一種從大豆乳清廢水中提純Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法
【專利摘要】一種從大豆乳清廢水中提純Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工及副產(chǎn)品綜合利用【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括大豆乳清廢水的預(yù)處理、復(fù)凝聚、離心、除糖、二次離心和蛋白回收得到最終產(chǎn)品。原料預(yù)處理后經(jīng)復(fù)凝聚得到終蛋白多糖復(fù)合物，終蛋白多糖復(fù)合物經(jīng)離心除糖，二次離心后即得含有純化Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的蛋白溶液。該蛋白溶液經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥得到Kunitz型胰蛋白酶抑制劑純品。本發(fā)明對(duì)大豆乳清蛋白廢水綜合利用，原料無(wú)需干燥，設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，無(wú)環(huán)境污染。且Kunitz型胰蛋白酶抑制劑回收率高，純度高，蛋白活性高。
【專利說(shuō)明】一種從大豆乳清廢水中提純Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大豆乳清蛋白的回收方法，具體是指一種利用聚陽(yáng)離子多糖回收大豆乳清中的KunitZ型胰蛋白酶抑制劑的方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品加工及副產(chǎn)品綜合利用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆乳清蛋白是殘存于大豆乳清中不能為酸所沉淀的蛋白質(zhì)，在大豆乳清蛋白中2S組分所占的比重較大；乳清蛋白質(zhì)中除含有球蛋白、白蛋白之外，還含有:①Kunitz胰蛋白酶抑制劑(ΚΤΙ，ρΗ3.0-ΙΟ.0，20kDa) !②Bowman-Brik胰蛋白酶抑制劑(BBI,pH3.(Tl0.0,20KDa) ；? β-淀粉酶(61.7KDa);④凝集素(ρΗ2.2~10.8，120KDa);⑤脂氧合酶(LOX，102KDa) 磷酸酶；?植酸酶和⑧細(xì)胞色素C等很多種生理活性物質(zhì)，約占大豆蛋白的9%-15.3%ο
[0003]目前，大豆胰蛋白酶抑制劑抗?fàn)I養(yǎng)作用主要表現(xiàn)在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白質(zhì)消化吸收和造成胰腺腫大兩個(gè)方面。主要是胰蛋白酶抑制因子與小腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶結(jié)合，生成無(wú)活性復(fù)合物，消耗和降解胰蛋白酶，導(dǎo)致腸道對(duì)蛋白質(zhì)消化、吸收及利用能力下降。同時(shí)，胰蛋白酶抑制劑與腸內(nèi)胰蛋白酶結(jié)合后隨糞便排出體外，使腸內(nèi)胰蛋白酶數(shù)量減少。然而，營(yíng)養(yǎng)過(guò)度和營(yíng)養(yǎng)不平衡將導(dǎo)致癌癥、高血壓、肥胖癥等疾病。這些被認(rèn)為影響人類消化吸收的具有生物活性的大豆乳清蛋白，現(xiàn)在對(duì)預(yù)防治療某些疾病具有顯著效果，這使得大豆乳清廢水成為一種有效的原料來(lái)源。例如，低濃度的胰蛋白酶抑制劑是廣譜抗致癌因子，能預(yù)防結(jié)腸癌、肝癌、口腔癌、肺癌等多種癌癥的發(fā)生，還有降低膽固醇水平的作用；能增強(qiáng)胰臟生長(zhǎng)和增加胰消化酶的活性，且對(duì)動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有活化作用；能控制腎小球腎炎或腎盂腎炎的一些炎癥發(fā)展過(guò)程。此外，微量胰蛋白酶抑制劑對(duì)于糖尿病治療，調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)有一定效果。醫(yī)藥上提取胰蛋白酶抑制劑(抑肽酶)治療急性胰腺炎。
