專利名稱：編碼殺蟲蛋白的新基因的制作方法
編碼殺蟲蛋白的新基因發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及編碼由蘇云金芽孢桿菌(5fl"7/附^"nVi&e附/y)菌林產(chǎn)生的 殺蟲蛋白的新的基因序列。具體地說，本發(fā)明提供了編碼CrylC蛋白的新 嵌合基因，其有益于保護(hù)植物免受昆蟲侵害。此處也包括包含這類基因的 植物細(xì)胞或植物，和制備或使用它們的方法，還有包含這類CrylC嵌合基 因和至少一種編碼殺蟲蛋白的其它基因(例如編碼CrylB或CrylD蛋白的 新基因序列)的植物細(xì)胞或植物。
背景技術(shù)：
來自蘇云金芽孢桿菌(這里簡(jiǎn)稱為"Bt")的菌林和蛋白質(zhì)因其對(duì)昆蟲 害蟲的特異毒性而廣為所知，并被用于控制植物的昆蟲害蟲幾乎達(dá)一個(gè)世 紀(jì)之久。目前能夠獲得表達(dá)Bt蛋白的一些轉(zhuǎn)基因植物物種，其有效地限制 了昆蟲對(duì)植物的損害。盡管已經(jīng)分離了許多殺蟲Bt蛋白，僅部分Bt蛋白在已經(jīng)商品化的轉(zhuǎn)基 因植物中，且僅在一些農(nóng)作物中獲得表達(dá)。多數(shù)商品化的轉(zhuǎn)基因Bt植物屬 于大田作物，例如玉米和棉花。在較小的市場(chǎng)作物(例如蔬茱)中，僅部分 植物物種用Bt基因轉(zhuǎn)化以賦予其對(duì)主要鱗翅目昆蟲害蟲的抗性，但是迄今 為止，沒有解除管制且推向市場(chǎng)的對(duì)鱗翅目有抗性的蔬菜Bt植物或種子。 Zhao等人(2003)已經(jīng)描述了表達(dá)CrylAc或Cry 1C Bt毒素的轉(zhuǎn)基因綠花椰 菜植物，以及在這些植物之間的雜交從而在相同植物中同時(shí)表達(dá)CrylAc 和CrylC毒素，但是這些植物尚未被商品化。包含Cry3A鞘翅目昆蟲活性 基因的NewLeaf頂馬鈴薯在北美曾經(jīng)短暫上市，但是在2001年已經(jīng)撤離市 場(chǎng)。本發(fā)明提供編碼CrylC型Bt蛋白的新基因，其理想地與編碼CrylB或 Cry 1D型Bt蛋白的基因組合。本發(fā)明的crylC、 crylB或crylD基因的DNA序列和本發(fā)明的4務(wù)飾的轉(zhuǎn) 運(yùn)肽的DNA序列(在所附的序列表中顯示)是人工基因，未在天然中發(fā)現(xiàn)， 并且與任何已知的DNA序列不同。實(shí)際上，SEQIDNo. 1、 3、 10、 14或16 的任何一種DNA序列與最近似的已知DNA序列顯示至多76.6。/。的序列同 一性。發(fā)明目的和概述在本發(fā)明中，提供用于植物的一些新的來自Bt的昆蟲控制基因。特別 是，這類基因是用于蔬菜植物作物，特別是蕓苔屬植物，例如花椰菜、甘 藍(lán)、大白菜、蕪菁、芥、油菜、羽衣甘藍(lán)、綠花椰菜、抱子甘藍(lán)、菠菜等。 具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中通過本發(fā)明的新基因保護(hù)下列蕓苔屬 物種植物免受昆蟲損害埃塞俄比亞芥(及ow77mto)、 B. e/柳gflto、地中海 圓白菜(及/n/ric"/wa)、芥菜型油菜(5./'M/icea)、歐洲油菜(及fm/uw)、胍兒 菜(B. wfl"'mwfl)、 黑齊(及w&ra)、甘藍(lán)(及0/emcetf)、及/je/r/ivV//"蕪青(J5. ftf/7fl)、 5. r"/7e^Ws、 5. se/7rice/w、 5.似Mf7ie/0尸ri/等,特另)J是甘藍(lán)(5iuss/ca 0/emce^)或歐洲油菜(Br氾w'airt印附)的植物物種。包含至少一種本發(fā)明的基因的植物或種子獲得。這里還包括通過與轉(zhuǎn)化的植物雜交以含有至少一 種本發(fā)明的基因和通過傳統(tǒng)育種步驟的應(yīng)用獲得的植物或種子。顯然要保 護(hù)免受本發(fā)明新基因編碼的Bt蛋白殺死或控制的昆蟲物種損害的任何植物 物種，都可以用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化以獲得對(duì)這類昆蟲具有增加的抗性的轉(zhuǎn) 基因植物和種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供技術(shù)的組合以允許從抗性管理角度 而言產(chǎn)生最優(yōu)化的產(chǎn)物。實(shí)際上，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的 植物產(chǎn)生至少2種不同的Bt蛋白，且這類蛋白質(zhì)由穩(wěn)定整合的本發(fā)明高表達(dá) cry基因編碼，優(yōu)選整合在植物基因組的單個(gè)基因座上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的至少2種Bt基因包括crylC和crylB基因、crylC和crylD 基因，或本發(fā)明的crylC、 crylB和crylD基因的組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方案中，能夠快速鑒定轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)記基因，優(yōu)選除草劑抗性基因與 本發(fā)明的cry基因處在相同的植物中，特別在相同的植物基因座中。在本發(fā) 明的一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記基因是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因或?qū)Σ?甘膦不敏感的EPSPS基因。在發(fā)明中還提供新的crylB和crylD基因，特別是crylB或crylD嵌合基 因，其可以在植物中高水平表達(dá)，例如crylBl和crylB2以及crylDl和 crylD2基因。而且，這里提供包含任何這些基因的植物細(xì)胞、植物或種子， 以及產(chǎn)生或單獨(dú)或組合使用它們的方法。本發(fā)明也提供編碼殺蟲蛋白的新基因，在其編碼序列中包含功能性植 物內(nèi)含子。內(nèi)舍子的存在也保證當(dāng)在內(nèi)含子不能被剪接的環(huán)境(例如細(xì)菌或 另外的原核孩t生物)中時(shí)，該基因不表達(dá)功能性蛋白。內(nèi)含子在基因序列中 的存在也允許在植物中獲得高表達(dá)水平。這里也包括本發(fā)明的CrylC蛋白的變體，其包含從氨基酸位置29至氨 基酸位置627的SEQIDNo.2序列，但是與SEQ ID No. 2中的位置相比，其 中下列位置處的一個(gè)、 一些或全部的下列氨基酸改變?cè)诎被嵛恢?25 處是丙氨酸，在氨基酸位置184處是纈氨酸，在氨基酸位置295處是精氨酸， 在氨基酸位置454處是天冬氨酸，或在氨基酸位置593處是精氨酸。這里還 提供本發(fā)明的CrylB蛋白的變體，其包含從氨基酸位置31至氨基酸位置648 的SEQ ID No. ll序列，但是其中在SEQ ID No. 11中位置151處的氨基酸是 酪氨酸，或在SEQIDNo. 11中位置353處的氨基酸是精氨酸，或這樣的蛋 白質(zhì)其中在SEQ ID No. 11中位置151處的氨基酸是酪氨酸和在SEQ ID No. 11中位置353處的氨基酸是精氨酸。本發(fā)明中還包括編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的新的DNA，特別是包含從核苷酸 位置7至核苷酸位置371的SEQ ID No. 16序列，尤其是SEQ ID No. 16的序 列的DNA,以及這樣的DNA:其編碼蛋白質(zhì)SEQ ID No. 17的變體，例如 包含從氨基酸位置3至氨基酸位置124的SEQ ID No. 17序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中在位置55處的Cys氨基酸由Tyr替代，和/或其中Gly氨基酸添加在 位置51處的Gly氨基酸之后。特別的，本發(fā)明提供包含下列有效連接序列的嵌合基因a)編碼CrylC 蛋白的編碼區(qū)，包含SEQ ID No. 1、 3、 4或6中任一DNA或其變體，和b) 能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這類啟動(dòng)子 包含SEQIDNo. 18或19的序列。在另一實(shí)施方案中，嵌合基因還包含3，多 聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，特別是來自黃頂菊CF/"iw紐^Vfew船)的NADP 蘋果酸酶基因的3，多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。在另一實(shí)施方案中，嵌合 基因在啟動(dòng)子和編碼區(qū)之間還包含來自稻(Oo^" sfl"vfl)的絨氈層特異性E1 基因的前導(dǎo)序列。本發(fā)明也提供包含任意上述嵌合基因、還包含第二嵌合基因的DNA ， 所述第二嵌合基因包含下列有效連接的序列a)編碼CrylB蛋白的第二編 碼區(qū)，包含SEQ ID No. 8或10的DNA，和b)能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的 第二啟動(dòng)子區(qū)；或提供包含任意上述嵌合基因、還包含第二嵌合基因的 DNA,所述第二嵌合基因包含下列有效連接的序列a)編碼CrylD蛋白的 第二編碼區(qū)，包含SEQIDNo. 12或14的DNA，和b)能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo) 表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述DNA,其中所迷第二啟動(dòng) 子區(qū)包含SEQID No. 18或19的序列并且不同于所述第一啟動(dòng)子區(qū)；或其中 所述第二嵌合基因還包含3，多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，特別是來自黃頂 菊NADP蘋果酸酶基因的3，多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案 中，在這些DNA中的第二嵌合基因在啟動(dòng)子和編碼區(qū)之間還包含來自稻的 絨氈層特異性E1基因的前導(dǎo)序列。本發(fā)明也提供上述DNA，還包含第三嵌合基因，所述第三嵌合基因包 含下列有效連接的序列a)編碼CrylD蛋白的編碼區(qū)，包含SEQ ID No. 12 或14的DNA，和b)能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。在本發(fā)明中也包括包含穩(wěn)定整合進(jìn)入其基因組的任何上迷基因或 DNA的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物，優(yōu)選細(xì)胞或植物是蕓苔屬物種植物或植物 細(xì)胞，特別是物種甘藍(lán)的，更特別是巻心茱或花椰菜。本發(fā)明中還包括任意上述嵌合基因或DNA用于控制昆蟲害蟲，以獲得 對(duì)昆蟲具有增加的抗性的植物細(xì)胞、植物或種子的用途；任意上述嵌合基 因或DNA在表達(dá)殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中延遲或阻止試圖以這類植物為 食的昆蟲的昆蟲抗性發(fā)展的用途；或任意上述嵌合基因或DNA保護(hù)巻心 菜、油菜或花椰菜免受小菜蛾(尸/"&//""/仍^// )損害的用途。這里也包括控制昆蟲的方法，包括在田地中栽培或播種包含任意上述 嵌合基因或DNA的植物的步驟；以及在蕓苔屬物種植物中控制昆蟲的方 法，包括在植物中表達(dá)任意上述嵌合基因或DNA的步驟；或產(chǎn)生對(duì)昆蟲有 抗性的植物或種子的方法，包括步驟a)獲得用權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的基因 或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA轉(zhuǎn)化的植物，和b)選擇含有所述基因或 DNA的所述植物或其種子的子代。根據(jù)本發(fā)明還提供包含下列有效連接的序列的嵌合基因a)編碼殺蟲 蛋白的編碼序列的第一片段，b)植物內(nèi)含子序列，c)所述編碼序列的第二 片段，d)能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)，并且其中這樣的嵌合基 因在不剪接所述內(nèi)含子的給定宿主細(xì)胞中不能夠產(chǎn)生殺蟲蛋白；特別是這 樣的嵌合基因，其中這類內(nèi)含子是馬鈴薯(Stf/fliuwi似&r仍w附)的ST-LSl 基因的第二內(nèi)含子。這里還提供包含任意上述嵌合基因或DNA的微生物，特別是這類微生 物屬于埃希氏菌屬(五sc&n'c/iiVi)、芽孢桿菌屬(Bfl"7/"力或農(nóng)桿菌屬 (々ra6a"eWw/w)。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，"核酸序列"指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，優(yōu) 選DNA分子。這里使用的"分離的DNA"指非天然存在的或不在其原始存 在的天然環(huán)境中的DNA，例如，在嵌合基因中與其它調(diào)控元件相連的DNA 編碼序列，轉(zhuǎn)移進(jìn)入另一宿主細(xì)胞(例如植物細(xì)胞)的DNA，或與任何天然 存在的DNA序列相比具有不同核苷酸序列的人工、合成制備的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)構(gòu)建了編碼份Cry毒素或其變體的核酸序列，特別是DNA^列。所述新的DNA^列在這里命名為o^C7-么cf^ iW、 cf^ 5么 ojlD2和c/j/Z^，其編碼的蛋白質(zhì)在這里命名為CrylC (例如，CrylCl、 CrylC3和CrylC4)、 CrylB (例如CrylBl和CrylB2)和CrylD (例如CrylDl 和CrylD2)蛋白。這里也提供編碼修飾的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的新的DNA序列， 例如，包含從核苷酸位置7到核苷酸位置371的SEQIDNo. 