一種提純雞卵黃免疫球蛋白IgY方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提純雞卵黃免疫球蛋白ＩｇＹ方法，該方法采用pＨ５.１水稀釋法加鹽析法,即兩步硫酸銨法對提純雞卵黃除脂，以獲得較高純度的ＩｇＹ,發(fā)明的兩步硫酸銨法提純的ＩｇＹ純度與得率均高于飽和硫酸銨法，用ＢａｎｄＳｃａｎ軟件分析蛋白純度，前者所得的ＩｇＹ純度可達(dá)９０％以上，而后者所得的ＩｇＹ純度約為７２％,用Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法測定ＩｇＹ蛋白濃度，前者蛋白得率為６.２５ｇ／Ｌ蛋黃，后者蛋白得率僅為４.２５ｇ／Ｌ蛋黃。顯然兩步硫酸銨法提取的ＩｇＹ純度與得率均高于后者。
【專利說明】一種提純雞卵黃免疫球蛋白I g Y方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提純雞卵黃免疫球蛋白I g Y方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來，將含有特異性I g Y的免疫雞蛋口服用于防治輪狀病毒腹瀉、脊髓灰質(zhì)炎、甲型肝炎和其它腸道感染性疾病并取得滿意效果，亦有口服特異性I g Y雞蛋產(chǎn)品替代抗生素成功治療胃腸道疾病的報(bào)道，雞卵黃抗體(I mm U η ο g I O b u I i η o fe g g y ο I k, I g Y)是由母雞血液中I g G轉(zhuǎn)移至其卵黃中對子代產(chǎn)生保護(hù)性作用的免疫球蛋白，免疫雞蛋黃中含有大量來源于血清的I g G抗體(B卩I g Y)，濃度遠(yuǎn)高于血清，維持時(shí)間長達(dá)2 8周，具有高度穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，這使雞卵黃抗體I gY 口服防病治病成為可能，目前國內(nèi)外已有較多關(guān)于怎樣從雞蛋黃中提取I g Y的報(bào)道，但存在諸如實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣不易操作、I g Y提取的純度與得率均較低等缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種提純雞卵黃免疫球蛋白I g Y方法，該方法能準(zhǔn)確分析株革蘭陰性桿菌的分布和耐藥性制備Ig Y具有純度高、得率高、特異性強(qiáng)及利用小體積樣品獲得大量純化蛋白的優(yōu)點(diǎn)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案
一種提純雞卵黃免疫球蛋白I g Y方法，該方法采用P H 5.1水稀釋法加鹽析法，即兩步硫酸銨法對提純雞卵黃除脂，以獲得較高純度的I g Y。
[0005]前述的一種提純雞卵黃免疫球蛋白I g Y方法中，所述兩步硫酸法為將蛋黃液加入雙蒸餾水后使得PH值為5.1，通過離心并用濾紙過濾除脂后得到上清液，上清液加入硫酸銨晶體，采用離心方法獲得白色沉淀，將白色沉淀放入pH7.4PBS中，再加入硫酸銨晶體，再次加入硫酸銨晶體，然后離心獲得白色沉淀并融入PH7.4的PBS中，置于雙蒸水中攪拌透析得到樣品。
[0006]由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的兩步硫酸銨法提純的I gY純度與得率均高于飽和硫酸銨法，用B a n d S C a η軟件分析蛋白純度，前者所得的I g Y純度可達(dá)9 O %以上，而后者所得的I g Y純度約為7 2 %，用B r a d f Or d方法測定I g Y蛋白濃度，前者蛋白得率為6.2 5 g / L蛋黃，后者蛋白得率僅為4.2 5 g / L蛋黃。顯然兩步硫酸銨法提取的I g Y純度與得率均高于后者。

【具體實(shí)施方式】
[0007]下面對本發(fā)明進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不作為對本發(fā)明的任何限制。
[0008]本發(fā)明的實(shí)施例:
I材料與方法
1.1動(dòng)物與試劑羅曼母雞由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供；S D S - P A G E凝膠配制試劑盒P
00 12 A、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)P O O 6 1、S D S - P AG E蛋白上樣緩沖液(5 X)、S DS-PAGE電泳液P 0014 B、考馬斯亮藍(lán)染色液(常規(guī)法)P O O I 7 B、考馬斯亮藍(lán)脫色液(常規(guī)法)P Q Q I 7 C、P B S、硫酸銨、EDT A均由碧云天生物技術(shù)研究所提供。
[0009]1.2 IgY提取與純化
1.2.1兩步硫酸銨提取方法
