專利名稱：：核糖體展示方法或mRNA展示方法以及對(duì)蛋白質(zhì)改進(jìn)的穩(wěn)定性進(jìn)行的選擇的制作方法核糖體展示方法或mRNA展示方法以及對(duì)蛋白質(zhì)改進(jìn)的穩(wěn)定性進(jìn)行的選擇本發(fā)明涉及選出、獲得或制備穩(wěn)定性改進(jìn)的多肽變體的方法。本發(fā)明還涉及所述變體在選擇后的制備和用途，例如在治療中的用途。本發(fā)明利用展示技術(shù)，結(jié)合體外翻譯，以及在RNA之類的基因型和目標(biāo)多肽之類的編碼表型之間的共價(jià)連接或非共價(jià)連接(non-covalentlinkage),來(lái)選出比親本多肽穩(wěn)定性改進(jìn)且保持功能活性的多肽變體。核糖體或多核糖體(polysome)展示和選擇涉及構(gòu)建核酸文庫(kù)，篩選結(jié)合，鑒定出目標(biāo)結(jié)合實(shí)體。通過(guò)合成多樣化序列的DNA庫(kù)，將該庫(kù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA庫(kù)，制得所述文庫(kù)。體外翻譯用于產(chǎn)生需要展示的編碼多肽或蛋白，所需的結(jié)合用固相靶抗原選出。編碼所述結(jié)合實(shí)體的mRNA可用于制備cDNA并將該cDNA擴(kuò)增，可以重復(fù)該過(guò)程，使編碼結(jié)合物的基因數(shù)大增。隨后，可以克隆各個(gè)編碼序列并進(jìn)行DNA測(cè)序，從而鑒定出所選蛋白。所述技術(shù)已有多方面的綜述(Hanes等，(2000)Meth.Enzymol.328,403-430;Pliickthun等，(2000)Adv.Prot.Chem.55,367-403;Lipovsek和Pliickthun(2004)J.ImmunologicalMethods290，51-67)。該技術(shù)已用于展示抗體片段、肽和各種蛋白，包括周質(zhì)蛋白和胞質(zhì)蛋白，如P-內(nèi)酰胺酶和錨蛋白-重復(fù)蛋白。從多核糖體復(fù)合體中回收mRNA首先報(bào)道于1973年的論文中，該論文描述了利用抗體和固定的寡胸苷來(lái)捕獲編碼小鼠免疫球蛋白L鏈的mRNA的方案(Schechter(1973)PNASUSA70，2256-2260)。Payvar和Schimke對(duì)多核糖體免疫沉定反應(yīng)方案進(jìn)行了改進(jìn)(Eur.J.Biochem.(1979)101,271-282),在利用單克隆抗體對(duì)多核糖體進(jìn)行免疫沉淀后，獲得了HLA-DR抗原的重鏈cDNA克隆(PNASUSA(1982)79,1844-1848)。Kawasaki提出并取得了利用核糖體展示來(lái)制備抗體文庫(kù)的專利(美國(guó)專利號(hào)5，643，768和美國(guó)專利號(hào)5,658,754,EP-B-0494955)。已有多個(gè)利用真核或原核翻譯體系進(jìn)行核糖體展示的應(yīng)用實(shí)例。利用大腸桿菌提取物選擇肽配體是由Mattheakis等首個(gè)論證的(PNASUSA(1994)91，9022-9026和MethodsEnzymol(1996)267，195-207)。該小組利用給定抗體作為選擇底物，證實(shí)選出了與給定抗體的已知肽表位很相似的肽配體。結(jié)合前列腺特異性抗原的高親和力肽配體，利用小麥胚芽(wheatgerm)提取物翻譯體系，從肽文庫(kù)經(jīng)多核糖體篩選而鑒定出(Gersuk等，(1997)BiotechandBiophys.Res.Com.232,578-582)。有報(bào)道稱，原設(shè)計(jì)用于增加三元復(fù)合體(ternarycomplex)產(chǎn)量、且允許形成二硫4建的大腸桿菌翻譯體系，被用來(lái)篩選功能性抗體片段(Hanes和Pluckthun，PNASUSA(1997)94，4937-4942)。該實(shí)驗(yàn)計(jì)劃隨后被用于從鼠文庫(kù)中篩選抗體，結(jié)果表明，因PCR誤差和篩選的組合效力，致使篩選期間發(fā)生了親和成熟。獲得了一種解離常數(shù)約為10-11M的ScFv片段(Hanes等，PNASUSA(1998)95，14130-50)。還有人利用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的提取物，從混合抗體群富集特異性抗體(He和Taussig(1997)NAR，5132-5234)。mRNA展示與核糖體展示一樣，利用mRNA與所編碼的多肽之間的復(fù)合體作為基本篩選單元。mRNA展示不同于核糖體展示之處是，mRNA與蛋白之間連接的共價(jià)特性。這種連接通過(guò)小銜接分子實(shí)現(xiàn)，所述分子通常是噤呤霉素(Nemoto等，(1997)FEBSLett414:405;Roberts和Szostak，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:12297;Takahashi等，(2003)TrendsBiochem.Sci.28:159)。mRNA展示并不限于4°C，而這是核糖體展示的常用溫度。通常，篩選所用溫度受蛋白靶標(biāo)穩(wěn)定性的限制。已有人用mRNA展示對(duì)肽和抗體進(jìn)行親和篩選(參見Lipovsek和Pliickthun，(2004)JImmunologicalMethods290:51-97)。本發(fā)明提供了適于利用展示技術(shù)，結(jié)合體外翻譯，以及在RNA之類的基因型和目標(biāo)多肽之類的編碼表型之間的共價(jià)連接或非共價(jià)連接，來(lái)選出比親本多肽穩(wěn)定性改進(jìn)且保持功能活性的多肽變體的方法。本發(fā)明的方法加入了多種此前未在核糖體展示或mRNA展示中一起使用的特征。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，同時(shí)使用了兩種或多于兩種的穩(wěn)定性選擇壓力(stabilityselectionpressure),尤其是允許篩選穩(wěn)定多肽的兩種或多于兩種的穩(wěn)定性選擇壓力。穩(wěn)定性選擇壓力可以是任何可在展示技術(shù)中使用的、允許基于穩(wěn)定性選出變體多肽的因素，所述展示技術(shù)結(jié)合了體外翻譯，以及在RNA之類的基因型和目標(biāo)多肽之類的編碼表型之間的共價(jià)連接或非共價(jià)連接。穩(wěn)定性一般可定義為，分子以其折疊、活性狀態(tài)存在的傾向。穩(wěn)定性選擇壓力可以破壞或妨礙多肽進(jìn)行正確折疊，從而使其不能保持活性狀態(tài)或完全活性狀態(tài)。穩(wěn)定性選擇壓力可以影響多肽保持其折疊、活性狀態(tài)的能力。穩(wěn)定性選擇壓力可以以某種方式區(qū)分出折疊、活性狀態(tài)的多肽和非折疊、非活性狀態(tài)的多肽。例如，穩(wěn)定性選擇壓力可以是化學(xué)變性劑，如尿素，鹽酸胍(GuHCl)或硫氰酸鹽，如硫氰酸鈉。穩(wěn)定性選擇壓力可以是還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP),巰基乙醇或谷胱甘肽。穩(wěn)定性選擇壓力可以是物理變性劑，如pH或溫度，尤其是增高的溫度。選擇壓力可以是蛋白酶或能降解蛋白的酶。選擇壓力可以是消耗伴侶分子或小分子蛋白折疊抑制劑。穩(wěn)定性選擇壓力可以是使用疏水相互作用層析(HIC)。疏水相互作用層析(HIC)是基于生物分子的表面疏水性差異來(lái)分離這些分子的技術(shù)。HIC技術(shù)已被用作蛋白純化策略的一部分，同時(shí)還是檢測(cè)蛋白構(gòu)象改變的分析工具(綜述見Queiroz等，(2001)J.Biotech.87，143-159;Fulton和Vanderburgh(1996)BiomoleculeChromatographyPerSeptiveBiosystems)。HIC基于HIC基質(zhì)和蛋白分子間的疏水引力。HIC基質(zhì)由與親水聚合物骨架(如交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖)相連的非極性小基團(tuán)(丁基、辛基或苯基)組成。很多一般被認(rèn)為是親水的蛋白也具有足量的可與HIC基質(zhì)相互作用的疏水基團(tuán)。HIC的靈敏度使其足以與通常被埋藏在蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中、但因錯(cuò)誤折疊而暴露的非極性基團(tuán)反應(yīng)。這種相互作用的強(qiáng)度由基質(zhì)類型，鹽類型和鹽濃度，pH,助劑和溫度決定。本文描述本發(fā)明人的工作是，利用核糖體展示或mRNA展示等展示技術(shù)首次證實(shí)，同時(shí)利用至少兩種選"t奪壓力，如DTT，HIC和增高的溫度，可改進(jìn)治療性蛋白的藥理學(xué)特性，尤其是提高保存期(shelf-life)穩(wěn)定性。使用至少兩種選擇壓力，尤其是同時(shí)使用至少兩種選擇壓力，與使用單一選擇壓力或先后使用多種選擇壓力相比，有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，其中之一是使方案更具普遍性(generic)且更有效(robust)。根據(jù)發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)，一些蛋白并不容易受單獨(dú)一種選擇壓力的影響(即單獨(dú)一種壓力并不使其明顯不穩(wěn)定)，但易受兩種壓力影響，尤其是當(dāng)同時(shí)使用兩種壓力時(shí)。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，DTT可能對(duì)其自身不足以起作用，而僅對(duì)特定類型的蛋白如含有二硫鍵的蛋白有用。因此，利用選擇進(jìn)行的本發(fā)明，允許獲得更嚴(yán)格的選擇方法、并基于穩(wěn)定性來(lái)篩選任何蛋白。在本發(fā)明方法中，可以構(gòu)建編碼多肽變體的基因文庫(kù)。在制備多肽變體時(shí)，例如在有DTT的條件下翻譯多肽變體時(shí)，可以對(duì)多肽變體施用穩(wěn)定性選擇壓力。穩(wěn)定性選擇壓力可以在多肽的翻譯過(guò)程中，在初生多肽折疊過(guò)程中和/或多肽折疊過(guò)程后起作用?？捎糜诙嚯闹苽溥^(guò)程(即初生的多肽翻譯和折疊過(guò)程)的穩(wěn)定性選擇壓力包括DTT,谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP),巰基乙醇，尿素，鹽酸胍，伴侶分子耗竭，pH，和小分子蛋白折疊抑制劑。伴侶分子的作用是幫助多肽折疊。因此，伴侶分子的消耗會(huì)影響多肽的正確折疊能力。利用免疫沉定(IP)可以從無(wú)細(xì)胞提取物中除去伴侶分子?？顾兄饕閭H分子(如GroEL/GroES，DnaJ,DnaK)的抗體是可商購(gòu)的，它們可以用在核糖體展示體系中基于ip去除特定組分。已證實(shí)這種方法可以從無(wú)細(xì)胞提取物中除去磷酸酶，從而提高ATP豐度和共有序列表達(dá)產(chǎn)量(Shen等(1998)Biochem.Eng.J.2:23-28)。折疊也可以被特別設(shè)計(jì)的小分子抑制(Gestwicki等(2004)Science306:865-869)。小分子蛋白折疊抑制劑可以是能破壞或阻止蛋白正確折疊的任何小分子。可以在制備變體(如在翻譯過(guò)程中)和選擇(如通過(guò)結(jié)合或生物活性進(jìn)行選擇)的整個(gè)過(guò)程中同時(shí)使用兩種選擇壓力。優(yōu)選在選擇過(guò)程中使用一種或多于一種的選擇壓力，更優(yōu)選在選擇過(guò)程中使用兩種選擇壓力或多于兩種的選擇壓力?？梢杂幸环N或多于一種的選擇壓力在翻譯過(guò)程中使用，并且有一種或多于一種的選擇壓力在選擇過(guò)程中使用?？梢赃x出更穩(wěn)定、且仍結(jié)合其關(guān)聯(lián)(cognate)配體、受體或特異性結(jié)合配對(duì)物的變體。使變體在同時(shí)有兩種或多于兩種穩(wěn)定性選擇壓力的情況下進(jìn)行保溫。在本發(fā)明的方法中，所用的穩(wěn)定性選擇壓力(優(yōu)選同時(shí)使用)可以是例如HIC和增高的溫度。改進(jìn)的活性變體借助其關(guān)聯(lián)配體、受體或特異性結(jié)合配對(duì)物而被捕獲。選擇壓力可以在捕獲活性變體時(shí)存在，或者在使變體與其關(guān)聯(lián)配體、受體或特異性結(jié)合配對(duì)物一起保溫之前除去。可用的穩(wěn)定性選擇壓力包括DTT，谷胱甘肽，TCEP，巰基乙醇，尿素，GuHCl，硫氰酸鈉，蛋白酶，HIC和增高的溫度。反相層析使用的基質(zhì)。例如，適合HIC的基質(zhì)是丁基-Sepaharose(Amersham)。"增高的溫度"是指，高于通常進(jìn)行展示技術(shù)的溫度且至少部分地使蛋白去穩(wěn)定化(destabilising)的溫度。例如，如本文所述，核糖體展示通常是在4。C進(jìn)行，以便能保證核糖體/mRNA/多肽復(fù)合體的穩(wěn)定性。因此，在利用核糖體展示的方法中增高的溫度是高于4。C的溫度。例如，增高的溫度可以是高于15°C,或在室溫或高于室溫，即約20。C-30。C之間的任何溫度。增高的溫度可以是約20，21，22，23，24，25，26,27，28，29或30。C。優(yōu)選，增高的溫度是25。C或者約是25°C。優(yōu)選，本發(fā)明方法-使用在室溫進(jìn)行、優(yōu)選在約25。C進(jìn)行的HIC。