16的序列，特別 是SEQIDNo.l6序列的DNA，其被設(shè)計(jì)用于在植物，特別是蔬菜，例如蕓 莒屬植物，特別是巻心菜和花椰菜中優(yōu)化表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，"CrylC蛋白"指包含SEQ ID No. 2的氨基酸序列的最 小片段的任何殺蟲蛋白，所述最小片段保留了殺蟲活性(下文稱為"最小毒 性片段")，特別是包含SEQ ID No. 2中從氨基酸位置29至氨基酸位置627 的氨基^列的任何蛋白質(zhì)，優(yōu)選包含SEQ ID No. 2中從氨基酸位置3至氨 基酸位置627的氨基酸序列的任何殺蟲蛋白。這里也包括包含SEQ ID No. 2 (這里也稱為CrylCl蛋白)、SEQ ID No. 5 (這里也稱為CrylC3蛋白)或SEQ ID No. 7 (這里也稱為CrylC4蛋白)的氨基酸序列的殺蟲蛋白。CrylC蛋白包含SEQ ID No. 2中從氨基酸位置29至氨基酸位置627的 氨基酸序列，其保留了天然產(chǎn)生的整個(gè)蛋白質(zhì)的全部或大部分的殺蟲活性， 在其N-或C-末端部分添加蛋白質(zhì)序列不破壞這一活性。因此，以含有或包 括此區(qū)域的M酸序列表征的任何蛋白質(zhì)是有用的，并構(gòu)成本發(fā)明的部分。 這包括包含SEQ ID No. 2蛋白質(zhì)的最小毒性蛋白質(zhì)片段的殺蟲雜合蛋白或 嵌合蛋白。這一定義中還包括包含SEQ ID No. 2中從氨基酸位置29至M 酸位置627的氨基酸序列的蛋白質(zhì)變體，例如殺蟲蛋白包含的序列與SEQ ID No. 2這一區(qū)域的氨基酸序列水平具有至少95%,特別是至少96%、 97%、 98%或99%的序列同一性，該序列同一性是在EMBOSS中使用尋找 序列全長范圍最佳比對(duì)的Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法(Rice等人， 2000)確定的，使用缺省設(shè)置(空位開放罰分10,空位延伸罰分0.5;比較氨 基酸序列使用EBLOSUM62矩陣)，優(yōu)選蛋白質(zhì)具有一些，優(yōu)選5-10個(gè)，特 別是少于5個(gè)氨基酸添加、替代或缺失，而不顯著改變、優(yōu)選不改變蛋白質(zhì) 的殺蟲活性。本發(fā)明的CrylC蛋白的優(yōu)選的變體包括包含SEQ ID No. 2中從M酸位置29至氨基酸位置627的序列的蛋白質(zhì)，但是其中與在SEQ ID No.2中的位置相比，在下列位置處的一個(gè)、 一些或全部的下列氨基H生 改變?cè)诎被嵛恢?25處是丙氨酸，在氨基酸位置184處是纈氨酸，在氨 基酸位置295處是精氨酸，在氨基酸位置454處是天冬氨酸，或在氨基酸位 置593處是精氨酸。這里也包括任何基于CrylC的蛋白質(zhì)變體、雜合蛋白或 突變體，保留與上文定義的本發(fā)明CrylC蛋白基本相同的殺蟲活性。如這里使用的術(shù)語"包含"某序列X的DNA或蛋白質(zhì)，是指至少包括 或含有序列X的DNA或蛋白質(zhì)，從而可以在5，(或N-末端)和/或3，(或C-末端) 端包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如在EP 0 193 259公開的可選擇標(biāo)記 蛋白(的核苷酸序列)、轉(zhuǎn)運(yùn)肽(的核苷酸序列)、和/或5，或3，前導(dǎo)序列。出于本發(fā)明的目的，表達(dá)為百分比的兩個(gè)相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的 "序列同一性"，是指在兩個(gè)最佳比對(duì)序列中具有相同殘基的位置數(shù)(x 100) 除以比較的位置數(shù)?？瘴患催@樣的位置，其中在比對(duì)中的該位置上，殘基 是在一個(gè)序列中存在而不在另一序列中，視為無相同殘基的位置。兩個(gè)序 列的比對(duì)通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)在 EMBOSS (Rice等人，2000)中進(jìn)行，以在全長序列范圍尋找最佳比對(duì)，使 用缺省設(shè)置(空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5)。如這里使用的，本發(fā)明Cry蛋白的"最小毒性片段"是保留殺蟲活性 的Cry蛋白的最小片段或部分，其可以通過例如胰蛋白酶或糜蛋白酶酶促 消化全長Cry蛋白獲得；或是保留殺蟲活性的Cry蛋白的最小片段或部分， 其可以通過在編碼Cry蛋白的DNA中缺失核苷酸而獲得。這樣的最小毒性 片段還可以通過用來自對(duì)這類Cry蛋白敏感的昆蟲物種(即，被Cry蛋白殺 死或以其它方式抑制其生長或進(jìn)食)的昆蟲腸液，優(yōu)選中腸液，處理Cry蛋 白而獲得。根據(jù)本發(fā)明，"CrylD蛋白"指包含SEQ ID No. 15的氨基餅列的最 小毒性片段的任何殺蟲蛋白，特別是包含SEQ ID No. 15中從氨基酸位置21 或29至氨基酸位置604的氨基酸序列的任何殺蟲蛋白，優(yōu)選包含SEQ ID No. 15中從氨基酸位置3至氨基酸位置604的氨基酸序列的任何殺蟲蛋白。這里也包括包含氨基酸序列SEQ ID No. 13 (這里也稱為CrylDl蛋白)或SEQ ID No. 15 (這里也稱為CrylD2蛋白質(zhì))的殺蟲蛋白。包含SEQ ID No. 15中從 氨基酸位置29至氨基酸位置604的氨基酸序列的CrylD蛋白保留天然產(chǎn)生 的整個(gè)蛋白質(zhì)的全部或大部分的殺蟲活性，并且在其N-或C-末端部分添加 蛋白質(zhì)序列不破壞這一活性。因此，以含有或包括這一區(qū)域的氨基酸序列 表征的任何蛋白質(zhì)是有用的并構(gòu)成本發(fā)明的部分。這包括包含SEQ ID No. 15的蛋白質(zhì)的最小毒性蛋白質(zhì)片段的殺蟲雜合蛋白或嵌合蛋白。在這一定 義中還包括與SEQ ID No. 15中從氨基酸位置29至氨基酸位置604的氨基酸 序列不同的蛋白質(zhì)變體，例如與SEQ ID No. 15的這一 區(qū)域具有至少95% ， 特別是至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的蛋白質(zhì)，所述序列 同 一性的確定是在EMBOSS中使用Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法(Rice 等人，2000)以找到序列全長范圍的最佳比對(duì)，使用缺省設(shè)置(空位開發(fā)罰 分IO,空位延伸罰分0,5;比較氨基酸序列使用EBLOSUM62矩陣)，優(yōu)選 蛋白質(zhì)在SEQ ID No. 15中從氨基酸位置29至氨基酸位置604的區(qū)域中具 有一些，優(yōu)選5-10個(gè)，特別是少于5個(gè)氨基酸添加、替代或缺失，而不顯著 改變、優(yōu)選不改變蛋白質(zhì)的殺蟲活性。根據(jù)本發(fā)明，"CrylB蛋白"指包含SEQ ID No. ll的氨基酸序列的最 小毒性片段的任何殺蟲蛋白，特別是包含SEQIDNo. 11中從氨基酸位置31 至氨基酸位置648的氨基酸序列的任何殺蟲蛋白，優(yōu)選包含SEQ ID No. 11 中從氨基酸位置3至氨基酸位置648的氨基,列的任何殺蟲蛋白，這里也 包括包含氨基^列SEQ ID No. ll或SEQ ID No. 9的任何殺蟲蛋白。包含 SEQ ID No, 11中從氨基酸位置31至氨基酸位置648的氨基,列的CrylB 蛋白保留了天然產(chǎn)生的完整蛋白的全部或大部分的殺蟲活性，在其N-或C-末端部分添加蛋白質(zhì)序列不破壞此活性。因此，以含有或包括這一區(qū)域的 氨基酸序列表征的任何蛋白質(zhì)是有用的并構(gòu)成本發(fā)明的部分。這包括包含 SEQ ID No. ll的蛋白質(zhì)的最小毒性蛋白質(zhì)片段的殺蟲雜合蛋白或嵌合蛋 白。在這一定義中還包括包含SEQ ID No. 11中從氨基酸位置31至氨基酸位 置648的氨基酸序列變體的殺蟲蛋白，例如與SEQ ID No. ll這一區(qū)域的氨基酸水平具有至少80%的序列同一性，特別是至少85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或至少99%的序列同一性，所述序列同一性的確定是在 EMBOSS中使用Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法(Rice等人，2000)找到序 列全長范圍的最佳比對(duì)，使用缺省設(shè)置(空位開發(fā)罰分IO，空位延伸罰分 0.5;比較氨基酸序列使用EBLOSUM62矩陣)，優(yōu)選蛋白質(zhì)在SEQ ID No. 11 中從氨基酸位置31至氨基酸位置648的區(qū)域中具有一些，優(yōu)選5-10個(gè)，特別 是少于5個(gè)氨基酸添加、替代或缺失，而不顯著改變、優(yōu)選不改變蛋白質(zhì)的 殺蟲活性。本發(fā)明的CrylB蛋白的優(yōu)選的變體包括包含SEQIDNo. ll中從 氨基酸位置31至氨基酸位置648的序列的殺蟲蛋白，但是其中在SEQ ID No. 11的氨基酸位置151處是酪氨酸或在SEQ ID No. 11的氨基酸位置處353是 精氨酸，或這樣的蛋白質(zhì)其中在SEQIDNo. 11的氨基酸位置151處是酪 氨酸和在SEQ ID No. 11的氨基酸位置353處是精氨酸。如這里使用的，術(shù)語DNA或基因，如在"crylCl DNA"中，指分別 編碼如以上定義的CrylC、 CrylB或CrylD蛋白的任何DNA序列。這包括 編碼以上定義的CrylC、 CrylB或CrylD蛋白如SEQIDNo. 2、 5、 7、 9、 11、 13、 15中任一蛋白的天然存在的、人工的或合成的DNA序列SEQ ID No.。這里也包括編碼殺蟲蛋白的DNA序列，其與SEQIDNo. 1、 3、 4、 6、 8、 10、 12或14中的任一足夠相似，從而它們?cè)趪?yán)格雜交條件下能夠(即， 具有能力)與這些DNA序列雜交。如這里使用的，嚴(yán)格雜交條件特別指下列 條件在濾膜上固定相關(guān)的DNA序列，濾膜在42。C在50V。曱酰胺、5% SSPE、 2xDenhardt試劑和0.1V。 SDS中預(yù)雜交1至2小時(shí)，或在68'C—在6 x SSC、 2xDenhardt試劑和0.1。/。 SDS中預(yù)雜交1至2小時(shí)。然后直接向預(yù)雜 交液加入變性的地高辛或放射標(biāo)記的探針，在以上提到的適合溫度孵育16 至24小時(shí)。孵育之后，接著在室溫于2xSSC、 0.1% SDS中洗滌濾膜30分 鐘，繼之各自在68t:在0.5xSSC和0.10/0 SDS中洗滌2次，每次30分鐘。通 過在刁0'C用增感屏將濾膜向X-射線膠片(科達(dá)XAR-2或等同物)曝光M至 48小時(shí)完成放射自顯影。當(dāng)然，在此過程中可以使用等同的條件和參數(shù)， 而仍然保留期望的嚴(yán)格雜交條件。本發(fā)明的cf^ C、 c/yJ5或co^Z) DNA的優(yōu)選的變體是編碼如上所述殺蟲CrylC、 CrylB或CrylD蛋白變體的 DNA 。本文的CrylC DNA或這里定義的基因也包括a)包含SEQ ID No. l中 從核苷酸位置85至核苷酸位置2073的核苦酸序列的DNA， b)包含SEQ ID No.3中從核苷酸位置85至核苷酸位置2073的核苦酸序列的DNA, c)包含與 SEQ ID No. 16的DNA序列融合的、SEQ ID No. l中從核苷酸位置85至核苷 酸位置2073SEQ ID No.的核苷齡列的DNA， d)包含SEQ ID No. 4中從核 苷酸位置7至核苷酸位置2439的核苷酸序列的DNA, e)包含與SEQ ID No. 16的DNA序列融合的、SEQ ID No. 3中從核苷酸位置85至核苷酸位置 2073SEQIDNo.的核苦酸序列的DNA，或f)包含SEQ ID No. 6中從核苦酸 位置7至核苷酸位置2439的核苦酸序列的DNA。本文的CrylD DNA或這里定義的基因也包括a)包含SEQ ID No. 14 中從核苷酸位置85至核苷酸位置1812的核苷酸序列的DNA,或b)包含SEQ ID No. 12中從核苷酸位置7至核苦酸位置2178的核苷酸序列的DNA。本文的CrylB DNA或這里定義的基因也包括a)包含SEQ ID No. 8中 從核普酸位置7至核苦酸位置2310的核苷酸序列的DNA，或b)包含SEQ ID No. 10中從核苷酸位置91至核苷酸位置1944的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明crylC、 crylB或crylD基因的DNA序歹'J(如序列表所示，不帶轉(zhuǎn) 運(yùn)肽序列)顯示與數(shù)據(jù)庫中可獲得的最相似的先前已知的DNA序列具有至 多僅76.6%的序列同一性。使用眾所周知的BLAST算法檢查可獲得的序列 數(shù)據(jù)庫尋找具有最接近的序列同一性的序列，然后在EMBOSS中使用 Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法(Rice等人，2000)以尋找本發(fā)明序列和最 接近序列之間的最佳比對(duì)(考慮其整體長度，使用缺省設(shè)置(空位開放罰分 10，空位延伸罰分0.5)。對(duì)于CrylDDNA,選擇已知技術(shù)序列的(相等長度 的)片段以保證最佳比對(duì)，但是甚至那樣與在可獲得的數(shù)據(jù)庫中列出的任何 已知DNA序列僅有72.5%的序列同 一性。因此，這里的crylC、 crylB或crylD基因也包括編碼殺蟲蛋白的DNA 序列，其與SEQIDNo. 1、 3、 4、 6、 8、 10、 12或14中任一編碼序列具有至少80%、 90%、優(yōu)選至少93%至97%、特別是至少98%或至少99%的序 列同一性；或這樣的編碼殺蟲蛋白的DNA序列，其在嚴(yán)格雜交條件下與 SEQIDNo. 1、 3、 4、 6、 8、 10、 12或14中任一雜交，優(yōu)選與SEQ ID No. 1、 3、 4、 6、 8、 10、 12或14中任一DNA序列的部分嚴(yán)格雜交，所述部分是編 碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的最小毒性蛋白質(zhì)片段所需要的。這里所指的DNA序列同 一性是在EMBOSS中使用Needleman-Wunsch全局比對(duì)算法計(jì)算的(Rice等 人，2000)尋找序列整體長度范圍的最佳比對(duì)，使用缺省設(shè)置(空位開放罰 分10，空位延伸罰分0.5; DNA序列比較使用EDNAFULL矩陣)，嚴(yán)格雜交 條件如以上定義。如這里使用的，蛋白質(zhì)的"殺蟲活性"意指當(dāng)這樣的蛋白質(zhì)被昆蟲攝 入時(shí)，該蛋白質(zhì)殺死昆蟲、抑制其生長或引起昆蟲進(jìn)食減少的能力，優(yōu)選 通過在重組宿主例如植物細(xì)胞中表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。