取消毒完畢的雞蛋I個(gè)，用剪刀打開一個(gè)小洞，讓蛋清緩緩流出至不能再流出后，再以無菌生理鹽水洗凈卵清，將整個(gè)卵黃小心移至濾紙上，來回滾動(dòng)，除盡蛋清，再用針頭刺破蛋黃，使之移到量筒。量取約8 m I蛋黃液，加I O倍雙蒸水稀釋卵黃，混勻后調(diào)P H值為5.1,-20 °C過夜，室溫解凍，I 2 O O O r / m i η 4 °C離心3 O m i η，再將上清液用濾紙過濾除脂，獲得較清上清液，上清液加入硫酸銨晶體，使其濃度為I 9%，靜置I h后，再次以12000r/min4 °C離心I 5 m i η ,取其白色沉淀，將白色沉淀溶于15ml0.0 Imo I / LpH7-4PBS中，再加入硫酸銨晶體，使其濃度為
14 %,再次靜置I h后,再次以12000r/min4 °C離心I 5 m i η ,取其白色沉淀，溶于0-0 1mol/LpH7.4的PBS2ml中，置于雙蒸水中攪拌透析，I h后更換透析液一次，共4?5次，透析過夜后，析出透析后的樣品，再以0.2 2 μ m濾器過濾滅菌，獲得I g Y后用無菌E P管盛裝，置一 2 O °C保存。
[0010]1.2.2 透析袋處理
在 3 O O m I 透析處理液(2 %N a H C O 3、I mm ο I / LEDTA,pH8.0)中將透析袋煮沸I O m i η后，以蒸餾水徹底漂洗后再在3 O O m I (ρ H 8) I mm οI / L E D T A液中煮沸1mi η，再以滅菌水里外徹底沖洗。
[0011]1.2.3 飽和硫酸銨提取方法
以相同濃度卵黃粗提液進(jìn)行飽和硫酸銨提取。用水稀釋法粗提卵黃獲得上清液后(方法同兩步硫酸銨法)，加入飽和硫酸銨(ΡΗ6.0?7.0)，使硫酸銨濃度為5 O %，靜置2h,以I 20 O O r / m i η 4 °C離心I 5 m i η離心棄上清液,加入飽和硫酸銨至3 3 %飽和度，靜置2 h再次以I 2 O O O r / m i η 4 °C離心I 5 m i η，離心取沉淀。如此重復(fù)2、3次可獲I g Y。其后實(shí)驗(yàn)過程同兩步硫酸銨法，同樣將獲得的I g Y用無菌E P管盛裝，置一 2 O °C保存。
[0012]1.3 SDS-PAGE 電泳
根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照S D S - P AGE電泳說明書及參考文獻(xiàn)資料方法進(jìn)行配膠、電泳、染色與脫色。
[0013]2 結(jié)果
兩步硫酸銨法提純的I g Y純度與得率均高于飽和硫酸銨法，用B a n d S C a η軟件分析蛋白純度，前者所得的I g Y純度可達(dá)9 O %以上，而后者所得的I g Y純度約為7 2 %。用B r a d f O r d方法測定I g Y蛋白濃度，前者蛋白得率為6.2 5 g / L蛋黃，后者蛋白得率僅為4.2 5 g / L蛋黃。顯然兩步硫酸銨法提取的I g Y純度與得率均聞?dòng)诤笳摺?br> [0014]3 討論近年來隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，從雞蛋黃中提取免疫球蛋白卵黃抗體技術(shù)(I g Y技術(shù))正在成為生物【技術(shù)領(lǐng)域】和醫(yī)藥研究中的新熱點(diǎn)，并且越來越得到國內(nèi)外同仁的重視，有可能替代用免疫動(dòng)物
提取血清免疫球蛋白治療與預(yù)防疾病的方法。
[0015]本實(shí)驗(yàn)比較了兩步硫酸銨法與飽和硫酸銨法提取卵黃抗體I gY技術(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩步硫酸銨法所得的I g Y純度與得率均高于飽和硫酸銨法，前者與后者相比，具有優(yōu)越性。
[0016]從免疫雞蛋中用兩步硫酸銨法獲取抗體的方法簡單而又實(shí)用,提取雞卵黃免疫球蛋白I g Y純度與得率均相對較高，期待卵黃抗體I g Y技術(shù)日趨成熟，使得大規(guī)模生產(chǎn)雞卵黃免疫球蛋白I g Y并在預(yù)防和治療細(xì)菌和病毒引起的消化道和非消化道疾病中發(fā)揮重要作用成為可能。
【權(quán)利要求】
1.一種提純雞卵黃免疫球蛋白I g Y方法，其特征在于:該方法采用P H 5.1水稀釋法加鹽析法，即兩步硫酸銨法對提純雞卵黃除脂，以獲得較高純度的I gY。
2.根據(jù)權(quán)利要I所述的一種提純雞卵黃免疫球蛋白Ig Y方法，其特征在于:所述兩步硫酸法為將蛋黃液加入雙蒸餾水后使得PH值為5.1，通過離心并用濾紙過濾除脂后得到上清液，上清液加入硫酸銨晶體，采用離心方法獲得白色沉淀，將白色沉淀放入pH7.4PBS中，再加入硫酸銨晶體，再次加入硫酸銨晶體，然后離心獲得白色沉淀并融入PH7.4的PBS中，置于雙蒸水中攪拌透析得到樣品。
【文檔編號(hào)】C07K1/36GK104497139SQ201410750608
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】敖云霞 申請人:敖云霞