同時(shí)如本文所述，mRNA展示通常是在約25。C進(jìn)行。因此，在利用mRNA展示的方法中增高的溫度是高于25。C的溫度。所述溫度可以是25醫(yī)30。C，25-35°C,30-35°C，25-40°C,30-40°C，35-40°C，25-50°C，30-50°C，或35-50。C,或者上述溫度范圍內(nèi)，或者是或約是25，30,35，40，45或50°C。優(yōu)選，增高的溫度是比展示方法的常用溫度高至少20°C，以便用作穩(wěn)定性選擇壓力。還原劑DTT在核糖體展示中作為選擇壓力來(lái)改進(jìn)含二硫鍵的蛋白的穩(wěn)定性的應(yīng)用公開在Jermutus等，(2001)ProcNatlAcadSciUSA98:75-80中。在進(jìn)行選擇前，HIC從隨機(jī)序列文庫(kù)中除去未折疊和錯(cuò)折疊肽的應(yīng)用由Keefe和Szostak(2001)Nature410:715-718，Mats匿a和Pluckthun(2003)FEBSLetters539:24-38公開。蛋白酶作為選擇壓力的應(yīng)用也有記載(Matsuura和Pliickthun2004FEBSLetters539:24-38)。于25°C用GuHCl進(jìn)行mRNA展示的應(yīng)用描述在Chaput和Szostak(2004)ChemBiol11:865-874中。因此，選擇壓力早已單獨(dú)或順序地用于糖體展示和mRNA展示中。但，是本發(fā)明首次在展示技術(shù)中利用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力，所述展示技術(shù)是結(jié)合了體外翻譯、以及在RNA之類的基因型和目標(biāo)多肽之類的編碼表型之間的共價(jià)連接或非共價(jià)連接的展示技術(shù)。本發(fā)明的選擇方案不同于核糖體展示或mRNA展示中的常規(guī)方案。例如，核糖體展示選擇是在4。C進(jìn)行，以保證核糖體/mRNA/蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定性(Hanes等，(2000)MethEnzymol328:404)。而HIC是隨溫度而定的，增高的溫度會(huì)增加HIC基質(zhì)和蛋白間的疏水相互作用。為了將HIC選擇壓力最大化，按照本發(fā)明實(shí)施方案中與HIC基質(zhì)一起進(jìn)行的保溫是在室溫進(jìn)行。這樣，可以聯(lián)合使用HIC和增高的溫度這兩種選擇壓力選出穩(wěn)定的多肽變體。結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，這些核糖體復(fù)合體在室溫是穩(wěn)定的，因此這種選擇方案是可行的。本發(fā)明還提供了利用三種穩(wěn)定性選擇壓力(如DTT，HIC和增高的溫度)進(jìn)行選擇的方案。選擇壓力可在初生多肽折疊過(guò)程中起作用和/或?qū)φ郫B的蛋白起作用。對(duì)正在折疊的多肽起作用、但對(duì)已折疊的分子可能無(wú)效的那些壓力應(yīng)在翻譯過(guò)程中使用并在翻譯后維持。這些壓力包括DTT，谷胱甘肽，TCEP，硫氰酸鈉，巰基乙醇，尿素，GuHCL，pH，小分子折疊抑制劑和消耗的伴侶分子。使折疊的蛋白去穩(wěn)定化的那些壓力可以在翻譯過(guò)程中使用，或者在翻譯后步驟中加以限制。這些壓力包括尿素，GuHCL,HIC，溫度和蛋白酶。本發(fā)明的用途和效力的證明可參考關(guān)于人促紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的新變體的舉例i兌明。Lin等，ProcNatlAcadSciUSA(1985)82:7582-4和JacobsK等，Nature313:806-810(1985)首次報(bào)導(dǎo)了人EPO的克隆和氨基酸序列。EPO是一種全球銷量高達(dá)三十億美元的重要生物藥產(chǎn)品。它主要用于增加患者的紅細(xì)胞和紅細(xì)胞生成，以便治療與慢性腎衰竭、癌化療、HIV感染、兒科用途、早產(chǎn)兒相關(guān)的貧血癥，減少貧血癥患者在接受并非急需的(elective)非心臟、非血管手術(shù)時(shí)輸血的必要。人EPO是一種酸性糖蛋白，分子量約30400道爾頓。它由恒定的165個(gè)氨基酸的單鏈多肽組成，其中有四個(gè)半胱氨酸殘基(在位置7，29，33和161),它們形成內(nèi)部二硫鍵(Lai等，JBiolChem1986261:3116-3121;Recny等，JBiolChem1987262:17156-17163)。已知半胱氨酸7和161之間的二石克4建是生物活性所必需的。EPO的糖部分由位于Asn24,38和83的三個(gè)N耳關(guān)糖鏈和位于Serl26的O聯(lián)糖組成(BrowneJK等，ColdspringHarbsympQuantBiol198651:693-702EgrieJC等，，Immunobiology1986172:213-224.)。人EPO的結(jié)構(gòu)已有報(bào)道(Cheetham等，1988NatStructBiol5:861-866;Syed等，1998Nature395:511-516)。人EPO是一個(gè)四螺旋束，這在造血生長(zhǎng)因子家族成員中是典型的。與恒定的氨基酸序列相比，糖結(jié)構(gòu)是可變的，該特征稱作微不均一性(micro-heterogendty)。糖部分在分支模式、復(fù)雜度大小和電荷方面的差異，對(duì)EPO藥物動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)具有深遠(yuǎn)影響。不同糖基化模式的影響已研究清楚(Darling等，2002Biochemistry41:14524-14531;Storring等，1998BrJHaematol100:79-89;Halstenson等，1991ClinPharmacolTher50:702-712;Takeuchi等，1990JBiolChem265:12127-12130)。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞(myeloidcell)的生成、效應(yīng)細(xì)胞功能和存活的細(xì)胞因子。人GM-CSF用于骨髓移植、骨髓移植物植活(engraftment)失敗或延遲、遷移后的骨髓再生，自體外周血祖細(xì)胞移植后的骨髓再生，以及在老年急性髓性白血病患者中引入化療后的骨髓再生。GM-CSF可從商品名leukine(Amgen)和leucomax(Schering-Plough)購(gòu)得。Cantrell等第一個(gè)報(bào)道了人GM-CSF的克隆和氨基酸序列(Cloning,sequence,andexpressionofahumangranulocyte/macrophagecolony-stimulatingfactor.ProcNatlAcadSciUSA.(Sep1985);82(18):6250-4)。GM-CSF是127個(gè)氨基酸的單體蛋白，有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)。該蛋白被合成為144個(gè)氨基酸的前體，它在氨基末端有疏水分泌信號(hào)序列。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的GM-CSF被發(fā)現(xiàn)是不同的糖基化形式，大小為14-35KDa不等。糖部分并不是完整的生物活性譜所必需的。GM-CSF的結(jié)構(gòu)是一種四螺旋束(Diederichs,K.，Boone,T.&Karplus,P.A.(1991).Novelfoldandputativereceptorbindingsiteofgranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor.Science,254,1779-1782),這與其它四螺旋細(xì)胞因子相似。它編碼四個(gè)半胱氨酸殘基，它們形成兩個(gè)二硫鍵(位置54/96和88/121)。在接受骨髓抑制性癌癥化療藥物、并有重癥中性粒細(xì)胞減少癥伴發(fā)熱的高發(fā)病率的患者內(nèi)，人G-CSF用于降低與發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少癥(喪失中性粒細(xì)胞)相關(guān)的感染的發(fā)病率。使用G-CSF產(chǎn)品可以幫助醫(yī)生及時(shí)地按照計(jì)劃給予化療劑量，并改進(jìn)臨床后果。G-CSF可從商品名Neupogen，Neulasta(PEG化G-CSF)和Granocyte購(gòu)得。Nagata等首次克隆并表達(dá)了人G-SCF(ThechromosomalgenestructureandtwomRNAsforhumangranulocytescolonystimulatingfactor.Nature5:575-581(1986》。成熟G-CSF是一種174個(gè)氨基酸的單體蛋白，有一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)位于Thrl33,還有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(Cys36-Cys42和Cys65-Cys74)。G-CSF的結(jié)構(gòu)是一種四螺旋束(Hill等1993ProcNatlAcadSciUSA90;5167-5171)。糖基化使分子穩(wěn)定，但并非生物活性所必需(Oh-eda等19卯JBiolChem265:11432-11435)。已有人在大腸桿菌中制得重組G-CSF,收獲了包含體(inclusionbody),并使G-CSF重新折疊(US5,849,883)。有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了穩(wěn)定性提高的G-CSF變體，如Bishop等2001ReengineeringGranulocytecolony-stimulatingfactorforenhancedstabilityJBiolChem276:33465-33470;Lou等2002DevelopmentofacytokineanalogwithenhancestabilityusingcomputationalultrahighthroughputscreeningProteinScience11:1218-1226;Fuji等1997StructureofKW-228,atailoredhumangranulocytecolonystimulatingfactorwithenhancedbiologicalactivityandstabilityFEBSLetters410:131-135。但是，所有關(guān)于在大腸桿菌中產(chǎn)生G-CSF的報(bào)道都是使用胞質(zhì)表達(dá)，獲得包含體，從該包含體重新折疊生成G-CSF。目前尚無(wú)在大腸桿菌中成功表達(dá)可溶性人G-CSF的報(bào)道，有一篇報(bào)道(Jeong和Lee2001ProteinExpressionandPurification23:311-318)例外，它利用了芽孢桿菌信號(hào)肽、組氨酸六聚物和凝血因子Xa切割位點(diǎn)。這導(dǎo)致可溶性表達(dá)，但N末端組氨酸標(biāo)簽沒被切除，而且未證實(shí)生物活性。G-CSF變體在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生可溶性單體活性蛋白。這使表達(dá)和純化過(guò)程簡(jiǎn)化，無(wú)需重折疊步驟，因此優(yōu)化了制備方法，而且可能對(duì)效力和儲(chǔ)存特性有利。本發(fā)明提供了本文證實(shí)的方法，它們提供穩(wěn)定性提高的EPO、GM-CSF和G-CSF變體，從而使患者和生產(chǎn)商受益。變體穩(wěn)定性提高一般導(dǎo)致在下游過(guò)程中獲得更高的表達(dá)和更高的產(chǎn)量，從而改進(jìn)商品成本(COG)。另外，穩(wěn)定性改進(jìn)的變體，它的保存期也延長(zhǎng)。保存期延長(zhǎng)也會(huì)影響商品成本，因而是有益的。另一益處是減少冷儲(chǔ)存的需要，有助于商品分發(fā)、以及患者在自己家中服藥。穩(wěn)定性改進(jìn)的變體因半衰期延長(zhǎng)，可以使體內(nèi)效力增強(qiáng)。另外，穩(wěn)定性改進(jìn)的變體可以更適合皮下給藥等給藥途徑，理由是聚集減少，這不僅增加效力，而且降低中和或結(jié)合所激發(fā)的抗體的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明同樣可以應(yīng)用于其它多肽并且選出穩(wěn)定性提高的多肽變體。如本文所述，使用多重選擇壓力，尤其是同時(shí)使用，可以用更普遍的選擇方案基于穩(wěn)定性選出各種多肽。本發(fā)明多肽的優(yōu)選特征在本文描述。本發(fā)明多肽應(yīng)該能用與體外翻譯，以及在RNA之類的基因型和目標(biāo)多肽之類的編碼表型之間的共價(jià)連接或非共價(jià)連接相結(jié)合的展示技術(shù)進(jìn)行展示。因此，多肽必需可以在無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系翻"^，并能在該體系中折疊成其正確的三級(jí)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明多肽可以是單順反子，或由相同亞單位組成(同多亞基)。可以使用由單順反子表達(dá)的與一個(gè)多肽鏈融合的二亞基分子，如單鏈Fv抗體分子。