應(yīng)該理解，對(duì)一種昆蟲物種 的昆蟲(優(yōu)選其幼蟲)的活性足夠使蛋白質(zhì)具有如這里使用的殺蟲活性，盡 管通常不同昆蟲物種的昆蟲受到本發(fā)明蛋白質(zhì)的影響。表達(dá)本發(fā)明CrylC、 CrylB或CrylD蛋白中至少一種的重組宿主通常是開發(fā)或靶向用于某農(nóng)作 物的特定主要昆蟲害蟲物種或其中這樣的昆蟲物種是害蟲的地區(qū)，例如， 蕓苔屬植物物種的小菜蛾，但是其它的昆蟲通常也將通過本發(fā)明的重組宿 主得到控制，例如通過轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物，例如，本發(fā)明示例的根據(jù) 本發(fā)明包含c/jK:和/或cfj/5基因的轉(zhuǎn)基因蕓苔屬花椰菜或巻心茱的植物 細(xì)胞或植物。如這里使用的，蛋白質(zhì)或表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的重組宿主的"(昆蟲)控 制量"或"控制"是指蛋白質(zhì)的量，其足以限制攝入這樣的植物的昆蟲對(duì) 植物的損害，例如通過殺死昆蟲或通過抑制昆蟲發(fā)育、受精或生長從而減 少昆蟲物種對(duì)植物的損害。這并非意味不再需要用化學(xué)殺蟲劑處理植物(例 如，為了控制不受本發(fā)明蛋白質(zhì)影響的昆蟲物種，例如(笫二種)鞘翅目昆 蟲或雙翅類昆蟲害蟲)，但是通過化學(xué)殺蟲劑對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)所靶向昆蟲的 處理可以顯著減少或避免，而仍然獲得田地中可接受的植物表現(xiàn)和可接受 的產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，使對(duì)本發(fā)明的新Cry蛋白敏感的昆蟲與昆蟲控制量、優(yōu) 選昆蟲殺死量的這些蛋白質(zhì)相接觸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明 的重組宿主，例如本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物，以高水平表達(dá)本發(fā)明 的蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)，從而獲得"高劑量"水平。如這里使用的，當(dāng)述 及重組植物細(xì)胞或植物時(shí)，"高劑量"水平、"高劑量昆蟲抗性"或"高劑 量"表達(dá)，是指在植物細(xì)胞或植物中的殺蟲蛋白濃度(通過ELISA測(cè)量為總 可溶蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)，該總可溶蛋白質(zhì)是在提取緩沖液中提取可溶蛋白質(zhì) 之后測(cè)量(例如，Jansens等人，1997中描述的提取緩沖液)，使用Bradford 分析(伯樂公司，Bio-Rad， Richmond, CA; Bradford, 1976))，該殺蟲 蛋白濃度在顯著較不敏感的發(fā)育階段殺死靶昆蟲，優(yōu)選所述發(fā)育階段對(duì)毒 素的敏感性比昆蟲一齡期低25至100倍之間，因此可以期望保證完全地控制 靶昆蟲。在一個(gè)實(shí)施方案中，這指對(duì)四齡期(對(duì)于具有五個(gè)齡期的昆蟲而言) 或末齡期(對(duì)于具有四個(gè)或更少齡期的昆蟲而言)靶昆蟲獲得至少97% ，優(yōu) 選至少99%，最優(yōu)選100%的死亡率，這是使用合適的對(duì)照，在常規(guī)昆蟲生 物測(cè)定，優(yōu)選整林植物的測(cè)定中對(duì)昆蟲侵襲這類植物細(xì)胞或植物之后10至 14天所測(cè)量的。針對(duì)一種靶昆蟲物種(即，昆蟲物種，優(yōu)選其幼蟲，其能夠 導(dǎo)致對(duì)植物物種或變種顯著的損害，通常是針對(duì)之設(shè)計(jì)和開發(fā)轉(zhuǎn)基因Bt植 物的昆蟲)的存在，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物提供"高劑量"水 平的昆蟲抗性，足以認(rèn)定植物提供本發(fā)明定義的"高劑量，，表達(dá)。本發(fā)明 蛋白質(zhì)的優(yōu)選耙昆蟲是造成經(jīng)濟(jì)損害的植物昆蟲害蟲。如這里使用的，術(shù)語"Cryl蛋白/DNA"或"本發(fā)明的Cry蛋白/DNA" 是指如這里定義的任一CrylC、 CrylB或CrylD蛋白或任一crylC、 crylB 或crylDDNA序列。如這里使用的，Cry或Cryl蛋白，可以是全長大小的 蛋白質(zhì)，也稱為原毒素；或可以是截短形式，只要保留了殺蟲活性即可； 或可以是雜合或融合蛋白形式的不同蛋白質(zhì)的組合。"原毒素"指全長殺 蟲晶體蛋白，其由天然存在的ADNA序列編碼，"毒素"指其殺蟲片段， 特別是其最小毒性片段，通常分子量范圍為約50-65kD,特別是約60kD， 通過SDS-PAGE電泳與常規(guī)使用的分子量標(biāo)準(zhǔn)相比較而確定。如這里使用的，"嵌合基因"用于指包含至少兩個(gè)不同DNA片段(例如 啟動(dòng)子、5，非翻譯前導(dǎo)序列、編碼區(qū)、內(nèi)含子、3，非翻譯拖尾以及3，端轉(zhuǎn)錄 形成和多聚腺苷酸化區(qū)域)的基因或DNA序列，所述DNA片段不是天然彼 此相連或它們來自不同來源。典型的，如這里使用的植物可表達(dá)的嵌合基 因是包含有效連接于合成的、人造的編碼序列如本發(fā)明任一crylC、 crylB 或crylD基因的啟動(dòng)子區(qū)的基因。編碼本發(fā)明Cryl蛋白的DNA序列能夠使用常規(guī)技術(shù)化學(xué)合成，并且能 夠插入到表達(dá)載體中以產(chǎn)生高量的Cryl蛋白。可以使用Cryl蛋白用常規(guī)方 式(H6fte等人，1988)來制備特異性的單克隆或多克隆抗體，開發(fā)免疫測(cè)定 (例如，ELISA、 Western印跡(即蛋白質(zhì)分析)、抗體包被的試條(dipstick)) 以檢測(cè)在任意材料，例如植物材料中這些蛋白質(zhì)的存在或缺乏。為了鑒定包含整合進(jìn)入其基因組的本發(fā)明任一cryl基因的轉(zhuǎn)基因植物 細(xì)胞、植物或植物材料(例如葉或種子)，或含有DNA的產(chǎn)品(其包含或來源特異性序列特征，例如，包含引入的(外源)cryl基因的基因組區(qū)的特異性 限制酶切圖i普、分子標(biāo)記或整合進(jìn)入植物基因組的外源DNA序列。一旦外源DNA的序列，例如本發(fā)明的cryl基因是已知的，可以通過分 子生物技術(shù)開發(fā)特異性識(shí)別樣品核酸(DNA或RNA)中這些序列的引物和探 針。例如，可以開發(fā)PCR方法以鑒定生物樣品中(例如，植物、植物材料或 包含植物材料的產(chǎn)品的樣品)的本發(fā)明的基因。這類PCR基于至少兩個(gè)特異 性"引物"，例如， 一個(gè)識(shí)別位于cryl基因內(nèi)的序列，另一個(gè)識(shí)別的序列 位于相連的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列內(nèi)或位于調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)，例如包含本發(fā)明所述cryl基因 的嵌合基因的啟動(dòng)子或3，末端，或兩者都特異性識(shí)別本發(fā)明的cryl基因。 引物優(yōu)選具有15至35個(gè)核苷酸的序列，其在優(yōu)化的PCR條件下"特異性 識(shí)別"本發(fā)明cryl嵌合基因內(nèi)的序列，從而從包含本發(fā)明cryl基因的核酸 樣品中擴(kuò)增特異性片段("整合片段"或有差別的擴(kuò)增子)。這意味著在優(yōu) 化的PCR條件下在植物基因組或外源DNA中僅耙向的整合片段而無其它 序列被擴(kuò)增。適合本發(fā)明的PCR引物是長度范圍從17個(gè)核苷酸至約200個(gè)核苷酸的 寡核苷酸，包含至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選20個(gè)連續(xù)的核苷酸的核苷酸 序列，所述核苷酸序列選自轉(zhuǎn)移至本發(fā)明的植物細(xì)胞或植物中的crylC、 erylB或crylD嵌合基因序列。當(dāng)然，引物可能長于提到的17個(gè)連續(xù)的核苷酸，可能，例如，是20、 21、 30、 35、 50、 75、 100、 150、 200個(gè)核苷酸長或甚至更長。引物可以完 全由選自cryl核苷酸序列的核苷酸序列組成。然而，引物5，端(即，在位 于3，的17個(gè)連續(xù)的核普酸外側(cè))的核苷酸序列是較不重要的。因此，引物的 5 ，序列可以由選自適宜的cry 1嵌合基因序列的核苷酸序列組成，但是可以 含有幾個(gè)(例如1、 2、 5、 IO)錯(cuò)配。引物的5，序列甚至可以完全由與本發(fā)明 的cryl基因不相關(guān)的核苷酸序列組成，例如，代表一個(gè)或多個(gè)限制性酶識(shí) 別位點(diǎn)的核苷酸序列。這樣的無關(guān)序列或具有錯(cuò)配的側(cè)翼DNA序列應(yīng)該優(yōu) 選不超過IOO，更優(yōu)選不超過50或不超過25個(gè)核苦酸。此外，合適的引物可以包含或由在其3，末端跨越連接區(qū)的核苷酸序列 組成，所述連接區(qū)位于本發(fā)明的cryl基因和整合在植物DNA中的cryl嵌合 基因中的相連轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列或調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)序列、拖尾 序列或3，轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序歹J)之間。對(duì)技術(shù)人員立即清楚的是正 確選擇的PCR引物對(duì)還應(yīng)該不包含彼此互補(bǔ)的序列。如這里使用的術(shù)語"引物"涵蓋在依賴模板的過程，例如PCR中能夠 引發(fā)新生核酸的合成的任何核酸。通常，引物是從10至30個(gè)核苷酸的寡核 苷酸，但是可以使用更長的序列。可以以雙鏈形式提供引物，盡管優(yōu)選單 鏈形式。探針可以被用作引物，但是其是被設(shè)計(jì)結(jié)合乾DNA或RNA而無需 用于擴(kuò)增過程。如這里使用的術(shù)語"識(shí)別"當(dāng)指特異性引物時(shí)，指在標(biāo)準(zhǔn)PCR鑒定操 作中特異性引物與本發(fā)明cryl基因中的核^列特異雜交的事實(shí)，其中該這里也包括在生物材料中檢測(cè)本發(fā)明cry 1基因的試劑盒，以及這樣的 試劑盒篩選生物材料的用途。如這里使用的"試劑盒"指為了在生物樣品中鑒定本發(fā)明的cryl基因的目的的一組試劑。更特別的，本發(fā)明的試劑盒 的優(yōu)選的實(shí)施方案包含如上所述的至少一條或兩條特異性引物。任選的， 該試劑盒還可以包含這里描述的在PCR鑒定操作中的任何其它試劑?；?者，根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施方案，該試劑盒可以包含如上所述的特異性 探針，其與生物樣品的核酸特異性雜交以鑒定其中cryl基因的存在。任選 的，該試劑盒還可以包含用于使用特異性探針鑒定生物樣品中的cryl基因 的任何其它試劑(例如但不限于雜交緩沖液，標(biāo)記物)。在本技術(shù)領(lǐng)域中，例如"PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals，第二版，1999)描述了標(biāo)準(zhǔn)PCR操作。包括特異性引物序列到具體說明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在pc:鑒定操作中許多參數(shù)可能需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整，可能需要輕微的修改以獲得相似的結(jié)果。例如，制 備DNA的不同方法的使用可能需要調(diào)整例如使用的引物量、聚合酶和退火 條件。同樣的，選擇其它的引物可能規(guī)定PCR鑒定操作的其它優(yōu)化的條件。 然而，這些調(diào)整對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，而且在(例如以上引用 的)現(xiàn)代PCR應(yīng)用手冊(cè)中被具體描述。根據(jù)本發(fā)明的合適的引物組合的實(shí)例是用于本發(fā)明crylB基因的(序列 5， - 3，) P1B227 (TAC TTC GAA CAG AAA GAA CGA GAA CGA G， SEQ ID No. 20)和P1B228 (GTC CAG CGA AAG GAA CTC CAA GAA， SEQ ID No. 21)，和用于本發(fā)明crylC基因的P1C247 (AAC CTT GAG GGA CTT GGA AAC, SEQ ID No. 22)和P1C252 (AAG ATG AGG GTT TCTGATAGCAG, SEQ ID No. 23)。因此，這里包括編碼殺蟲CrylB或 Cry 1 C蛋白和由這些引物特異性識(shí)別的任何基因，以及使用這樣的或其它 特異性引物檢測(cè)這類基因的任何方法。也可以設(shè)計(jì)特異性標(biāo)記物或標(biāo)記的探針檢測(cè)本發(fā)明的DNA序列，這里 包括定向于本發(fā)明的任何的crylC、 crylB或crylD基因的特異性標(biāo)記物或 探針的任意用途。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特異性標(biāo)記物、引物或標(biāo) 記的探針不檢測(cè)或識(shí)別不含有本發(fā)明cryl DNA序列的任何植物優(yōu)選與測(cè)試植物相同物種的任何植物，特別是任何這樣的標(biāo)記物、引物或標(biāo)記的探針不檢測(cè)或識(shí)別表達(dá)CrylC 、 CrylD或CrylB蛋白而其中不含有本發(fā)明 DNA序歹iJ(例如，這里定義的crylC、 crylD或crylB DNA，例如，包含SEQ IDNo. 1、 3、 4、 6、 8、 10、 12或14中任一核苷酸序列的DNA)的任何植物。 可以輕微修飾本發(fā)明的DNA序列以產(chǎn)生更方便的限制酶位點(diǎn)，或產(chǎn)生 小的改變而不改變功效，不顯著改變(優(yōu)選不改變)其編碼的蛋白質(zhì)。