[0004]已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了乳清蛋白的回收方法。例如CN1537865公開的從大豆黃漿水提取乳清蛋白、核酸等成分；CN1954689和CN1364765公開的膜分離制備和提取大豆乳清蛋白的方法。CN102746375公開的一種具有抗腫瘤作用的大豆乳清蛋白的制備方法。CN1027812公開了從乳清工藝流中回收和分離大豆乳清蛋白和其它組分的方法。這些方法均采用了膜分離或者離子交換層析方法。本發(fā)明采用了天然可食性的聚陽(yáng)離子多糖作為回收材料，充分利用了蛋白多糖的復(fù)凝聚原料，有針對(duì)性的回收了大豆乳清蛋白中的KTI，本工藝流程用于選擇性回收乳清蛋白未見報(bào)道。本發(fā)明不僅可以去除大豆乳清中的KTI組分，降低大豆乳清的抗?fàn)I養(yǎng)成分，還可以回收高純度的KTI。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單易于操作的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備高純度KTI的方法，制備的KTI純度達(dá)到90%，仍然保持天然的KTI活性。[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種從大豆乳清廢水中提純Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法，步驟為:
(1)大豆乳清廢水的預(yù)處理:將大豆乳清廢水用PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)至pH4.5，離心，除沉淀；再次PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至7.0-10.0,離心，除沉淀，收集上清液；將上述上清液經(jīng)過(guò)截留分子量3500-8000Da的透析膜透析，脫鹽36_48h，即得大豆乳清液；
(2)大豆乳清液與聚陽(yáng)離子多糖復(fù)凝聚:將步驟(1)制備的大豆乳清液用去離子水稀釋1-4倍,使其中大豆乳清蛋白的質(zhì)量濃度為0.1%-0.4%，得大豆蛋白乳清液；將上述大豆蛋白乳清液與質(zhì)量濃度為0.1%-0.4%的聚陽(yáng)離子多糖溶液按照體積比為100-200: I混合，PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至4.0-6.0,離心，收集沉淀；對(duì)上清液重復(fù)以上步驟2-3次，合并沉淀物，即得Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物；
(3)純化Kunitz型胰蛋白酶抑制劑:將步驟(2)得到的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至8.0-11.0，離心，棄去沉淀物，收集 上清液，真空冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
[0007]所述pH調(diào)節(jié)劑為:酸性pH調(diào)節(jié)劑選用:有機(jī)酸:包括但不限于甲酸、乙酸；無(wú)機(jī)酸:包括但不限于鹽酸，硫酸；堿性pH調(diào)節(jié)劑選用:包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉。
[0008]所述步驟(3)中，純化的KTI經(jīng)過(guò)SEC-HPLC檢測(cè)樣品純度，經(jīng)過(guò)雙縮脲法測(cè)定蛋白含量，經(jīng)過(guò)苯酚硫酸法測(cè)定含糖量，經(jīng)過(guò)干燥法測(cè)定水分，經(jīng)過(guò)灼燒重量法測(cè)定灰分；κτι回收完成后，剩余的大豆乳清液經(jīng)過(guò)電泳(SDS-PAGE)分析確定KTI殘余量。
[0009]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低；聚陽(yáng)離子多糖的用量少，并且易于去除；大豆乳清液中的KTI可以完全回收，剩余溶液基本無(wú)KTI殘留；回收的大豆KTI純度較高，同時(shí)具有很高胰蛋白酶抑制活性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1本發(fā)明的提純工藝流程圖。
[0011]圖2本發(fā)明制備的KTI的純度SEC-HPLC檢測(cè)圖譜。
[0012]圖3剩余大豆乳清液中KTI的SDS-PAGE檢測(cè)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明的提純工藝流程圖如圖1所示。
[0014]實(shí)施例1
(O大豆乳清廢水的預(yù)處理:將大豆乳清廢水調(diào)至ΡΗ4.5，離心，除沉淀；再次調(diào)至pH
