一種直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物amoz的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應(yīng)用。樹狀半抗原是將AMOZ的乙醛酸衍生物偶聯(lián)在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到，基于該樹狀半抗原制備人工抗原，再以人工抗原制備抗體。通過本發(fā)明的人工抗原能夠獲得直接針對(duì)AMOZ的高質(zhì)量抗體，抗體的效價(jià)為1:64000，基于該抗體所建立的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法（CLEIA）對(duì)AMOZ的最低檢測(cè)限為0.112ng/mL，半抑制濃度為15.26ng/mL，可以直接用于AMOZ的檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)方案的AMOZ半抗原、人工抗原制備出的抗體特異性差，不能直接識(shí)別AMOZ本身的缺點(diǎn)。本發(fā)明的樹狀半抗原、人工抗原及抗體在食品中AMOZ的殘留檢測(cè)上具有廣泛的應(yīng)用前景，同時(shí)該半抗原的制備思路可以為其他類似的小分子化合物的半抗原設(shè)計(jì)提供借鑒。
【專利說明】一種直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原、樹狀抗原及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]硝基呋喃類抗生素具有殺菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于臨床和動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)。近年來(lái)研究表明硝基呋喃類藥物及其代謝物對(duì)人類具有很大毒性，歐盟已于1995年禁止在食用動(dòng)物中使用硝基呋喃類抗生素，又在1997年將所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物，我國(guó)亦于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。由于硝基呋喃類藥物代謝速度很快，在生物體內(nèi)數(shù)小時(shí)便可降解，而代謝產(chǎn)物可與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)合物，長(zhǎng)期存在于生物體內(nèi)，因而目前對(duì)硝基呋喃類藥物殘留的檢測(cè)主要集中在對(duì)其代謝物含量的測(cè)定。3-氨基-5-嗎啉甲基-2-惡唑烷酮(AMOZ)是抗生素呋喃它酮的代謝產(chǎn)物，具有潛在致畸、致癌性，作為非法使用硝基呋喃類抗生素的一種指示物，建立其快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效的檢測(cè)方法十分必要。
目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)AMOZ的方法主要有色譜方法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。前兩種屬于儀器分析檢測(cè)技術(shù)，存在著周期長(zhǎng)、專業(yè)性強(qiáng)、費(fèi)用高等不足，難以適應(yīng)許多場(chǎng)合快速檢測(cè)的需要，在應(yīng)用上不能廣泛推廣?；诳乖?抗體特異性識(shí)別的免疫分析方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行高通量篩選實(shí)驗(yàn)。但是，大量實(shí)踐證明:當(dāng)化合物(半抗原 )的分子量〈300 Da時(shí)，其高特異性高親和力的抗體制備難度增大。AMOZ分子量很小(201.22 Da),即使將其與載體蛋白偶聯(lián)，其高特異性高親和力抗體的制備難度也相對(duì)很大，因而，目前報(bào)道的免疫檢測(cè)方法在檢測(cè)之前大都需對(duì)AMOZ進(jìn)行衍生化處理作間接檢測(cè)，存在著前處理操作復(fù)雜繁瑣、成本高及回收率偏低等不足，限制了其應(yīng)用，并且，該類免疫檢測(cè)方法大多停留在酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)上，靈敏度較低。
[0003]目前，研究報(bào)道的能夠?qū)MOZ進(jìn)行直接檢測(cè)的免疫檢測(cè)方法相對(duì)很少。2009年，Pimpitak等人報(bào)道了一種檢測(cè)強(qiáng)化蝦樣品中AMOZ殘留量的方法。他們將AMOZ與3-羧酸苯甲醛衍生化制備免疫半抗原CPAM0Z，通過抗原制備、動(dòng)物免疫以及單克隆抗體制備獲得單克隆抗體，該抗體雖然能夠識(shí)別ΑΜ0Ζ，但是識(shí)別靈敏度低，比其對(duì)半抗原CPAMOZ的靈敏度低23倍?；谠摽贵w他們建立了間接檢測(cè)AMOZ的免疫分析方法，即在檢測(cè)前對(duì)其進(jìn)行衍生化(將AMOZ與2-硝基苯甲醛衍生化為ΝΡΑΜ0Ζ)，衍生化的時(shí)間需要十多個(gè)小時(shí)，十分費(fèi)時(shí)。2012年，Yan等人報(bào)道了一種直接檢測(cè)肉類中AMOZ殘留量的免疫分析方法。他們將呋喃環(huán)上的硝基氨基化了的呋喃它酮作為免疫半抗原與載體蛋白通過戊二醛偶聯(lián)制備免疫原，通過動(dòng)物免疫獲得了可以特異性識(shí)別AMOZ的多克隆抗體，基于該抗體建立了直接檢測(cè)肉類中AMOZ殘留量的ELISA方法，檢測(cè)限為0.4ng/g，可用于AMOZ殘留量的測(cè)定。但是，上述兩種方案制備的抗體對(duì)AMOZ的父本呋喃它酮均存在嚴(yán)重的交叉現(xiàn)象，并且對(duì)呋喃它酮的特異性識(shí)別能力要遠(yuǎn)高于對(duì)AMOZ的識(shí)別(交叉反應(yīng)率分別為338%和289%)，易導(dǎo)致樣品檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。
