完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法。該方法為：使用0～4℃的含翻譯延伸抑制劑和鎂離子的等滲鹽溶液清洗新鮮的組織；將清洗干凈的組織中的多余液體去除，然后用液氮進(jìn)行快速冷凍處理，冷凍至組織的溫度穩(wěn)定；將快速冷凍處理好的組織置于不高于-80℃的環(huán)境下保存，在該條件下，能進(jìn)行儲(chǔ)存和運(yùn)輸；對(duì)保存的組織樣品提取RNC，得到組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物。本發(fā)明能夠進(jìn)行組織內(nèi)RNC長(zhǎng)期儲(chǔ)存和運(yùn)輸，有效地獲取組織樣品的RNC；而且突破了時(shí)間和空間的限制，為進(jìn)一步研究RNC以及RNC的商業(yè)化服務(wù)提供了便利。
【專(zhuān)利說(shuō)明】完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù) 合物（Ribosome Nascent-chain Complex，RNC)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 翻譯調(diào)控是生命體內(nèi)的重要調(diào)控層次。在細(xì)胞中有的基因翻譯多、有的基因翻譯 少，有的基因根本就不被翻譯。因此對(duì)細(xì)胞中的翻譯狀況進(jìn)行研究顯得極為必要。細(xì)胞進(jìn) 行翻譯時(shí)，核糖體結(jié)合在mRNA鏈上并移動(dòng)，依據(jù)mRNA上的三聯(lián)密碼子信息來(lái)逐步合成蛋 白質(zhì)多肽鏈（稱為新生肽鏈，nascent-chain)。這一復(fù)合物稱為核糖體新生肽鏈復(fù)合物 (Ribosome Nascent-chain Complex, RNC)。只有完整提取了 RNC，才能對(duì)正在翻譯的 mRNA 進(jìn)行定性定量研究，因此，完整提取得到RNC對(duì)研究和應(yīng)用都有重要的意義。對(duì)正在翻譯的 mRNA進(jìn)行測(cè)定（翻譯組測(cè)序），可用正在翻譯的mRNA的含量推算蛋白質(zhì)的含量（Wang et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013)，可計(jì)算翻譯效率從而表征細(xì)胞的各種表型（Wang et al.，2013,文 獻(xiàn)前面已提過(guò)，此處略，下文中，只要是簡(jiǎn)寫(xiě)的，均為文獻(xiàn)名稱已在【背景技術(shù)】提及過(guò)），可以 發(fā)現(xiàn)未知蛋白（Zhang et al. How to discover new proteins-translatome profiling. Science China Life sciences 57, 358_360,2014b)，對(duì)蛋白質(zhì)組研究也有重要的指導(dǎo) 意義(Chang et al. Systematic analyses of the transcriptome，translatome，and proteome provide a global view and potential strategy for the C-HPP. Journal of proteome research 13,38-49,2014 ;Liu et al. Chromosome-8-coded proteome of Chinese Chromosome Proteome Data set (CCPD)2.0 with partial immunohistochemical verifications. Journal of proteome research 13, 126-136, 2014 ;Wang et al. Omics evidence: single nucleotide variants transmissions on chromosome 20 in liver cancer cell lines.Journal of proteome research 13,200-211，2014 ;Zhang et al. Systematic analysis of missing proteins provides clues to help define all of the protein-coding genes on human chromosome I. Journal of proteome research 13，114-125, 2014a ;Zhong et al. Resolving chromosome-centric human proteome with translating mRNA analysis:a strategic demonstration. Journal of proteome research 13, 50-59, 2014)，被列為人類(lèi)蛋白質(zhì)組計(jì)劃的第四支柱（Zhong et al.，2014)。
