精氨酸果糖苷(af)制備方法及其醫(yī)用用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及精氨酸衍生物類的化合物，具體的說是精氨酸果糖苷，并公開了該化 合物在醫(yī)療領(lǐng)域的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿?。╠iabetesmellitus)是一種體內(nèi)胰島素相對或絕對不足或革E細胞對胰 島素敏感性降低或胰島素本身存在結(jié)構(gòu)上的缺陷而引起的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代 謝紊亂的一種慢性疾病。它不是單一的疾病，而是復(fù)合病因引起的綜合征，是包括遺傳及 環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素共同作用的結(jié)果。亞洲糖尿病學(xué)會披露，截至2012年中國患糖 尿病的總?cè)藬?shù)已達到9240萬，其糖尿病發(fā)病率高達9. 7%。糖尿病患者平均可減少十年壽 命，且可能發(fā)生的并發(fā)癥遍及全身。視網(wǎng)膜癥、腎病和神經(jīng)障礙的發(fā)病率最高，被稱為糖尿 病的三大并發(fā)癥。目前，糖尿病的分類主要有四類：1型糖尿病又稱為胰島素依賴性糖尿 ?。╥nsulin-dependentdiabetesmellitus)、2型糖尿病又稱為非胰島素依賴性糖尿病 (non-insulin-dependentdiabetesmellitus)、妊娠糖尿病及其他特殊類型的糖尿病。在 糖尿病的患者中，2型糖尿病所占的比例約為95%。它是成人發(fā)病型糖尿病，多在于35-40 歲之后發(fā)病，但是現(xiàn)在青年發(fā)病率明顯增多。目前，我國20歲以上人群中男性和女性糖尿 病的患病率分別達10. 6%和8. 8%。
[0003] 精氨酸單糖苷(AF)，又稱為精氨酸果糖苷，其化學(xué)名為1-(精氨酸_N°基）_1_去 氧-D果糖。它是人參加工過程中的初產(chǎn)物，是由鮮人參中的葡萄糖與精氨酸經(jīng)加熱后發(fā) 生美拉德反應(yīng)所生成的。1996年研究者報告 [1]，從紅參中分離并鑒定了該化合物，并進行 了化學(xué)合成，其簡單合成路線：精氨酸與葡萄糖的比例為1:2,在溶媒冰醋酸的條件下，溫 度80°C下反應(yīng)1小時，即可獲得AF合成物。2009年LeeJung-Sook等[2]報告了AF體外 抗氧化作用；2009年Jang,HaeDong[3]報告，精氨酸衍生物制備及改善男性性功能；JP 2010090076[4]公開了AFG與AF的制造方法及其在化妝品中的應(yīng)用；KR10-0966613?專 利指出，采用發(fā)酵法制備精氨酸衍生物，并應(yīng)用健康大鼠觀察了AFG與AF對餐后血糖的 作用，AFG與AF有降低餐后血糖的作用，但是沒有觀察AF對2型糖尿病大鼠或小鼠的空腹 血糖以及餐后血糖的作用，CN102178687?公開了AFG對2型糖尿病大鼠的治療作用，可明 顯降低大鼠空腹血糖，餐后血糖以及血液生化指標。本發(fā)明以鏈脲佐菌素（STZ)誘導(dǎo)2型 糖尿病動物模型，觀察AF對2型糖尿病小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)AF在糖尿病的治療方面具有很好 的療效。因此，AF在作為預(yù)防和治療糖尿病藥物方面有著可觀的開發(fā)和應(yīng)用價值。
