專利名稱：：呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：硝基呋喃類藥物是人工合成的廣譜抗生素，它有非常好的抗菌作用和藥動力學(xué)的特性，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用作為家畜、家禽、人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品的促生長添加劑。但通過長期的實驗室研究發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發(fā)生癌變和基因突變，并由此推斷,人類長期使用該類藥物或長期食用添加該類促生長劑的家畜、家禽、人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品，同樣也可發(fā)生癌變和基因突變。所以此類藥物禁止在治療和飼料中使用。我國于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令，在農(nóng)業(yè)部發(fā)布的193號公告的《食品動物禁用獸藥及其他化合物清單》中，硝基呋喃類抗生素在所有食品動物和所有用途中都被禁止使用。歐盟委員會于2003年通過了2003/181/EC委員會決議，建立了用于檢測禽肉產(chǎn)品和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物的各種方法的最小要求性倉旨限值(MinimumRequiredPerformanceLimits,MRPL)為1yg/kg，歐盟從第三國進口的動物性產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物的含量不得超過1Hg/kg。2004年美國FDA公布了禁止在進口動物源性食品中使用的ll種藥物名單，其中包括呋喃唑酮。因此，為確保動物源性食品的安全和對外出口貿(mào)易的發(fā)展，建立準確可靠，靈敏度高的定性定量方法是十分必要的。由于呋喃唑酮在體內(nèi)很快就能被代謝,而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物(A0Z)則能存留較長的一段時間，所以在分析此類藥物的殘留時經(jīng)常要分析其代謝后的產(chǎn)物，檢測監(jiān)管部門就以檢測代謝產(chǎn)物為手段達到檢測呋喃唑酮殘留的目的。國內(nèi)外現(xiàn)己開發(fā)出檢測呋喃唑酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，但是現(xiàn)在國內(nèi)大部分需求是從國外進口的，國內(nèi)生產(chǎn)的試劑盒在準確性、靈敏度、特異性等方面還不能優(yōu)于進口試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷。本發(fā)明提供一種檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括有包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板與酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體或包被呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體的酶聯(lián)板與酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原；所述呋喃唑酮代謝物衍生物抗原是采用活性酯法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與載體蛋白進行偶聯(lián)得到的。上述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白或血藍蛋白。上述酶聯(lián)板是以聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠或瓊脂糖凝膠為載體，用pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液作為封閉液制備而成的。上述酶聯(lián)板的制備方法如下(1)用包被緩沖液將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物或抗抗體以0.02-0.08Pg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入10(^1已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37。C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15-30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150-200W封閉液，37。C溫育l-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。作為優(yōu)化，上述酶為過氧化物酶或半乳糖甘酶，優(yōu)選為過氧化物上述酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體是采用戊二醛法進行偶聯(lián)制得。上述酶標記抗原是采用活性酯法將標記酶與呋喃唑酮代謝物半抗原進行偶聯(lián)得到。上述呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體。作為優(yōu)化，上述試劑盒還包含呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明提供的試劑盒內(nèi)生產(chǎn)的試劑盒使用方便，而且在準確性、靈敏度、特異性等方面均性能良好。具體實施例方式本發(fā)明的檢測原理當包被原為呋喃唑酮代謝物衍生物偶聯(lián)抗原時是將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與牛丙種球蛋白偶聯(lián)物(A0Z-BGG)吸附于固相載體上，加入樣本或呋喃唑酮代謝物衍生物標準品，然后加酶標記呋喃唑酮代謝物特異性抗體，待測樣品中殘留的呋喃唑酮代謝物(經(jīng)前處理衍生化以后)和酶標板上包被的呋喃唑酮代謝物衍生物抗原競爭酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體。顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中呋喃唑酮代謝物殘留量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出呋喃唑酮代謝物的濃度。包被原為呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體時是將抗體吸附于固相載體上，加入酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原，再加入樣本或呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液，待測樣本中殘留的呋喃唑酮代謝物(經(jīng)前處理衍生化以后)和酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原競爭呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中呋喃唑酮代謝物殘留量呈負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出呋喃唑酮代謝物的濃度，與標準溶液顏色比較則可判斷樣品中呋喃唑酮代謝物的濃度范圍。