[0003] 能高效完整提取RNC的方法是利用蔗糖密度梯度離心法，此方法能完整提出RNC， 定量保留核糖體上全長(zhǎng)的mRNA和新生肽鏈以供其后的各種生化與分子生物學(xué)研究（Wang et al.，2013 ;Zhang et al.，2009)。然而此法只適用于新鮮細(xì)胞提取RNC。由于組織內(nèi)部 環(huán)境的復(fù)雜化，以及RNC本身非常脆弱，使組織樣品內(nèi)部的RNC的獲取相對(duì)于新鮮細(xì)胞更 加難以獲取。從培養(yǎng)細(xì)胞提取RNC時(shí)，需要事先加入翻譯延伸抑制劑（如氯霉素、放線菌 酮等）將核糖體固定在核糖體上以保持當(dāng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)翻譯狀況，但組織塊通常由多層 相互連接的細(xì)胞所組成，翻譯延伸抑制劑很難快速滲透進(jìn)入組織塊內(nèi)部的細(xì)胞而固定核糖 體。培養(yǎng)細(xì)胞可用Triton等去垢劑快速溫和地破細(xì)胞膜而釋放細(xì)胞內(nèi)容物，而組織塊由于 細(xì)胞間連接緊密，Triton等去垢劑難以將組織塊良好破碎，使得提取效率非常低。因此，組 織樣品的RNC提取過(guò)程無(wú)法沿用細(xì)胞提取RNC的策略。完整獲取組織樣品的RNC是一個(gè)實(shí) 驗(yàn)室及商業(yè)服務(wù)面臨的巨大挑戰(zhàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種完整獲取組織內(nèi)核糖體 新生肽鏈復(fù)合物的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合 物的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)使用0?4°C的含翻譯延伸抑制劑和鎂離子的等滲鹽溶液清洗新鮮的組織；翻 譯延伸抑制劑和鎂離子的濃度以能有效抑制組織內(nèi)細(xì)胞翻譯延伸為基準(zhǔn)；
[0007] (2)將清洗干凈的組織中的多余液體去除，然后用液氮進(jìn)行快速冷凍處理，冷凍至 組織的溫度穩(wěn)定；
[0008] (3)將快速冷凍處理好的組織置于不高于_80°C的環(huán)境下保存，在該條件下，能進(jìn) 行儲(chǔ)存和運(yùn)輸；
[0009] (4)對(duì)步驟（3)保存的組織提取RNC，得到組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物。
[0010] 當(dāng)組織塊較大，如Imm3以上，步驟（1)優(yōu)選為：將新鮮組織置于0?4°C的含翻譯 延伸抑制劑和鎂離子的等滲鹽溶液中剪碎；然后用〇?4°C的含翻譯延伸抑制劑和鎂離子 的等滲鹽溶液清洗；剪碎清洗有利于去除大塊組織間隙中的組織液，也有利于翻譯延伸抑 制劑和鎂離子有效穩(wěn)定抑制細(xì)胞翻譯延伸；；翻譯延伸抑制劑和鎂離子的濃度以能有效抑 制組織內(nèi)細(xì)胞翻譯延伸為基準(zhǔn)；
[0011] 步驟（1)中所述的翻譯延伸抑制劑為放線菌酮；
[0012] 所述的放線菌酮在所述的等滲鹽溶液中的終濃度為0. 3mg/ml或超過(guò)0. 3mg/ml ;
[0013] 步驟（1)中所述的鎂離子在所述的等滲鹽溶液中的終濃度為50mM或超過(guò)50mM ;
[0014] 步驟（1)中所述的等滲鹽溶液為DPBS溶液、PBS溶液或D-Hank' s溶液；
[0015] 步驟（1)中所述的清洗的次數(shù)為1?2遍；
[0016] 步驟（1)中所述的新鮮組織通過(guò)如下步驟得到：從生物體上提取組織，保證在 30min以內(nèi)完成，而且在提取過(guò)程中避免其他組織和雜質(zhì)混入，盡量保證組織的單一性；
[0017] 步驟（2)中所述的將清洗干凈的組織中的多余液體去除為通過(guò)使用潔凈的濾紙 實(shí)現(xiàn)；
[0018] 步驟（3)中所述的不高于-80°C的環(huán)境為_(kāi)196°C?_80°C的環(huán)境，更優(yōu)選為_(kāi)80°C 的環(huán)境；
[0019] 步驟（4)中所述的對(duì)步驟（3)保存的組織提取RNC包含如下具體步驟：將組織置 于液氮環(huán)境中，將其進(jìn)行磨碎；研磨完畢后保持在液氮環(huán)境中加入預(yù)冷至〇?4°C的細(xì)胞裂 解液，繼續(xù)研磨混勻；然后置于冰上等待完全融化，進(jìn)行裂解反應(yīng)；將裂解好的組織樣品于 2?6°C離心，取上清；使用蔗糖密度梯度離心法獲取組織樣品的RNC復(fù)合體；
