專利名稱：一種抗血循型蛇毒雞卵黃抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種血循型蛇毒雞卵黃抗體(Immunoglobulin-yolk, IgY)及制備方法與應用。具體而言，是基于血循型蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性基序多肽免疫，制備抗血循型蛇毒雞卵黃抗體的制備方法。
背景技術：
長久以來，毒蛇咬傷給人們的生產生活帶來了嚴重危害，據(jù)世界衛(wèi)生組織網站公布的數(shù)字顯示:全世界每年被蛇咬傷的人數(shù)有250多萬人，導致死亡人數(shù)高達12.5萬人。我國每年毒蛇咬傷患者達10多萬人次，其中約73 %為中青年，死亡率為5 % 10 %，蛇傷致殘喪失勞動能力者占25% 30% ?？梢姸旧呤俏：θ祟惤】档囊粋€重要生物安全隱患，必須采取相關措施，降低或消除相關風險。注射抗蛇毒血清是目前世界公認的最有效的治療方法，但蛇毒本身成分復雜，含有數(shù)百種功能各異的蛋白質，用全毒免疫產生的抗蛇毒血清不僅含有能中和毒素成分的抗體，也含有大量針對蛇毒中其他非毒素成分的抗體。這不僅使得抗血清的臨床使用劑量大大增加，增加了過敏反應概率，也浪費了寶貴的血清資源(Wagstaff S C，Laing GDj Theakston R Dj et al.Bioinformatics and multiepitope DNA immunization todesign rational snake antivenom.PLoS Medj 2006，3:184.)。如果能夠將蛇毒中的主要毒性致死成分分離、純化，制備單克隆抗體，則其中和相應蛇毒蛋白能力將極大提高，抗體用量減少，不良反應也可相應減少，而且其抗體生產成本也將極大降低，質量也可得到穩(wěn)定控制。檢索相關文獻，已有不少有關蛇毒蛋白單克隆抗體的成功制備(尹惠瓊.利用噬菌體展示文庫技術制備抗蛇毒ScFv抗體.云南大學，2004碩士論文.；李麗紅等.眼鏡王蛇毒單克隆抗體的制備.細胞與分子免疫學雜志，2009，25 (3): 236-238.等)但絕大部分僅局限于毒蛇分類鑒定和基礎理論研究上；這極可能是由于蛇毒毒性成分的多樣性(賈艷等.蛇毒的毒性成分及其應用研究.蛇志，2004，16(2):23-32.)，因此至今幾乎沒有一種單克隆抗體能夠完全中和某種蛇毒毒性。尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)是我國常見的毒蛇，屬于蝰科蝮亞科，又名五步蛇(浙江)，棋盤蛇(福建)，百步蛇(臺灣)，主要棲息于越南北部，老撾和中國南部地區(qū)，其毒液主要為血循毒(Li QB, Yu QS, Huang Gff, et al.Hemostaticdisturbances observed in patients with snakebite in south China.Toxicon.2000，38 (10): 1355-1366.Chen CCj Yang CM，Hu FR，et al.Penetrating ocular injurycaused by venomous snakebite.Am.J.0phthalmol.2005，140(3): 44- 546.)。患者被咬傷后，傷口局部紅腫、疼痛劇烈，流血不止，腫脹迅速，毒素向肢體上端蔓延，常有水泡、淤斑出現(xiàn)。中毒嚴重者還會出現(xiàn)血壓下降、心律失常、少尿、無尿，最后因循環(huán)衰竭而導致死亡。研究表明，蛇毒金屬蛋白酶(Wagstaff S C，Laing G Dj Theakston R Dj etal.Bioinformatics and multiepitope DNA immunization to design rational snakeantivenom.PLoS Med，2006，3:184)是引起出血、致死等癥狀的主要物質，它們有的干擾傷口血液的凝結和血檢的形成，有的則降解胞外基質或基底I旲，可占總蛇毒蛋白的60%以上，是蛇毒蛋白中的主要成分；能夠有效中和這些金屬蛋白酶，則基本可以有效緩解五步蛇毒對機體的損傷。研究表明，蛇毒金屬蛋酶和哺乳動物基質金屬蛋白酶一樣，它們都是金屬鋅蛋白，有一個鋅結合域HEXXHXXGXXH。自1950年以來，已有150多種蛋白酶(其中有100多種毒金屬蛋白酶)從蛇毒中純化出來，其中有超過40種(20多種是金屬蛋白酶)的氨基酸全序列被測定。根據(jù)已報道的蛇毒金屬蛋白酶的cDNA序列和蛋白質的結構，將蛇毒金屬蛋白酶分成4類:其中PI類僅含金屬蛋白酶域(metalloproteinase domain),分子量20 30kDa ;PII類含金屬蛋白酶·域和去整合素域(disintegrin domain),分子量30 50kDa ；PIII類含金屬蛋白酶域、去整合素域和富半胱氨酸域(cysteine-rich domain),分子量50 80kDa ;PIV類在PIII類基礎上多了二硫鍵連接的類C型凝集素域(C_typelectin domain) (Cynthia Tallant, Aniebrys Marrero, F.Xavier Gomis-Riith.Matrixmetalloproteinases: Fold and function of their catalytic domains.Biochimica etBiophysica Acta, 2010, 1803:20-28)。