分泌抗鳶尾黃斑病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分泌抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用差速離心的方法提純的鳶尾黃斑病毒病毒粒子為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株12C10，其保藏號為CGMCC No.9336。該雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗腹水ELISA效價達10-7，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈，且該單抗能非常特異和靈敏地檢測鳶尾黃斑病毒。12C10分泌的單抗僅與鳶尾黃斑病毒有特異性反應(yīng)，而不與番茄斑萎病毒、蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒等反應(yīng)。該雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單抗為該病毒病的診斷、檢驗檢疫及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。CGMCC No.933620140703
【專利說明】分泌抗鳶尾黃斑病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分泌抗鳶尾黃斑病毒(IYSV)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]鳶尾黃斑病毒(Iris yellow spot virus, IYSV)是布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番爺斑萎病毒屬(Tospovirus)病毒。自20世紀(jì)80年代以來隨著植物病毒研究手段的提高和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，Tospovirus屬內(nèi)多種新病毒被鑒定和命名。IYSV最早于1992年在荷蘭的鳶尾上被發(fā)現(xiàn)據(jù)文獻報道，IYSV的寄主范圍較窄，但能侵染單子葉植物。鳶尾受到侵染時，最初出現(xiàn)褪綠斑，隨病情發(fā)展為黃色壞死斑。依據(jù)栽培品種的不同，受侵染植物可達50%?95%。此外IYSV還可自然侵染洋蔥、韭菜等蔬菜作物。同其它Tospovirus病毒一樣，IYSV也通過薊馬傳播，病情嚴(yán)重的地區(qū)，通常薊馬也比較多。目前該病毒在荷蘭、意大利、德國、美國、日本都有報道，但國內(nèi)還沒有發(fā)生危害的報道。
[0003]鑒于Tospovirus屬病毒復(fù)雜的血清學(xué)關(guān)系和我國對鳶尾、洋蔥等進口量的不斷增加，有必要對該病毒進行相應(yīng)的檢測技術(shù)研究，建立相應(yīng)的技術(shù)儲備。
[0004]針對鳶尾黃斑病毒(IYSV)單克隆抗體的制備展開工作。當(dāng)前監(jiān)測體系尚不完善，甚至主要流行區(qū)也未開展相關(guān)預(yù)測預(yù)報的工作。目前用來檢測這種病毒的方法主要采用RT-PCR檢測、電鏡觀察等方法。這幾種方法都具有其局限性，而且不適合大批量的田間樣品檢測。而血清學(xué)的方法適于田間樣品批量檢測，但必須依賴于特異性的病毒單抗。目前國內(nèi)外未研制出針對這種病毒的特異性的單克隆抗體。
[0005]以鳶尾黃斑病毒(IYSV)提純病毒粒子為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了 I株分泌抗IYSV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞12C10，以其分泌的單抗為核心建立了檢測IYSV的高通量的血清學(xué)方法和檢測試劑盒，并成功應(yīng)用于鳶尾黃斑病毒的檢測，從而為我國鳶尾黃斑病毒的檢驗檢疫，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
[0007]分泌抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株12C10，它能分泌抗鳶尾黃斑病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株12C10于2014年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.9336 ；
抗鳶尾黃斑病毒的單克隆抗體的腹水ELISA效價達10'抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與鳶尾黃斑病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，能檢測出傳毒介體薊馬體內(nèi)的鳶尾黃斑病毒；
抗鳶尾黃斑病毒的單克隆抗體僅能與鳶尾黃斑病毒有特異性反應(yīng)，而不與番茄斑萎病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反應(yīng)；抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體在該病毒檢測、檢驗檢疫上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:1)提供的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗鳶尾黃斑病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISAjPTAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測鳶尾黃斑病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測鳶尾黃斑病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于植物和其傳毒介體薊馬中鳶尾黃斑病毒的檢測，也可以用于該病毒的檢驗檢疫。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是dot-ELISA方法檢測鳶尾黃斑病毒的靈敏度分析；
圖2是dot-ELISA方法檢測煙草中鳶尾黃斑病毒病的結(jié)果。

【具體實施方式】
[0010]分泌抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株12C10，它能分泌抗鳶尾黃斑病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株12C10于2014年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編:100101，保藏號為CGMCC N0.9336，分類命名為:分泌抗鳶尾黃斑病毒(IYSV)單抗雜交瘤細(xì)胞；
抗鳶尾黃斑病毒的單克隆抗體的腹水ELISA效價達10'抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與鳶尾黃斑病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，能檢測出傳毒介體薊馬體內(nèi)的鳶尾黃斑病毒；