[0020] 所述的細(xì)胞裂解液為組成如下細(xì)胞裂解液的：20mM、pH7. 4的HEPES-K0H溶液， 1511111%(]12,20〇11111((]1，10〇1^/1111放線菌酮，21111二硫蘇糖醇，體積百分比1 (%的1'1'；[1:011 X-100, pH = 7. 4 ；
[0021] 所述的細(xì)胞裂解液配制時(shí)使用無(wú)菌無(wú)RNase的水和無(wú)菌器具，配制完畢后溶液需 過(guò)濾除菌；
[0022] 所述的繼續(xù)研磨的時(shí)間為1?2min ;
[0023] 所述的離心的條件為4°C、16200Xg離心至少20min ;
[0024] 所述的鹿糖密度梯度離心法可參考文獻(xiàn)"Wang et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013"。
[0025] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0026] (1)本發(fā)明提供的方法可有效地獲取組織樣品內(nèi)完整的RNC。
[0027] (2)本發(fā)明提供的方法突破了時(shí)間和空間的限制，可將組織內(nèi)RNC長(zhǎng)期（可達(dá)一個(gè) 月）儲(chǔ)存和運(yùn)輸，為進(jìn)一步研究RNC以及RNC的商業(yè)化服務(wù)提供了便利。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1是按實(shí)施例1方法提取小鼠六種組織RNC的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道M 為DNA Marker,泳道1為空白對(duì)照,泳道2為心,泳道3為肝,泳道4為肺,泳道5為腎,泳道 6為精巢，泳道7為腦。
[0029] 圖2是小鼠各組織的翻譯組測(cè)序的基因翻譯量的兩兩比較；其中，散點(diǎn)圖為兩種 組織的基因表達(dá)量對(duì)比圖，位于對(duì)角線的直方圖為該組織的基因表達(dá)量的分布圖，數(shù)字為 散點(diǎn)圖對(duì)應(yīng)的兩種組織的基因表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)R。
[0030] 圖3是小鼠各組織的翻譯組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序定量比較圖，每個(gè)子圖的橫軸為轉(zhuǎn) 錄組定量[Iog ltl mRNA (rpkM)]，縱軸為翻譯組定量[Iogltl RNC-mRNA(rpkM)]。
[0031] 圖4是使用含不同濃度的放線菌酮及MgCl2的0?4°C、pH 7. 0?7. 2的DPBS溶 液處理小鼠組織后得到的樣品抽提RNC后的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道一為樣品一、泳 道二為樣品二、泳道三為樣品三、泳道四為樣品四、泳道五為樣品五、泳道六為樣品六。
[0032] 圖5是用不同方法提取小鼠組織RNC的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，泳道1為按對(duì)比 例2的方法提取的卵巢RNC，泳道2和3分別為按對(duì)比例3的方法提取的肌肉組織RNC和肺 組織RNC，泳道4和5分別為按對(duì)比例4的方法提取的腎組織RNC和腦組織RNC，泳道Nl和 N2分別為按實(shí)施例1的方法提取的腎、脾RNC。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例涉及的主要材料如下：
[0035] -六周齡BALB/C小鼠購(gòu)買(mǎi)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0036] -DPBS溶液購(gòu)自Life Technology。
[0037] -RB溶液：20mM、pH7.4 的HEPES-K0H溶液、15mM MgCl2、200mM KC1、100iig/ml放 線菌酮，2mM二硫蘇糖醇，pH=7.4。配制時(shí)使用無(wú)菌無(wú)RNase的水和無(wú)菌器具，配制完畢 后溶液需過(guò)濾除菌。
[0038]-蔗糖溶液：30% (w/v)蔗糖溶于上述RB溶液，預(yù)冷至0?4°C。
[0039]-放線菌酮（廣州捷倍斯公司）水溶液儲(chǔ)液：濃度為lOOmg/ml。
[0040]-細(xì)胞裂解液：Triton X-IOO溶于上述RB溶液中，Triton X-IOO的終濃度為體積 百分比1%。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] (1)使用頸部脫臼法殺死六周齡BALB/C小鼠，并用70% (w/v)酒精浸泡小鼠，達(dá) 到消毒的目的。