本發(fā)明提供了一種檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有-(l)包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體或酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原；(3)呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復(fù)溶液；本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物包被抗原是采用活性酯法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與載體蛋白進行偶聯(lián)得到的，該載體蛋白可為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白、血藍蛋白等大分子載體。制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸鹽緩沖液；包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原或抗體的載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為去離子水或超純水；所用的封閉液是含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液。本發(fā)明所述試劑盒中包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板或包被抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為(l)用包被緩沖液將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物或抗抗體以0.02-0.08Pg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入100W已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37'C溫育2h,傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15-30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150-200W封閉液，37r溫育l-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。以上方法制備的酶聯(lián)板具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過冷熱穩(wěn)定性試驗，酶聯(lián)板的相關(guān)技術(shù)參數(shù)均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。本發(fā)明所述試劑盒中酶標記物為酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體或酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發(fā)明優(yōu)選過氧化物酶；酶標記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；酶標記物工作液所用的稀釋液為含有50%甘油(可防止放入-2(TC環(huán)境的酶標記物凍結(jié)，亦可長時間保持酶標記物的生物活性)、1%的疊氮化鈉防腐劑(便于保存)的溶液。本發(fā)明所述試劑盒中酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體的制備步驟為(1)過氧化物酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體的制備將抗體與過氧化物酶(HRP)進行偶聯(lián)，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗體與辣根過氧化物酶的結(jié)合率升高，傳統(tǒng)GA—步法偶聯(lián)反應(yīng)不易控制，反應(yīng)速度快的分子易發(fā)生自生聚合，且偶聯(lián)效率不高。為了解決這些問題，我們將一步法進行了改進，克服了一步法的缺點。首先在被偶聯(lián)的兩種分子中，與偶聯(lián)劑反映較弱的分子先用過量的偶連劑活化，然后去處多余的偶連劑；第二步將一端與某種分子連接的偶連劑，通過改變反應(yīng)條件而與另一種分子連接起來。二步法雖然操作較繁，但偶連效率提高，而且形成的同分子聚合物減少。本發(fā)明所述試劑盒中酶標記抗原是采用戊二醛法將標記酶與呋喃唑酮代謝物半抗原進行偶聯(lián)得到。本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用活性酯法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍蛋白進行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值7.4、0.08mol/L、含有0.3%明膠、5%。土溫-80和5%。甲醇的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體，其制備方法如下(1)呋喃唑酮代謝物衍生物單克隆抗體制備的步驟為a.動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，免疫原(呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為80-100Pg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞；b.細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5-10:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔，利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；C.細胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成l-5X106個/ml的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存，復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37。C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5nil/只，7-14天后腹腔注射雜交瘤細胞5X105-106個/只，7-IO天后采集腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-2(TC保存；e.抗體凍干粉可將腹水在37'C環(huán)境下烘干，放入-2(TC保存；f.抗體工作液是用抗體稀釋液將抗體以0.02-0.08Pg/ml濃度進行稀釋。(2)呋喃唑酮代謝物衍生物多克隆抗體制備的步驟為采用新西蘭大白兔作為免疫動物，免疫原(呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為1mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。本發(fā)明所述試劑盒中當標記酶為過氧化物酶時底物顯色液過氧化氫或過氧化脲與四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液、終止液為0.1-0.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為半乳糖甘酶時，底物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液；濃縮洗滌液為去離子水或超純水；濃縮復(fù)溶液為含1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液為六個濃度梯度的呋喃唑酮代謝物衍生物溶液，呋喃唑酮代謝物衍生物稀釋液為含有5%。甲醇的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中試劑的配制具體為a.呋喃唑酮代謝物衍生物標準溶液呋喃唑酮代謝物衍生物系列標準溶液6瓶，濃度為0Pg/L、0.025Pg/L、0.075Pg/L、0.225Pg/L、0.675Pg/L、2.025Pg/L，1-3ml/瓶。