加壓素、加壓素鞣酸鹽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了加壓素、加壓素鞣酸鹽的制備方法。該加壓素的制備方法包括下述步驟:采用高效液相反相色譜法將加壓素粗品溶液依次進(jìn)行反相純化、反相脫鹽,即可;高效液相反相色譜法的填料為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。本發(fā)明將反相純化和反相脫鹽聯(lián)用,設(shè)計(jì)出聚合物填料苯乙烯-二乙烯基苯的最新應(yīng)用,可以大批量制備加壓素和加壓素鞣酸鹽。
【專利說明】加壓素、加壓素鞣酸鹽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。更具體地,本發(fā)明涉及加壓素、加壓素鞣酸鹽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血管緊張素(或血管緊張素胺)為增血壓藥,英文名angiotensinamide或[Asn1,Val5]-angiotensin II,化學(xué)結(jié)構(gòu)為 L-Asn-L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Val-L-His-L-Pro-L-Phe,是由八個(gè)氨基酸殘基組成的合成多肽,理論分子量1031.18。血管緊張素用于外傷或手術(shù)后休克和全身麻醉或腰椎麻醉時(shí)所致的低血壓癥等,可預(yù)防或治療圍手術(shù)期低血壓,作為急救用藥治療休克期低血壓,也可用于治療血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑用藥過量且常規(guī)治療無效時(shí)。
[0003]鞣酸加壓素,是由九個(gè)氨基酸殘基組成的合成多肽,其化學(xué)結(jié)構(gòu)為L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly (I — 6) - 二硫鍵鞋酸鹽,加壓素的理論分子量1084.24。鞣酸加壓素為抗利尿激素藥,能促進(jìn)遠(yuǎn)端腎小管及集合管對(duì)水分的重吸收而具有抗利尿作用,其制劑臨床用于治療尿崩癥。
[0004]醋酸奧曲肽(Octreotide acetate),是由七個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)蘇氨醇組成的合成多肽,化學(xué)結(jié)構(gòu)為D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-賴氨酰-L-蘇氨酰-N-[2R-羥基-1R-(羥甲基)丙基]-L-半胱氨酰胺環(huán)(2 —7)-二硫鍵醋酸鹽,奧曲肽的理論分子量為1019.26,其原料藥凍干粉中醋酸含量為5%~12%。醋酸奧曲肽可抑制生長激素,抑制胃腸胰臟分泌多肽等,其制劑臨床用于需要長期奧曲肽治療的活動(dòng)性肢端肥大癥,如術(shù)后生長激素殘留致血清生長激素水平增高,垂體外照射放射治療后尚未達(dá)到充分療效的血清生長激素水平升高,部分不適合手術(shù)治療及新診斷生長激素分泌腺瘤患者的術(shù)前治療。
[0005]目前已上市多肽藥物常見的純化方法大都采用了制備型高效液相色譜法,該法是獲得高純度多肽目標(biāo)分子的最有效的方法,也是我們固相合成血管緊張素純化和脫鹽的主要技術(shù)手段。一般多肽藥物純化制備工藝設(shè)計(jì)是先中低壓色譜富集目標(biāo)多肽,然后高壓色譜精制,但是考慮到我們目標(biāo)多肽血管緊張素分子量約lkD,無合適的分子篩凝膠柱(其上樣量小,流速低,處理量小,比較適合分子量大于IOkD蛋白的脫鹽)或超濾膜選擇。而且中低壓色譜中常用的分離方法有分子篩色譜法、離子交換色譜法和疏水相互作用色譜法,這些色譜方法中用到的填料的粒徑通常從幾十微米到幾百微米不等,空隙尺寸多為幾百納米不等,無法得到高純度的目標(biāo)多肽。如果采用高鹽洗脫,后期處理無法找到合適的脫鹽方案,分離純化效果也有限,樣品損失很大,回收率計(jì)算也較復(fù)雜,對(duì)于后期反相制備很不利。現(xiàn)在還缺乏一種有效的制備 多肽鹽原料藥的方法,因此仍然迫切需要開發(fā)新的多肽鹽的純化工藝。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)中多肽鹽的制備工藝復(fù)雜、收率低的缺陷,而提供了一種多肽、多肽鹽的制備方法。本發(fā)明的多肽鹽的制備方法以多肽為起始原料,經(jīng)過高壓反相色譜純化和脫鹽步驟,制備高純度的多肽鹽、特別是血管緊張素醋酸鹽、鞣酸加壓素和醋酸奧曲肽的方法。
[0007]發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)的研究發(fā)現(xiàn),目前高壓反相色譜法經(jīng)典純化的填料是硅膠基質(zhì),其柱效好,分辨率高,但色譜條件PH2-7耐受較窄;而安捷倫聚合物填料PLRP-S為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物,可耐受較寬闊的pH范圍(pH范圍可達(dá)1-14),并且可用IM NaOH溶液再生,也可以精準(zhǔn)控制孔徑大小與孔徑形態(tài),使得溶質(zhì)分子無障礙擴(kuò)散,相對(duì)于硅膠基質(zhì),其增加了有效表面積,能保持很好的柱效和分辨率,且提升了填料的載樣量。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:
