專利名稱：：一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫化學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及一種分析檢測硝呋索爾代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
：硝呋索爾是一種硝基呋喃類藥物，它有非常好的抗菌作用，除了作為一種抗生素被應(yīng)用于獸醫(yī)醫(yī)療中外，它還曾作為豬，禽與水產(chǎn)品生長促進劑被廣泛使用。但因為其可能的不安全因素，歐盟于2002年立法禁止其在動物源性食品中的使用。研究證明硝呋索爾對光敏感，代謝快速，在動物體內(nèi)若干小時就能迅速代謝，代謝物為3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)，該化合物能在體內(nèi)停留較長時間。所以分析硝呋索爾主要目標物為其代謝物。測定動物源性食品中的DNSH殘留量，目前國內(nèi)報道的檢測方法主要有液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS);高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。儀器法是一種精確，穩(wěn)定的確證方法，但具有成本高，低通量，前處理煩瑣，操作復(fù)雜等缺點，不易廣泛普及。隨著我國與歐盟農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的不斷增長，對硝呋索爾的檢測要求也不斷增加。儀器法顯然無法應(yīng)對大批量樣品短時間的快速檢測。酶聯(lián)免疫方法能彌補儀器法的上述缺點，做為儀器法的補充，被廣泛運用于小分子農(nóng)獸藥殘留的檢測。作為商品化的硝呋索爾酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，因其具有較高的穩(wěn)定性和靈敏度以及方便的操控性，如果能夠研究開發(fā)出來，將在硝呋索爾檢測中發(fā)揮重要作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，可實現(xiàn)大批量樣品短時間的快速檢測，具有較高的穩(wěn)定性和靈敏度。本發(fā)明的另一個目的是提供所述試劑盒的使用方法，使用簡單，操作方便。本發(fā)明的目的通過以下具體技術(shù)方案來予以實現(xiàn)提供一種適用于檢測硝呋索爾代謝物的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體、特異性抗體溶液、3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)標準溶液，酶標板、樣品稀釋液、洗滌液、二抗溶液、顯色液A液、顯色液B液和終止液，所述特異性抗體溶液為經(jīng)過稀釋的兔抗3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)抗體溶液，所述酶標板為孔內(nèi)包被有3,5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶連物的ELISA板條，所述二抗溶液為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體稀釋液。所述酶標板孔內(nèi)包被的3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶聯(lián)物是由3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白通過活潑酯法交聯(lián)后，透析純化的產(chǎn)物，具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)所述特異性抗體溶液是由3,5-二硝基水楊酸肼和乙醛酸反應(yīng)，所得產(chǎn)物偶連牛血清蛋白得到偶連物，其結(jié)構(gòu)如式(II)所示，偶連物經(jīng)透析純化，免疫實驗用兔，純化兔血清，調(diào)配成抗體溶液，本發(fā)明實施例中抗體溶液以lg/L濃度分裝。所述偶連物結(jié)構(gòu)如式(II)所示-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(II)本發(fā)明同時提供了所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)溶解有步驟(1)處理的樣品的抗體稀釋液50uL，加入50uL特異性抗體溶液，室溫反應(yīng)30min，洗滌液洗滌，拍干；(3)加入二抗稀釋液100uL，室溫反應(yīng)20min，洗滌液洗滌，拍干；(4)加入將顯色A液和顯色B液現(xiàn)配的顯色液100yL，室溫蔽光顯色10min;(5)加入終止液體50nL，測定OD必o值；利用標準品做出標準曲線，通過標準曲線算出樣品中硝呋索爾代謝物的含量。步驟(1)所述樣品為動物肌肉、肝臟等，樣品前處理包括鹽酸水解、乙醚脫脂、甲醇去蛋白、樣品稀釋液復(fù)溶等步驟。具體操作是在玻璃試管中加入lg樣品，0.9mL蒸餾水，0.lmL1M的鹽酸，振蕩10min，10000rpm離心2min，吸取上清液混合lmL的乙醚，振蕩60s，10000rpm離心2min。去除有機層；水層用氮氣吹干，加入2mL甲醇，振蕩10min后10000rpm離心2min，用氮氣吹干甲醇，加入0.5mL樣品稀釋液。