7.0，離心，去除大顆粒物質(zhì)，收集上清液。將上述上清液經(jīng)過(guò)截留分子量3500-8000Da的透析膜透析，脫鹽48h，即得試驗(yàn)用大豆乳清液。
[0015](2)大豆乳清液與聚陽(yáng)離子多糖復(fù)凝聚:將0.1g聚陽(yáng)離子多糖粉末加入到IOOmL去離子水中，攪拌至聚陽(yáng)離子多糖完全溶解，配制成質(zhì)量百分比濃度為0.1%均一的聚陽(yáng)離子多糖溶液。將試驗(yàn)用大豆乳清液稀釋2倍，即得含有約0.1%蛋白的大豆乳清液。將上述大豆乳清液以及0.1%的聚陽(yáng)離子多糖溶液均調(diào)至pH4.0。將大豆乳清液按照體積比100:1，緩慢加入到0.1%的聚陽(yáng)離子多糖溶液中，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至4.8，離心，收集沉淀；對(duì)上清液再次重復(fù)以上步驟2次，合并沉淀物，即得KTI與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物。
[0016](3)純化Kunitz型胰蛋白酶抑制劑:將得到的KTI與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至9.0，離心，棄去沉淀物，收集上清液，冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
[0017] 稱取純化的KTI 3.011^，溶解于1.01^超純水中，配制成1(1'1濃度為3.011^/1^的溶液，過(guò)0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測(cè)蛋白純度。將剩余乳清蛋白液部分凍干，并做SDS-PAGE電泳分析，檢測(cè)剩余KTI。
[0018]經(jīng)測(cè)定，以上實(shí)例所得KTI，其得率為98.8%;冷凍干燥后的KTI樣品含有蛋白
94.89%,多糖 2.02%,灰分 0.87% 及水分 2.2%。
[0019]實(shí)施例2
(O大豆乳清廢水的預(yù)處理:將大豆乳清廢水調(diào)至PH 4.5，離心，除沉淀；再次調(diào)至pH
8.0，離心，去除大顆粒物質(zhì)，收集上清液。將上述上清液經(jīng)過(guò)截留分子量3500-8000Da的透析膜透析，脫鹽36h，即得試驗(yàn)用大豆乳清液。
[0020](2)大豆乳清液與聚陽(yáng)離子多糖復(fù)凝聚:將0.2g聚陽(yáng)離子多糖粉末加入到IOOmL去離子水中，攪拌至聚陽(yáng)離子多糖完全溶解，配制成質(zhì)量百分比濃度為0.2%均一的聚陽(yáng)離子多糖溶液。將試驗(yàn)用大豆乳清液稀釋I倍，即得含有約0.2%蛋白的大豆乳清液。將上述大豆乳清液以及0.2%的聚陽(yáng)離子多糖溶液均調(diào)至pH4.0。將大豆乳清液按照體積比200:1，緩慢加入到0.2%的聚陽(yáng)離子多糖溶液中，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至4.9，離心，收集沉淀；對(duì)上清液再次重復(fù)以上步驟2次，合并沉淀物，即得KTI與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物。
[0021](3)純化Kunitz型胰蛋白酶抑制劑:將得到的KTI與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至10.0，離心，棄去沉淀物，收集上清液，冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
[0022]稱取純化的KTI 4.0mg,溶解于1.0mL超純水中，配制成濃度為4.0mg/mL的溶液，過(guò)0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測(cè)蛋白純度。將剩余乳清蛋白液部分凍干，并做SDS-PAGE電泳分析，檢測(cè)剩余KTI。
[0023]經(jīng)測(cè)定，以上實(shí)例所得KTI，其得率為96.5%;冷凍干燥后的KTI樣品含有蛋白
95.53%,多糖 1.72%,灰分 0.85% 及水分 2.1%。
[0024]實(shí)施例3
(O大豆乳清廢水的預(yù)處理:將大豆乳清廢水調(diào)至PH 4.5，離心，除沉淀；再次調(diào)至pH
9.0，離心，去除大顆粒物質(zhì)，收集上清液。將上述上清液經(jīng)過(guò)截留分子量3500-8000Da的透析膜透析，脫鹽48h，即得試驗(yàn)用大豆乳清液。