實(shí)際 上，因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，眾所周知大部分氨基酸密碼子可以由其它替 代而不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。而且， 一些氨基酸可以由其它等同的氨 基酸取代，而不顯著改變(優(yōu)選不改變)蛋白質(zhì)的殺蟲活性。而且，在分子 區(qū)域中氨基,列或組成的改變，不同于負(fù)責(zé)結(jié)合或形成孔的那些，較不 可能引起蛋白質(zhì)的殺蟲活性的變化(例如，可以移去Cry 1原毒素的C-末端 部分或由另 一氨基酸序列替代而不影響本發(fā)明Cryl蛋白的殺蟲活性)。本發(fā) 明DNA序列的等同物包括與這里定義的本發(fā)明cryl基因相比具有少于20, 優(yōu)選5-10個(gè)核普酸差異的DNA序列，但是其編碼如這里定義的本發(fā)明的殺 蟲Cryl蛋白。例如以上所述的對(duì)DNA序列的小的修飾可以常規(guī)的，即通過PCR介導(dǎo) 的誘變進(jìn)行(Ho等人，1989， White等人，1989)。使用可獲得的技術(shù)通過 從頭DNA合成期望的編碼區(qū)能夠?qū)NA序列進(jìn)行常規(guī)的更深度的修飾。如這里使用的術(shù)語"編碼"，當(dāng)指編碼蛋白質(zhì)的基因時(shí)，是指把宿主 細(xì)胞的這類基因中含有的編碼序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯而由這類基因產(chǎn)生蛋白質(zhì) 的能力。因此，本發(fā)明的crylCl嵌合基因編碼本發(fā)明的CrylCl蛋白，盡管 此基因含有由非編碼的內(nèi)含子序列中斷的兩個(gè)編碼序列。當(dāng)指本發(fā)明的Cryl蛋白的氨基酸序列時(shí)，使用術(shù)語"基本相同"旨在 包括與蛋白質(zhì)的氨基酸序列相比，差異不超過5%，優(yōu)選不超過2%的氨基 #列；當(dāng)指Cry蛋白的毒性時(shí)，旨在包括在相同的生物測(cè)定條件下(優(yōu)選 在相同的生物測(cè)定中使用來自相同群體和合適對(duì)照的昆蟲)，與所比較蛋白 質(zhì)獲得的LC50值相比，其獲得的LC50值差異不超過2倍，優(yōu)選不超過50% 的蛋白質(zhì)。如這里使用的，"微生物"指僅在顯微鏡幫助下可以觀察到的任何活 的微生物，例如細(xì)菌、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、病毒、真菌。這包括大小在 視覺局限之下的全部普遍的單細(xì)胞微生物，其能夠在實(shí)驗(yàn)室繁殖和操作， 通常是原核或單細(xì)胞真核的生命形式，包括組織培養(yǎng)物和質(zhì)粒。從總DNA制備的本發(fā)明的cryl DNA序列能夠被連接在合適的表達(dá)載 體中，和轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中，然后可以通過常規(guī)檢測(cè)工具來篩選宿 主細(xì)胞中該毒素的存在和表達(dá)。使用本發(fā)明的基因的數(shù)據(jù)庫搜索提示本發(fā)明的DNA序列顯著不同于 任何先前描述的編碼具有抗鱗翅目活性毒素的基因或DNA序列(見，例如， 2006年1月26日版專利申請(qǐng)中描述的DNA序列(Geneseq release 200602), H6fte和Whiteley， 1989; Crickmore等人，1998;以及與Crickmore等人 (1998)出版物對(duì)應(yīng)的Bt命名網(wǎng)站上2005年8月2日更新的內(nèi)容，參 見http:〃www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil一Crickmore/Bt/index.html)。在可獲得的DNA序列數(shù)據(jù)庫中(來自專利或科學(xué)文獻(xiàn))在DNA氷平最接 近的序列同一性是對(duì)于SEQ ID No. l或3的crylC DNA為76.60%,對(duì)于 SEQ ID No. 10的crylB DNA為730/),和對(duì)于SEQ ID No. 14的crylD DNA 為72.5%，在EMBOSS中使用以上定義的Needleman-Wunsch缺省設(shè)置。因 此，假定可獲得的DNA序列數(shù)據(jù)庫是全部已知DNA序列的代表，本發(fā)明的 DNA序列在其核苷酸上與先前已知的DNA序列差異至少23。/。。假定在可獲 得的數(shù)據(jù)庫中含有最接近的序列，這反映了與其相應(yīng)最接近的公開的DNA 序列相比，SEQIDNo. l或3的核苷酸序列有約485個(gè)核苷酸的差異，SEQ ID No. 10的核苷酸序列有約524個(gè)核苷酸的差異，和SEQ ID No. 14的核苷 酸序列有約498個(gè)核苷酸的差異。這一差異對(duì)于SEQ ID No. 4、 6、 8或12 的DNA序列甚至更加明顯，其編碼具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合蛋白。并且，本發(fā)明 的優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA序列(SEQ ID No. 16)(其適合在本發(fā)明的耙植 物中表達(dá))被發(fā)現(xiàn)與在可獲得的DNA序列數(shù)據(jù)庫中鑒定的最接近的DNA序 列相比具有約76.1。/。序列同一性(對(duì)于與SEQ ID No. 16序列等長的部分)， 因此是非常不同的。編碼Cryl蛋白的DNA序列的"殺蟲有效部分(部分或片段)"這里也稱 為"截短的基因"或"截短的DNA"，意指編碼多肽的DNA序列，其比 Cryl蛋白原毒素形式具有更少的氨基酸但是仍然能殺蟲的。為了在重組的宿主(例如大腸桿菌)、在其它Bt菌林或在植物中表達(dá)編 碼本發(fā)明Cry蛋白的DNA序列的全部或殺蟲有效部分，可以在DNA序列側(cè) 翼引入合適的限制酶切位點(diǎn)。可以通過定點(diǎn)誘變，使用眾所周知的操作進(jìn) 行(Stanssens等人，1989; White等人，1989)。為了在植物中獲得提高的 表達(dá)，本發(fā)明的cryl基因是人工的基因，其中該序列通過DNA合成適用于 最佳表達(dá)。在這樣的序列中，通過設(shè)計(jì)包含植物(優(yōu)選靶植物屬或物種)優(yōu) 選密碼子的DNA序列替代抑制最佳表達(dá)的DNA序列而實(shí)現(xiàn)。為了提高在植物中的表達(dá)或當(dāng)其不存在于植物宿主細(xì)胞中(例如，在細(xì) 菌宿主細(xì)胞中)時(shí)阻止殺蟲蛋白的表達(dá)，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，植物 內(nèi)含子是插入在本發(fā)明的嵌合cryl基因中，優(yōu)選在至少一個(gè)本發(fā)明的cryl 基因的編碼序列中。這里可以使用任何已知的植物內(nèi)含子(例如，Brown， 1986， Brown和Simpson, 1998， Brown等人，1996)只要它被有效連接于 編碼序列片段，從而保證正確的剪接即可。通過RT-PCR或Northern印跡 (即RNA分析)或通過技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)任何可以獲得的手段，方便的在靶宿主植 物物種或其細(xì)胞中對(duì)內(nèi)含子的有效連接和產(chǎn)生的正確剪接進(jìn)行檢查。在一 個(gè)實(shí)施方案中在基因中使用雙子葉植物基因的內(nèi)含子以在雙子葉植物細(xì)胞 中表達(dá)，在基因中使用單子葉植物內(nèi)含子從而在單子葉植物中表達(dá)。在一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的內(nèi)含子是如Eckes等人(1986)所述的馬鈴薯光誘導(dǎo) 型的組織特異性ST-LS1基因的第二內(nèi)含子，例如，在核苷酸位置672和862 之間的SEQIDNo. l的核苷齡列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，植物內(nèi) 含子被引入任意的Bt殺蟲蛋白編碼序列，特別是SEQIDNo. l核苦酸位置 672和862之間的內(nèi)含子，從而其在植物細(xì)胞中被有效剪接?？梢允褂贸Ｒ?guī) 技術(shù)，例如RT-PCR、 Northern印跡或檢測(cè)在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的功能蛋白 質(zhì)來測(cè)量在植物細(xì)胞中有效的剪接。當(dāng)然，為了有效的剪接，需要將內(nèi)含 子插入在編碼序列的正確位置中，從而在序列中獲得功能性的5，和3，剪接位點(diǎn)。本發(fā)明的兩個(gè)cry基因，以SEQ ID No. l和3為例，各自在不同位置 含有植物內(nèi)含子，經(jīng)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在甘藍(lán)植物細(xì)胞中都蜂皮有效剪接， 產(chǎn)生編碼期望的Cry蛋白的mRNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，蛋白質(zhì)靶向于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，例如質(zhì)體 (優(yōu)選葉綠體)、線粒體，或從細(xì)胞分泌，可能優(yōu)化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和/或表達(dá)。 為此目的，本發(fā)明的嵌合基因包含編碼信號(hào)或靶向肽的編碼區(qū)，連接于本 發(fā)明的Cry蛋白編碼區(qū)。包括在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的特別優(yōu)選的肽是耙向 葉綠體或其它質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，尤其是來自其基因產(chǎn)物是靶向質(zhì)體的植物基 因的重復(fù)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域，優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽由Lebrun等人(1996)或Capdlades 等人(美國專利5，635，618)描述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽、來自葭菜的鐵氧還蛋白-NADP十 氧化還原酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Oelmuller等人，1993)、 Wong等人(1992)描述的轉(zhuǎn)運(yùn) 肽和在公開的PCT專利申請(qǐng)WO 00/26371中的耙向肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí) 施方案中，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽包含SEQIDNo. 17中氨基酸位置3至氨基酸位置 124的序列或其變體，例如包含SEQIDNo. 17中氨基酸位置3至氨基酸位 置124的序列的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其中在SEQIDNo. 17中位置55處的Cys氨 基酸是由Tyr替代，和/或其中在SEQ ID No. 17中位置51處的Gly氨基酸之 后添加Gly氨基酸。還優(yōu)選將與其連接的蛋白質(zhì)通過信號(hào)傳遞分泌到細(xì)胞 外的肽，例如馬鈴薯蛋白水解酶抑制劑II的分泌信號(hào)(Keil等人，1986)、水 稻a-淀粉酶3基因的分泌信號(hào)(Sutliff等人，1991)和煙草PR1蛋白的分泌信 號(hào)(Cornelissen等人，1986)。根據(jù)本發(fā)明特別有用的信號(hào)肽包括質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(例如，Van Den Broeck 等人(1985))或?qū)⒌鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體的美國專利5, 510，471和美國專利 5，635，618的優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、分泌信號(hào)肽或?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向至其它質(zhì)體、 線粒體、ER或另一細(xì)胞器的肽。在天然靶向或分泌的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了把向 至細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或分泌到植物細(xì)胞外或至細(xì)胞壁的信號(hào)序列，優(yōu)選由 K化sgen等人(1989)、 KWsgen和Weil (1991)、 Neuhaus & Rogers (1998)、 Bih等人(1999)、 Morris等人(1999)、 Hesse等人(1989)、 Tavladoraki等人 (1998)、 Terashima等人(1999)、 Park等人(1997)、 Shcherban等人(1995)描述的那些，其全部在此被并入作為參考，特別是來自蕓苔植物物種、玉米、 棉花或大豆的靶向或分泌蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列。編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的優(yōu)選的DNA^列是包含SEQ ID No. 16中從核苷酸位置7至核苷酸位置371 的序列，特別是SEQ ID No. 16的序列的DNA。而且，對(duì)于任何把昆蟲害蟲，可以使用本領(lǐng)域公知的方法(例如，Van Rie等人，1990)，對(duì)本發(fā)明的Cry蛋白的結(jié)合特性進(jìn)行評(píng)估，以確定本發(fā)明 的Cry蛋白是否結(jié)合靶昆蟲中腸上其它Cry或非Cry蛋白不能識(shí)別(或竟?fàn)? 的位點(diǎn)。