金屬蛋白酶域是四類蛇毒金屬酶類的共有部分。對比分析各蛇毒金屬蛋白酶域結果表明，HEXXHXXGXXH序列是酶活性中心的高度保守序列。為此，理論上而言，將該保守序列作為抗原肽免疫動物可以得到針對該類抗原位點的特異性抗血清，而該抗血清極可能均能夠與上述各類蛇毒金屬蛋白發(fā)生交叉反應，起到中和蛇毒毒性作用。而由于免疫動物所用抗原肽的單一性，其制備所得抗血清抗體成分相對單一，可減少抗血清用量，減少不良反應；同時，基于這一抗原肽，可以進一步篩選建立有效的單克隆抗體制劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種基于血循型蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性結構域序列作為抗原肽，免疫母雞制備抗血循型蛇毒雞卵黃抗體的制備方法；該方法抗體產率高、成本低；所得到的抗體安全性高、穩(wěn)定性好、過敏性不良反應?。豢梢宰龀煽诜苿┖妥⑸鋭?；可用于具有血循毒性蛇毒咬傷治療，尤其適用于五步蛇和短尾蝮蛇咬傷治療。本發(fā)明采用的技術方案是:本發(fā)明提供一種抗血循型蛇毒雞卵黃抗體，所述抗體按如下方法制備:(I)基于血循型蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性結構域序列，合成蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性結構域多肽；所述多肽的氨基酸序列為CXnHEXXHXXGXXHXn*XnHEXXHXXGXXHXnC，其中X為除半胱氨酸以外的任何氨基酸，η是包括零的任何正整數(shù)；(2)將步驟(I)中的多肽與載體偶聯(lián)、綴合或融合，制備抗原肽復合物；(3)母雞免疫:將步驟(2)中的抗原肽復合物注入母雞體內進行免疫，連續(xù)收集雞蛋;(4)從步驟(3)收集的雞蛋中提取抗蛇毒雞卵黃抗體，即獲得所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體。進一步，優(yōu)選所述η是(Γ20之間的任何正整數(shù)。進一步，所述載體包括蛋白或脂類。更優(yōu)選所述載體為:鑰孔血藍蛋白(keyholeLimpet Hemocyanin)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin)、牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin)、牛甲狀腺球蛋白(Bovine Thyroglobulin)、雞卵白蛋白(Ovalbumin)及其他Y球蛋白等蛋白載體；另有重組載體可以為多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、二軟脂酰賴氨酸(Dipalmitoyl-Lysine)、多聚谷氨酸(Poly- y -Glutamic acid)及其他多聚混合氨基酸等。進一步，步驟(3)按如下方法進行:將步驟(2)中制備的抗原肽復合物與等體積福氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)在室溫下混合乳化,然后于母雞皮下多點注射進行首次免疫，首次免疫抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只(優(yōu)選Img/只)，首次免疫廣2周后進行第一次加強免疫，抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只(優(yōu)選0.5mg/只)，首次免疫2 4周后進行第二次加強免疫，抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只(優(yōu)選0.5mg/只)，后續(xù)每間隔:Γ4周免疫一次，抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只(優(yōu)選0.5mg/只)，并于初次免疫3周后開始連續(xù)收集雞蛋。首次免疫之后的每次加強免疫或免疫均用步驟(2)中制備的抗原肽復合物與等體積福氏不完全佐劑在室溫下混合乳化后于母雞皮下進行多點注射。本發(fā)明步驟(4)所述從收集的雞蛋中提取雞卵黃抗體的方法及分離純化方法為本領域公知技術，可以采用硫酸銨沉淀法、聚乙二醇沉淀法、柱層析法及相關商品化試劑盒等純化方法。本發(fā)明還涉及一種所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體在制備抗血循型蛇毒藥物中的應用。所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體可對血循型毒蛇咬傷進行治療，可以通過口服或注射給藥，優(yōu)選為注射給藥?？寡蜕叨倦u卵黃抗體用量優(yōu)選Γιο mg/kg體重。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體產率高、成本低；所得到的抗體安全性高、穩(wěn)定性好、過敏性不良反應??；可以做成口服制劑或注射劑；可用于具有血循毒性蛇毒咬傷治療，尤其適用于五步蛇和短尾蝮蛇咬傷治療。


