一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的方法，包括以下步驟：在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入1ml Triton X-114，充分混溶得到混合物A，將混合物A冰浴30min；混合物A在37℃條件下水浴放置10min，攪拌；25℃條件下，將攪拌均勻的混合物A在12000g下離心15min，移出上層水相；將用于去除內(nèi)毒素的尿囊素直接加到上層水相中，得到混合物B，將混合物B在室溫下震蕩20min；25℃條件下，將震蕩后的混合物B在5000g下離心5min，去除底層沉淀，保留上清溶液，上清液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。本方法具有處理量大、處理周期短、生產(chǎn)成本低、去除內(nèi)毒素徹底，可將內(nèi)毒素含量控制在畜禽臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的優(yōu)點(diǎn)，并且符合規(guī)模化生產(chǎn)的需求。
【專利說明】一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液中 內(nèi)毒素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，特別涉及一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種成分叫脂多糖，主要由0-特異性鏈、核心 多糖、類脂A三部分組成，其主要毒性成分為類脂A。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工 方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來。當(dāng)含內(nèi)毒素或被內(nèi)毒素污染的生物制品進(jìn)入畜、禽機(jī)體循 環(huán)系統(tǒng)后，達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)引起畜、禽機(jī)體產(chǎn)生一系列變態(tài)反應(yīng)，如高燒、休克等。
[0003] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，重組蛋白生物制品逐漸被開發(fā)利用。由于大多數(shù)重 組蛋白質(zhì)是利用大腸桿菌表達(dá)的，其屬于革蘭氏陰性菌，在純化蛋白時(shí)需要對(duì)菌體進(jìn)行破 壁，釋放重組蛋白的同時(shí)，脂多糖也隨之釋放到緩沖液中，造成內(nèi)毒素污染。
[0004] 由于內(nèi)毒素在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及高溫下都極其穩(wěn)定，且性質(zhì)極不均一，傳統(tǒng)的各種方法 如萃取、吸附及層析等只能去除部分內(nèi)毒素，達(dá)不到畜禽臨床應(yīng)用的要求，很難找到一種有 效的去除重組蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的方法。
[0005] 目前報(bào)道的方法有Triton X-114霧點(diǎn)法，利用Triton X-114具有的兩性特點(diǎn)進(jìn) 行內(nèi)毒素去除的方法，但是經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種方法也只能將內(nèi)毒素的含量從1000萬EU/ml 降低至10萬EU/ml左右，達(dá)不到畜禽臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提出一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋 白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的方法，通過先添加Triton X-114,后添加尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液 中內(nèi)毒素的方法，相比較單獨(dú)應(yīng)用Triton X-114,可使內(nèi)毒素含量降低1000倍，很好的解 決了內(nèi)毒素含量達(dá)不到畜禽臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的難題。
[0007] 在一些說明性實(shí)施例中，一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液中 內(nèi)毒素的方法，包括以下步驟：
[0008] 在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入Triton x-1141ml，充分混溶后得到混合物 A，將所述混合物A冰浴30min ;將混合物A在37°C條件下水浴放置10min，攪拌；25°C條件 下，將攪拌均勻的所述混合物A在12000轉(zhuǎn)/min下離心15min，移出上層水相；將用于去 除內(nèi)毒素的尿囊素直接加到所述上層水相中，得到混合物B，將所述混合物B在室溫下震蕩 20min ;25°C條件下，將震蕩后的所述混合物B在5000轉(zhuǎn)/min下離心5min，去除底層沉淀， 保留上清溶液，所述上清液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本方法具有處理量大、處理周期短、生產(chǎn) 成本低、去除內(nèi)毒素徹底、可將內(nèi)毒素含量控制在畜禽臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的優(yōu)點(diǎn)，并且符 合規(guī)模化生產(chǎn)的需求。
[0010] 為了上述以及相關(guān)的目的，一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例包括后面將詳細(xì)說明并在權(quán)利要求 中特別指出的特征。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵺`它們。
[0012] 下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述。
[0013] 在一些說明性實(shí)施例中，一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液 中內(nèi)毒素的方法，包括以下步驟：在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入Triton X-1141ml， 充分混溶后得到混合物A，將所述混合物A冰浴30min ;將混合物A在37°C條件下水浴放置 IOmin,攪拌；25°C條件下，將攪拌均勻的所述混合物A在12000g下離心15min，移出上層水 相；將用于去除內(nèi)毒素的尿囊素直接加到所述上層水相中，得到混合物B，將所述混合物B 在室溫下震蕩20min ;25°C條件下，將震蕩后的所述混合物B在5000g下離心5min，去除底 層沉淀，保留上清溶液，所述上清液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。