多肽優(yōu)選含有能形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，或?qū)φ郫B和穩(wěn)定性重要的其它殘基。可以根據(jù)不同條件，優(yōu)選地去除或影響多肽中對(duì)折疊和穩(wěn)定性重要的組件(element)，所述條件如添加還原劑或定點(diǎn)誘變。本發(fā)明多肽的實(shí)例還包括，但不限于，四種反平行a-螺旋束蛋白的家族成員，如干擾素或白細(xì)胞介素，以及復(fù)雜受體如腫瘤壞死因子受體II(TNFRII)的胞外區(qū)。穩(wěn)定性通?？梢远x為，分子保持其折疊和活性狀態(tài)的傾向。天然產(chǎn)生的分子通常因其新陳代謝而穩(wěn)定性有限，而它們的快速新陳代謝常常是它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)的固有作用機(jī)理的關(guān)鍵特征。一般情況下，處于折疊和天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)的穩(wěn)定蛋白不會(huì)被蛋白酶或其他機(jī)制降解。這歸因于兩種關(guān)鍵的脫離穩(wěn)定狀態(tài)的途徑，它們是通常情況下將蛋白從體內(nèi)消除的途徑。這兩種途徑是解折疊和聚集。它們通常是相關(guān)聯(lián)的。解折疊是將折疊的活性分子轉(zhuǎn)變成較少折疊的狀態(tài)的途徑。聚集是錯(cuò)誤折疊的結(jié)果，導(dǎo)致分子不可逆地轉(zhuǎn)變成非活性狀態(tài)。解折疊和聚集都能明顯增加蛋白對(duì)蛋白水解或其他消化作用的敏感性。蛋白聚集是大腸桿菌表達(dá)的可溶性功能型重組蛋白的主要缺陷。重組蛋白的聚集很可能是由于伴侶分子的量有限。在這些條件下，折疊不完全，部分地折疊的中間體含有暴露的疏水表面，它們進(jìn)入解離途徑(off-pathway),發(fā)生自我結(jié)合。自我結(jié)合是蛋白聚集和形成包含體的基礎(chǔ)(參見綜述Baneyx(1999)Recombinantproteinexpressionin^c/zeWc/z""co//.CurrOpinBiotechnol10:411-421;Carrio和Villaverde(2002)JBiotech96，3-12;Geogiou和Valaw(1996)CurrOpinBiotech7,190-197)。已知大腸桿菌胞質(zhì)表達(dá)的GM-CSF會(huì)形成不可溶聚集體(Greenberg等，(1988)CurrMicrobiol17:321-332)。周質(zhì)表達(dá)也會(huì)使大部分產(chǎn)物在不可溶組分內(nèi)(Lundell等，(1990)BiotechnologyandAppliedBiochemistry12:567-578)。針對(duì)更易于在表達(dá)過(guò)程中發(fā)生聚集的蛋白產(chǎn)生更穩(wěn)定的變體，得到可溶性單體蛋白。這種蛋白能更有效的折疊，不太可能解折疊，因此具有較少的能引起聚集的暴露性疏水表面。這將增加從大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)量，而且不再需要重折疊過(guò)程。此前已有多種提高蛋白的可溶性表達(dá)的嘗試。例如，改變培養(yǎng)條件，使用伴侶分子，產(chǎn)生融合蛋白和改造蛋白，采用GuHCl篩選等，它們已經(jīng)取得了不同程度的成功。在本發(fā)明實(shí)施方案的方法中，所述多肽的折疊和解折疊途徑被改變，致使所得實(shí)體更穩(wěn)定。盡管此前已對(duì)蛋白熱力學(xué)穩(wěn)定性增強(qiáng)的演變進(jìn)行了論證(Jermutus等，(2001)ProcNatlAcadSci98:75-80)，但本文是首次描述體外演變，此過(guò)程引起的氨基酸變化可為生物療法帶來(lái)實(shí)實(shí)在在的好處。本發(fā)明的實(shí)施方案通過(guò)以下實(shí)施例的舉例，包括參考附圖，進(jìn)行更詳細(xì)描述，但它們絕非限制。圖1示變體F07(變體l(Var.l))和野生型產(chǎn)生的GM-CSF的western印跡。樣品如本文所述來(lái)制備。泳道1是來(lái)自細(xì)胞裂解物的F07總GM-CSF。泳道2是經(jīng)4000rpm離心獲得的F07周質(zhì)制品(periprep)。泳道3是經(jīng)15000rpm離心獲得的F07周質(zhì)制品。泳道4來(lái)自細(xì)胞裂解物的野生型總GM-CSF。泳道5是經(jīng)4000rpm離心獲得的野生型周質(zhì)制品。泳道6是經(jīng)15000rpm離心獲得的野生型周質(zhì)制品。泳道7是MagicMarker(Invitrogen)。圖2示野生型(WT)和變體(Varl)的G-CSF產(chǎn)物的銀染凝膠。Varl泳道中，約25kDa的明顯泳帶是單體G-CSF。樣品如實(shí)施例6和7所述來(lái)制備。圖3示野生型(WT)和變體(Var1)50ml周質(zhì)表達(dá)的SEC示蹤和產(chǎn)量。樣品如實(shí)施例8所述來(lái)制備。在Var1中，箭頭(l)指示聚集的G-CSF,箭頭(2)指示單體G-CSF。在單體G-CSF(箭頭(2))中，下部峰值是在O.D254測(cè)定的，上部峰值是在O.D280測(cè)定的。本發(fā)明一方面提供了一種提供比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體的方法，所述方法包括(a)提供多個(gè)mRNA分子，每一mRNA分子包含編碼目標(biāo)多肽變體的核苦酸序列且缺失框內(nèi)終止密碼子；(b)保溫所述mRNA分子，所用的保溫條件致使所述mRNA分子發(fā)生核糖體翻譯，產(chǎn)生所編碼的目標(biāo)多肽變體，由此形成多個(gè)復(fù)合體，每個(gè)復(fù)合體都至少含有mRNA和所編碼的目標(biāo)多肽變體；(c)將這些復(fù)合體與結(jié)合所述親本目標(biāo)多肽的受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物接觸，選出一個(gè)或多個(gè)復(fù)合體，它們每一個(gè)都在該選擇條件下展示出與所述受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物結(jié)合的目標(biāo)多肽變體；其中，如下進(jìn)行步驟(i)，(ii)和(iii)中的一步或多步；(i)在步驟(b)的翻譯過(guò)程中，同時(shí)使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力；(ii)在步驟(c)的選擇過(guò)程中，同時(shí)使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力；(iii)至少一種穩(wěn)定性選擇壓力在步驟(b)的翻譯過(guò)程中、繼而在步驟(c)的選擇過(guò)程中使用，且至少一種另外的穩(wěn)定性選擇壓力在步驟(c)的選擇過(guò)程中使用；和(d)確定所選的一或多種目標(biāo)多肽變體的穩(wěn)定性，從而獲得比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的一種或多種目標(biāo)多肽變體。本發(fā)明的方法利用了與體外翻譯，以及在RNA之類的基因型和目標(biāo)多肽之類的編碼表型之間的共價(jià)連接或非共價(jià)連接聯(lián)合的選擇或展示技術(shù)，來(lái)選出比親本多肽穩(wěn)定性改進(jìn)、但仍保留功能活性的多肽變體。本發(fā)明的方法可以利用例如核糖體展示技術(shù)或mRNA展示技術(shù)。在核糖體展示的情況下，用本發(fā)明方法形成的復(fù)合體還包含核糖體。穩(wěn)定性選擇壓力可選自二硫蘇糖醇(DTT),谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP),巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl)，伴侶分子耗竭，pH，小分子蛋白折疊抑制劑，蛋白酶，硫氰酸鈉，疏水相互作用層析(HIC)和溫度。(使用增高的溫度可以在穩(wěn)定性方面提供選擇壓力)。變體多肽翻譯過(guò)程中的穩(wěn)定性選擇壓力可以是二硫蘇糖醇(DTT),谷胱甘肽，三P-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl)，伴侶分子耗竭，pH和小分子蛋白折疊抑制劑。任選地，穩(wěn)定性選擇壓力可以不出現(xiàn)在翻譯過(guò)程中。優(yōu)選，在翻譯過(guò)程中使用DTT作為選擇壓力。在本發(fā)明的方法中，同時(shí)使用至少兩種穩(wěn)定性選擇壓力來(lái)選出多肽變體。兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力可選自二硫蘇糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，琉基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl)，蛋白酶，硫氰酸鈉，HIC和溫度。優(yōu)選地，同時(shí)使用的選擇壓力，在選擇階段包括HIC和溫度，在包括翻譯階段使用DTT的過(guò)程中也優(yōu)選如此。用作選擇壓力的溫度可以是室溫，優(yōu)選約25。C。一種或多種穩(wěn)定性選擇壓力可以在捕獲選出的變體時(shí)存在，所述變體是能與結(jié)合親本目標(biāo)多肽的受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物相結(jié)合的變體?；蛘?，可以在用所述受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物捕獲選出的變體之前，除去兩種選擇壓力中的一種或多種。有無(wú)選擇壓力至少部分取決于選擇壓力是否影響或破壞所選變體和受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物間的相互作用。例如，當(dāng)用蛋白酶作為選擇壓力時(shí)，優(yōu)選在引入受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物之前將蛋白酶去除或使蛋白酶失活，以便避免受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物被蛋白酶降解。在本發(fā)明的方法中，可以比較所選出的一或多種目標(biāo)多肽變體在有和無(wú)選擇壓力(如DTT)的條件下被展示出來(lái)時(shí)，結(jié)合受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物的能力，由此確定穩(wěn)定性。在本發(fā)明上下文中，對(duì)穩(wěn)定性的計(jì)量值可以用比值表示，所述比值是，變體與受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物結(jié)合的能力在有二硫蘇糖醇(DTT)(如10mMDTT)的條件下與在無(wú)DTT的條件下，經(jīng)同樣的放射免疫分析(RIA)測(cè)定的比值。該比值越高，變體的穩(wěn)定性就越高，其在還原環(huán)境中的折疊形式就越多。與野生型多肽相比，變體的該比率提高了約或至少約5倍，更優(yōu)選約或至少約10倍，15倍，20倍，25倍或30倍。在本發(fā)明的方法中，可以將所選的一或多種目標(biāo)多肽變體的聚集與親本目標(biāo)多肽的聚集進(jìn)行比較，來(lái)確定穩(wěn)定性。因此，另一種可用于本發(fā)明的穩(wěn)定性計(jì)量值是變體多肽與野生型多肽在一段時(shí)間內(nèi)的聚集的比較值。例如，可將野生型和變體多肽在一定溫度范圍內(nèi)(如5。C-45。C)儲(chǔ)存，然后用本領(lǐng)域常規(guī)方法分析降解產(chǎn)物和聚集物。穩(wěn)定蛋白更好地保持其折疊狀態(tài)，且更不易降解和聚集。評(píng)估聚集可借助對(duì)可溶性蛋白的表達(dá)進(jìn)行的篩選，例如，包括表達(dá)蛋白，然后離心，利用PAGE和免疫印跡進(jìn)行分析。當(dāng)經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有與經(jīng)離心可除去的拖尾(smear)或條帶不同的、經(jīng)離心未被除去的單個(gè)的條帶時(shí)，說(shuō)明存在可溶蛋白而非聚集體。多肽變體的穩(wěn)定性可以通過(guò)在生物活性試驗(yàn)中確定變體的功能或活性來(lái)進(jìn)行測(cè)定。穩(wěn)定性改進(jìn)的變體多肽，可以在比野生型蛋白保留90%殘余活性的溫度高出2-10。C(如高出2、3、4、5、6、7、8、9或10。C)的溫度，仍保持90%的殘余活性。殘余(即折疊且有活性的)蛋白的百分比，可利用常規(guī)生物化學(xué)技術(shù)(如HPLC，SDSPAGE)進(jìn)行測(cè)定，或通過(guò)結(jié)合試驗(yàn)等活性試驗(yàn)或激發(fā)細(xì)胞反應(yīng)來(lái)測(cè)定。本發(fā)明的方法可以包括從選定的復(fù)合體回收mRNA。故，可以分離出選定的一或多種復(fù)合體的mRNA，和/或用其提供DNA來(lái)用該DNA產(chǎn)生所編碼的特異性結(jié)合配對(duì)物，和/或在利用核糖體展示、mRNA展示、或其他體系(如噬菌體展示、酵母展示)進(jìn)行的新一輪篩選中使用。