[0004]在建立小分子化合物免疫分析方法的過程中，半抗原的設(shè)計(jì)合成是首要并且是關(guān)鍵步驟，半抗原的優(yōu)劣直接影響到獲得的抗體質(zhì)量。目前采用常規(guī)的半抗原制備方案獲得的AMOZ抗體均存在特異性差、親和力低的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服傳統(tǒng)的AMOZ免疫分析技術(shù)中均需對(duì)其進(jìn)行衍生化處理的缺陷，提供一種可以用于對(duì)呋喃它酮代謝物AMOZ進(jìn)行直接檢測(cè)的樹狀半抗原、人工樹狀抗原。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述AMOZ樹狀半抗原、人工樹狀抗原的制備方法。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種可以對(duì)AMOZ進(jìn)行直接快速檢測(cè)的免疫分析方法。
[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種AMOZ樹狀半抗原，是通過將AMOZ的乙醛酸衍生物偶聯(lián)在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到的。所述AMOZ的乙醛酸衍生物具有式(I )所示分子結(jié)構(gòu):
【權(quán)利要求】
1.一種直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原，其特征在于，所述樹狀半抗原是將AMOZ的乙醛酸衍生物偶聯(lián)在四分支聚酰胺-胺的活性氨基末端得到，樹狀半抗原的結(jié)構(gòu)如式(III)所示:

2.權(quán)利要求1所述用于直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的樹狀半抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.制備AMOZ的乙醛酸衍生物:將AMOZ和乙醛酸分別溶于無(wú)水乙醇中，攪拌條件下將乙醛酸的乙醇溶液滴加到AMOZ乙醇溶液中，攪拌過夜；ΑΜ0Ζ和乙醛酸的摩爾比為1:1.2，反應(yīng)結(jié)束，真空抽濾，依次用乙醇和乙醚洗滌，得具有式(I )所示分子結(jié)構(gòu)的AMOZ的乙醛酸衍生物； S2.制備四分支聚酰胺-胺:乙二胺與丙烯酸甲酯作為原料，反應(yīng)遵循Michael加成和酰胺化縮合反應(yīng)，以乙二胺為核，一端氨基用叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)，與丙烯酸甲酯進(jìn)行Michael加成反應(yīng)，得到Boc-Eddp-OCH3 ;將乙二胺的一端氨基用荷甲氧羰酰基(Fmoc )保護(hù)，將Boc-Eddp-OCH3與過量Fmoc保護(hù)的乙二胺進(jìn)行酰胺化縮合反應(yīng)，得到 Boc-Eddp-(Fmoc- Ethylenediamine)2，去 Boc 保護(hù)得到 H-Eddp-(Fmoc-Ethylenediamine) 2 ;將 H-Eddp- (Fmoc- Ethylenediamine) 2 進(jìn)一步與 Boc-Eddp-OCH3 進(jìn)行酸胺化縮合反應(yīng)，得到 Boc-Eddp-(Eddp) 2_ (Fmoc- Ethylenediamine) 4，去 Fmoc 保護(hù)得到四分支聚酰胺-胺； S3.將四分支聚酰胺-胺與過量AMOZ的乙醛酸衍生物進(jìn)行酰胺化縮合反應(yīng)，得到Boc-Eddp-(Eddp) 2_(AMOZ-2-1minoacetyl-Ethylenediamine)4，脫去 Boc 氨基保護(hù)基，得到式(III)所示分子結(jié)構(gòu)的AMOZ樹狀半抗原。
3.一種直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的人工樹狀抗原，其特征在于，具有式(V)所示分子結(jié)構(gòu):
4.權(quán)利要求3所述用于直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的人工樹狀抗原的制備方法，其特征在于，采用戊二醛偶聯(lián)法將權(quán)利要求1中所述具有式(III)所示分子結(jié)構(gòu)的AMOZ樹狀半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將具有式(III)所示分子結(jié)構(gòu)的AMOZ樹狀半抗原溶于PBS緩沖溶液中，與含有l(wèi)Omg/mL載體蛋白的PBS緩沖溶液混合，攪拌過程中逐滴加入適量2.5%的戊二醛水溶液，室溫避光反應(yīng)3h，4°C用PBS透析2天，每天更換透析液3次；所述AMOZ樹狀半抗原與載體蛋白的摩爾比為60:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于所述載體蛋白為牛血清蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白或卵清蛋白。
7.權(quán)利要求3所述AMOZ的人工樹狀抗原在制備AMOZ抗體或在檢測(cè)AMOZ中的應(yīng)用。
8.一種直接檢測(cè)呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫分析方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.將權(quán)利要求3具有式(V)所示分子結(jié)構(gòu)的AMOZ人工抗原免疫動(dòng)物制備AMOZ的多克隆抗體； S2將具有式(VI)所示分子結(jié)構(gòu)人工包被抗原作為包被原包被在微孔板上，將步驟SI制備得到的AMOZ的多克隆抗體加入微孔板中；
【文檔編號(hào)】C07K14/795GK103951630SQ201410154388
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】徐振林, 沈玉棟, 孫遠(yuǎn)明, 劉鳳銀, 肖治理, 楊金易, 雷紅濤, 王弘 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)