抗鳶尾黃斑病毒的單克隆抗體僅能與鳶尾黃斑病毒有特異性反應(yīng)，而不與番茄斑萎病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反應(yīng)；抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體在該病毒檢測、檢驗檢疫上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0011]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗鳶尾黃斑病毒單抗，且其特異性強、效價高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測IYSV的高通量的血清學(xué)方法和檢測試劑盒，并可應(yīng)用于IYSV的檢測及其檢驗檢疫。
[0012]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0013]一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備
1.免疫原及檢測抗原的制備
1)將大研缽和組織攪拌器預(yù)冷；
2)稱取500g病葉，每10g病葉中加入pH7.5的0.5M磷酸鹽緩沖液(即PB緩沖液)200ml (含0.0lM Na-EDTA和0.1%巰基乙醇)，勻漿2分鐘后用雙層尼龍紗布過濾，濾液離心(6000r/min, 20min)去植物組織殘洛；
3)所得上清液邊攪拌邊滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG (分子量為6000) 和0.1mol/L NaCl, 4°C攪拌 4h 以上；
4)離心(11000r/min，15min)得沉淀；
5)沉淀用pH 7.5 的 0.5M PB (含 0.0lM MgCl2^P 0.5M 脲)充分洗滌，離心(6000r/min, 15min)后吸出上清置于離心管，沉淀再洗滌，離心反復(fù)3次；
6)合并上清液,超速離心(33000r/min,10min)所得沉淀懸浮后離心 (8000r/min,15min)；
7)合并上清液再超速離心(33000r/min,10min),離心管底部加有20%_30%鹿糖墊；
8)所得沉淀用pH7.5的0.5M PB (含0.0lM MgCl2)懸浮，懸浮液即為病毒提純液；
2.免疫動物
用提純的鳶尾黃斑病毒(IYSV)的病毒粒子免疫四周齡體重18-20g BALB/c雌性小鼠。即鳶尾黃斑病毒(IYSV)的病毒粒子ΙΟΟμ?ν只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點注射0.2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進行融合。
[0014]3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按10:1的比例，在無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min,去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma,分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無血清的RPM1-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5 % 0)2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0015]4.雜交瘤細(xì)胞、陽性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時，以感染IYSV病毒的煙草葉片和提純病毒為檢測抗原包被，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲72個陽性孔。選擇10個呈強陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進行有限稀釋法克隆，獲得I株能分泌抗IYSV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株12C10。經(jīng)6個月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0016]5.單克隆抗體的特異性檢測
用感染番茄斑萎病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反應(yīng)的病葉汁包被ELISA板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對照，以鳶尾黃斑病毒(IYSV)為陽性對照，用ACP-ELISA法測定單抗的特異性反應(yīng)。ACP-ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后10ul/孔包被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時使其吸附于ELISA板孔；PBST洗滌三次后用3%的脫脂奶粉或1% BSA或3%牛血清封閉30-60min ;加入適當(dāng)稀釋的單抗10ul/孔，37°C 1-2小時；PBST洗滌三次后加入稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)10ul/孔，37°C 1-2小時；PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2moI/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12C10單抗對IYSV有特異性反應(yīng)，而與番茄斑萎病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系及健康植物均無免疫反應(yīng)。
[0017]6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X 15個雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加2倍體積0.06 M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動透析24小時后即獲純化的腹水抗體，-70°C保存。
[0018]7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴散試驗，結(jié)果為12C10單抗亞類為IgGUkappa鏈。用間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，檢測結(jié)果表明上述單抗腹水效價在10— 7。
[0019]二、病毒免疫學(xué)檢測方法及其檢測試劑盒 1.dot-ELISA方法的建立及其田間檢測應(yīng)用
1.1 dot-ELISA檢測鳶尾中IYSV方法的建立及其田間樣品檢測將鳶尾葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30 (w/v，g /1^)加入0.01 mol/L PBS(pH7.4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ I上清點到硝酸纖維素膜(NC)上，同時設(shè)置健康和感病鳶尾葉汁分別作為陰性和陽性對照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30min ；NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3-4次，每次3 min ；NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30-60 min; PBST洗膜4_5次，每次3 min; 66 μ L NBT和 33 μ L BCIP底物(Promega)加入到 10 ml 底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCU0.025 mol/L MgCl、ρΗ9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果O