一般情況下，提供多樣化mRNA序列的文庫(kù)、群體或全體(repertoire),其編碼具有形成目標(biāo)多肽的潛力的多樣化肽或多肽的文庫(kù)、群體或全體。在本發(fā)明方法中使用的核糖體翻譯體系可以是原核的或真核的。它們都已在本領(lǐng)域用于展示和選擇大量不同的結(jié)合分子。參見如Mattheakis等，(1994)PNASUSA91,9022-9026;Mattheakis等，(1996)MethodsEnzymol267:195-207;Gersuk等，(1997)BiotechandBiophysResCom232,578-582;Hanes和Pluckthun(1997)PNASUSA94，4937-4942;Hanes等，(1998)PNASUSA95,14130-50;He和Taussig(1997)NAR5132-5234.(Hanes等(2000)Meth.Enzymo1.328，403-430，Pliickthun等(2000)Adv.Prot.Chem55,367-403)。用于核糖體展示的構(gòu)建體可以包含RNA聚合酶啟動(dòng)子(如T7聚合酶啟動(dòng)子)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Kozak共有序列，起始密碼子，以及多肽、肽或蛋白的編碼序列。編碼一或多種檢測(cè)標(biāo)記的一種或多種核苷酸序列也可以包括在內(nèi)，使產(chǎn)生的多肽、肽或蛋白還包括一或多種檢測(cè)標(biāo)記(如組氨酸標(biāo)記)。還可將一或多種其它特征引入用于核糖體展示的構(gòu)建體中，參見WO01/75097。在本發(fā)明的方法中使用的mRNA翻譯體系可以是已有的任何合適體系?？墒褂迷嘶蛘婧说姆g體系，如大腸桿菌或小麥(如由Roche,Invitrogen提供)粗制裂解物，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(如由Ambion，Promega提供)或重建體系如PURE(由Shimizu等，Cell-freetranslationreconstitutedwithpurifiedcomponents,Nat.Biotechnol.19(2001)751—755才艮道)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在翻譯體系中保溫的mRNA分子是通過(guò)RT-PCR反應(yīng)獲得的，該反應(yīng)中至少一種RT-PCR引物是誘變引物，其編碼包含在所述mRNA編碼區(qū)的指定區(qū)域內(nèi)的多種不同序列。例如，指定區(qū)域可以是編碼抗體分子CDR(優(yōu)選抗體VH區(qū)CDR3)的區(qū)域。進(jìn)行突變的指定區(qū)域可以包括對(duì)總體蛋白穩(wěn)定性而言必需的殘基(Proba等，(1998)J.Mol.Biol.275，245-253),或很可能參與早期聚集事件的蛋白區(qū)，如暴露的環(huán)。如本文所述，本發(fā)明方法可用于任何能在體外體系中產(chǎn)生的蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，需要展示的目標(biāo)多肽是抗體分子，通常是單鏈抗體分子，如scFv抗體分子、VH、Fd(由VH和CHI區(qū)組成)、或dAb分子。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用非抗體目標(biāo)多肽，包括受體、酶、肽和蛋白配體。目標(biāo)多肽的實(shí)例包括但不限于，四種反平行ot-螺旋束蛋白家族的成員，如干擾素或白細(xì)胞介素，以及復(fù)雜受體(如腫瘤壞死因子受體II(TNFRII))的胞外區(qū)。在本發(fā)明方法中，從展示所選目標(biāo)多肽變體的選定復(fù)合體回收的mRNA可以被擴(kuò)增，并拷貝到編碼所選目標(biāo)多肽變體的DNA中。DNA可以提供在產(chǎn)生產(chǎn)物的表達(dá)體系中，所述產(chǎn)物是所選目標(biāo)多肽變體或其多肽鏈。編碼所選目標(biāo)多肽變體或其多肽鏈的DNA可以提供在核苷酸序列中，以提供編碼融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白含有與其它氨基酸融合的所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈。包含編碼所述融合蛋白的所述核苦酸序列的DNA可以提供在產(chǎn)生產(chǎn)物的表達(dá)體系中，所述產(chǎn)物是該融合蛋白。本發(fā)明的方法還可以包括對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離或純化，所述產(chǎn)物可配制成含有至少一種其它組分的組合物。編碼所展示的目標(biāo)多肽變體的核酸被選出并回收后，可用于提供編碼的目標(biāo)多肽或提供另外的核酸(如通過(guò)PCR等擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)提供)。選出的mRNA可進(jìn)行RT-PCR，產(chǎn)生cDNA拷貝。編碼目標(biāo)多肽變體的組成成分的核酸可用于提供另外的分子，比如重排的抗體分子，融合蛋白，免疫粘附素等。因此，例如，編碼所選scFv抗體分子的VH和VL區(qū)的核酸，可用于構(gòu)建編碼其它形式的抗體分子(如Fab分子或完整抗體)的序列。在本發(fā)明方法中，編碼所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈的DNA可以進(jìn)行突變，使其編碼的多肽含有不同于所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈的氨基酸序列。編碼所述多肽的突變DNA可以提供在產(chǎn)生產(chǎn)物的表達(dá)體系中，其中的產(chǎn)物是所述多肽。所述方法還可以包括分離或純化產(chǎn)物，任選地，將產(chǎn)物配制成含有至少一種其它組分的組合物。另外，可以用本領(lǐng)域已有的任何技術(shù)使核酸序列改變或突變。這可以用于提供衍生序列?？梢蕴峁┚幋a所選目標(biāo)多肽變體或其組分的衍生物的序列，所述衍生物例如含有不同于所選目標(biāo)多肽變體或其組分的氨基酸序列，是通過(guò)添加、刪除、插入和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列而得的。提供這種衍生物的方法還可以提供融合蛋白或偶聯(lián)物，其中，另外的肽或多肽部分(如毒素或標(biāo)記物)與所述目標(biāo)多肽變體或其組分相連。編碼核酸，無(wú)論重構(gòu)與否，都可以利用本領(lǐng)域可得的任何技術(shù)來(lái)制備編碼的多肽或肽，從而通過(guò)重組表達(dá)來(lái)獲得多肽和肽。本文描述了本發(fā)明的進(jìn)一步方面和實(shí)施方案，優(yōu)選的方面和實(shí)施方案是下文包括的權(quán)利要求。本發(fā)明通過(guò)以下方法舉例說(shuō)明，其中的親本目標(biāo)多肽是野生型促紅細(xì)胞生成素(EPO)。具體地，所述親本目標(biāo)多肽是具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的人野生型EPO。本文所述方法提供了在SEQIDNO:2所示的人野生型序列中包括選自下述突變組合中的一組突變的目標(biāo)多肽變體(1)L16II25FT27MV61AR139HT157V(2)D8VT26AT27AS126PG158E(3)D8VT27AY49NW64RV82AE89G126PG158E(4)T26AW64RA135VG158E(5)D8VV74FT107AN147D。另外，本發(fā)明通過(guò)以下方法舉例說(shuō)明，其中的親本目標(biāo)多肽是野生型粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。具體地，所述親本目標(biāo)多肽是具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的人野生型GM-CSF。本文描述的方法提供了，在SEQIDNO:4所示的人野生型序列中包含R4SL15HA18VI43VK63TT102A這組突變的目標(biāo)多肽變體。另外，本發(fā)明通過(guò)以下方法舉例說(shuō)明，其中的親本目標(biāo)多肽是野生型粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。具體地，所述親本目標(biāo)多肽是具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的人野生型G-CSF。本文描述的方法提供了，在SEQIDNO:6所示的人野生型序列中包含一般而言，在本發(fā)明的各個(gè)方面和實(shí)施方案中，親本多肽包含折疊的蛋白結(jié)構(gòu)域，且最優(yōu)選具有生物活性。生物活性可以包括，與關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體(如受體或配體)結(jié)合的能力，也可以包括觸發(fā)受體活性或生物應(yīng)答的能力，對(duì)催化反應(yīng)的能力等。如本文所述，在本發(fā)明上下文中使用的穩(wěn)定性計(jì)量值可以用比值表示，所述比值是指，由mRNA翻譯產(chǎn)生的目標(biāo)多肽變體，在有二硫蘇糖醇(DTT)或任何其它穩(wěn)定性選擇壓力(如增高的溫度或使用HIC基質(zhì))的條件下，經(jīng)放射免疫分析(RIA)測(cè)定的，結(jié)合關(guān)聯(lián)受體、配體或其它特異性結(jié)合配對(duì)物的能力，與由mRNA翻譯產(chǎn)生的目標(biāo)多肽變體，在無(wú)任何選擇壓力的條件下，經(jīng)同樣的放射免疫分析測(cè)定的，結(jié)合目標(biāo)多肽受體、配體或其它特異性結(jié)合配對(duì)物的能力的比值。翻譯可以在有"S-Met的條件下進(jìn)行，以產(chǎn)生放射性標(biāo)記的蛋白。通過(guò)使翻譯混合物與非關(guān)聯(lián)受體和/或無(wú)關(guān)抗原如BSA接觸，并測(cè)量在這些表面的殘余放射活性，可以確定非特異性結(jié)合或背景結(jié)合。本發(fā)明上下文中用到的所選目標(biāo)多肽變體如EPO變體的穩(wěn)定性計(jì)量值可以用比值表示，所述比值是，變體如EPO變體，在有二硫蘇糖醇(DTT)如10mMDTT的條件下，經(jīng)放射免疫分析(RIA)測(cè)定的，結(jié)合其受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物(如對(duì)EPO變體而言是EPO受體)的能力，與變體如EPO變體，在無(wú)DTT的條件下，經(jīng)同樣的放射免疫分析測(cè)定的，結(jié)合受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物(如對(duì)EPO變體而言是EPO受體)的能力的比值。該比值越高，變體如EPO變體的穩(wěn)定性就越高，其在還原環(huán)境的折疊形式就越多。與野生型EPO相比，EPO變體的該比值提高了約或至少約5倍，更優(yōu)選約或至少約10倍，15倍，20倍，25倍或30倍。以下實(shí)施例證實(shí)，本發(fā)明提供了穩(wěn)定性改進(jìn)且保持功能性的變體。例如參見表1，其提供了在有和無(wú)DTT的條件下與EPO受體結(jié)合的比值，野生型EPO為0.00,各種EPO變體為0.1至0.33不等。如本文所述，本發(fā)明上下文中采用的穩(wěn)定性計(jì)量值可以是聚集。因此，可以比較一段時(shí)間內(nèi)EPO變體與野生型EPO各自的聚集，從而確定穩(wěn)定性。例如，可將野生型EPO和變體EPO在一定溫度范圍內(nèi)(如5。C-45。C)儲(chǔ)存，然后用本領(lǐng)域常規(guī)方法分析降解產(chǎn)物和聚集物。穩(wěn)定蛋白更好地保持其折疊狀態(tài)，且更不易降解和聚集。穩(wěn)定性改進(jìn)的EPO變體多肽，可以在比野生型蛋白保持90%殘余活性的溫度高出2-10。C(如高出2、3、4、5、6、7、8、9或10。C)的溫度，仍保持90。/。的殘余活性。殘余(即折疊且有活性的)蛋白的百分比，可利用常規(guī)生物化學(xué)技術(shù)(如HPLC,SDSPAGE)進(jìn)行測(cè)定，或通過(guò)結(jié)合試驗(yàn)等活性試驗(yàn)或激發(fā)細(xì)胞反應(yīng)來(lái)測(cè)定。例如，評(píng)估聚集可借助對(duì)可溶性蛋白的表達(dá)進(jìn)行的篩選，例如，包括表達(dá)蛋白，然后離心，利用PAGE和免疫印跡進(jìn)行分析。經(jīng)免疫印跡檢測(cè)到與拖尾不同的單個(gè)的條帶時(shí)，說(shuō)明存在可溶蛋白而非蛋白聚集體。具有改進(jìn)的表達(dá)語(yǔ)的GM-CSF變體可以用本發(fā)明的方法鑒定。GM-CSF變體的產(chǎn)物經(jīng);險(xiǎn)測(cè)主要是單個(gè)的條帶，這與野生型產(chǎn)物的梯狀拖尾(ladderedsmear)不同。G-CSF變體的產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)也是單個(gè)的條帶。多肽變體的穩(wěn)定性可以通過(guò)在生物活性試驗(yàn)中確定變體的功能或活性來(lái)評(píng)估。