[0025](2)大豆乳清液與聚陽(yáng)離子多糖復(fù)凝聚:將0.3g聚陽(yáng)離子多糖粉末加入到IOOmL去離子水中，攪拌至聚陽(yáng)離子多糖完全溶解，配制成質(zhì)量百分比濃度為0.3%均一的陽(yáng)離子多糖溶液。將試驗(yàn)用大豆乳清液稀釋0.5倍，即得含有約0.3%蛋白的大豆乳清液。將上述大豆乳清液以及0.3%的聚陽(yáng)離子多糖溶液均調(diào)至pH4.0。將大豆乳清液按照體積比150:1，緩慢加入到0.3%的聚陽(yáng)離子多糖溶液中，磁力攪拌，調(diào)節(jié)pH至5.0，離心，收集沉淀；對(duì)上清液再次重復(fù)以上步驟3次，合并沉淀物，即得KTI與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物。
[0026](3)純化Kunitz型胰蛋白酶抑制劑:將得到的KTI與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，調(diào)節(jié)pH至11.0，離心，棄去沉淀物，收集上清液，冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
[0027]稱取純化的KTI 5.0mg,溶解于1.0mL超純水中，配制成濃度為5.0mg/mL的溶液，過(guò)0.45 μ m微孔濾膜，SEC-HPLC檢測(cè)蛋白純度。將剩余乳清蛋白液部分凍干，并做SDS-PAGE電泳分析，檢測(cè)剩余KTI。
[0028]經(jīng)測(cè)定，以上實(shí)例所得KTI，其得率為97.3%;冷凍干燥后的KTI樣品含有蛋白
95.18%,多糖 1.81%,灰分 0.82% 及水分 2.2%。
[0029]本發(fā)明制備的KTI的純度SEC-HPLC檢測(cè)圖譜如圖2所示。剩余大豆乳清液中KTI的SDS- PAGE檢測(cè)圖譜如圖3所示。
【權(quán)利要求】
1.一種從大豆乳清廢水中提純KunitZ型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于步驟為: (1)大豆乳清廢水的預(yù)處理:將大豆乳清廢水用PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)至pH4.5，離心，除沉淀；再次PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至7.0-10.0,離心，除沉淀，收集上清液；將上述上清液經(jīng)過(guò)截留分子量3500-8000Da的透析膜透析，脫鹽36_48h，即得大豆乳清液； (2)大豆乳清液與聚陽(yáng)離子多糖復(fù)凝聚:將步驟(1)制備的大豆乳清液用去離子水稀釋1-4倍,使其中大豆乳清蛋白的質(zhì)量濃度為0.1%-0.4%，得大豆蛋白乳清液；將上述大豆蛋白乳清液與質(zhì)量濃度為0.1%-0.4%的聚陽(yáng)離子多糖溶液按照體積比為100-200: I混合，PH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至4.0-6.0,離心，收集沉淀；對(duì)上清液重復(fù)以上步驟2-3次，合并沉淀物，即得Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物； (3)純化Kunitz型胰蛋白酶抑制劑:將步驟(2)得到的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑與聚陽(yáng)離子多糖的復(fù)合物懸浮于2-3倍體積的去離子水中，pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至8.0-11.0，離心，棄去沉淀物，收集上清液，真空冷凍干燥，即得純化的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從大豆乳清廢水中提純Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的方法，其特征在于:所述 PH調(diào)節(jié)劑為:酸性pH調(diào)節(jié)劑選用:有機(jī)酸:包括但不限于甲酸、乙酸；無(wú)機(jī)酸:包括但不限于鹽酸，硫酸；堿性PH調(diào)節(jié)劑選用:包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉。
【文檔編號(hào)】C07K1/32GK103965352SQ201410193480
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】華欲飛, 李興飛, 孔祥珍, 陳業(yè)明, 張彩猛 申請(qǐng)人:江南大學(xué)