除這里的任一cryl基因之外，也在植物中表達(dá)結(jié)合有關(guān)敏感昆蟲 中不同結(jié)合位點(diǎn)的其它Bt毒素或具有不同作用模式的從Bt菌林或其它來 源衍生的其它毒素(例如VIP毒素或昆蟲(腸)蛋白水解酶抑制劑)，，這對(duì)于 阻止或延遲昆蟲對(duì)表達(dá)殺蟲毒素植物的抗性發(fā)展是非常有價(jià)值的。因?yàn)樾?的cryl基因的特征，它們對(duì)于轉(zhuǎn)化植物，例如，單子葉植物，例如玉米或 小麥，或雙子葉植物，例如棉花、大豆和蕓莒物種植物，保護(hù)這些植物免 受昆蟲損害是非常有用的。尤其對(duì)于特定昆蟲害蟲控制昆蟲抗性的目的而言，優(yōu)選將本發(fā)明的 crylC基因與編碼不同昆蟲控制蛋白的其他基因，特別是Bt晶體蛋白組合， 所述Bt晶體蛋白不識(shí)別在靶昆蟲中由這類CrylC蛋白識(shí)別的至少一個(gè)結(jié)合 位點(diǎn)。優(yōu)選的昆蟲控制蛋白與本發(fā)明的CrylC蛋白組合，特別是在才直物(優(yōu) 選蕓苔物種植物，特別是巻心菜和花椰菜)中同時(shí)表達(dá)，所述優(yōu)選的昆蟲控 制蛋白包括本發(fā)明的CrylB蛋白或本發(fā)明的CrylD蛋白、VIP3Aa蛋白或其 毒性片段(如在Estmch等人，1996和美國專利6，291，156中所述)，或來自 致病桿菌(X^WOf/jfl6dw51)、沙雷菌屬0^/Ttfft'fl)或發(fā)光桿菌(J^oto/^a6fir"s) 物種菌林的殺蟲蛋白(例如，Waterfield等人，2001; ffrench-Constant和 Bowen， 2000)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用本發(fā)明的cryl基因轉(zhuǎn)化已經(jīng)表 達(dá)昆蟲控制蛋白的植物獲得這樣的共表達(dá)，或通過用昆蟲控制蛋白轉(zhuǎn)化的 植物與用本發(fā)明的cryl基因轉(zhuǎn)化的植物雜交獲得這樣的共表達(dá)。對(duì)于蕓苔 物種植物，優(yōu)選使用cryl基因作為第一基因，使用CrylB、 CrylD或VIP3Aa 蛋白或其變體或衍生物作為第二基因。在最小化或阻止對(duì)轉(zhuǎn)基因昆蟲抗性植物的抗性發(fā)展的努力中，為了在相同植物中獲得不同Bt (或類似的，其 它昆蟲控制蛋白)殺蟲蛋白的表達(dá)的方法描述在歐洲專利0 408 403中。在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物中，本發(fā)明的 cry 1 C基因是位于與笫二昆蟲控制基因，例如CrylB或CrylD基因相同的一 個(gè)基因座上，從而這些基因在這樣的植物細(xì)胞或植物后代中不分離。出于選擇目的，也為了增加雜草控制選擇，優(yōu)選用DNA轉(zhuǎn)化本發(fā)明的 轉(zhuǎn)基因植物，所述DNA編碼失活廣i普除草劑的蛋白質(zhì)，或編碼的蛋白質(zhì)是 除草劑的蛋白質(zhì)靶標(biāo)的變體，但是該蛋白質(zhì)變體對(duì)這類除草劑，例如，基 于草胺膦或草甘膦的除草劑是不敏感的。編碼Cry原毒素的殺蟲有效部分的殺蟲有效的cryl基因，優(yōu)選cryl嵌合 基因，能夠以常規(guī)方式穩(wěn)定插入植物細(xì)胞的細(xì)胞核基因組，并且可以以常 規(guī)方式使用這樣轉(zhuǎn)化的植物以產(chǎn)生昆蟲抗性的轉(zhuǎn)化植物。在這方面，在農(nóng) 桿菌，例如根癌農(nóng)桿菌中含有殺蟲有效的cryl基因部分的卸甲Ti質(zhì)?？捎?于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并使用下列方法從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物，所 述方法例如，在EP 0 116 718、 EP 0 270 822、 PCT公開WO 84/02913和公 開的歐洲專利申請(qǐng)("EP，， ) 0 242 246和在DeBlock等人(1989)中所述。優(yōu) 選的T說粒載體在T說粒的T-DNA的邊界序列之間部分，或至少位于TLf 粒的T-DNA的右邊界序列的左邊，各自含有殺蟲有效的cry基因。當(dāng)然， 可以使用其它類型的栽體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，使用操作例如直接基因轉(zhuǎn)移(例如 如EP 0 233 247所述)、花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如如EP 0 270 356、 PCT公開WO 85/01856和美國專利4,684,611中所述)、植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如如 EP 0 067 553和美國專利4，407，956中所述)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如如美國 專利4，536，475中所迷)和其它方法，例如轉(zhuǎn)化某些玉米品系的方法(例如， 美國專利6，140，553; Fromm等人，1990; Gordon-Kamm等人，1990)和 廣泛轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法(PCT公開WO 92/09696)。對(duì)于棉花轉(zhuǎn)化，特別 優(yōu)選在PCT專利公開WO 00/71733中描述的方法。對(duì)于大豆轉(zhuǎn)化，參考本 領(lǐng)域公知的方法，例如，Hinchee等人(1988)和Christou等人(1990)或WO 00/42207的方法。而且，除了細(xì)胞核基因組的轉(zhuǎn)化，本發(fā)明還包括質(zhì)體基因組，優(yōu)選葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化。Kota等人(1999)已經(jīng)描述了在煙草葉綠體中表達(dá) Cry2A蛋白的方法，Lin等人(2003)描述了在質(zhì)體轉(zhuǎn)基因(transplastomic)煙 草植物中crylC基因的表達(dá)。在常規(guī)植物培育方案中使用產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的植物來產(chǎn)生具有相同特征的 更多轉(zhuǎn)化的植物或在相同或有關(guān)植物物種的其它品種中引入有效殺蟲的 cry基因部分。從轉(zhuǎn)化的植物獲得的種子含有有效殺蟲的cry基因部分作為 穩(wěn)定的基因組插入片段。將有效殺蟲的cryl基因，優(yōu)選SEQIDNo. 1、 3、 4或6的序列插入植物 細(xì)胞基因組，從而使該插入基因位于啟動(dòng)子的下游(即，3，)，在其控制下， 所述啟動(dòng)子能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)基因的表達(dá)(這里稱為"植物可表達(dá)的啟 動(dòng)子")。這優(yōu)選是在植物細(xì)胞基因組，特別是在細(xì)胞核或質(zhì)體(例如，葉 綠體)基因組中通過插入包含植物可表達(dá)的啟動(dòng)子的cry 1嵌合基因而實(shí)現(xiàn)。 優(yōu)選的植物可表達(dá)的啟動(dòng)子包括分離林CM1841(Gardner等人，1981)、 CabbB-S (Franck等人，1980)和CabbB-JI (Hull和Howell, 1987)的花椰菜 花葉病毒(CaMV)強(qiáng)組成型35S啟動(dòng)子("35S啟動(dòng)子")；由Odell等人(1985) 所述的35S啟動(dòng)子、來自泛素家族的啟動(dòng)子(例如，玉米泛素啟動(dòng)子，見 Christensen等人，1992，也見Cornejo等人，1993)、 gos2啟動(dòng)子(de Pater 等人，1992)、 emu啟動(dòng)子(Last等人，19卯)、擬南芥肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(例如 由An等人(1996)所述的啟動(dòng)子)、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(例如由Zhang等人 (1991)所述的啟動(dòng)子)；木薯葉脈花葉病毒的啟動(dòng)子(WO 97/48819, Verdaguer等人(1998))、來自地下三葉草矮化病毒的pPLEX系列啟動(dòng)子 (WO 96/06932),特別是由Boevink等人(1995)或Schiinmann等人(2003)所述 的衍生自地下三葉草矮化病毒基因組區(qū)段4或7的重復(fù)啟動(dòng)子區(qū)(這里稱為 "S7S7"或"S4S4"啟動(dòng)子)、乙醇脫氬酶啟動(dòng)子(例如，pAdhlS (GenBank 登錄號(hào)X04049、 X00581))和分別驅(qū)動(dòng)T-DNA的1，和2，基因表達(dá)的TR1，啟動(dòng) 子和TR2，啟動(dòng)子(分別是"TR1，啟動(dòng)子"和"TR2，啟動(dòng)子")(Velten等人， 1984)?；蛘撸梢岳梅墙M成型而是對(duì)植物的一種或多種組織或器官(例如，葉和/或4艮)特異的啟動(dòng)子，藉此，插入的cry基因部分僅在特異性組織 或器官的細(xì)胞中表達(dá)。例如，通過將有效殺蟲基因部分置于在光誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子的控制下，有效殺蟲的cry基因部分能夠在植物(例如，玉米、棉花)的 葉中選擇性表達(dá)，所述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如該植物本身或另 一植物(例如豌 豆)的核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動(dòng)子，如在美國專利 5，254，799中所公開?；蛘呤褂闷浔磉_(dá)是誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，優(yōu)選創(chuàng)傷例如昆 蟲進(jìn)食誘導(dǎo)型的，例如，由Cordera等人(1994)所述的MPI啟動(dòng)子，或農(nóng)桿 菌TR2，或甘露堿合酶啟動(dòng)子(Velten等人，1984)或化學(xué)因子誘導(dǎo)型的啟動(dòng) 子。優(yōu)選殺蟲有效的cry基因部分插入植物基因組從而使插入的基因部分 位于適宜3，末端轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)(即，轉(zhuǎn)錄形成和多聚腺苷酸化信號(hào))的上游 (即，5')。這優(yōu)選通過在植物細(xì)胞基因組中插入cryl嵌合基因完成。優(yōu)選的 多聚腺苦酸化和轉(zhuǎn)錄形成信號(hào)包括以下基因3，非翻譯區(qū)的那些信號(hào)來自 黃頂菊的NADP蘋果酸酶基因(Marshall等人，1996)、胭脂堿合酶基因 (Depicker等人，1982)、章魚堿合酶基因(Gielen等人，1984)和T-DNA基因 7(Velten和Sche11， 1985)，其在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中作為3，非翻譯DNA序列 起作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將至少一種，優(yōu)選至少2種本發(fā)明的基因 轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物，所述植物選自玉米、棉花、水田芥、辣根、芥末、M 菜、水芽、蘿卜、蕓苔、大豆、蔬菜植物、十字花科植物物種、蕓苔屬植 物物種例如花椰菜、巻心菜、大白菜、蕪菁、芥、油菜、羽衣甘藍(lán)、綠花 椰菜、抱子甘藍(lán)、菠菜等。具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中通過本發(fā) 明的基因保護(hù)下列蕓苔屬物種植物免受昆蟲損害埃塞俄比亞芥、及 e/￡mgflto、地中海圓白菜、芥菜型油菜、歐洲油菜、胍兒菜、白芥(fi. A,Wa)、 塌菜(5. ros"/fl尸&)、，繁、芥、甘藍(lán)、B. /7ervi>7V//s、蕪青、r"/ es,W51、丑.scprice/w、 A tow恥/wft7等，特別是植物種甘藍(lán)(例如亞種花椰菜甘藍(lán)(Ao^v泡)和結(jié)球 甘藍(lán)(cfl/;i似to))或歐洲油菜，以及下列屬的植物蘿卜屬(及"/^朋M"(例如蘿 卜5fl《/v"s))、辣才艮屬(Jr附om"'fl)(例如辣才艮(A r"W/cflrtfl))、 山崳菜屬(『fls"W")(例如日本山脊菜(『./'fl/w"i'c"))、芝麻菜屬(Er"oi)(例如芝麻菜(五. vm/owiVi))、豆瓣菜屬(/V"^wft'ww)(例如豆瓣菜(AC cy^c/""/e))和獨(dú)4亍菜屬 (丄e尸W"附)(例如家獨(dú)行菜(丄.Mft'VM附))。本發(fā)明包括用本發(fā)明的至少一種 或兩種基因轉(zhuǎn)化的以上列出的蕓苔屬物種植物，例如本發(fā)明的crylB和 crylC基因，以及與含有本發(fā)明基因的有關(guān)植物(包括有關(guān)植物物種的植物) 雜交或育種之后獲得的植物。這樣的雜交或育種可以使用本領(lǐng)域公知的傳 統(tǒng)育種技術(shù)完成，但是也包括公知的體外操作，例如胚復(fù)蘇、原生質(zhì)體融 合等。本發(fā)明因此還涉及含有本發(fā)明基因(例如本發(fā)明的co;/丑和co;7C基因) 的蕓莒屬植物，例如歐洲油菜、蕪青、芥菜或埃塞俄比亞芥，轉(zhuǎn)化的甘藍(lán) 植物或其子代雜交而獲得，或涉及含有本發(fā)明基因(如本發(fā)明的co^B和 0^C基因)的甘藍(lán)植物，與轉(zhuǎn)化的歐洲油菜植物雜交而獲得，涉及這樣的 植物的用途。還可以使用植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中大量產(chǎn)生本發(fā)明的蛋 白質(zhì)，例如，產(chǎn)生Cryl蛋白，在正確形成之后，其然后可以施用于作物。 當(dāng)提到這里制備的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞時(shí)，是指如在分離物或組織培養(yǎng)物中的 植物細(xì)胞(又或植物原生質(zhì)體)，或指在植物或分化的器官或組織中含有的 植物細(xì)胞(或原生質(zhì)體)，這里明確包括兩種可能性。