例如，GM-CSF變體的穩(wěn)定性可以在TF1細(xì)胞增殖試驗(yàn)中評(píng)定；G-CSF變體的穩(wěn)定性可以在OCI/AML5細(xì)胞增殖試驗(yàn)中評(píng)定。用于確定穩(wěn)定性的生物活性試驗(yàn)本身的特性當(dāng)然是由目標(biāo)多肽的功能或活性來(lái)決定的。分析具體蛋白活性的合適方法是本領(lǐng)域已知的。以下實(shí)施例證實(shí)，本發(fā)明提供了穩(wěn)定性改進(jìn)且保持功能性的變體。例如，參見表2，其提供了TF1增殖試驗(yàn)中GM-CSF變體與野生型GM-CSF比較的結(jié)果，表3提供了OCI/AML5細(xì)胞增殖試驗(yàn)中G-CSF變體與野生型G-CSF比較的結(jié)果。本發(fā)明的目標(biāo)多肽變體可以是，與起始多肽或親本多肽相比，包含一或多種另外的變化，所述起始多肽或親本多肽可以是野生型或天然蛋白或此前獲得的多肽變體。已知可對(duì)目標(biāo)多肽進(jìn)行多種不同修飾(包括天然發(fā)生的突變和人工產(chǎn)生的變體)，它們產(chǎn)生與野生型相比改變的特性。這些特性中的一種或多種可以保留或提供至本發(fā)明的目標(biāo)多肽變體中。目標(biāo)多肽變體按照本發(fā)明的方法制成后，比如從編碼核酸(見下文)表達(dá)出來(lái)后，可進(jìn)行分離和/或純化(如利用抗體進(jìn)行)。因而，制得的多肽可以不含或基本不含雜質(zhì)。一種多肽可以不含或基本不含其它多肽。經(jīng)過(guò)分離和/或純化的多肽可以用于配制組合物，所述組合物可以包含至少一種另外的組分，如藥物組合物包含可藥用賦形劑(excipient)、媒介物(vehicle)或載體(carrier)。Hanyou本發(fā)明多肽的組合物可以如下述用于預(yù)防性和/或治療性療法中。制備本發(fā)明多肽的一種便捷方式是，在表達(dá)體系中使用編碼所述多肽的核酸，使該核酸表達(dá)。因此，本發(fā)明還包括制備多肽的方法(如所公開的)，該方法包括從編碼多肽的核酸(通常是本發(fā)明的核酸)進(jìn)行表達(dá)。這可以通過(guò)在引起或允許所述多肽表達(dá)的適宜條件下，使含有所述載體的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而方便地實(shí)現(xiàn)。多肽還可以表達(dá)在體外體系如網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中。在各種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的體系是熟知的。適合的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物和酵母，以及桿狀病毒體系。本領(lǐng)域已有的用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼年倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、COS細(xì)胞等。常用的優(yōu)選細(xì)菌宿主是大腸桿菌?？梢蕴暨x或構(gòu)建適合的載體，其可含有適宜的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列，終止子片段，聚腺普酸化序列，增強(qiáng)子序列，標(biāo)記基因和其它需要的序列。載體可以是質(zhì)粒，病毒，如噬菌體或噬菌粒，取決于需要。詳述參見如MolecularCloning:aLaboratoryManual:3rdedition,Sambrook和Russell,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress。許多才喿作核酸的已知技術(shù)和方案，如制備核酸構(gòu)建體，誘變，測(cè)序，將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)，分析蛋白，者卩i羊述在CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等eds.,JohnWiley&Sons,1992中。編碼目標(biāo)多肽變體的核酸可以根據(jù)本發(fā)明的方法制備。一般而言，本發(fā)明的核酸是分離物，分離和/或純化的形式，或無(wú)雜質(zhì)或基本無(wú)雜質(zhì)。核酸可以是完全或部分合成的，并可包括基因組DNA，cDNA或RNA。本發(fā)明提供的核酸可以是可復(fù)制載體的一部分，本發(fā)明還提供了一種包括編碼本發(fā)明目標(biāo)多肽變體的核酸的載體，特別是提供了能在合適的條件下表達(dá)所編碼的多肽的任何表達(dá)載體，和含有任何所述載體或核酸的宿主細(xì)胞。在此語(yǔ)境中的表達(dá)載體是一種核酸分子，其含有編碼目標(biāo)多肽的核酸和合適的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列適于在網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物等體外表達(dá)體系織，或在真核細(xì)胞(如COS或CHO細(xì)胞)或原核細(xì)胞(如大腸桿菌)等體內(nèi)體系中表達(dá)所述多肽。宿主細(xì)胞可以包括本文所公開的核酸。可將該核酸整合到宿主細(xì)胞基因組(染色體)內(nèi)。利用常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入能促進(jìn)與基因組重組的序列，可以增強(qiáng)整合。核酸可以在細(xì)胞內(nèi)的染色體外載體上。可將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。導(dǎo)入通常(特別是對(duì)體外導(dǎo)入而言)稱為"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)染，，但無(wú)任何限制，其可以使用任何已有的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，適合的技術(shù)包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，以及用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒(如痘苗病毒，對(duì)于昆蟲細(xì)胞來(lái)說(shuō)用桿狀病毒)進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞來(lái)說(shuō)，適合的技術(shù)包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。標(biāo)記基因如抗生素抗性或敏感基因可用來(lái)鑒定含有目標(biāo)核酸的克隆，如本領(lǐng)域所熟知的那樣。導(dǎo)入后，可以在適合基因表達(dá)的條件下，引起或允許核酸表達(dá)，如通過(guò)培育宿主細(xì)胞(其包括實(shí)際轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，但更可能是該轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代細(xì)胞)來(lái)表達(dá)，從而產(chǎn)生編碼多肽。如果該多肽與合適的信號(hào)前導(dǎo)肽一起表達(dá)，那么就可能讓該多肽從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中去。在表達(dá)完成之后，可依具體情況從宿主細(xì)胞和/或培育基中分離和/純化多肽，然后根據(jù)需要使用，如用于配制成組合物，其包括一種或多種其它組分，如包括一種或多種可藥用賦形劑、i某介物或載體的藥學(xué)組合物見下文)。在通過(guò)表達(dá)來(lái)生成目標(biāo)多肽變體之后，可常規(guī)測(cè)試其活性，如結(jié)合目標(biāo)多肽受體或配體或其它特異性結(jié)合配對(duì)物的能力。本發(fā)明另一方面提供了一種獲得比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體的方法，該方法包4舌通過(guò)從編碼核酸進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生目標(biāo)多肽變體，其中所述產(chǎn)生是在有和無(wú)DTT的條件下通過(guò)翻譯而進(jìn)行的，而且所述產(chǎn)生發(fā)生在核糖體展示體系中，導(dǎo)致產(chǎn)生多個(gè)核糖體復(fù)合體，它們每一個(gè)都含有目標(biāo)多肽變體和編碼目標(biāo)多肽變體的mRNA;測(cè)定包含在核糖體復(fù)合體中的目標(biāo)多肽變體比親本目標(biāo)多肽改進(jìn)的穩(wěn)定性，所用的穩(wěn)定性計(jì)量值例如是，在有DTT的條件下翻譯時(shí)，經(jīng)放射免疫分析測(cè)定的，結(jié)合目標(biāo)多肽受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物的能力，與在無(wú)DTT的條件下翻譯時(shí)，經(jīng)相同的測(cè)定法測(cè)定的，結(jié)合目標(biāo)多肽受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物的能力的比值，其中結(jié)合能力是在有室溫進(jìn)行的疏水相互作用層析存在的條件下測(cè)定的。如本文其它地方所述，該比率可以提高約或至少約5倍或更多。本發(fā)明的方法包括制備比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體多肽的方法，該方法包括在有和無(wú)DTT的條件下，通過(guò)從編碼的核酸進(jìn)行表達(dá)，在核糖體展示體系中產(chǎn)生目標(biāo)多肽變體；在室溫，利用疏相互作用層析，比較在有和無(wú)DTT的條件下生成并展示在核糖體上的目標(biāo)多肽變體與關(guān)聯(lián)受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物的結(jié)合，由此測(cè)試改進(jìn)的穩(wěn)定性。本發(fā)明的方法包括在對(duì)編碼親本目標(biāo)多肽的核酸進(jìn)行檢測(cè)和/或突變之前，分離出所述目標(biāo)多肽變體的步驟，以便在從編碼目標(biāo)多肽變體的核酸進(jìn)行表達(dá)之前提供該核酸。所述方法可以任選地在目標(biāo)多肽變體產(chǎn)生之后和測(cè)試之前，包括分離和/或純化目標(biāo)多肽變體。操作本方法的人可以額外地先進(jìn)行一步提供目標(biāo)多肽變體的步驟，方法是，通過(guò)例如如所述取代和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，來(lái)改變目標(biāo)多肽變體的氨基酸序列?？梢蕴峁└鞣N不同的變體并測(cè)試所需活性，比如為了從大量變體中鑒定出具有本發(fā)明所需特性的一種或多種變體。通常，目標(biāo)多肽的氨基酸序列改變可以通過(guò)改變編碼目標(biāo)多肽的核酸的編碼序列來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢愿淖円粋€(gè)或多個(gè)核苷酸，從而改變一個(gè)或多個(gè)密碼子，并因此改變編碼的氨基酸。如本文別處所述，且如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，可以使用任何適合的誘變技術(shù)，尤其是定向或定點(diǎn)誘變，來(lái)改變目標(biāo)多肽變體的編碼序列，并因此改變編碼的氨基酸序列。綜述見cPherson和Moller(2000)PCR.TheBasicsfromBackgroundtoBench;BIOSScientificPublishersLtd。根據(jù)本發(fā)明選擇穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體，可以利用核糖體展示，在有和無(wú)DTT的條件下在核糖體展示體系中翻譯，并在室溫利用HIC選出在復(fù)合體中與核糖體和mRNA結(jié)合的目標(biāo)多肽變體。本發(fā)明另一方面提供了一種制備、鑒定或獲得比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體的方法，該方法包括對(duì)編碼親本目標(biāo)多肽的核酸進(jìn)行突變，以提供一種或多種核酸，其編碼具有改變的氨基酸序列的一種或多種目標(biāo)多肽變體("目標(biāo)多肽變體")；在核糖體展示體系中將所述一或多種核酸表達(dá)為mRNA,通過(guò)翻i奪該mRNA，產(chǎn)生所編碼的一或多種目標(biāo)多肽變體，其中該翻譯是在有DTT和無(wú)DTT的條件下進(jìn)行的；利用疏水相互作用層析，選出如此產(chǎn)生的、比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的一或多種目標(biāo)多肽變體；其中所述疏水相互作用層析是在室溫進(jìn)行的。室溫是指溫度處在或高于20°C且處在或^f氐于30°C，優(yōu)選約25。C?？梢灾苽渥凅w的文庫(kù)或多樣化群體，并測(cè)試所需能力。突變可以發(fā)生在本文公開的一組突變范圍內(nèi)指定的任何殘基，任何半胱氨酸和/或發(fā)生N-糖基化的任何殘基中，或者按照本文描述的任何方式發(fā)生。