[0004] 眾所周知飲酒過量會造成各種肝臟疾病。飲酒量與肝硬化的發(fā)病率存在一定的聯(lián) 系 [7]。Mandayamw等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，如果男人平均每日攝入乙醇量超過80g，女人平均每日攝入 乙醇量超過20g，以此方式飲酒達10年以上者，其患肝硬化的幾率會大大增加。每日飲酒超 過30g的人與不飲酒的相比肝硬化的幾率要大10%左右[9]。此外，一次性大劑量的飲酒也 會增加酒精性肝病的發(fā)病率[1°'11]。酒的類別對酒精性肝病的影響在于烈酒更容易造成肝損 傷，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，白酒和啤酒比葡萄酒更容易損傷肝臟 [12]。另有報道指出在進餐時間以外飲 酒的患酒精性肝病的風(fēng)險比進餐時飲酒的要高2. 7倍[13]。與男人相比，女人的肝臟更容易 收到酒精的傷害，因女性肝臟對酒精的敏感程度高，導(dǎo)致肝損傷所需的酒精量比男性要少 [14]。此外，蛋白質(zhì)及一些微量營養(yǎng)元素的缺失，也會增加酒精對肝臟的損傷程度 [15]。就個 體差異而言，遺傳對酒精的代謝起到很大的影響，因酒精在肝臟中代謝需要酶的參與，遺傳 是造成個體間酒精代謝酶含量多少的主要原因 [lfU7]。這也就說同等劑量的酒精，對不同人 造成的損傷的是有差異的，也解釋了為什么喝一樣多的酒，有人沒事，有的人就會喝醉。黃 種人的乙醇脫氫酶就有異于白種人，其活性較低，所以其酒精性肝病患病率較西方人低。對 已感染肝炎病毒的患者，飲酒會增加肝硬化的風(fēng)險 [18]，患有酒精性肝病的患者一旦感染上 肝炎病毒，也會加重酒精性肝損傷的程度[19]。乙醇進入肝臟時破壞了肝細胞膜脂質(zhì)雙分子 層，改變了包膜的通透性，從而影響了其結(jié)構(gòu)和功能。大量的乙醇迅速損害可以幫助人體吸 收脂肪的甲基供體，從而使脂肪在肝臟積蓄，造成肝臟損傷 [2°]。乙醇還能造成體內(nèi)半胱氨 酸積蓄，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，破壞線粒體功能紊亂。線粒體功能的紊亂就大大降低了氧化乙醛的能 力，進而使毒性更強的乙醇代謝中間產(chǎn)物一乙醛在肝臟內(nèi)的含量增加。它與體內(nèi)多種蛋白 共價結(jié)合，形成不穩(wěn)定的乙醛蛋白加合物 [21]，不但破壞原有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，而且還會 刺激機體產(chǎn)生抗體，引起免疫應(yīng)答，對肝細胞造成傷害[22]。
[0005] 酒精性肝病是一類危害大但又不易察覺的疾病，臨床表現(xiàn)主要包括酒精性脂肪 肝，酒精性肝炎，酒精性肝硬化三類。若不及時治療，任其發(fā)展，可發(fā)生很多并發(fā)癥，嚴重者 會導(dǎo)致肝癌。近十年來，隨著人們生活水平的不斷提高和社交圈的擴大，全球酒的消費量也 在迅速遞增。同時，酒精性肝病的病發(fā)率也呈明顯上升趨勢。對于肝臟疾病的治療，選擇合 適的藥物十分關(guān)鍵，可以很大程度上避免因藥物對肝臟造成的二次傷害，應(yīng)當(dāng)選擇毒副作 用小的天然保肝藥物。目前市場上使用的保肝藥物有許多，聯(lián)苯雙酯是目前運用較為普遍 的一種，另外從中藥中提取的水飛薊素也收到很好的效果。本專利公開了AF對酒精肝損傷 的修復(fù)作用。
[0006] 經(jīng)檢索未見關(guān)于AF在抗2型糖尿病及酒精肝損傷的修復(fù)作用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明涉及精氨酸單糖苷（AF)在治療2型糖尿病及酒精肝損傷修復(fù)作用的新用 途。本發(fā)明所使用的化合物：1_ (精氨酸4°基）_1_去氧-D果糖，簡稱AF，其化學(xué)結(jié)構(gòu) 是如下：
本發(fā)明所使用的AF具體制備方法：將L-精氨酸與葡萄糖以1:2-4的質(zhì)量比，置入2-8 倍量的冰醋酸中，待二者充分溶解后，在溫度60-80°C的條件下反應(yīng)10-60分鐘，反應(yīng)完成 后，在40°C以下條件下除去醋酸，冷凍干燥，即得AF總合成物。將AF總合成物用硅膠干法 拌樣，過200-300目硅膠濕柱，70%乙醇洗脫，收集AF流份，真空低壓濃縮，回收乙醇，冷凍 干燥成粉末。將粉末溶于1-8倍量的0. 2%的醋酸三重蒸餾水中，上聚丙烯酰胺凝膠柱，以 0. 2%的醋酸水溶液洗脫，再次收集AF流份，冷凍干燥即得AF純品。