因此，在說明書或權(quán) 利要求書中提到植物細(xì)胞并非僅意指在培養(yǎng)物中的分離的細(xì)胞，而是指任 何植物細(xì)胞，其可位于或在其可能存在于任何類型的植物組織或器官中。也可以使用編碼抗鱗翅目蛋白的全部或部分的本發(fā)明的cryl基因轉(zhuǎn)化 細(xì)菌，例如對(duì)鱗翅目或鞘翅目具有殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌。藉此，可 以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的Bt菌林，其對(duì)于抗擊廣i瞽的鱗翅目和鞘翅目昆蟲害蟲或抗擊 額外的鱗翅目昆蟲害蟲是有用的。使用摻入合適的克隆載體中的本發(fā)明的 cryl基因轉(zhuǎn)化細(xì)菌，例如假單胞菌屬、農(nóng)桿菌屬、芽孢桿菌屬或埃希氏菌 屬的細(xì)菌，可以以常規(guī)的方式進(jìn)行，優(yōu)選使用如在Mahillon等人(1989)和 在PCT專利公開WO 90/06999中所述的常規(guī)的電穿孔技術(shù)進(jìn)行。可以通過常規(guī)方法發(fā)酵含有本發(fā)明CfJ基因的芽孢桿菌種菌抹(Dulmage， 1981;Bernhard和Utz， 1993)以提供高產(chǎn)量的細(xì)胞。在眾所周知的合適的條件下(Dulmage， 1981)，這些菌林各自生成孢子以高產(chǎn)量產(chǎn) 生含有Cry原毒素的晶體蛋白?？梢允褂糜胏fy基因轉(zhuǎn)化的微生物，或優(yōu)選其相應(yīng)的Cry蛋白或Cry原 毒素、毒素或有效殺蟲的原毒素部分作為活性成份，連同合適的載體、稀 釋劑、乳化劑和/或分散劑以常規(guī)方式配制本發(fā)明的殺蟲的，特別是抗鱗翅 目的組合物(例如，由Bernhard和Utz， 1993所述)。這種殺蟲組合物可以4皮 配制為可濕性粉劑、丸劑、顆粒劑或粉塵劑(dust)或使用水性或非水性溶劑 配制為液體劑型，如泡沫劑、凝膠劑、混懸劑、濃縮液等。根據(jù)本發(fā)明，控制昆蟲，特別是鱗翅目昆蟲的方法可以包括向要保護(hù) 的地方(地區(qū))施用(例如，噴霧)殺蟲量的Cry蛋白或用本發(fā)明的cry基因轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞。要保護(hù)的地方可能包括，例如，昆蟲害蟲的棲息地或正在生 長的植物或其中要培育植物的地區(qū)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用本發(fā)明的cryl基因或Cryl蛋白 抑制的昆蟲包括選自以下組成的組的昆蟲小菜蛾(尸/ 紐//<1 j^/wte//a)、甜 菜夜蛾(iS"d一mz e喊"fl)、棉貪夜蛾(5^ofifc;ptef" //加m斷、草地貪夜蛾 (5^/印,mi ,"g—n/a)、粉紋夜蛾(7Wc/ro/ /腦.""/)、 煙芽夜蛾0^//。幼/5 W/^ce"s)、甘藍(lán)夜域(Ma附e"/Yi6msw'cfle)、 大菜粉蝶(尸/eWs Am柳'aie)、 煙 草天織(Mfl"cf"cflf sexto)、 云杉巻葉斌/w/my"em"fl)、 Ororistowewa occzWe""http://^著蔽斜條巻葉域(C/ro"'W"wewm msflceimflf)、竭 巻域(戶flWflfe附/S p^TMS朋fl)、 荷蘭石竹小巻域(P/fl印朋,fl加/to"fl)、 舞毒械(JL>7Mflrt、 白斑天幕毛蟲(Og^i'fl /e"casrig附fl)、 森林天幕毛蟲 (Affl/aawtf附"/sW"Vi) 、 /Lfl/wA/nayisce//"/^ 二化螺(Ot//。 s"/;/^柳ff嗣、斑 禾草螟、 三化螟(iSWiyop/fflfgff ZwcC"/as)、 橘帶巻蛾 (J,gyrWfle"/fl c/fr""")、 萊粉蝶(」r^^iVi rflt/m)、 黑楊葉曱(C/r，o附e/fl sm]p,fl)、玉米螟(0欲/"/flr ww緒a/Zs)、大豆夜械(i^em/o/ /腦Vi /"c/"flfews)和松 異帶蛾(7%""附"0/ 0^1/;/印oai附/m)。在一個(gè)實(shí)施方案中，小菜蛾是優(yōu)選的 靶昆蟲害蟲。這是在幾種具有十字花的植物，特別是十字花科(必mM/aicflefl) 植物中導(dǎo)致重大損失的廣泛分布的物種。由本發(fā)明的基因編碼的CrylC、CrylB和CrylD蛋白對(duì)于控制這一昆蟲是特別有用的，例如，通過在植物 的細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的基因?？梢酝ㄟ^在田地中栽培或種植包含任一本發(fā)明crylC基因的植物，或 通過在被這類昆蟲感染的植物中或植物上獲得本發(fā)明定義的CrylC蛋白的 存在(例如，通過播種或栽培用本發(fā)明的crylCl或crylC2基因轉(zhuǎn)化的蕓苔 屬物種植物，例如巻心菜或花椰茱植物，或噴灑含有本發(fā)明的CrylC蛋白 的組合物)來控制這類昆蟲。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的cryl基因，至少是 crylCl或crylC2基因，在植物中用來保護(hù)其對(duì)抗鱗翅目昆蟲害蟲的用途， 優(yōu)選與本發(fā)明的cry 1B或cry 1D基因組合。在本發(fā)明中，還提供編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的修飾的編碼序列。這樣的編 碼序列具有適于在植物，特別是十字花科植物例如甘藍(lán)或歐洲油菜，尤其 是巻心菜、花椰菜或油菜(蕓苔)中高表達(dá)的密碼子使用。在本發(fā)明的一個(gè) 實(shí)施方案中，修飾的轉(zhuǎn)運(yùn)肽包含SEQIDNo.l6中從核苷酸位置7至核苷酸 位置371的核苷酸序列，特別是SEQIDNo. 16的序列。本發(fā)明也包括包舍 本發(fā)明的修飾的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列的植物細(xì)胞、植物或種子，以及這種轉(zhuǎn)運(yùn) 肽編碼序列將任何蛋白質(zhì)靶向蔬菜植物的葉綠體，特別是蕓苔屬物種植物 的葉綠體的用途。在權(quán)利要求書的措辭中反映了本發(fā)明的這些和/或其它實(shí)施方案，其形 成本發(fā)明的說明部分。下列實(shí)施例舉例說明本發(fā)明，其并非被提供用于限制本發(fā)明或保護(hù)的 范圍。除非另外說明，全部重組DNA技術(shù)的執(zhí)行是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作，如在以 下文獻(xiàn)中所述Sambrook等人(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Molecular Cloning : A Laboratory Manual)， 第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press ， NY和Ausubel等人(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA的第1和2巻。植物分子工作 的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.D. Croy的Plant Molecular Biology Labfax (1993)，由BIOS科學(xué)出版公司(UK)和Blackwell科學(xué)出版社，UK出版。在實(shí)施例、權(quán)利要求書和說明書中述及的所附的序列表如下序列表SEQ ID No. 1:在位置672包含內(nèi)含子的優(yōu)化的crylCl編碼序列 SEQ ID No. 2:由SEQ ID No. l編碼的CrylCl蛋白的氨基酸序列 SEQ ID No. 3:優(yōu)化的crylC2編碼序列，在位置489包含內(nèi)含子 SEQ ID No. 4:優(yōu)化的crylC3編碼序列，包含SEQ ID No. l和SEQ IDNo. 16的序列，編碼具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合蛋白SEQ ID No. 5:由SEQ ID No. 4編碼的CrylC3蛋白SEQ ID No. 6:優(yōu)化的crylC4編碼序列，包含SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 16的序列，編碼具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合蛋白SEQ ID No.7:由SEQ ID No. 6編碼的CrylC4蛋白SEQ ID No.8:優(yōu)化的crylBl編碼序列，包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列SEQ ID No.9:由SEQIDNo. 8的序列編碼的CrylBl蛋白SEQ ID No.10:優(yōu)化的cry 1B2編碼序列SEQ ID No.11:由SEQIDNo. 10的序列編碼的CrylB2蛋白SEQ ID No.ir-優(yōu)4匕的crylDl編碼序列，包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列SEQ ID No.is:由SEQ ID No. 12的序列編碼的CrylDl蛋白SEQ ID No.14:優(yōu)化的crylD2編碼序列SEQ ID No.15:由SEQ ID No. 14的序列編碼的CrylD2蛋白SEQ ID No.16:編碼優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列SEQ ID No.17:由SEQIDNo. 16的序列編碼的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽SEQ ID No.18:重復(fù)的S7地下三葉草矮化病毒啟動(dòng)子序列(S7S7)SEQ ID No.19:重復(fù)的S4地下三葉草矮化病毒啟動(dòng)子序列(S4S4)SEQ ID No.20:crylB基因引物PlB227SEQ ID No.21:crylB基因引物PlB228SEQ ID No.22:crylC基因引物PlC247SEQ ID No.23:crylC基因引物PlC252實(shí)施例1 .嵌合基因和轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建使用重組技術(shù)設(shè)計(jì)和組裝幾種C^^基因以獲得在植物中具有最佳表現(xiàn) 的基因。為在植物細(xì)胞中最佳表達(dá)而設(shè)計(jì)的c/^C7 DNA是以SEQ ID No. l表 示。此DNA編碼本發(fā)明的殺蟲CrylCl蛋白(SEQIDNo.2)。為了轉(zhuǎn)化植物， 構(gòu)建包含下列有效連接元件(5，至3，)的第一嵌合基因(ci^C7嵌合基因)包 含衍生自地下三葉草矮化病毒基因組區(qū)段7的重復(fù)的啟動(dòng)子區(qū)(S7S7啟動(dòng) 子，Boevink等人，1995， SEQ ID No. 18)的啟動(dòng)子、稻絨氈層特異性的E1 基因(GEl)的前導(dǎo)序列(Michiels等人，1992)、在位置672包含馬鈴薯光誘 導(dǎo)型的組織特異性ST-LSl基因的第二內(nèi)含子(Eckes等人，1986)的crylCl DNA (SEQ ID No. 1),和包括來自黃頂菊的NADP蘋果酸酶基因的3，非翻譯 區(qū)(3，Mel， Marshall等人，1996)的序列。制備類似的crylC嵌合基因，其中ST-LSl內(nèi)含子2位于crylC DNA (即， crylC2 DNA)的位置489，這是crylC2嵌合基因，其它的構(gòu)建與crylCl嵌 合基因完全相同。為了確保將CrylC蛋白靶向至植物細(xì)胞葉綠體，構(gòu)建crylCl和crylC2 嵌合基因的變體，其如Lebrun等人(1996)所述包含編碼優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的修 飾序列，該序列有效連接于crylC編碼區(qū)從而使轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合蛋白在植物細(xì) 胞中表達(dá)。這些是分別包含crylC3和crylC4編碼序列的crylC3和crylC4 嵌合基因，其各自含有SEQ ID No. 16的修飾的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列， CrylC3 DNA序列顯示于SEQ ID No. 4,其為SEQ ID No. l的crylCl序列 與SEQ ID No. 16的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列的融合。CrylC4 DNA序列顯示于SEQ ID No. 6，其為SEQ ID No. 3的crylC2序列與SEQ ID No. 16的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼 序列的融合。為在植物細(xì)胞中最佳表達(dá)而設(shè)計(jì)的crylBl DNA表示為SEQ ID No. 8。 此DNA編碼本發(fā)明的殺蟲CrylBl蛋白(SEQIDNo. 9)。為了轉(zhuǎn)化植物，構(gòu) 建包含下列有效連接的元件(5，至3，)的嵌合基因(crylBl嵌合基因)包含衍生自地下三葉草矮化病毒基因組區(qū)段4的重復(fù)的啟動(dòng)子區(qū)(S4S4啟動(dòng)子， Boevink等人，1995， SEQ ID No. 19)的啟動(dòng)子、稻E1基因(GE1)的前導(dǎo)序 歹iJ(Michiels等人，1992)、包含SEQ ID No. 16的修飾的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列 的crylBl DNA、和包括來自黃頂菊的NADP蘋果酸酶基因的3，非翻譯區(qū)(3' Mel， Marshall等人，1996)的序列。使用crylB2 DNA (SEQ ID No. IO)還制備了第二種形式的crylB嵌合 基因，其中不含有編碼優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，從而植物細(xì)胞中發(fā)生CrylB 蛋白的細(xì)胞質(zhì)累積。這是CrylB2嵌合基因。為在植物細(xì)胞中優(yōu)化表達(dá)而設(shè)計(jì)的crylDl DNA表示為SEQ ID No. 12。