[0020]用方陣試驗確定檢測鳶尾病葉的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗表明12C10單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測IYSV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)鳶尾葉片稀釋到1:20480倍(w/v，g/mL)時，以12C10單抗建立的dot-ELISA檢測仍呈現(xiàn)紫色的陽性斑點，即其檢測病葉的靈敏度達到1:20480倍稀釋(圖1)。
[0021]用建立的dot-ELISA方法對上海出入境檢驗檢疫局截獲的可疑感染IYSV樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22個樣品中有14個樣品產(chǎn)生紫色的陽性斑點(圖2)。陽性樣品進一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽性樣品均檢測到IYSV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測序表明陽性樣品感染IYSV。說明該dot-ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于鳶尾樣品中IYSV的檢測和檢疫。
[0022]1.2 dot-ELISA檢測薊馬體內(nèi)IYSV方法的建立
單頭薊馬放入0.5 mL的eppendorf的離心管中，并加入10 μ L PBS (0.01mol/L,pH7.4)，用牙簽搗爛薊馬后、5000 rpm離心3 min，取3 μ L上清點到NC膜上，膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測鳶尾中IYSV方法相同，不同的只是二抗為適度稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，顯色底物是HRP的顯色底物，即如TMB沉淀型顯色底物等。同時設(shè)非帶毒和帶毒的薊馬作為陰性和陽性對照。
[0023]用方陣試驗確定檢測薊馬的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度,試驗表明12C10單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:4000和1:6000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測薊馬體內(nèi)IYSV的dot-ELISA方法，檢測結(jié)果表明攜帶IYSV的蚜蟲呈現(xiàn)藍色斑點，而無毒的薊馬沒有任何顯色反應(yīng)，即建立的dot-ELISA方法能特異性地檢測薊馬體內(nèi)的IYSV。
[0024]2.以單抗為核心建立的抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測IYSV病毒 ACP-ELISA方法的操作步驟:
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(PH9.6)按1:30 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液或按100 ul碳酸鹽緩沖液每頭薊馬加入后搗爛的上清10ul/孔加入ELISA板，IYSV病葉或攜帶IYSV薊馬為陽性對照，相應(yīng)健葉或非帶毒薊馬為陰性對照，37°C 2h，或4°C過夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后10ul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗(Sigma)，10ul/孔，37°C，Ih ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物或TMB底物10ul/孔，室溫30min；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色或藍色的孔為陽性，或用2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測0D405或450值，以P/N> 2.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0025]ACP-ELISA方法檢測靈敏度檢測
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對病葉從1:10至5120作倍比稀釋或單頭薊馬進行倍比稀釋20uL/頭至3200uL/頭，分別以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進行上述ACP-ELISA方法檢測。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對1:10?40960倍稀釋的病葉汁液及單頭薊馬稀釋到160uL/頭均呈陽性反應(yīng)，即對檢測病葉的靈敏度可達到1:40960，對薊馬的檢測靈敏度達到160 uL/頭，表明ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。
[0026]3.檢測IYSV的TAS-ELISA檢測方法
3.1.TAS-ELISA方法的操作流程:
1)抗IYSV的兔抗血清1:3000倍稀釋后(合成的免疫原免疫兔子獲得)10ul/孔包被聚苯乙烯板，37°C，2-4h或4°C，過夜；
2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉200ul/孔于 37°C 封閉 30-60min ；
3)加入檢測樣品10ul/孔。以IYSV病葉或攜帶IYSV的薊馬為陽性對照，以相應(yīng)的健康樣品或非帶IYSV的薊馬作陰性對照，37°C l-2h ；
4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水10ul/孔，37°Cl_2h
5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP或HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma)10ul/孔，370C l-2h
6)PBST洗滌后加PNPP底物或TMB底物于室溫顯色5_30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色或藍色的孔為陽性，2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測儀測405nm或450nm的OD值，以P/N> 2.1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0027]3.2TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定:
采用TAS-ELISA方陣試驗進行，即橫向分別加用包被緩沖液從1: 100至1: 102400倍比稀釋的兔抗IYSV血清；加入IYSV病葉汁或薊馬勻漿液；縱向分別加用封閉液從1:
5至1: 2048000倍比稀釋單抗腹水；AP或HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說明書稀釋，I: 10000倍；按TAS-ELISA方法流程進行操作。結(jié)果為IYSV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1: 5000,1: 8000。
[0028]3.3.TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將IYSV病葉汁或薊馬勻漿液用PBS倍比稀釋后進行TAS-ELISA測定，結(jié)果為:TAS-ELISA檢測病葉和薊馬的靈敏度分別達到1:81920倍稀釋(w/v, g /mL)和160 uL/頭,說明本方法具有很好的靈敏度。
[0029]4.鳶尾黃斑病毒dot-ELISA檢測試劑盒
1)試劑盒主要成分:
IYSV單克隆抗體I管0.2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗I管0.1ml
TMB底物I瓶1ml
NBT/BCIP底物各I瓶分別為2 ml和Iml
陽性對照I (含IYSV鳶尾葉汁)I管2 ml
陽性對照2 (帶毒IYSV薊馬)I管2 ml
陰性對照I (健康鳶尾葉汁)I管2 ml
陰性對照2 (健康薊馬勻漿液)I管2 ml
抗體稀釋液(1X) I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)檢測鳶尾樣品的操作步驟:
a.將鳶尾葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10?30(w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7.4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ I上清點到NC上，同時設(shè)置健康和感病鳶尾葉汁分別作為陰性和陽性對照，室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； e.NC膜放入1:3000倍稀釋的單抗中室溫孵育30?60 min ；
f.用PBST洗膜3?4次，每次3min ； NC膜放入1:8000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30?60 min;
g.PBST洗膜4?5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0.1 mol/L Tris C1、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl, pH9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽性對照顯色明顯(紫色)，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0030]3)檢測薊馬樣品的操作步驟:
a.單頭薊馬放入0.5 mL的eppendorf的離心管中，并加入20 μ L PBS (0.01mol/L,pH7.4)，用牙簽搗爛蟲子后、5000 rpm離心3 min，取3 μ L上清點到NC膜上，同時設(shè)置帶毒和非帶毒的薊馬分別作為陰性和陽性對照，室溫干燥10-20 min;
b.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
c.NC膜放入1:3000倍稀釋的單抗中室溫孵育30?60 min ；
d.用PBST洗膜3?4次，每次3min ； NC膜放入1:3000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30?60 min;
e.PBST洗膜4?5次，每次3 min;膜放入TMB底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
f.待陽性對照顯色明顯(藍色)，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0031]4)保存及有效期
于2?8 °C避光保存，有效期12個月。
[0032]5)緩沖液配方:
磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L, ρΗ7.4):
NaCl8 g
KCl0.2 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO412H203g
疊氮化鈉0.2 g
加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7.4，定容至1000 ml
ELISA 洗滌液(0.01 mol/L PBST):
1000 ml 0.01mol/L PBS 中加 0.5 ml Tween-20
ELISA封閉液:
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
【權(quán)利要求】
1.一種分泌抗鳶尾黃斑病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株12C10，其特征在于能分泌抗鳶尾黃斑病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株12C10于2014年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.9336。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株12C10分泌的抗鳶尾黃斑病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體腹水ELISA效價達10_7,抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與鳶尾黃斑病毒的衣殼蛋白有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，能檢測出傳毒介體薊馬體內(nèi)的鳶尾黃斑病毒。
3.—種如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株12C10分泌的抗鳶尾黃斑病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體能與鳶尾黃斑病毒有特異性反應(yīng)，而不與番茄斑萎病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反應(yīng)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗鳶尾黃斑病毒的單克隆抗體在該病毒檢測、檢驗檢疫上的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)檢測試劑盒。
【文檔編號】C07K16/10GK104513812SQ201410629108
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】吳建祥, 于翠, 周雪平, 李娜 申請人:浙江大學(xué), 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心