進(jìn)行突變的目標(biāo)多肽可以是野生型多肽或現(xiàn)有變體，如以前基于所需特性(如改進(jìn)或增高的穩(wěn)定性)選出的變體?？设b定或選出一或多種具有所需特性的目標(biāo)多肽變體。在鑒定或獲得本發(fā)明目標(biāo)多肽變體之后，它可以以分離和/或純化的形式提供，它可以根據(jù)需要使用，而且可以配制成含有至少一種其它組分(如可藥用賦形劑或載體)的組合物。編碼目標(biāo)多肽變體的核酸可用于制備適合隨后使用的變體。如所述，這種核酸可以例如從最初提供的文庫(kù)或多樣化群體中分離，所述文庫(kù)或多樣化群體是從中產(chǎn)生并鑒定出所述目標(biāo)多肽變體的那些。中。'口'？,''因此，本發(fā)明另一方面提供了治療方法，包括施用本文提供的目標(biāo)多肽變體，含有所述目標(biāo)多肽變體的藥物組合物，以及所述目標(biāo)多肽變體在制備藥物中的用途，例如，在制備藥物或藥物組合物的方法中的用途，包括將所述目標(biāo)多肽變體與可藥用賦形劑一起配制。關(guān)于可以使用目標(biāo)多肽變體的臨床表征(clinicalindications)是使用所述目標(biāo)多肽具有療效的那些。按照本發(fā)明，可將目標(biāo)多肽變體給予一個(gè)體，優(yōu)選通過(guò)以"預(yù)防有效量"或"治療有效量，，施用(根據(jù)具體情況而定，盡管預(yù)防可以認(rèn)為是治療)，該量足以顯示對(duì)個(gè)體的有效性。實(shí)際施用量，和施用速度和時(shí)間過(guò)程，都決定于正治療患者的特性和嚴(yán)重性。治療處方，如劑量選擇等，都在一般醫(yī)師和其它醫(yī)療人員的職責(zé)范圍內(nèi)。組合物可以單獨(dú)施用，或者與其它治療組合施用，可以同時(shí)或順序地施用，取決于所治療的狀態(tài)。本發(fā)明的藥物組合物，以及用于本發(fā)明的藥物組合物，除活性成分外可包括可藥用賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它原料。這些原料應(yīng)該是無(wú)毒的，而且不會(huì)干擾活性成分的效力。載體和其它原料的準(zhǔn)確特性取決于施用途徑，施用途徑可以是任何適合的途徑，但最可能是注射，尤其是靜脈注射。對(duì)于靜脈、表皮或皮下注射，或在疼痛點(diǎn)注射來(lái)說(shuō)，活性成分將以腸胃外可接受的液體溶液形式存在，該液體溶液無(wú)熱源而且具有合適的pH，等滲性和穩(wěn)定性。那些本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員可以很好地利用如等滲載體制成合適的溶液，3口SodiumChlorideInjection,Ringer'sInjection,或LactatedRinger'sInjection。如果需要，可包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其它添加劑。在本/>開文本的啟發(fā)下，包括下述實(shí)施例，本發(fā)明的進(jìn)一方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見的。j么女；《b日士古JjJj士i享；3子iJ;^fK31入太+4夫去j^辦實(shí)施例1構(gòu)建EPO變體文庫(kù)和選出穩(wěn)定性改進(jìn)的EPO變體文庫(kù)構(gòu)建EPOcDNA從Invitrogen獲得。將成熟序列重排(reformat)至線性核糖體展示模板中，隨后用該模板生成文庫(kù)。在DNA水平上，將T7啟動(dòng)子添加到5，-端，以便有效轉(zhuǎn)錄出mRNA。在mRNA水平上，構(gòu)建體包括原核生物核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shine-Dalgarno序列)。在3，端，添加gIII的一部分作為間隔(Hanes等，(2000)MethEnzymol328:.404)。按照操作手冊(cè)(BDBioscience),利用易錯(cuò)PCR生成變體文庫(kù)，誤差率為8.1個(gè)核苷酸突變/分子。這使得導(dǎo)入4個(gè)突變/分子，并獲得約2.5x101()個(gè)變體分子的文庫(kù)。穩(wěn)定性篩選使用至少兩種同時(shí)發(fā)生的穩(wěn)定性選擇壓力(包括DTT、HIC和增高的溫度)來(lái)進(jìn)行篩選，接著再篩選功能活性。在翻譯和選擇過(guò)程中有還原劑二硫蘇糖醇(DTT)。DTT防止形成二硫鍵，此鍵是EPO穩(wěn)定性的關(guān)鍵組成。翻譯后，將翻譯混合物與DTT—起于疏水相互作用層析(HIC)基質(zhì)中25。C保溫。與常^見的4。C相比，DTT、HIC錯(cuò)折疊的、穩(wěn)定性較差的變體。HIC基質(zhì)通過(guò)離心或過(guò)濾等方法從混合物中除去。在進(jìn)行功能選擇之前，可能還需要進(jìn)行緩沖液交換步驟。在有和無(wú)DTT的條件下，按Jermutus等(2001)所述進(jìn)行體外翻譯和選擇，不同之處如下1.翻譯在30。C進(jìn)行10分鐘；2.用HIC和增高的溫度作為添加的選擇壓力。在有和無(wú)DTT的條件下進(jìn)行翻譯之后，在含KC1(1M增加到3M)以及濃度與翻譯過(guò)程中等同的DTT的緩沖液中終止翻譯。然后，將翻譯混合物與lml柱床體積的HIC珠(丁基-、辛基-和苯基-Sepharose，Amersham)保溫。在"。C晃動(dòng)30分鐘之后，室溫離心除去HICJ朱。3.然后將上清液冷卻至4°C,進(jìn)行功能選擇，其中將經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性選擇的文庫(kù)與EPO受體融合蛋白一起保溫，之后捕獲該融合蛋白，利用》茲分離回收結(jié)合的復(fù)合體，并同時(shí)洗除未結(jié)合的復(fù)合體。然后，用RT-PCR回收編碼EPO結(jié)合變體的mRNA,并重復(fù)所述選擇步驟。用DTT、HIC和增溫三者的導(dǎo)致更不穩(wěn)定化的組合進(jìn)行4輪選擇。將第4輪獲得的PCR產(chǎn)物克隆至體外表達(dá)載體pIVEX2.3d(Roche)中。簡(jiǎn)言之，經(jīng)PCR擴(kuò)增，在產(chǎn)物5，導(dǎo)入Nco1限制性位點(diǎn)、3'端導(dǎo)入終止密碼子以及緊接的Notl限制性位點(diǎn)。終止密碼子允許無(wú)標(biāo)記的變體EPO表達(dá)。產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化，用Not1和Nco1(NewEnglandBiolabs)進(jìn)行雙酶消化并進(jìn)行凝膠純化。將消化后的產(chǎn)物連接到經(jīng)NotlNcol消化的pIVEX2.3d中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1細(xì)胞。挑取單菌落至96孔板，進(jìn)行篩選和測(cè)序。實(shí)施例2在初級(jí)穩(wěn)定性RIA中篩選單個(gè)EPO變體按Jermutus等，(2001)所述，用初級(jí)穩(wěn)定性RIA(放射性免疫分析)篩選EPO變體的穩(wěn)定性。簡(jiǎn)言之，擴(kuò)增并轉(zhuǎn)錄每一變體的線性DNA模板，將所得mRNA在G25Sephadex柱上純化并定量。在有"S-標(biāo)記的蛋氨酸的條件下，將每一變體取平行雙份于30。C體外翻譯30分鐘，其中一份為非還原劑條件，另一份在10mMDTT(二硫蘇糖醇)中。翻譯用含0.05%Tween20的PBS終止，所述PBS中還有與翻譯時(shí)等量的DTT。翻譯混合物在EPO受體包被板上室溫保溫1小時(shí)。平板用含0.05%Tween20的PBS洗3次，并用PBS洗3次。殘余的放射活性用0.1M三乙胺洗脫，通過(guò)液體閃爍計(jì)凄t來(lái)定量。將10mMDTT中的RIA信號(hào)除以無(wú)DTT時(shí)的RIA信號(hào)，算出變體的穩(wěn)定性。變體越穩(wěn)定，該比值就越大，即在DTT中無(wú)活性時(shí)該比值=0,在DTT中具有全部活性時(shí)該比值=1。從第4輪獲得的48個(gè)經(jīng)克隆的EPO變體如上述進(jìn)行篩選，鑒定出5個(gè)EPO變體比WT更穩(wěn)定(表1)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表15種變體的穩(wěn)定性RIA結(jié)果，有非還原劑條件(DTT-)下的RIA絕對(duì)信號(hào)，以及如上述算出的穩(wěn)定性計(jì)量值(0丁丁+/0丁丁-)。EPO變體的序列分析對(duì)第4輪所得EPO變體進(jìn)行測(cè)序，5種更穩(wěn)定的變體與具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的WTEPO在氨基酸水平上的序列差異如下變體1L16II25FT27MV61AR139HT157V變體2D8VT26AT27AS126PG158E變體3D8VT27AY49NW64RV82AE89GS126PG158E變體4T26AW64RA135VG158E變體5D8VV74FT107AN147D實(shí)施例3構(gòu)建GM-CSF變體文庫(kù)并篩選穩(wěn)定性以便改進(jìn)表達(dá)文庫(kù)構(gòu)建對(duì)人GM-CSFcDNA進(jìn)行克隆，并將成熟序列重排至線性核糖體展示模板中，隨后用該模板生成文庫(kù)。在DNA水平上，將了7啟動(dòng)子添加到5，-末端，以便有效轉(zhuǎn)錄出mRNA。在mRNA水平上，構(gòu)建體包含原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shine-Dalgarno序列)。在3，末端添加gIII的一部分作為間隔(Hanes等，(2000)MethEnzymol328:.404)。按照操作手冊(cè)(BDBioscience),用易錯(cuò)PCR生成變體文庫(kù)，誤差率為8.1個(gè)核苷酸突變/分子。這導(dǎo)致引入3個(gè)突變/分子。穩(wěn)定性篩選如實(shí)施例1所述，使用至少兩種同時(shí)發(fā)生的穩(wěn)定性選擇壓力(包括DTT、HIC和增高的溫度)來(lái)進(jìn)行篩選，再通過(guò)結(jié)合GM-CSF受體融合蛋白來(lái)篩選功能活性。用DTT、HIC和增溫三者的導(dǎo)致更不穩(wěn)定化的組合進(jìn)行4輪篩選。將第4輪獲得的PCR產(chǎn)物克隆至周質(zhì)表達(dá)載體pcantab6(McCafferty等，ApplBiochemBiotechnol,(May-Jun1994)47(2-3):157-71;discussion171-3)。簡(jiǎn)言之，經(jīng)PCR擴(kuò)增，在產(chǎn)物5，導(dǎo)入Ncol限制性位點(diǎn)，3'端導(dǎo)入Notl限制性位點(diǎn)。將產(chǎn)物凝膠純化，用Not1和Ncol(NewEnglandBiolabs)雙酶消化并進(jìn)行凝膠純化。將消化后的產(chǎn)物連接到經(jīng)NotlNcol消化的pcantab6中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151(BiostatDiagnostics)。挑取單菌落至96孔板，進(jìn)行篩選和測(cè)序。實(shí)施例4在初級(jí)表達(dá)篩選中篩選單個(gè)GM-CSF變體GM-CSF變體的可溶表達(dá)利用96孔表達(dá)、PAGE和免疫印跡進(jìn)行篩選。筒言之,可溶表達(dá)用OvernightExpressAutoinductionSystem(MerckBioscience)實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)物在E-PAGE蛋白電泳系統(tǒng)(Invitrogen)上電泳。在周質(zhì)提取情況中，離心收細(xì)胞。周質(zhì)材料因滲壓休克而釋出，碎片經(jīng)離心去除，表達(dá)的蛋白保留在上清中。從提取的蛋白中取樣，在可以同時(shí)對(duì)96個(gè)樣品進(jìn)行電泳的E-PAGE(Invitrogen)SDS-PAGE系統(tǒng)中電泳。然后，將凝膠印跡到PVDF膜上，用多克隆抗人GM-CSF抗體(Chemicon)探查，用抗兔IgGHRP偶聯(lián)物(DakoUK)、ECLPlus化學(xué)發(fā)光劑(Amersham)檢測(cè)，用LumiImager(BoehringerMannheim)獲耳又圖像。第4輪所得88個(gè)GM-CSF變體如上述進(jìn)行篩選，鑒定出表達(dá)特性改進(jìn)的GM-CSF變體，它們的產(chǎn)物經(jīng)抗GM-CSF抗體檢測(cè)主要是單一條帶，而同等條件下野生型的產(chǎn)物為梯狀拖尾。實(shí)施例5GM-CSF變體的可溶表達(dá)GM-CSF變體和野生型的周質(zhì)產(chǎn)物取平行雙份進(jìn)行對(duì)比。用OvernightExpressAutoinductionSystem(MerckBioscience),在250mlErylenmeyer燒瓶中的50ml體積中，使大腸桿菌HB2151(BiostatDiagnostics)中的pCANTAB6表達(dá)重組蛋白。在600nm波長(zhǎng)(006()())測(cè)定1:10稀釋的培養(yǎng)物的吸光度，荻得最終的培養(yǎng)密度。