b.包被緩沖液pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸鹽緩沖液。c.封閉液含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液。d.洗滌液去離子水或超純水，30-50ml/瓶，l瓶。e.酶標記物酶標記抗抗體工作液或酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原工作液，7-12ml/瓶，l瓶。f.底物顯色液過氧化氫或過氧化脲與四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液，10-15ml/瓶，l瓶。g.底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液pH8.1、含有MgCl20.01W的100聽lTris-HCl;h.終止液l-2mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液，5-8ml/瓶，l瓶。i.抗體稀釋液pH值7.4、0,08mol/L、含有0.3%明膠、50%0土溫-80和5%。甲醇的磷酸鹽緩沖液。j.濃縮復(fù)溶液含有5%甲醇、19G小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的5-10倍，30-50ml/瓶，1瓶。k.衍生化試劑溶液100%甲醇或100%N，N，-二甲基甲酰胺(DMF)本發(fā)明所述檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物的方法，包括了以下步驟(1)樣品前處理；(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。(1)本發(fā)明中樣品前處理方法為樣本前處理需配制用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1:1稀釋，用于樣本提取后的復(fù)溶。C液(供奶樣用)稱12.5g亞硝基鐵氰化鉀用去離子水定溶至100ml。D液(供奶樣用)稱29.8g硫酸鋅用去離子水溶解定溶至100ml。0.1MK2HP04稱22.8gK2HP043H20加去離子水溶解定溶至1L1MHC1取8.6ml濃HC1加水定溶至lOOml。1MNaOH稱取4gNaOH加水定溶至100ml。a.肉樣或魚蝦取1±0.05g的均質(zhì)樣本(肉樣/魚蝦)加入4ml的去離子水，0.5ml1MHC1和100W衍生化試劑，充分振蕩；置于72"過夜孵育(大約2-4h);分別加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振蕩30s;在室溫下(20-25°C)4000r/min以上離心10min;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于5(TC氮氣/空氣吹干；用lml正己烷溶解干燥物，用lml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合；在室溫下(20-25°C)4000r/min以上離心10min;取50W下層相用于分析。樣本稀釋倍數(shù)2本法的優(yōu)點在于提高了衍生化的溫度，使反應(yīng)時間大大縮短。b.奶樣取2ml牛奶，將其置5000rpm離心10min，除去上層脂肪，取下層50W，試劑盒所提供的復(fù)溶液按l:40倍稀釋。樣本稀釋倍數(shù)40c.蜂蜜取l土0.05g樣本到離心管中；加入4ml的去離子水溶解，再加入0.5ml1MHC1和100W衍生化試劑，充分振蕩；2.置于37'C過夜孵育(大約16h);分別加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振蕩30s;在室溫下(20-25°C)4000r/min以上離心10min;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一潔凈容器中于50'C氮氣/空氣吹干；用lml正己烷溶解干燥物，用lml已稀釋好的復(fù)溶液充分混合;在室溫下(20-25'C)4000r/min以上離心10min。樣本稀釋倍數(shù)2d.蛋類稱取制備好的雞蛋樣本2g，加入到50ml離心管中，分別加入4ml水，0.5ml1MHC1，200ylC液，振蕩混勻；加入200iUD液，充分振蕩5min，室溫(20-25°C)3000g以上離心10min;取全部上清液，加入200ul衍生化試劑，充分振蕩，5(TC水浴2h(中間每半個小時劇烈振蕩1-2分鐘)；分別加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH5ml乙酸乙酯，劇烈振蕩30s，室溫(20-25°C)4000r/min以上離心10min;取2.5ml上層有機相于5(TC下氮氣吹干；加入lml正己烷溶解干燥物；加入2ml稀釋后的復(fù)溶液，振蕩10s，4000r/min以上離心10min(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，請于60'C水浴中加熱5min，再重復(fù)離心)；除去上層有機相；取下層水相50ul用于分析。(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進行檢測1)從4'C冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫(20-25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2)取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8"C。3)配液將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用蒸鎦水或去離子水稀釋至800邁1備用(或按需要量稀釋)。4)編號將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5)加標準品/樣本50W/孔到各自的微孔中，然后加呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體50W/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。3"C環(huán)境中反應(yīng)30min。6)取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液25(mi/孔洗板4-5次，每次間隔10秒，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。7)顯色每孔加入底物液100W，輕輕振蕩混勻，37。C環(huán)境中避光顯色15min。8)測定每孔加入終止液50W，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD值。(3)分析檢測結(jié)果結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第l種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與SEM的含量成負相關(guān)。1)定性判定-用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含SEM濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.268，樣品2的吸光度值為1.230，標準液吸光度值分別是Oppb為1.671;0.025ppb為1.425;0.075ppb為1.103;0.225ppb為0.567;0.675ppb為0.205;2.025ppb為0.104。則樣品1的濃度范圍是0.225ppb-0.675pb;樣品2的濃度范圍是0.025ppb-0.075ppb。(再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù))2)定量判定所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(O標準)的吸光度值(B。)