該稀釋液用于酶聯(lián)免疫(ELISA)分析。步驟(4)所述顯色液中顯色A液體顯色B液的體積比為1:1。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明設(shè)計半抗原制備的免疫原免疫產(chǎn)生的抗體具有靈敏度高，特異性好等優(yōu)點，采用間接競爭ELISA法，實現(xiàn)了動物肌肉、肝臟中硝呋索爾代謝物的快速批量檢測。本發(fā)明樣品前處理簡單，操作快速，高通量；本發(fā)明試劑盒具有較高的穩(wěn)定性和靈敏度，最低檢測限為0.lng/mL，并且成本較低，完全可作為商品化的硝呋索爾酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，將在硝呋索爾檢測中發(fā)揮重要作用。圖1DNSH的間接競爭ELISA標準曲線具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一歩詳細說明本發(fā)明。實施例1半抗原的合成將0.llg乙醛酸溶解于10mL甲醇中，加入3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)0.24g，攪拌3h，過濾并甲醇洗滌沉淀，得到半抗原DNSHAO.21g，產(chǎn)率72%。APCI-MSm/z:297[M-H]—.APCI-MS/MSm々281[M-OH]-;281(M-OH);226(M-NCHCOOH);210(M-H十-NHNCHCOOH):183(M-H^2CONHNCHCOOH)。^醒R(600MHz，^rDMSO，TMS):314.13(s,1H);8.78(d，J=3.0Hz，1H);8.580(d,/=3.0Hz,1H);7.95(s，1H);7.70(s，lH)。實施例2抗原的合成取半抗原DNSHA0.lmmol溶于2mLDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg，4。C下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清夜為A液；稱取BSA140mg溶于10mL濃度為0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMF1mL，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4。C下反應(yīng)12h。離心后，取上清夜，4t下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液，得到的全抗原DNSHA-BSA以lg/L濃度分裝，凍存于-20。C冰箱中，供免疫用。制備的全抗原DNSHA-BSA結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(II)實施例3包被原的合成取3，5-二硝基水楊酸(DNSA)0.lmmol溶于2mLDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg，4。C下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清夜為A液；稱取BSA140mg溶于10mL濃度為0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，加入DMF1mL，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4。C下反應(yīng)12h。離心后，取上清夜，4。C下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液，得到的包被原DNSA-0VA以1g/L濃度分裝，凍存于-20"C冰箱中，供包被用。制備的包被原DNSA-0VA結(jié)構(gòu)式為實施例4抗體的制備多克隆抗體的制備人工免疫抗原免疫新西蘭大白兔，采用背部多點免疫法，首次用弗氏完全佐劑乳化，間隔4周，以后免疫每隔兩周免疫，用弗氏不完全佐劑乳化，免疫三次。最后一次免疫后7天心臟采血，離心保留血清。用辛酸-硫酸銨法純化?？贵w經(jīng)冷凍干燥，存放于-20"C冰箱中。間接競爭ELISA測定抗體陽性滴度以2.1倍于陰性血清的測定值為準，測得抗體的陽性滴度為1:320000。實施例5本發(fā)明方法靈敏度的測定采用方陣滴定法確定抗體及各包被原工作濃度。使用最佳濃度包被的酶標板，加入50uL0.2ng/mL，0.5ng/mL，lng/mL，2ng/mL，5ng/mL的代謝物，50uL最佳工作濃度的抗體。37。C水浴溫育lh。洗滌三次后拍干，加入一定濃度羊抗兔IgG-服P，每孔100uL，37i:水浴中溫育1h。洗滌三次拍干，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液，每孔100uL，室溫避光顯色15min，向每孔中加入50yL止液，測讀各孔450nm處吸光值。DNSH的間接競爭ELISA標準曲線見附圖1，其IC5Q為5.6ng/mL，最低檢測限為0.lng/mL。實施例6方法特異性測定將呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因配成不同濃度溶液，測定其交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表l，發(fā)現(xiàn)與同類藥物無交叉反應(yīng)。表1.