圖1:M15 多肽 HPLC 圖；圖2:M15多肽質譜圖；圖3:1gY 樣品 SDS-PAGE 電泳圖；圖4:小鼠皮下出血毒性實驗結果:A為五步蛇蛇毒皮下出血毒性實驗結果；B為蝮蛇蛇毒皮下出血實驗結果；圖中O是指蛇毒加免疫前的IgY 5(^g注射點，Dl是指蛇毒加免疫后的IgY5(^g注射點，D2是指蛇毒加免疫后的IgY 25Pg注射點，D3是指蛇毒加免疫后的IgY IOPg注射點，D4是指蛇毒加免疫后的IgY 5Pg注射點，D5是指蛇毒加免疫后的IgY 2.5Pg注射點。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:如未特別指明之處，可根 據(jù)本領域技術人員所熟悉的《Making and UsingAntibodies: A Practical Handbook》(CRC Press, Florida, 2006)、《抗體制備與使用實驗指南》(科學出版社，北京，2010年)等手冊以及本文所引用的參考文獻中所列的方法來實施。另外，實施例中所使用的材料除有特別說明外，均可通過商業(yè)途徑從市場上購買。實施例1:基于蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性基序的新型抗血循型蛇毒雞卵黃抗體制備1、多肽的合成及偶聯(lián)通過對多種蛇毒金屬蛋白酶(如，AcutolysinA、Acutolysin F、AcutolysinE、Aculysin 2、Metalloprotease H1、Metalloprotease H2、Metalloprotease H3、Metalloprotease H4和Metalloprotease H5)催化結構域氨基酸序列進行對比分析，確定合成以下多肽序列(M15):CAHEMAHNLGVRHDE,并提交杭州聚成生物技術有限公司合成多肽，HPLC和MS鑒定結果如圖1、2所示。然后通過碳二亞胺法將該多肽偶聯(lián)至鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH,購自 sigma 公司),形成抗原妝復合物 KLH-M15。2、母雞免疫將上述抗原肽復合物KLH-M15與等體積福氏完全佐劑(購自MP Biomedicals)在室溫下混合乳化，取22周齡的萊杭母雞，于母雞皮下多點注射上述福氏完全佐劑乳化的抗原肽復合物KLH-M15進行初次免疫，初次免疫KLH-M15量為1.0mg/只；2周后用福氏不完全佐劑(購自MP Biomedicals)乳化的抗原肽復合物KLH-M15加強免疫一次，KLH-Ml5用量為0.5mg/只；4周后進行第二次加強免疫(福氏不完全佐劑乳化的抗原肽復合物KLH-Ml5), KLH-Ml5用量為0.5mg/只；之后每隔4周免疫一次(福氏不完全佐劑乳化的抗原肽復合物KLH-M15)，每次KLH-M15量為0.5mg/只；并于第一次免疫3周后連續(xù)收集雞蛋，置于4°C保存?zhèn)溆?；同時留取免疫前雞蛋作為陰性對照。3、抗體提取采用聚乙二醇沉淀法從步驟2收集的雞蛋中提取、純化抗蛇毒雞卵黃抗體(IgY)(Pauly D, Chacana PA, Calzado EG, Brembs B, Schade R.1gY technology: extractionof chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.J Vis Exp.2011(51).do1:pi1: 3084.10.3791/3084.):取卵黃，加入 2 倍卵黃體積 pH7.4的PBS緩沖液，混勻后加入終濃度為3.5%的PEG6000 (質量濃度)，冰浴振蕩溶解lOmin，12000g，4°C離心20min，取上清；按照上清液體積，加入8.5% (質量濃度)的PEG6000，冰浴振蕩溶解15min, 12 000g，4°C離心20min，去上清;沉淀用IOml ρΗ7.4的PBS溶解，加入12%(質量濃度)的PEG6000，冰浴振蕩溶解15min，12 000g，4°C離心20min，去上清；沉淀用ImlPH7.4的PBS溶解后用14 OOODa截留量的透析袋于冰浴的pH7.4的PBS中透析過夜，換液3次。透析后的樣品于280nm處測定吸光度值,計算抗體IgY含量達56.7mg/ml (計算方法參照:Pauly D, Chacana PA, Calzado EG, Brembs B, Schade R.1gY technology:extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG)precipitation.J Vis Exp.2011(51).do1:pi1: 3084.10.3791/3084.);樣品于 _2(TC 保存?zhèn)溆谩?、SDS-PAGE 檢測