[0043] (2)獲取小鼠組織器官（獲取肺、肝、骨骼肌、精巢、卵巢、腦、脾、腎、腎上腺、心臟、 胸腺，共11種組織），并分別置于含放線菌酮（終濃度為〇. 3mg/ml)及MgCl2 (終濃度為 50mM)的0?4°C、pH 7. 0?7. 2的DPBS溶液中，清洗兩遍。對(duì)取出組織塊體積較大的組 織塊（如肝、心臟、骨骼肌，估計(jì)體積大約大于1mm3)，浸泡在上述溶液中剪碎至每塊組織小 于Imm 3,再用上述溶液清洗兩遍。
[0044] (3)小心收集步驟（2)處理好的組織樣品，并用濾紙吸干液體，將組織樣品放入收 集的EP管中，迅速放入液氮中保存。速凍后，可以將凍存的組織樣品放入_80°C冰箱保存。
[0045] (4)在液氮中，保持液氮溫度下（_196°C )使用研磨棒研磨組織樣品。
[0046] (5)研磨完畢后加入細(xì)胞裂解液，繼續(xù)研磨混勻，冰上放置20min。
[0047] (6)將裂解好的組織樣品置于預(yù)冷至4°C的離心機(jī)中以16200 Xg轉(zhuǎn)速離心20min， 去除組織碎片，小心吸取上清。
[0048] (7)立刻繼續(xù)進(jìn)行蔗糖密度梯度離心及后續(xù)提取RNC的步驟。該步驟見(jiàn)文獻(xiàn)"Wang et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013"，具體如下：
[0049] ①上清液小心轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的在超速離心管中2ml蔗糖溶液表層。
[0050] ②4°C、330000 Xg超速離心3小時(shí)。
[0051] ③棄上清，將沉淀溶于RB溶液中，得到各組織的RNC。
[0052] (8)使用TR[Z0|R_.RNA提取試劑（Invitrogen公司），按其說(shuō)明手冊(cè)方法操作，從 RNC 中提取 RNC-RNA。
[0053] (9)使用NEBNext mRNA library construction kit for Illumina(New England Biolabs公司）對(duì)組織RNC-RNA中的mRNA進(jìn)行測(cè)序建庫(kù)，Illumina HiSeq-2500測(cè)序儀進(jìn) 行二代測(cè)序，獲得組織細(xì)胞的翻譯組測(cè)序信息（正在翻譯的mRNA的定量信息）。
[0054] 為檢驗(yàn)本發(fā)明方法可以從組織中提出未降解的RNC-RNA，我們將部分小鼠組織的 RNC-RNA用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，SybrGreen II染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)成像檢測(cè) (圖1)。結(jié)果顯示，本發(fā)明提取的組織RNC-RNA量多，帶型清晰，無(wú)降解。
[0055] 為檢驗(yàn)本發(fā)明方法對(duì)組織RNC的定量提取效果，將上述獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行組織 間的RNC樣品進(jìn)行比較獲得相關(guān)性及Pearson相關(guān)系數(shù)（圖2)。由于各組織內(nèi)的基因翻譯 量理應(yīng)各不相同，我們應(yīng)看到各組織內(nèi)的RNC-mRNA的量相關(guān)性各有高低。圖2顯示，絕大 部分組織之間的基因翻譯量的相關(guān)系數(shù)R在〇. 48?0. 86之間，符合預(yù)期。這說(shuō)明本發(fā)明 的方法能反映各組織類(lèi)型間的基因翻譯狀況的差異。
[0056] 同一組織內(nèi)的RNC-mRNA(正在翻譯的mRNA)與總mRNA的量應(yīng)有不同，因?yàn)?有的基因翻譯效率高，有的基因翻譯效率低（Wang et al. ,Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013)。為檢驗(yàn)本發(fā)明所提取的組織中RNC-mRNA(正在翻譯的mRNA)與總 mRNA確實(shí)存在著差異，將各組織的RNC-mRNA測(cè)序結(jié)果和mRNA測(cè)序結(jié)果對(duì)比（圖3)。結(jié)果 顯示，各組織中RNC-mRNA與mRNA的定量相關(guān)系數(shù)為PearsonR= 0. 5?0. 97,表明基因的 翻譯與轉(zhuǎn)錄并不完全相同，這符合文獻(xiàn)中的報(bào)道（Wang et al.，Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013)。而在測(cè)序結(jié)果中可以看到，各組織中都存在著數(shù)量不等的不被翻 譯的mRNA，結(jié)果見(jiàn)表1，也符合文獻(xiàn)中的報(bào)道（在Wang et al. ,Nucleic acids research 41，4743-4754, 2013中有綜述）。以上結(jié)果反映出RNC-mRNA與mRNA在定量上確實(shí)存在差 異。這說(shuō)明本發(fā)明所提取出的RNC-mRNA并非總mRNA，而確實(shí)是正在翻譯中的mRNA。
