhuǎn)基因作物 的殺蟲(chóng)能力。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為pET30a酶切載體與基因 Crylm7連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌不同菌斑的PCR產(chǎn) 物；
[0020] M :DL2000plus DNA marker ;1-6 :pET30a酶切載體與基因 Crylm7連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸 桿菌不同菌斑的PCR產(chǎn)物；圖中箭頭所指的位置為2525bp。
[0021] 圖2為質(zhì)粒pET30a-Crylm7經(jīng)BamHI和SacI雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖；
[0022] M :DL2000plus DNA marker ;1 :質(zhì)粒 pET30a_Crylm7 雙酶切產(chǎn)物。
[0023] 圖3為含有Crylm7或CrylIe抗蟲(chóng)基因的pET30a載體圖；
[0024] 其中pET30a_Bt中Bt示意殺蟲(chóng)基因名字Crylm7或Crylle。
[0025] 圖4為Crylm7殺蟲(chóng)蛋白基因蛋白誘導(dǎo)純化后SDS-PAGE電泳檢測(cè)；
[0026] M :PageRuler Prestained Protein Ladder ;I :CrylIe;2 :Crylm7。
[0027] 圖5為植物表達(dá)載體p3301Ubi-Crylm7構(gòu)建時(shí)Crylm7基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂 糖電泳圖；
[0028] M:DL2000plus DNA marker ;1 :Crylm7。
[0029] 圖6為含有Crylm7殺蟲(chóng)蛋白基因的p3301Ubi_Crylm7植物表達(dá)載體圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] Crylm7誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0033] Crylm7的基因序列委托上海生工合成并構(gòu)建到pUC57載體上，構(gòu)成具有氨芐青霉 素抗性的質(zhì)粒pUC57-Crylm7。
[0034] 將質(zhì)粒pUC57-Crylm7及質(zhì)粒pET30a(購(gòu)自美國(guó)Novagen公司）各取20ng加入 到50 μ L大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5 α中，冰浴30min ;42°C熱激90sec，冰浴2min ;加入 300 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C低速振蕩恢復(fù)培養(yǎng)Ihr后，將菌液涂于含相應(yīng)抗生素的平板 上，晾干；37°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)15hr。挑取單克隆菌斑于IOml含氨芐青霉素的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，次日，依照天根質(zhì)粒小提中量提取試劑盒操作步驟提取質(zhì) 粒，并用NanoDrop 2000C微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提的質(zhì)粒定量。
[0035] 選擇在質(zhì)粒上有單一酶切位點(diǎn)且恰位于基因兩端的限制性內(nèi)切酶BamHI和 Sac I雙酶切質(zhì)粒pUC57-Cry lm7及pET30a，使基因與載體的兩端具有相同的粘性末端。 pUC57-Crylm7酶切后，經(jīng)瓊脂糖膠電泳，對(duì)照Marker分別切取約2. Ikb大小左右的片段，用 天根膠回收試劑盒對(duì)核酸片段進(jìn)行回收；質(zhì)粒pET30a經(jīng)雙酶切后用天根純化試劑盒進(jìn)行 純化回收。然后，按照T4連接酶的使用說(shuō)明將切膠回收的核酸片段與純化回收的載體片段 進(jìn)行連接。連接反應(yīng)結(jié)束，取5 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5 α，方法同上。PCR擴(kuò)增 篩選陽(yáng)性克隆，具體引物信息如下：
[0036] 上游引物：5' -TAATACGACTCACTATAGGG-3'（SEQ ID Ν0:3)
[0037] 下游引物：5' -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'（SEQ ID Ν0:4)
[0038] 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2525bp。
[0039] PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序如下：
[0040] PCR反應(yīng)體系：
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種殺蟲(chóng)蛋白Crylm7,其特征在于： 1) 由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或 2) 在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸序列所 獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1所述的殺蟲(chóng)蛋白的編碼基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 /Jn〇
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的工程菌。
5. 權(quán)利要求2所述的基因在轉(zhuǎn)化植物中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在植物體內(nèi)表達(dá)所述殺蟲(chóng)蛋 白的基因，提高植物的抗害蟲(chóng)能力。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述害蟲(chóng)為鱗翅目害蟲(chóng)。
8. 權(quán)利要求1所述的蛋白在殺蟲(chóng)藥劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/32GK104311648SQ201410591794
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】劉允軍, 張煜文, 王國(guó)英, 何康來(lái) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所