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值(％)=!xlOO%BoB—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B。一Ong/ml標準溶液的平均吸光度值以標準品百分吸光率為縱坐標，以SEM標準品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中SEM實際濃度。本發(fā)明提供的檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法，樣品前處理過程簡單，檢測時間斷、費用低廉，且能同時檢測大批樣品。實施例1檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.包被原的合成將呋喃唑酮代謝物采用衍生物法合成呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和牛丙種球蛋白載體蛋白用活性酯法進行偶聯(lián)得到。b.免疫原的合成將呋喃唑酮代謝物采用衍生物法合成呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和鑰孔槭血藍蛋白載體蛋白用活性酯法進行偶聯(lián)得到。2.呋喃唑酮代謝物衍生物鼠單克隆抗體的制備a.動物免疫采用。Balb/c小鼠作為免疫動物，以呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為300Pg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免后腹腔加強免疫一次，3天后取脾細胞。b.細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。c.細胞凍存和復(fù)蘇取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞用凍存液制成5X106個/1111的細胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37'C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞5X106個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，2crc保存。3.呋喃唑酮代謝物衍生物兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動物，以呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與鑰孔槭血藍蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為3mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7天后采血，測定血清抗體效價，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。4.酶標板的制備用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成0.06Pg/ml，每孔加入100Ml，37。C溫育6h，傾去包被液，用洗漆液洗滌4次，每次lmin，拍干，然后在每孔中加入封閉液，37。C溫育lh，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實施例2檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板；(2)用辣根過氧化物酶標記的呋喃唑酮代謝物衍生物特異性鼠抗體；(4)呋喃唑酮代謝物標準品溶液6瓶，濃度分別為0Pg/L、0.025Pg/L、0.0754g/L、0.225Pg/L、0.675g/L、2..025Pg/L;(5)底物顯色液過氧化氫或過氧化脲與四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液；(6)終止液為2mol/L的硫酸緩沖液；(7)濃縮洗滌液為去離子水或超純水；(8)抗體稀釋液為pH值7.4、0.08mol/L、含有0.3%明膠、5%>吐溫-80和5%。甲醇的磷酸鹽緩沖液。(9)濃縮復(fù)溶液含有5%甲醇、1%小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液；實施例3檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒的的組建組建檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被呋喃唑酮代謝物衍生物特異性兔抗體的酶聯(lián)板；(2)用堿性磷酸酯酶標記的呋喃唑酮代謝物衍生物抗原；(3)呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液6瓶，濃度分別為04g/L、0.025Pg/L、0.075^g/L、0.225Pg/L、0.675Pg/L、2.025Pg/L;(4)底物顯色液對硝基磷酸鹽緩沖液；(5)終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液；(6)濃縮洗滌液為PH7.4，含有0.8%吐溫20和0.1%疊氮化鈉(NaW3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(7)濃縮復(fù)溶液為含有50%甲醇、ly。小牛血清(BSA)的磷酸鹽緩沖液。實施例4樣品中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測1.樣品前處理取lg魚蝦的均質(zhì)物，依次加入4ml的蒸餾水，0.5mllM的HC1和10mM的2-硝基苯甲醛，充分振蕩。72"C孵育2小時，分別加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，劇烈振蕩30秒鐘在室溫下(20-25°0離心，轉(zhuǎn)速為3000rpm。取出2.5ml的乙酸乙酯層蒸干，用lml的正己烷溶解干燥物，用lml的復(fù)溶液適當?shù)幕旌?。在室?20-25°C)、3000rpm離心。用的下層液體進行分析。2.用試劑盒檢測向呋喃唑酮代謝物衍生物偶聯(lián)抗原包被的96孔酶標板微孔中加系列標準品或樣本溶液(各2孔)50W，再加入酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗體工作液50W，用蓋板膜封板，37r恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250W洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入底物顯色液100W，輕輕振蕩混勻，37。C恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液2mol/L硫酸50W，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)，除以第一個標準溶液(O標準)的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度值。以呋喃唑酮代謝物濃度的半對數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液中呋喃唑酮代謝物所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中呋喃唑酮代謝物的實際濃度。實施例5樣品中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測1.樣品前處理取2ml牛奶，將其置5000rpm離心10min，除去上層脂肪，取下層50W，試劑盒所提供的復(fù)溶液按1:40倍稀釋。2.用試劑盒檢測向呋喃唑酮代謝物衍生物特異性兔抗體包被的96孔酶標板微孔中加入細菌提取堿性磷酸酯酶標記的呋喃唑酮代謝物衍生物抗原50W，再加入系列標準品或樣本溶液50W，用蓋板膜封板，37"C恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌過程。