將所有培養(yǎng)物按照OD,1.0的標(biāo)準(zhǔn)歸一化1(normalise),離心收獲細(xì)胞，周質(zhì)材料經(jīng)滲壓休克(使用200mMTris[pH8.04°C]，ImMEDTA,0.5M蔗糖)釋出，碎片在微管中經(jīng)4000rpm低速離心去除。不可溶的蛋白在微管中經(jīng)15000rpm高速離心從周質(zhì)提取物中去除。樣品在NuPAGEBis-Tris凝膠系統(tǒng)(Invitrogen)中用lxMES緩沖液電泳。將凝膠印跡到PVDF膜上，接著用多克隆抗人GM-CSF抗體(Chemicon)探查，并用抗兔IgGHRP偶聯(lián)物(DakoUK)、ECLPlus化學(xué)發(fā)光劑(Amersham)檢測(cè)，用LumiImager(BoehringerMannheim)獲耳又圖像。GM-CSF變體1(F07)在周質(zhì)中產(chǎn)生可溶蛋白，見圖1。GM-CSF野生型不產(chǎn)生可溶蛋白(圖1)，與預(yù)料的一樣(Lundell等，l"0)。變體和野生型的生物活性在TF-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)中評(píng)價(jià)。TF-1細(xì)胞從R&DSystems獲得，并按說(shuō)明書維持。試驗(yàn)培養(yǎng)基包含RPMI-1640、GLUTAMAXI、5%胎牛血清和1%丙酮酸鈉。在每次試驗(yàn)前，先將TF-1細(xì)胞300xg離心5分鐘使之沉淀，吸出培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸在試驗(yàn)培養(yǎng)基中。重復(fù)該步驟3次，使重懸細(xì)胞的終濃度為lxl05/ml試驗(yàn)培養(yǎng)基。在試驗(yàn)培養(yǎng)基中將GM-CSF變體(一式兩份)稀釋到所需濃度。然后，將100pl重懸細(xì)胞加到各試驗(yàn)點(diǎn)，使試驗(yàn)總體積為200^1/孔。試驗(yàn)板于37。C、5%<:02保溫72小時(shí)。然后，各試驗(yàn)點(diǎn)加20(il氚化胸苷(5nCi/ml,NEN)，將試驗(yàn)板放回培育箱中再保溫4小時(shí)。用細(xì)胞采集器在玻璃纖維過(guò)濾板(PerkinElmer)上收集細(xì)胞。胸苦摻入用PackardTopCount微板液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定。數(shù)據(jù)用GraphpadPrism軟件分析。在TF1增殖試驗(yàn)中，GM-CSF變體1比野生型GM-CSF活性更強(qiáng)(表2):<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2、TF1增殖試驗(yàn)中GM-CSF野生型(WT)和變體1的EC50。GM-CSF變體的序列分析對(duì)變體1進(jìn)行測(cè)序，其與具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的WTGM-CSF在氨基酸水平上的序列差異如下變體1R4SL15HA18V143VK63TT102A實(shí)施例6G-CSF變體文庫(kù)的構(gòu)建和篩選穩(wěn)定性以^使改進(jìn)表達(dá)文庫(kù)構(gòu)建對(duì)人G-CSFcDNA進(jìn)行克隆，將成熟序列重排至線性核糖體展示模板中，隨后用該模板生成文庫(kù)。在DNA水平上，將T7啟動(dòng)子添加到5，-末端，以便有效轉(zhuǎn)錄出mRNA。在mRNA水平上，構(gòu)建體包含原核核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shine-Dalgarno序列)。在3'末端添力口gIII的一部分作為間隔(Hanes等,2000MethEnzymol328:.404)。按照操作手冊(cè)(BDBioscience),用易錯(cuò)PCR生成變體文庫(kù)，誤差率為8.1個(gè)核苷酸突變/分子。這導(dǎo)致引入3個(gè)突變/分子。穩(wěn)定性篩選如實(shí)施例1所述，使用至少兩種同時(shí)發(fā)生的穩(wěn)定性選擇壓力(包括DTT、溫度和HIC)來(lái)進(jìn)行篩選，再通過(guò)結(jié)合生物素化G-CSF受體(RnD目錄號(hào)381-ER-05)來(lái)篩選功能活性。用DTT、HIC和溫度的導(dǎo)致更不穩(wěn)定化的組合進(jìn)行4輪篩選。將第4輪獲得的PCR產(chǎn)物克隆入周質(zhì)表達(dá)載體pcantab6內(nèi)(McCafferty等，ApplBiochemBiotechnol.1994May-Jun47(2-3):157-71;discussion171-3)。簡(jiǎn)言之，經(jīng)PCR擴(kuò)增，在產(chǎn)物5，導(dǎo)入Nco1限制性位點(diǎn)，3'端導(dǎo)入Notl限制性位點(diǎn)。將產(chǎn)物凝膠純化，用Notl和Ncol(NewEnglandBiolabs)雙酶消化并進(jìn)行凝膠純化。將消化后的產(chǎn)物連接到經(jīng)NotlNcol消化的pcantab6中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151(BiostatDiagnostics)。挑取單菌落至96孔板，進(jìn)行篩選和測(cè)序。實(shí)施例7在初級(jí)表達(dá)篩選中篩選G-CSF變體G-CSF變體的可溶表達(dá)在96孔小規(guī)模表達(dá)篩選中進(jìn)行測(cè)試。簡(jiǎn)言之，G-CSF變體蛋白用pCANTAB6表達(dá)載體和大腸桿菌HB2151細(xì)胞(BiostatDiagnostics)表達(dá)。在96孑Lmasterblock(GreinerBio-One)中一式三份進(jìn)行表達(dá)篩選，所述masterblock每孔500ml中含有2xTY肉湯(broth),0.2%葡萄糖，lOOmM氨千青霉素。除第12列孔之外的各孔加lmlG-CSF變體甘油儲(chǔ)液(glycerolstock),第12列孔加lml野生型G-CSF甘油儲(chǔ)液。將這些板在HiGro培養(yǎng)箱(Genemachines,Inc)中37。C/600rpm保溫6小時(shí)。然后加IPTG，使各孔終濃度為lmM，平板37。C/600rpm保溫過(guò)夜。2500xg離心10分鐘，收集細(xì)胞。沉淀在含200mMTrispH8.0、lmMEDTA、0.5M蔗糖，0.1%Tween的200ml溶液中4°C重懸浮，并在水上保溫20分鐘，使周質(zhì)物質(zhì)釋出。細(xì)胞碎片以2500xg離心10分鐘除去。將每個(gè)克隆的三份樣本合并，取1400ml加到20mlNiNTAPhyNexus吸頭(PhyNexus,Inc)中。所述吸頭用含50mMTrispH7.4，300mMNaCl,0.1%Tween的340ml溶液洗滌，接著用含50mMTrispH7.4，300mMNaCl，0.1%Tween，30mM咪唑的100ml溶液洗滌。然后，用含50mMTrispH7.4,300mMNaCl，0.1%Tween的170ml溶液洗滌，再用100mMHEPESpH3.0、140mMNaCl、0.2%Tween洗脫結(jié)合的G-CSF。洗脫出的樣品用25ml的200mMHEPESpH8.0中和。樣品在12%NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen)上用lxMES緩沖液進(jìn)行電泳，凝膠用SilverXpress4艮染試劑盒(Invitrogen)染色。從第4輪獲得的88個(gè)G-CSF變體如上所述進(jìn)行篩選，鑒定出一種表達(dá)特性改進(jìn)的G-CSF變體，它的產(chǎn)物經(jīng)銀染檢測(cè)主要是單一條帶，而同等條件下野生型的產(chǎn)物基本上無(wú)法測(cè)出(圖2)。實(shí)施例8G-CSF變體的大規(guī)模表達(dá)和純化比較G-CSF變體和野生型G-CSF的周質(zhì)大規(guī)模生成。將每種G-CSF的單菌落接種到2L錐瓶?jī)?nèi)400ml的2xTY肉湯、0.2%葡萄糖、100mM氨芐青霉素中。將培養(yǎng)物37°C/300rpm保溫6小時(shí)，之后加入IPTG至終濃度lmM。將培養(yǎng)物37。C/300rpm保溫過(guò)夜。以16800xg離心10分鐘，收集細(xì)胞。每種沉淀在含200mMTrispH8.0、ImMEDTA、0.5M蔗糖、0.1%Tween的25ml溶液中4。C重懸，并在冰上保溫20分鐘，使周質(zhì)物質(zhì)釋出。以12000xg離心10分鐘除去細(xì)胞碎片。用AKTAExplorer(GEHealthcare)進(jìn)行純化。每次純化時(shí)，使周質(zhì)樣品流過(guò)已在50mMTrispH8.0、300mMNaCl、0.1%Tween中平衡的5mlHisTrapHP柱(GEHealthcare)。用含50mMTrispH8.0、300mMNaCl、0.1%Tween、30mM咪唑的50ml溶液洗柱，之后用50mMTrispH8.0、300mMNaCl、0.1%Tween、200mM咪唑?qū)⒔Y(jié)合的G-CSF洗脫。使洗脫的樣品流過(guò)已在2xPBS、0.1%Tween中平衡的Superdex7516/30凝膠過(guò)濾柱(GEHealthcare)。G-CSF變體(變體l)產(chǎn)生可溶性單體蛋白，產(chǎn)量為8mg/L，見圖3。野生型不產(chǎn)生單體蛋白，產(chǎn)生少量二聚體G-CSF或聚集的G-CSF，產(chǎn)量為8嗎/L(圖3)。實(shí)施例9G-CSF的生物活性變體和野生型的生物活性在OCI/AML5細(xì)胞增殖試驗(yàn)中測(cè)定。從德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心獲得OCI/AML5細(xì)胞(DSMZ，Braunschweig.ACC247)，按照說(shuō)明進(jìn)行維持。試驗(yàn)培養(yǎng)基包含MEMA和16.6%v/v胎牛血清。每次試驗(yàn)前，OCI/AML5細(xì)胞進(jìn)行300xg離心5分鐘而沉淀，吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞用試驗(yàn)培養(yǎng)基重懸。重復(fù)該步驟3次，使重懸浮細(xì)胞的終濃度為lx105/ml試驗(yàn)培養(yǎng)基。G-CSF變體(一式兩份)用試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。然后，各試驗(yàn)點(diǎn)加100|il重懸細(xì)胞，使試驗(yàn)總體積為200nl/孔。試驗(yàn)板于37°C、5%C02保溫72小時(shí)。然后，各試驗(yàn)點(diǎn)加20(il氟化胸苷(5Ci/ml，NEN)，將試驗(yàn)板放回培育箱中再保溫4小時(shí)。用細(xì)胞采集器在玻璃纖維過(guò)濾板(PerkinElmer)上收集細(xì)胞。胸苷摻入用PackardTopCount微板液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定。數(shù)據(jù)用GraphpadPrism軟件分析。在0C1/AML5增殖試^r中，G-CSF變體1比野生型G-CSF活性更強(qiáng)(表3)。_<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表3、G-CSF的野生型(WT)和變體1在OC1/AML5增殖試驗(yàn)中的EC50。G-CSF變體的序列分析對(duì)變體1進(jìn)行測(cè)序。該變體與具有SEQIDNo6所示氨基酸序列的WTG-CSF在氨基酸水平的序列差異如下變體1C17GW58RQ70RF83LSEQIDNO:1編碼WT人EPO的核苷酸序列SEQIDNO:2WT人EPO的氨基酸序列APPRF工CDSRVLERYLLEAK1020EAEN工TTGCAEHCSLNEN工T3040VPDTKVNFYAWKRMEVGGGA5060VEVWQGLALLSEAVLRGQAL7080LVNSSQPWEPLQLHVDKAVS90100GLRSLTTLLRALGAQEEA工S110120PPDAASAAPLRTITADTFRK130140LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA150160TGCAGGACAGGGGACAGAACGTCCTGTCCCCTGTCTCRTGDRSEQIDNO:3編碼WT人GM-CSF的核苷酸序列SEQIDNO:4WT人GM-CSF的氨基酸序列APARSPSPSTQPWEHVNAIQ>1020TFESFKENLKDFLLVIPFD>110120TGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGACGACCCTCGGTCAGGTCCTCCWEPVQE>SEQIDNO5編碼WT人G-CSF的核苷酸序列SEQIDNo6WT人G-CSF的氨基酸序列GACCTCCACAGCATGGCGCAAGATGCGGTGGAACGGGTCGGGLEVSYRVLRHLAQP170權(quán)利要求1.