采用SDS-PAGE法(參見申請?zhí)?200610035761.6)對步驟3提取、純化的IgY樣品進行檢測；樣品于65kDa (重鏈)和25kDa (輕鏈)處可見明顯兩個條帶(圖3所示)，與相關文獻報道一致(Pauly D, Chacana PA, Calzado EG, Brembs B, Schade R.1gY technology:extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG)precipitation.J Vis Exp.2011(51).do1:pi1: 3084.10.3791/3084.)(見圖 3)。5、ELISA 效價檢測參照申請?zhí)?200610035761.6方法，對步驟3制備的抗體樣品與抗原肽復合物KLH-M15的效價及樣品與五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的交叉免疫性進行了測定。結果表明，樣品與KLH-M15的效價可達32萬倍稀釋度，但其與五步蛇和蝮蛇蛇毒的交叉反應性均較差，稀釋度分別只有5千倍和2千倍左右。6、小鼠皮下出血試驗選用ICR系健康雄性小白鼠，隨機分組，每組10只。實驗組一:將1.0mg/ml的五步蛇毒液10 μ L與PBS (ρΗ7.4)溶解的不同稀釋度的IgY樣品10 μ L在無菌EP管內混合(見表1)，置25°C恒溫水浴箱中孵育60min，然后在脫毛小白鼠的背部進行皮下注射。實驗組二:將0.5mg/ml的蝮蛇蛇毒液10 μ L與PBS (ρΗ7.4)溶解的不同稀釋度的IgY樣品10 μ L在無菌EP管內混合(見表I )，置25°C恒溫水浴箱中孵育60min，然后在脫毛小白鼠的背部進行皮下注射。18h后頸椎脫白處死，解剖，拍照記錄出血斑塊長短徑，并采用IPP軟件計算出血面積及各抗血清對出血抑制率，結果見表I和圖4所示。
權利要求
1.種抗血循型蛇毒雞卵黃抗體，其特征在于所述抗體按如下方法制備: (1)基于血循型蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性結構域序列，合成蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性結構域多肽；所述多肽的氨基酸序列為CXnHEXXHXXGXXHXn*XnHEXXHXXGXXHXnC，其中X為除半胱氨酸以外的任何氨基酸，η是包括零的任何正整數(shù)； (2)將步驟(1)中的多肽與載體偶聯(lián)、綴合或融合，制備抗原肽復合物； (3)母雞免疫:將步驟(2)中的抗原肽復合物注入母雞體內進行免疫，連續(xù)收集雞蛋； (4)從步驟(3)收集的雞蛋中提取抗蛇毒雞卵黃抗體，即獲得所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體。
2.權利要求1所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體，其特征在于所述η是(Γ20之間的任何正整數(shù)。
3.權利要求1所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體，其特征在于所述載體包括蛋白或脂類。
4.權利要求1所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體，其特征在于步驟(3)按如下方法進行:將步驟(2)中制備的抗原肽復合物與等體積福氏完全佐劑在室溫下混合乳化，然后于母雞皮下多點注射進行 首次免疫，首次免疫抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只，首次免疫廣2周后進行第一次加強免疫，抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只，首次免疫2 4周后進行第二次加強免疫，抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只，后續(xù)每間隔3 4周免疫一次，抗原肽復合物的用量為0.Γ3 mg/只，并于初次免疫3周后開始連續(xù)收集雞蛋。
5.種權利要求1所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體在制備抗血循型蛇毒藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗血循型蛇毒雞卵黃抗體，所述抗體按如下方法制備基于血循型蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性結構域序列，合成蛇毒鋅離子金屬蛋白酶活性結構域多肽；將多肽與載體偶聯(lián)、綴合或融合，制備抗原肽復合物；將抗原肽復合物注入母雞體內進行免疫，連續(xù)收集雞蛋；從收集的雞蛋中提取抗蛇毒雞卵黃抗體，即獲得所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體；本發(fā)明所述抗血循型蛇毒雞卵黃抗體產率高、成本低；所得到的抗體安全性高、穩(wěn)定性好、過敏性不良反應小；可以做成口服制劑或注射劑；可用于具有血循毒性蛇毒咬傷治療，尤其適用于五步蛇和短尾蝮蛇咬傷治療。
文檔編號C07K16/40GK103087194SQ20121059156
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月30日 優(yōu)先權日2012年12月30日
發(fā)明者范永升, 蔣福升, 丁志山, 劉翔宇, 呂迪, 潘平, 毛建洋 申請人:浙江中醫(yī)藥大學