此DNA編碼本發(fā)明的殺蟲CrylDl蛋白(SEQ ID No. 13)。為了轉(zhuǎn)化植 物，構(gòu)建包含下列有效連接的元件(5，至3，)的嵌合基因(crylDl嵌合基因) S4S4啟動(dòng)子(SEQ ID No. 19)、稻El基因(GEl)的前導(dǎo)序歹寸(Michiels等人， 1992)、包含SEQIDNo. 16的修飾的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的crylDlDNA、和 包括來自黃頂菊的NADP蘋果酸酶基因的3，非翻譯區(qū)(3， Mel， Marshall等 人，1996)的序列。使用cryl D2 DNA還制備了第二種形式的crylD嵌合基因，其中不含有 編碼優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，從而植物細(xì)胞中發(fā)生CrylD蛋白的細(xì)胞質(zhì)累積。 這是CrylD2嵌合基因。制備DNA轉(zhuǎn)化載體(pTlC4Bl)，其在T-DNA邊界之間以從頭到尾的方 向包含crylC4嵌合基因和crylBl嵌合基因(3，Mel-crylC4-GEl前導(dǎo)序列 -8787-8484-?！?前導(dǎo)序列《^181-3，]\161);以及轉(zhuǎn)移載體(pTlC2B2),其基因(3，Mel-crylC2國GEl前導(dǎo)序列國S7S7-S4S4-GE1前導(dǎo)序列 畫crylB2-3，Mel)。以這樣的方式，利用兩種T-DNA載體，本發(fā)明的crylC 和crylB基因?qū)⒏∑す厕D(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，將在成功轉(zhuǎn)化之后位于一個(gè)基因座 上。構(gòu)建相似的T-DNA載體，其含有以上crylC嵌合基因，但是含有 crylDl或crylD2嵌合基因代替以上crylB嵌合基因作為笫二嵌合基因。還構(gòu)建了三聯(lián)cry基因轉(zhuǎn)化載體，同時(shí)包含crylC、 crylD和crylB基因(全部或 者具有或者沒有修飾的轉(zhuǎn)運(yùn)肽)。含有本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)化栽體衍生自pGSCr700 (Cornelissen和Vandewiele, 1989)。該載體骨架含有下列基因元件a) 質(zhì)粒核心，包含在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322(Bolivar等人，1977) 的復(fù)制起點(diǎn)和在4艮癌農(nóng)桿菌中復(fù)制的來自假單胞菌質(zhì)粒pVSl (Itoh等人， 1984)的復(fù)制起點(diǎn)的限制片段。b) 可選擇的標(biāo)記基因，為在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中增殖和選擇該質(zhì) 粒賦予對(duì)鏈霉素和壯觀霉素0 ^)的抗性。c) DNA區(qū)，包括來自轉(zhuǎn)座子Tn903 (Oka等人，1981) w/ "基因的新霉 素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列的片段。各個(gè)轉(zhuǎn)化載體的T-DNA區(qū)也含有嵌合的Zuw基因作為可選擇標(biāo)記基 因。表達(dá)Aw基因使能夠產(chǎn)生酶(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，其代謝除草劑草胺 膦，因此在植物中賦予其對(duì)除草劑的抗性。該嵌合6"r基因包含來自花椰菜 花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄物(Odell等人，1985)的35S3啟動(dòng)子區(qū)、如Thompson等人 (1987)所述吸7jC鏈霉菌(&r印to附j(luò);c^ /0^wc印Zcws)的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶 基因的kr編碼序列、和來自pT汀37 (Depicker等人，1982) T-DNA的胭脂 堿合酶基因3，非翻譯區(qū)的3，轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化序列。還構(gòu)建了與所迷相似的轉(zhuǎn)化載體，其中使用crylCl或crylC3嵌合基因 (與以上crylC基因相似，但是在位置489具有ST-LS1內(nèi)含子)。也構(gòu)建了 含有以上所述的crylBl或crylB2嵌合基因、或crylDl或crylD2嵌合基因的 這些載體。在用于植物轉(zhuǎn)化之前，通過限制酶消化分析和DNA測(cè)序?qū)θ繕?gòu)建的 質(zhì)粒進(jìn)行確認(rèn)是正確的。2.植物轉(zhuǎn)化和再生使用常規(guī)方法將以上含有本發(fā)明的crylC和crylB基因的轉(zhuǎn)化載體 pTlC4Bl和pTlC2B2轉(zhuǎn)移進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌菌林用于轉(zhuǎn)化。使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化花椰菜和巻心菜植物。通過在70。/。乙醇中浸泡然后浸 沒在6Vo漂白劑中對(duì)結(jié)球甘藍(lán)(5nws/ca ofe/wcfl cfl/ /toto)(巻心菜)或花 椰菜(5msw'ctf o/emcM v"r. ^//^/s)(菜花)的種子滅菌。然后用無菌水清洗 種子，轉(zhuǎn)移至含有基于MS的培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于玻璃容器 中，在24。C孵育5-8天。切下0.5-0.7 cm的下胚軸外植體，置于具有合適激 素的液體培養(yǎng)基中。向培養(yǎng)基加入帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌，使終濃度 為lxl(f個(gè)細(xì)菌/ml。在共培養(yǎng)期之后，在具有合適抗生素和激素的液體培 養(yǎng)基中清洗外植體，在濾紙上沾干。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)外植體一周，該培養(yǎng)基含有5 mg/l硝酸銀 和250 mg/I的Triacillin和羧節(jié)西林，以及IO mg/l膦絲菌素用于選擇轉(zhuǎn)化事 件。每兩周將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基。每周檢查外植體的愈傷組織形 成。從外植體切下愈傷組織，轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將芽轉(zhuǎn)移到具有生根 培養(yǎng)基的塑料容器中。芽置于此培養(yǎng)基中直至其被標(biāo)準(zhǔn)化或生根。如果它 們大小在3-10cm，具有良好發(fā)育的根系統(tǒng)，則將它們轉(zhuǎn)移至溫室。也使用根癌農(nóng)桿菌用crylC和crylB基因轉(zhuǎn)化油菜植物。在常規(guī)的轉(zhuǎn)化 和再生方法，例如由De Block等人(1989)所述的方法中使用歐洲油菜的下胚 軸外植體。3.轉(zhuǎn)化體的分析轉(zhuǎn)化的植物^皮一經(jīng)再生，使用PCR和Southern (即DNA)分析以確認(rèn)轉(zhuǎn) 基因的整合。使用免疫分析，例如CrylC-和CrylB-特異性ELISA測(cè)定或蛋 白質(zhì)印跡選擇顯示CrylC和CrylB蛋白的最佳表達(dá)水平的那些轉(zhuǎn)化的植 物。對(duì)采集自用SEQ ID No. l或3的crylC基因轉(zhuǎn)化的花椰菜植物的RNA 的RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)剪接正確發(fā)生和在這些植物中產(chǎn)生功能性的CrylC蛋 白，該SEQIDNo. l或3的crylC基因在不同位置包含植物內(nèi)含子。這也通 過對(duì)這些植物的Northern印跡分析而證實(shí)。并且，使用小菜蛾幼蟲在標(biāo)準(zhǔn)昆蟲生物測(cè)定條件下使用合適的對(duì)照與含有CrylC和CrylB基因的選擇的轉(zhuǎn)化的巻心菜、花椰菜和油菜植物進(jìn)行 昆蟲測(cè)定，證實(shí)在那些選擇進(jìn)行最佳表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物中這些表達(dá)的蛋白質(zhì) 的高殺蟲活性和高劑量。并且，已經(jīng)選擇的對(duì)CrylC或CrylB蛋白具有抗 性的小菜蛾昆蟲仍然能被本發(fā)明的植物有效殺死。也從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化、選擇的植物獲得子代植物和種子，本發(fā)明的基因 顯示以預(yù)期的孟德爾方式在這類子代中分離。在溫室和大田中多個(gè)地點(diǎn)選 擇轉(zhuǎn)基因植物能鑒定植物林系，所述植物林系具有與最佳農(nóng)業(yè)表現(xiàn)組合的 cryl嵌合基因的優(yōu)化的穩(wěn)定性和表達(dá)。選擇的最佳表現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因植物與幾 個(gè)不同的商品林系的雜交，和與其重復(fù)的回交，致使本發(fā)明的(連鎖的) crylB和crylC基因存在于不同的巻心菜、花椰菜或油菜遺傳背景中，優(yōu)化 適合不同區(qū)域或氣候條件。引用參考文獻(xiàn)An等人(1996) Plant J. 10， 107Bernhard和Utz (1993) "Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimentalandcommercial uses", In Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide: TheoryandPractice，第255-267頁,編輯 Entwistle, P.F.， Cory， J.S., Bailey, M.J.andHiggs， S.， John Wiley and Sons, New York (1993).Bih等人(1999) J. Biol. Chem. 274， 22884-22894.Boevink等人(1995) Virology, 207， 354-361.Bolivar等人(1977) Gene, 2: 95-113.Bradford等人(1976) Anal. Biochem. 72， 248-254.Brown (1986) Nucleic Acids Res. 1986 14， 9549—9559.Brown和Simpson (1998) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49，77—95.Brown等人(1996) Plant Mol Biol. 32， 531-535.Christensen等人(1992) Plant Mol. Biol， 18， 675-689.Christou等人(19卯).Trends Biotechnology 8， 145.Cordera等人(1994) The plant Journal 6， 141.Cornejo等人(1993) Plant Mol. Biol. 23， 567-581.Cornelissen & Vandewiele (1989) Nucleic Adds Research, 17: 19-25.Cornelissen等人(1986) EMBO J. 5， 37-40.Crickmore等人(1998) Microbiol. Mol. Biol Rev. 62(3)， 807-13.Datta等人(1990) Bio/Technology 8， 736-740.De Block等人(1989) Plant Physiol" 91: 694.De Pater等人，1992， Plant J. 2， 834-844.Depicker等人(1982) Journal of Molecular and Appliedgenetics, 1: 561-573. Dulmage (1981)， "Production of Bacteria for Biological Control of Insects" in Biological Control in Crop Production,編輯Paparizas， D,C.， OsmunPublishers, Totowa， N.J" USA,第129-141頁(1981). Eckes等人(1986) Molecular and General genetics, 205: 14-22. Estruch等人(1996)， Proc Natl Acad Sci USA 93， 5389-94. Ffrench-Constant和Bowen (2000) Cell Mol Life Sci 57， 828-33. Franck等人(1980) Cell 21, 285-294. Fromm等人(1990) Bio/Technology 8， 833-839. Gardner等人(1981) Nucleic Acids Research 9， 2871-2887. Gielen等人(1984) EMBO J 3， 835-845. Gordon-Kamm等人(19卯)The Plant Cell 2, 603-618. Hesse等人(1989), EMBO J. 8 2453-2461. Hinchee等人(1988) Bio/Teehnology 6， 915. Ho等人(1989).gene 77， 51-59.H6fte等人(1988) Appl. and Environm. Microbiol. 54, 2010-2017. H6fte和Whiteley (1989) Microbiological Review 53, 242-255. Hull和Howell (1987) Virology 86, 482-493. Itoh等人(1984)Plasmid，ll: 206-220. Jansens等人(1997) Crop Science 37， 1616-1624. Keil等人(1986)， Nucl. Acids Res. 14， 5641-5650. K16sgen等人(1989)， Mol. Gen. Genet. 