加入對硝基磷酸鹽緩沖液100W，輕輕振蕩混勻，37。C恒溫箱避光顯色15邁in。每孔加入終止液2mol/L。氫氧化鈉50W，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個濃度的標準溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(0標準)的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以呋喃唑酮代謝物衍生物濃度(^/L)的半對數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品溶液所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中呋喃唑酮代謝物實際濃度。實驗例1標準品精密度試驗從每批按照實施例1(4)中的方法制備的酶聯(lián)板中，各抽出10個微孔，測定0.45Pg/L。標準溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)3次，計算變異系數(shù)CW。，結(jié)果見表l。表1標準可重復(fù)性試驗(CV%)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在3.2%-9.2%之間，符合了變異系數(shù)小于20%的規(guī)定，說明本試劑盒標準品精密度達到了標準。實驗例2樣本可重復(fù)性試驗以0.5Pg/L，濃度的呋喃唑酮代謝物對魚蝦、肌肉和牛奶，添加到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各五個，每個濃度重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)，結(jié)果見表2、表3。表2魚蝦、肌肉樣品可重復(fù)性試<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>結(jié)果表明魚奸、肌肉樣本變異系數(shù)均低于20%，牛奶樣本的變異系數(shù)均低于20%，符合了變異系數(shù)小于25%的規(guī)定，說明本試劑盒測定樣本的精密度達到了標準。實驗例3試劑盒的準確度試驗取兩個濃度的呋喃唑酮代謝標準品溶液，分別為0.5Pg/kg(L)和Wg/kg(L)，分別對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分別計算回收率。表4試劑盒的準確度<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>結(jié)果表明魚蝦、肌肉添加的回收率在72%-95.7%之間，牛奶添加回收率在82%-102.8%之間。實驗例4試劑盒保存條件為2-8°C，經(jīng)過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50%抑制濃度、呋喃唑酮代謝物添加實際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37"C保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結(jié)果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒在2-8i:可以保存6個月以上。權(quán)利要求1.一種呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，包括有包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板與酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體或包被呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體的酶聯(lián)板與酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原；所述呋喃唑酮代謝物衍生物抗原是采用活性酯法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與載體蛋白進行偶聯(lián)得到的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纖維蛋白或血藍蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述酶聯(lián)板是以聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠或瓊脂糖凝膠為載體，用pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，含有8%-15%的脫脂奶和1%惰性蛋白的溶液作為封閉液制備而成的。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述酶聯(lián)板的制備方法如下(1)用包被緩沖液將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物或抗抗體以0.02-0.08Pg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入已經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37。C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次15-30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150-200W封閉液，37。C溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述酶為過氧化物酶或半乳糖甘酶。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述酶為過氧化物酶。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體是采用戊二醛法進行偶聯(lián)制得。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標記抗原是采用戊二醛法將標記酶與呋喃唑酮代謝物半抗原進行偶聯(lián)得到。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體。10.據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含呋喃唑酮代謝物衍生物標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮復(fù)溶液。全文摘要本發(fā)明涉及呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒。本發(fā)明提供一種檢測呋喃唑酮代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括有包被呋喃唑酮代謝物衍生物抗原的酶聯(lián)板與酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體或包被呋喃唑酮代謝物衍生物特異性抗體的酶聯(lián)板與酶標記呋喃唑酮代謝物衍生物抗原；所述呋喃唑酮代謝物衍生物抗原是采用活性酯法將呋喃唑酮代謝物衍生物半抗原與載體蛋白進行偶聯(lián)得到的。本發(fā)明提供的試劑盒內(nèi)生產(chǎn)的試劑盒使用方便，而且在準確性、靈敏度、特異性等方面均性能良好。文檔編號G01N33/545GK101349697SQ200810042040公開日2009年1月21日申請日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日發(fā)明者青吳,俊唐,成李,宏楊,楊宗繁,溫俊梅,聶繼斌,欣齊申請人:深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司