[0009]本發(fā)明提供了一種多肽的制備方法,其包括下述步驟:采用高效液相反相色譜法將多肽粗品溶液依次進(jìn)行反相純化、反相脫鹽,即可;高效液相反相色譜法的填料為苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。
[0010]其中,所述的多肽粗品可為本領(lǐng)域的各種多肽粗品,較佳地為堿性多肽粗品,更佳地為血管緊張素粗品、加壓素粗品或奧曲肽粗品。所述的血管緊張素粗品較佳地為專利申請(qǐng)CN201210131066.5公開的采用固相法合成的血管緊張素粗品,HPLC純度為80~90% ;所述的加壓素粗品較佳地為專利申請(qǐng)CN201210131067.X公開的采用固相法合成的加壓素粗品,HPLC純度為80~90%;所述的奧曲肽粗品較佳地為采用固相法合成制得的奧曲肽粗品,HPLC純度為80~90%。
[0011]所述的多肽粗品溶液較佳地為多肽粗品溶于體積百分比濃度為5%的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。
[0012]其中,所述的反相純化的條件優(yōu)選如下:流動(dòng)相A為體積百分比為0.1%的三氟乙酸水溶液,流動(dòng)相B為體積百分比為0.1 %的三氟乙酸乙腈溶液,流動(dòng)相C為所述的多肽粗品溶液,流速為180~220mL/min (較佳地為200mL/min),檢測波長為220nm ;
[0013]按照下表的條件進(jìn)行在線上樣、洗脫,百分比為體積百分比;
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種加壓素的制備方法,其包括下述步驟:采用高效液相反相色譜法將加壓素粗品溶液依次進(jìn)行反相純化、反相脫鹽,即可;高效液相反相色譜法的填料為苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述的加壓素粗品為專利申請(qǐng)CN201210131067.X公開的采用固相法合成的加壓素粗品,所述的加壓素粗品的HPLC純度為80~90%。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述的加壓素粗品溶液為加壓素粗品溶于體積百分比濃度為5%的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述的反相純化的條件如下:流動(dòng)相A為體積百分比為0.1%的三氟乙酸水溶液,流動(dòng)相B為體積百分比為0.1%的三氟乙酸乙腈溶液,流動(dòng)相C為所述的加壓素粗品溶液,流速為180~220mL/min,檢測波長為220nm ; 按照下表的條件進(jìn)行在線上樣、洗脫,百分比為體積百分比;
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于,所述的反相脫鹽的條件如下:流動(dòng)相A為水,流動(dòng)相B為乙腈,流動(dòng)相C為0.lmol/L NaOH溶液,流速為180~220mL/min,檢測波長為220nm ; 按照下表的條件進(jìn)行在線上樣、洗脫,百分比為體積百分比;
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于,在所述的反相純化中,流速為200mL/min ;在所述的反相脫鹽中,流速為200mL/min。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述的高效液相反相色譜法的裝填條件如下:填料為安捷倫PLRP-S苯乙烯-二乙烯基苯共聚物,孔徑10nm,粒徑10 μ m,裝柱密度 0.33g/mL,柱壓為 650psi。
8.一種加壓素鞣酸鹽的制備方法,其包括下述步驟:將權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的制備方法得到的加壓素與鞣酸混合,即可。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法,其特征在于,在所述的混合結(jié)束后,還進(jìn)行減壓濃縮,冷凍干燥,即可。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法,其特征在于,所述的減壓濃縮的壓力為-0.15~-0.05MPa,所述的減壓濃縮的溫度為25~35°C。
11.由權(quán)利要求8~10中任一項(xiàng)所述的制備方法制得的不含有三氟乙酸的加壓素鞣酸鹽。
【文檔編號(hào)】C07K7/16GK103980351SQ201410229108
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】洪勇, 江錫銘, 丁金國, 黃臻輝 申請(qǐng)人:上海第一生化藥業(yè)有限公司