[0008] 以下實驗表明本發(fā)明提供的1、AF的制備及檢測方法；2、AF在治療2型糖尿?。?、 酒精肝損傷的修復(fù)作用。
[0009] 實驗例IAF合成方法 將L-精氨酸與葡萄糖以1:2-4的質(zhì)量比，置入4倍量的冰醋酸中，待二者充分溶解后， 在溫度80°C的條件下反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)完成后，在40°C以下條件下除去醋酸，冷凍干燥，即 得AF粗合成物。將AF粗合成物用硅膠干法拌樣，過200-300目硅膠濕柱，70%乙醇洗脫，收 集AF流份，真空低壓濃縮，回收乙醇，冷凍干燥成粉末。將粗合成物粉末溶于少量的0. 2% 的醋酸三重蒸餾水中，使其濃度達到〇. 6g/mL，然后上聚丙烯酰胺凝膠柱，以0. 2%的醋酸水 溶液洗脫，再次收集AF流份，冷凍干燥即得AF純品。
[0010] 實驗例2AF測試方法 a)精密稱取AF樣品I. 5mg，用蒸餾水溶解，使之濃度為I. 5mg/mL，0. 23ii濾膜過濾樣 品，HPLC分析備用。
[0011] b)HPLC分析條件：流動相A:醋酸鈉緩沖溶液（pH6. 5)-乙腈溶液；流動相B: 乙腈-水（體積比為4:1)溶液。線性梯度洗脫：0min，0%B;4min，3%B;16min，10%B;流速 I.OmL/min。檢測波長254nm;柱溫40°C;色譜柱Vnusil-AA氨基酸分析專用柱（5iim， 4. 8mmX250mm);液相色譜分析儀為島津LC-20A。
[0012] c)HPLC流動相溶液的配置 流動相A的配制方法：稱取7. 6g醋酸鈉，加三重水925mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至 6. 5,然后加乙腈70mL，混勻，用0. 45iim濾膜過濾； 三乙胺、乙腈溶液：取三乙胺1瓶（I. 4mL)，加乙腈8. 6ml，混勻； 異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯1瓶（25iU)，加乙腈2mL，混勻，4°C保存。
[0013] e)待測樣品及標準品溶液的衍生 準確吸取精氨酸標準溶液、AF樣品溶液200iiL，置于2ml離心管中，再加入三乙胺乙腈 溶液100yL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液100iU，混勻，室溫放置lh，然后加入正己烷400iiL， 振搖后放置lOmin，取下層溶液，0. 45ym濾膜過濾，帶進行液相分析。
[0014] f)將AF樣品溶液和精氨酸標準品溶液進行液相分析，進樣量為20iil，根據(jù)峰面 積歸一化法計算得到樣品AF的純度為96. 7%。
[0015] 實驗例3精氨酸單糖苷（AF)對2型糖尿病的作用 1.實驗材料、動物、儀器及試劑 動物系昆明種小鼠，體重20-22g，雄性，購自于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。
[0016] f5D血糖試劑盒，北京怡成電子技術(shù)有限公司；BP211D型電子天平(十萬分之一)， 德國sartorius公司離心機，上海東方儀器廠；酶標儀，日本三洋公司；酸度計，上海虹易科 技公司；。
[0017] 精氨酸單糖苷（AF):純度96. 7%，4°C保存，由實驗室自制，用前用蒸餾水配制成所 需濃度。
[0018] 鏈脲佐菌素（STZ)，sigma公司；葡萄糖，上海三浦化工有限公司；二甲雙胍，北京 京豐制藥有限公司；生理鹽水，長春豪邦藥業(yè)有限公司；基礎(chǔ)飼料，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實 驗動物