217， 155-161. K16sgen和Weil (1991), Mol. Gen. Genet. 225， 297-304. Kota等人(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96， 1840-1845. Last等人(1990) Theor. Appl. Genet. 81， 581-588. Lebrun等人(1996) US Patent 5，510，471. Lin等人(2003) Bot. Bull. Acad. Sin. 44: 199-210. Mahaion等人，F(xiàn)EMS Microbiol. Letters 60, 205-210 (1989). Marshall等人(1996) Plant Physiology, 111: 1251-1261. Michiels等人(1992) published PCT application W092/13956. Morris等人(1999)， Biochem. Biophys. Res. Commun. 255， 328-333.Needleman和Wunsch (1970) J. Mol. Biol" 48: 443-53. Neuhaus & Rogers (1998)， Plant Mol. Biol. 38， 127-144. Odell等人(1985) Nature, 313: 810-812. Oelmuller等人，Mol. Gen.genet 237， 261-272 (1993). Oka等人(1981) Journal of Molecular Biology, 147: 217-226. Park等人(1997), J. Biol. Chem. 272， 6876-6881. Rice等人(2000) Trends ingenetics， 16: 276-277. Schii腿ann等人(2003) Functional Plant Biology 30， 453 - 460. Shcherban等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92， 9245-9249. Shimamoto等人(1989) Nature 338， 274-276. Stanssens等人(1989), Nucleic Acids Research 12， 4441-4454. Sutliff等人(1991) Plant Molec. Biol. 16， 579-591. Tavladoraki等人(1998)， FEBS Lett. 426， 62-66. Terashima等人(1999)， Appl. Microbiol. Biotechnol. 52， 516-523. Thompson等人(1987) The EMBO Journal, 6: 2519-2523. Van Den Broeck等人，1985， Nature 313, 358. Van Rie等人(19卯)Science 247， 72. Velten等人(1984) J" EMBO J 3， 2723-2730. Velte腿dSchell (1985) Nucleic Acids Research 13， 6981-6998. Verdaguer等人(1998) Plant Mol. Biol. 37， 1055-1067. Waterfield等人(2001) Trends Microbiol 9,185-91. White等人(1989) Trends in Genet. 5， 185-189. Wong等人(1992) Plant Molec. Biol.20， 81-93. Zambryski (1988) Annual Review of Genetics, 22: 1-30. Zhang等人(1991) The Plant Cell 3， 1155-1165. Zhao等人(2003) Nature Biotechnology, 21: 1493-1497.^^部引用的參考文獻(xiàn)通過參考被并入本說明書。任何這些參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)該被解釋為對(duì)在這類參考文獻(xiàn)中含有的每個(gè)陳述精確性的認(rèn)可， 也并非承認(rèn)這類參考文獻(xiàn)是有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)或在任何領(lǐng)域的普遍常識(shí)部
權(quán)利要求
1.嵌合基因，包含下列有效連接的序列a)編碼Cry1C蛋白的編碼區(qū)，包含SEQ ID No.1、3、4或6中的任一DNA，和b)能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。
2. 權(quán)利要求l的嵌合基因，其中所述啟動(dòng)子包含SEQIDNo. 18或19的 序列。
3. 權(quán)利要求1或2的嵌合基因，其還包含3，多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
4. 權(quán)利要求3的嵌合基因，其中所述3，多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來 自黃頂菊的NADP蘋果酸酶基因。
5. 權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)的嵌合基因，其還包含位于啟動(dòng)子和編碼區(qū) 之間的稻絨氈層特異性E1基因的前導(dǎo)序列。
6. 包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)嵌合基因的DNA，其還包含第二嵌合基 因，所述第二嵌合基因包含下列有效連接的序列a) 編碼CrylB蛋白的第二編碼區(qū)，包含SEQIDNo. 8或10的DNA，和b) 能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的第二啟動(dòng)子區(qū)。
7. 包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)嵌合基因的DNA，還包含第二嵌合基因， 所述第二嵌合基因包含下列有效連接的序列a) 編碼CrylD蛋白的編碼區(qū)，包含SEQ ID No. 12或14的DNA,和b) 能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。
8. 權(quán)利要求6或7的DNA,其中所述第二啟動(dòng)子區(qū)包含SEQ ID No. 18 或19的序列，并與所述第一啟動(dòng)子區(qū)不同。
9. 權(quán)利要求6或7的DNA,其中所述第二嵌合基因還包含3，多聚腺苷酸 化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
10. 權(quán)利要求9的DNA，其中所述3，多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來自黃 頂菊的NADP蘋果酸酶基因。
11. 權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的DNA,其中所述第二嵌合基因在啟動(dòng)子 和編碼區(qū)之間還包含稻絨氈層特異性E1基因的前導(dǎo)序列。
12. 權(quán)利要求6的DNA,還包含第三嵌合基因，所述第三嵌合基因包含 下列有效連接的序列a) 編碼CrylD蛋白的編碼區(qū)，包含SEQ ID No. 12或14的DNA，和b) 能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。
13. 轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包含穩(wěn)定整合在其基因組中的權(quán)利要求l-5中任 一項(xiàng)的基因或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA。
14. 植物，包含穩(wěn)定整合在其基因組中的權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的基因 或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA。
15. 權(quán)利要求14的植物或權(quán)利要求13的植物細(xì)胞，其是蕓苔屬物種植 物或植物細(xì)月包。
16. 權(quán)利要求15的植物，其是甘藍(lán)、歐洲油菜、蕪菁、芥茱或埃塞俄 比亞芥物種的植物。
17. 權(quán)利要求16的植物，其為巻心菜或花椰菜。
18. 權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的嵌合基因或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的 DNA在控制昆蟲害蟲中的用途。
19. 控制昆蟲的方法，包括在田地中栽培或播種包含權(quán)利要求l-5中 任一項(xiàng)的嵌合基因或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA的植物，
20. 嵌合基因，包含下列有效連接的序列a) 編碼殺蟲蛋白的編碼序列的第一片段，b) 植物內(nèi)含子序列，c) 所述編碼序列的第二片段，d) 能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。
21. 在蕓苔屬物種植物中控制昆蟲的方法，包括在植物中表達(dá)權(quán)利 要求l-5中任一項(xiàng)的嵌合基因、或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA。
22. 產(chǎn)生昆蟲抗性植物或種子的方法，包括步驟 a)獲得用權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的嵌合基因、或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA轉(zhuǎn)化的植物，和b)選擇含有所述基因或DNA的所述植物或其種子的子代。
23. 微生物，包含權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的嵌合基因、或權(quán)利要求6-12 中任一項(xiàng)的DNA。
24. 權(quán)利要求23的微生物，其為埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬或農(nóng)桿菌屬 的微生物。
25. 權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的嵌合基因、或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的 DNA在獲得對(duì)昆蟲具有增加的抗性的植物細(xì)胞、植物或種子中的用途。
26. 權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA在表達(dá)殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物中延 遲或防止試圖以這類植物為食的昆蟲的昆蟲抗性發(fā)展中的用途。
27. 權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的嵌合基因、或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的 DNA用于獲得免受小菜蛾損害的甘藍(lán)、歐洲油菜、蕪青、芥菜或埃塞俄比 亞芥物種植物的用途。
28. 權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的嵌合基因、或權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的 DNA，其中CrylC蛋白是包含從氨基酸位置29至氨基酸位置627的SEQ ID No.2序列的變體，但是其中在下列位置中一個(gè)、 一些或全部的下列氨基酸 與在SEQ ID No. 2的該位置相比發(fā)生改變?cè)诎被嵛恢?25處是丙氨酸， 在氨基酸位置184處是纈氨酸，在氨基酸位置295處是精氨酸，在氨基酸位 置454處是天冬氨酸，或在氨基酸位置593處是精氨酸。
29. 權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的DNA，其中CrylB蛋白是包含從氨基酸 位置31至氨基酸位置648的SEQ ID No. ll序列的變體，但是其中在SEQ ID No. 11中氨基酸位置151處是酪氨酸，或在SEQ ID No. 11中氨基酸位置353 處是精氨酸；或是這樣的蛋白質(zhì)，其中在SEQIDNo. 11中氨基酸位置151 處是酪氨酸和在SEQ ID No. 11中氨基酸位置353處是精氨酸。
30. 權(quán)利要求28的嵌合基因或權(quán)利要求29的DNA用于獲得免受小菜蛾 損害的甘藍(lán)、歐洲油菜、蕪青、芥菜或埃塞俄比亞芥物種植物的用途。
31. 轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包含穩(wěn)定整合在其基因組中的權(quán)利要求28的基 因或權(quán)利要求29的DNA。
32. 編碼優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA,包含從核苷酸位置7至核苷酸位 置371的SEQ ID No. 16的序列。
33. 權(quán)利要求20的嵌合基因，其中植物內(nèi)含子是馬鈴薯ST-LS1基因的 第二內(nèi)含子。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的殺蟲蛋白新的基因序列。特別是，本發(fā)明提供了編碼Cry1C、Cry1B或Cry1D蛋白的新的嵌合基因，其可用于保護(hù)植物免受昆蟲損害。這里也包括包含這類基因的植物細(xì)胞或植物和制備或使用它們的方法，以及包含這類嵌合基因和至少一種其它的這類嵌合基因的植物細(xì)胞或植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101405296SQ200780009986
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2007年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月21日
發(fā)明者F·莫伊倫韋特, G·范埃爾迪克, J·范里 申請(qǐng)人:拜爾生物科學(xué)公司