交叉反應(yīng)試驗結(jié)果競爭藥物交叉反應(yīng)率(％)DNSH100%呋喃唑酮<0.01呋喃它酮<0-01呋喃西林<0.01呋喃妥因<0.01以上實驗結(jié)果說明由所設(shè)計半抗原制備的免疫原免疫產(chǎn)生的抗體具有靈敏度高，特異性好等優(yōu)點。實施例7樣品前處理在玻璃試管中加入lg樣品，0.9mL蒸餾水，0.lmL1M的鹽酸。振蕩10min，10000rpm離心2min，吸取上清液混合lmL的乙醚，振蕩60s,10000rpm離心2min，去除有機層，水層用氮氣吹干，加入2mL甲醇，振蕩10min后10000rpm離心2min，用氮氣吹干甲醇，加入0.5mL樣品稀釋液。該稀釋液用于酶聯(lián)免疫(ELISA)分析。實施例8試劑盒精密度的檢測按照本試劑盒的使用方法測定標準溶液，做6個重復(fù)，以吸光值計算變異系數(shù)，結(jié)果見表2:表2icELISA方法的批內(nèi)和批間誤差(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例9試劑盒對實際樣品的檢測結(jié)果表3icELISA方法檢測加標魚肉，蝦肉樣品的檢測結(jié)果和回收率(11=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本試劑盒選用不含DNSH的魚，蝦肉，添加DNSH標樣，評價試劑盒對實際樣品檢測能力。表3顯示其平均添加回收率為60.079.0%之間。本發(fā)明方法在對所有低藥物濃度樣品均能檢出陽性，陰性樣品無假陽性，說明本方法具有初步篩選所要求的穩(wěn)定性，能夠準確篩選出陽性樣品。權(quán)利要求1、一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，包括盒體、特異性抗體溶液、3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)標準溶液，酶標板、樣品稀釋液、洗滌液、二抗溶液、顯色液A液、顯色液B液和終止液，其特征在于所述特異性抗體溶液為經(jīng)過稀釋的兔抗3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)抗體溶液，所述酶標板為孔內(nèi)包被有3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶連物的ELISA板條，所述二抗溶液為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體稀釋液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，其特征在于所述酶標板孔內(nèi)包被的3,5-二硝基水楊酸與卵清蛋白偶聯(lián)物是由3，5-二硝基水楊酸與卵清蛋白通過活潑酯法交聯(lián)后，透析純化的產(chǎn)物，具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)3、根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，其特征在于所述特異性抗體溶液是由3，5-二硝基水楊酸肼和乙醛酸反應(yīng).，所得產(chǎn)物偶連牛血清蛋白得到偶連物，偶連物經(jīng)透析純化，免疫實驗用兔，純化兔血清，調(diào)配成抗體溶液；所述偶連物結(jié)構(gòu)如式(II)所<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)4、一種權(quán)利要求1所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)溶解有步驟(1)處理的樣品的抗體稀釋液50iiL，加入50uL特異性抗體溶液，室溫反應(yīng)30min，洗滌液洗滌，拍干；(3)加入二抗稀釋液100uL，室溫反應(yīng)20min，洗滌液洗滌，拍干；(4)加入將顯色A液和顯色B液現(xiàn)配的顯色液100uL，室溫蔽光顯色10min;(5)加入終止液體50PL，測定0D45Q值；利用標準品做出標準曲線，通過標準曲線算出樣品中硝呋索爾代謝物的含量。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(1)所述樣品前處理包括鹽酸水解、乙醚脫脂、甲醇去蛋白和樣品稀釋液復(fù)溶步驟。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒的使用方法，其特征在于步驟(4)所述顯色液中顯色A液體顯色B液的體積比為l:1。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測硝呋索爾代謝物的試劑盒，包括盒體、特異性抗體溶液、3，5-二硝基水楊酸肼(DNSH)標準溶液，酶標板、樣品稀釋液、洗滌液、二抗溶液、顯色液A液、顯色液B液和終止液。待測樣品經(jīng)過鹽酸水解，乙醚脫脂，甲醇去蛋白，樣品稀釋液復(fù)溶等樣品前處理步驟后，使用本試劑盒進行分析。本發(fā)明所述試劑盒適用于檢測硝呋索爾代謝物具有前處理簡單，快速，高通量，廉價等優(yōu)點，最低檢測限為0.1ng/mL。文檔編號G01N33/543GK101419233SQ200810219300公開日2009年4月29日申請日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者孫遠明,張世偉,楊金易,沈玉棟,弘王,肖治理,雷紅濤申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)