一種提供比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體的方法，該方法包括(a)提供多個(gè)mRNA分子，每一mRNA分子包含編碼目標(biāo)多肽變體的核苷酸序列且缺失框內(nèi)終止密碼子；(b)保溫所述mRNA分子，所用的保溫條件致使所述mRNA分子發(fā)生核糖體翻譯，產(chǎn)生所編碼的目標(biāo)多肽變體，由此形成多個(gè)復(fù)合體，每個(gè)復(fù)合體都至少含有mRNA和所編碼的目標(biāo)多肽變體；(c)將這些復(fù)合體與結(jié)合所述親本目標(biāo)多肽的受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物接觸，選出一個(gè)或多個(gè)復(fù)合體，它們每一個(gè)都在該選擇條件下展示出與所述受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物結(jié)合的目標(biāo)多肽變體；其中，如下進(jìn)行步驟(i)，(ii)和(iii)中的一步或多步；(i)在步驟(b)的翻譯過(guò)程中，同時(shí)使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力；(ii)在步驟(c)的選擇過(guò)程中，同時(shí)使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力；(iii)至少一種穩(wěn)定性選擇壓力在步驟(b)的翻譯過(guò)程中、繼而在步驟(c)的選擇過(guò)程中使用，且至少一種另外的穩(wěn)定性選擇壓力在步驟(c)的選擇過(guò)程中使用；和(d)確定所選的一或多種目標(biāo)多肽變體的穩(wěn)定性，從而獲得比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的一種或多種目標(biāo)多肽變體。2.權(quán)利要求1的方法，其中形成了復(fù)合體，所述復(fù)合體包含mRNA、編碼的目標(biāo)多肽變體和核糖體。3.前述任一權(quán)利要求的方法，其中穩(wěn)定性選擇壓力選自下組二硫蘇糖醇(DTT),谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl)，伴侶分子耗竭，pH,小分子蛋白折疊抑制劑，蛋白酶，硫氰酸鈉，疏水相互作用層析(HIC)和溫度。4.前述任一權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)中的穩(wěn)定性選擇壓力選自下組二硫蘇糖醇(DTT),谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl),伴侶分子耗竭，pH和小分子蛋白折疊抑制劑。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(c)的選擇過(guò)程中使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力。6.前述任一權(quán)利要求的方法，其中步驟(C)中的穩(wěn)定性選擇壓力選自下組二硫蘇糖醇(DTT)，谷胱甘肽，三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽(TCEP)，巰基乙醇，尿素，鹽酸胍(GuHCl),蛋白酶，硫氰酸鈉，HIC和溫度。7.前述任一權(quán)利要求的方法，其中二硫蘇糖醇(DTT)在步驟(b)中用作穩(wěn)定性選擇壓力。8.前述任一權(quán)利要求的方法，其中HIC和/或溫度在步驟(c)中用作穩(wěn)定性選擇壓力。9.權(quán)利要求1的方法，其中DTT在步驟(b)中用作穩(wěn)定性選擇壓力，HIC和溫度在步驟(c)中用作穩(wěn)定性選擇壓力。10.權(quán)利要求8或9的方法，其中溫度是室溫。11.前述任一權(quán)利要求的方法，其中，通過(guò)比較所選一或多種目標(biāo)多肽變體在有和無(wú)DTT的條件下被展示出來(lái)時(shí)，對(duì)受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物的結(jié)合能力，測(cè)出穩(wěn)定性。12.權(quán)利要求1-10之一的方法，其中穩(wěn)定性是通過(guò)將所選的一或多種目標(biāo)多.肽變體的聚集與親本目標(biāo)多肽的聚集進(jìn)行比較而測(cè)出的。13.前述任一權(quán)利要求的方法，其中在翻譯體系中保溫的mRNA分子是通過(guò)RT-PCR反應(yīng)獲得的，在該P(yáng)CR中至少一種RT-PCR引物是誘變引物，其編碼包含在編碼目標(biāo)多肽變體的核苷酸序列的指定區(qū)域內(nèi)的多種不同序列。14.前述任一權(quán)利要求的方法，還包括從所選復(fù)合體中回收mRNA。15.權(quán)利要求14的方法，其中對(duì)從展示所選目標(biāo)多肽變體的所選復(fù)合體中回收的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，并將其拷貝到編碼該所選目標(biāo)多肽變體的DNA中。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述DNA是在用于制備產(chǎn)物的表達(dá)體系中提供的，所述產(chǎn)物是所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈。17.權(quán)利要求16的方法，還包括分離或純化所述產(chǎn)物。18.權(quán)利要求17的方法，還包括將所述產(chǎn)物配制成含有至少一種其它組分的組合物。19.權(quán)利要求15的方法，其中編碼所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈的DNA是在核苷酸序列提供的中，以便獲得編碼融合蛋白的核苷酸序列，所述融合蛋白包含與其它氨基酸融合的所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈。20.權(quán)利要求19的方法，其中包含編碼所述融合蛋白的所述核苷酸序列的DNA是在制備產(chǎn)物的表達(dá)體系中提供的，所述產(chǎn)物是所述融合蛋白。21.權(quán)利要求20的方法，還包括分離或純化所述產(chǎn)物。22.權(quán)利要求21的方法，還包括將所述產(chǎn)物配制成含有至少一種其它組分的組合物。23.權(quán)利要求15或19的方法，其中將編碼所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈的DNA突變，以便編碼含有與所選目標(biāo)多肽變體或所選目標(biāo)多肽變體的多肽鏈不同的氨基酸序列的多肽。24.權(quán)利要求23的方法，其中編碼所述多肽的突變DNA是在用于制備產(chǎn)物的表達(dá)體系內(nèi)提供的，所述產(chǎn)物是所述多肽。25.權(quán)利要求24的方法，還包括分離或純化所述產(chǎn)物。26.權(quán)利要求25的方法，還包括將所述產(chǎn)物配制成含有至少一種其它組分的組合物。27.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是抗體分子。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗體分子是單鏈抗體分子。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體分子是scFv,VH，F(xiàn)d或dAb分子。30.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是四種反平行a-螺旋束蛋白組成的家族的成員。31.權(quán)利要求l-26任一項(xiàng)的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是復(fù)合物受體的胞外區(qū)。32.權(quán)利要求l-26任一項(xiàng)的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是促紅細(xì)胞生成素(EPO)。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是具有SEQIDNO:2所示序列的人野生型EPO。34.權(quán)利要求33的方法，其中目標(biāo)多肽變體在人野生型序列SEQIDNO:2中包括選自下組突變中的一組突變(1)L16II25FT27MV61AR139HT157V(2)D8VT26AT27AS126PG158E(3)D8VT27AY49NW64RV82AE89G126PG158E(4)T26AW64RA135VG158E(5)D8VV74FT107AN147D。35.權(quán)利要求l-26任一項(xiàng)的方法，其中親本目標(biāo)多肽是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是具有SEQIDNO:4所示序列的人野生型GM-CSF。37.權(quán)利要求36的方法，其中目標(biāo)多肽變體在人野生型序列SEQIDNO:4中包括一組突變R4SL15HA18VI43VK63TT102A。38.權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述親本目標(biāo)多肽是具有SEQIDNO:6所示序列的人野生型G-CSF。40.權(quán)利要求39的方法，其中目標(biāo)多肽變體在人野生型序列SEQIDNO:6中包括一組突變C17GW58RQ70RF83L。41.一種制備比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體多肽的方法，該方法包括在核糖體展示體系中，通過(guò)在有和無(wú)DTT的條件下從編碼的核酸中進(jìn)行表達(dá)而產(chǎn)生目標(biāo)多肽變體；在室溫，利用疏相互作用層析，比較在有和無(wú)DTT的條件下生成并展示在核糖體上的目標(biāo)多肽變體與關(guān)聯(lián)受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物的結(jié)合，由此測(cè)試改進(jìn)的穩(wěn)定性。42.權(quán)利要求41的方法，其中穩(wěn)定性是用穩(wěn)定性計(jì)量值進(jìn)行測(cè)試的，所述計(jì)量值是，在有DTT時(shí)翻譯出的多肽在放射免疫測(cè)定中測(cè)出的與目標(biāo)多肽受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物結(jié)合的能力，與在無(wú)DTT時(shí)翻譯出的多肽在相同測(cè)定法中測(cè)出的與目標(biāo)多肽受體、配體或特異性結(jié)合配對(duì)物結(jié)合的能力的比值。43.權(quán)利要求41或42的方法，包括在測(cè)試前分離目標(biāo)多肽變體的步驟。44.權(quán)利要求41-43之一的方法，包括對(duì)編碼親本目標(biāo)多肽的核酸進(jìn)行突變，以便在從編碼目標(biāo)多肽變體的核酸進(jìn)行表達(dá)之前提供該編碼目標(biāo)多肽變體的核酸。45.—種鑒定或獲得比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體的方法，所述方法包括對(duì)編碼親本目標(biāo)多肽的核酸進(jìn)行突變，從而獲得一種或多種核酸，它們具有編碼一種或多種目標(biāo)多肽變體的序列，所述目標(biāo)多肽變體有改變的氨基酸序列；在有和無(wú)DTT的條件下表達(dá)所述一種或多種核酸，從而在核糖體展示系統(tǒng)中生成所述一種或多種目標(biāo)多肽變體；在室溫，利用疏水相互作用層析，比較有和無(wú)DTT的條件下生成并展示在核糖體上的目標(biāo)多肽變體與關(guān)聯(lián)受體、配體或特異性結(jié)合元件的結(jié)合，由此測(cè)試這樣制備的所述一或多種目標(biāo)多肽變體比親本目標(biāo)多肽改進(jìn)的穩(wěn)定性。46.權(quán)利要求45的方法，包括制備目標(biāo)多肽變體文庫(kù)，和測(cè)試所述文庫(kù)中變體的改進(jìn)的穩(wěn)定性。47.權(quán)利要求46的方法，包括鑒定穩(wěn)定性改進(jìn)的一種或多種目標(biāo)多肽變體。48.權(quán)利要求47的方法，包括分離出所述一種或多種目標(biāo)多肽變體。49.權(quán)利要求47或48的方法，包括分離出編碼所述一種或多種目標(biāo)多肽變體的核酸序列。50.權(quán)利要求49的方法，包括將所述一種或多種分離的目標(biāo)多肽變體配制成含有至少一種其它組分的組合物。全文摘要一種利用RNA表達(dá)體系，通過(guò)翻譯和選擇而獲得比親本目標(biāo)多肽穩(wěn)定性改進(jìn)的目標(biāo)多肽變體的方法，其中在翻譯過(guò)程中同時(shí)使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力，在選擇過(guò)程中同時(shí)使用兩種或更多種穩(wěn)定性選擇壓力，或在翻譯過(guò)程中且繼續(xù)在選擇過(guò)程中使用至少一種穩(wěn)定性選擇壓力，且在選擇過(guò)程中使用至少另外一種穩(wěn)定性選擇壓力。文檔編號(hào)C12N15/10GK101180393SQ200680007212公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年1月5日優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日發(fā)明者盧茨·杰姆圖斯,安德魯·布坎南申請(qǐng)人:劍橋抗體技術(shù)有限公司