[0014] 其中，尿囊素購自Sigma公司（P101415527) ;Triton X-114,購自索萊寶科技有限 公司。
[0015] 在一些說明性實(shí)施例中，所述VP2重組蛋白質(zhì)溶液由雞傳染性法氏囊病病毒VP2 通過基因工程技術(shù)獲得。
[0016] 在一些說明性實(shí)施例中，所述尿囊素添加量為5_50mg/ml。
[0017] 在一些說明性實(shí)施例中，所述尿囊素添加量為5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ ml 〇
[0018] 在一些說明性實(shí)施例中，其特征在于：所述尿囊素為固態(tài)。
[0019] 在一些說明性實(shí)施例中，其特征在于：所述TritonX-114為原液。
[0020] 實(shí)施例1尿囊素添加量為10mg/ml
[0021] 在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入Triton X-1141ml，放置到磁力攪拌器上攪拌 均勻，得到混合物A，將所述混合物A冰浴30min ;將混合物A在37°C條件下水浴放置10min， 攪拌；25°C條件下，將攪拌均勻的所述混合物A在12000g下離心15min，移出上層水相；將 lOmg/ml用于去除內(nèi)毒素的尿囊素直接加到所述上層水相中，得到混合物B，將所述混合物 B在室溫下震蕩20min ;25°C條件下，將震蕩后的所述混合物B在5000g下離心5min，去除 底層沉淀，保留上清溶液，所述上清液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。
[0022] 其中，所用的玻璃儀器均用0. 5M NaOH溶液浸泡24小時(shí)，純水洗滌3-5次后，于 250°C下烘烤兩小時(shí)；離心機(jī)（3K15)購自Sigma公司。
[0023] 實(shí)施例2尿囊素添加量為5mg/ml
[0024] 在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入Triton X-1141ml，放置到磁力攪拌器上攪拌 均勻，得到混合物A，將所述混合物A冰浴30min ;將混合物A在37°C條件下水浴放置10min， 攪拌；25°C條件下，將攪拌均勻的所述混合物A在12000g下離心15min，移出上層水相；將 5mg/ml用于去除內(nèi)毒素的尿囊素直接加到所述上層水相中，得到混合物B，將所述混合物B 在室溫下震蕩20min ;25°C條件下，將震蕩后的所述混合物B在5000g下離心5min，去除底 層沉淀，保留上清溶液，所述上清液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。
[0025] 實(shí)施例3尿囊素添加量為30mg/ml
[0026] 在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入Triton X-1141ml，放置到磁力攪拌器上攪拌 均勻，得到混合物A，將所述混合物A冰浴30min ;將混合物A在37°C條件下水浴放置lOmin， 攪拌；25°C條件下，將攪拌均勻的所述混合物A在12000g下離心15min，移出上層水相；將 30mg/ml用于去除內(nèi)毒素的尿囊素直接加到所述上層水相中，得到混合物B，將所述混合物 B在室溫下震蕩20min ;25°C條件下，將震蕩后的所述混合物B在5000g下離心5min，去除 底層沉淀，保留上清溶液，所述上清液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。
[0027] 實(shí)施例4尿囊素添加量為50mg/ml
[0028] 在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入Triton X-1141ml，放置到磁力攪拌器上攪拌 均勻，得到混合物A，將所述混合物A冰浴30min ;將混合物A在37°C條件下水浴放置lOmin， 攪拌；25°C條件下，將攪拌均勻的所述混合物A在12000g下離心15min，移出上層水相；將 50mg/ml用于去除內(nèi)毒素的尿囊素直接加到所述上層水相中，得到混合物B，將所述混合物 B在室溫下震蕩20min ;25°C條件下，將震蕩后的所述混合物B在5000g下離心5min，去除 底層沉淀，保留上清溶液，所述上清液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。
[0029] 應(yīng)用鱟試劑凝膠半定量法，測(cè)定實(shí)施例1?4所得的VP2重組蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒 素的含量。
[0030] 1.對(duì)當(dāng)試劑靈敏度復(fù)核：使用當(dāng)試劑盒（靈敏度為0. 25EU/ml)和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 (10EU/ml)，按廠家說明書進(jìn)行操作（入=0? 25EU/ml)。
[0031] 其中，鱟試劑采用湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑盒（靈敏度為 0.25EU/ml)。
[0032] 復(fù)核結(jié)果見表1。
[0033] 表1鱟試劑靈敏度復(fù)核
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種應(yīng)用Triton X-114和尿囊素去除重組蛋白質(zhì)溶液中內(nèi)毒素的方法，其特征在 于：包括以下步驟： 在100ml VP2重組蛋白質(zhì)溶液中加入Triton X-1141ml，充分混溶得到混合物A，將所 述混合物A冰浴30min ;將混合物A在37°C條件下水浴放置lOmin，攪拌；25°C條件下，將攪 拌均勻的所述混合物A在12000g下離心15min，移出上層水相；將用于去除內(nèi)毒素的尿囊 素直接加到所述上層水相中，得到混合物B，將所述混合物B在室溫下震蕩20min ;25°C條件 下，將震蕩后的所述混合物B在5000g下離心5min，去除底層沉淀，保留上清溶液，所述上清 液即為去除內(nèi)毒素的VP2重組蛋白質(zhì)溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述VP2重組蛋白質(zhì)溶液由雞傳染性法 氏囊病病毒VP2通過基因工程技術(shù)獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述尿囊素添加量為5-50mg/ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述尿囊素添加量為5mg/ml、10mg/ml、 30mg/ml 或者 50mg/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述尿囊素為固態(tài)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述TritonX-114為原液。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK104356211SQ201410485475
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】李明義, 單學(xué)強(qiáng), 劉陽, 李曉林, 張倫, 馮晶晶, 李佳棋, 李朝陽, 喬彥良 申請(qǐng)人:山東信得科技股份有限公司