[0057]表1

【權(quán)利要求】
1. 一種完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 使用0?4°c的含翻譯延伸抑制劑和鎂離子的等滲鹽溶液清洗新鮮的組織；翻譯延 伸抑制劑和鎂離子的濃度以能有效抑制組織內(nèi)細(xì)胞翻譯延伸為基準(zhǔn)； (2) 將清洗干凈的組織中的多余液體去除，然后用液氮進(jìn)行快速冷凍處理，冷凍至組織 的溫度穩(wěn)定； (3) 將快速冷凍處理好的組織置于不高于_80°C的環(huán)境下保存，在該條件下，能進(jìn)行儲(chǔ) 存和運(yùn)輸； (4) 對(duì)步驟（3)保存的組織提取RNC，得到組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在于： 步驟（1)為：將新鮮組織置于〇?4°C的含翻譯延伸抑制劑和鎂離子的等滲鹽溶液中剪碎； 然后用〇?4°C的含翻譯延伸抑制劑和鎂離子的等滲鹽溶液清洗；翻譯延伸抑制劑和鎂離 子的濃度以能有效抑制組織內(nèi)細(xì)胞翻譯延伸為基準(zhǔn)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在 于：步驟（1)中所述的翻譯延伸抑制劑為放線菌酮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述的放線菌酮在所述的等滲鹽溶液中的終濃度為〇. 3mg/ml或超過(guò)0. 3mg/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在 于：步驟（1)中所述的鎂離子在所述的等滲鹽溶液中的終濃度為50mM或超過(guò)50mM。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在 于：步驟（1)中所述的等滲鹽溶液為DPBS溶液、PBS溶液或D-Hank' s溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求或21所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在 于：步驟（1)中所述的新鮮組織通過(guò)如下步驟得到：從生物體上提取組織，保證在30min以 內(nèi)完成，而且在提取過(guò)程中避免其他組織和雜質(zhì)混入，盡量保證組織的單一性； 步驟（2)中所述的將清洗干凈的組織中的多余液體去除為通過(guò)使用潔凈的濾紙實(shí)現(xiàn)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在 于：步驟（3)中所述的不高于-80°C的環(huán)境為_(kāi)196°C?-80°C的環(huán)境。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在 于：步驟（4)中所述的對(duì)步驟（3)保存的組織提取RNC包含如下具體步驟：將組織置于液氮 環(huán)境中，將其進(jìn)行磨碎；研磨完畢后保持在液氮環(huán)境中加入預(yù)冷至〇?4°C的細(xì)胞裂解液， 繼續(xù)研磨混勻；然后置于冰上等待完全融化，進(jìn)行裂解反應(yīng)；將裂解好的組織樣品于2? 6°C離心，取上清；使用蔗糖密度梯度離心法獲取組織樣品的RNC復(fù)合體； 所述的細(xì)胞裂解液為組成如下細(xì)胞裂解液的：20mM、pH7. 4的HEPES-KOH溶液，15mM MgCl2,200mM KCl，100yg/ml 放線菌酮，2mM 二硫蘇糖醇，體積百分比 1% 的 Triton X-100， pH = 7. 4 ； 所述的細(xì)胞裂解液配制時(shí)使用無(wú)菌無(wú) RNase的水和無(wú)菌器具，配制完畢后溶液需過(guò)濾 除囷。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述完整獲取組織內(nèi)核糖體新生肽鏈復(fù)合物的方法，其特征在 于：所述的離心的條件為4°C、16200Xg離心20min。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK104262478SQ201410452522
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】孫黎, 張弓, 王通, 金靜潔 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)