專利名稱：表達(dá)人c蛋白酶原的載體和化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼人C蛋白新酶原的新DNA化合物和重組DNA克隆載體。這些酶原在體內(nèi)僅由凝血酶就能以具有臨床意義的速度被激活，這些酶原和天然C蛋白酶原相比，非常容易受凝血酶/凝血調(diào)節(jié)蛋白的激活。這些表達(dá)載體提供了一種簡(jiǎn)單而有效的在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)這些人C蛋白酶原的工具。天然人C蛋白酶原的活化需要用高水平的凝血酶、或凝血酶和凝血調(diào)節(jié)蛋白、或其它昂貴的酶來進(jìn)行處理。本發(fā)明提供一種生產(chǎn)C蛋白酶原的方法，該C蛋白酶原是凝血酶的極好底物，因此，在較低水平的凝血酶、或凝血酶/凝血調(diào)節(jié)蛋白、或其它酶的存在下就能被激活。最重要的是，本發(fā)明的人C蛋白酶原甚至在生理Ca2+存在下也能被凝血酶激活，而生理Ca2+抑制凝血酶對(duì)天然C蛋白酶原的激活。新的人C蛋白酶原的活化肽氨基酸殘基順序不同于本領(lǐng)域已知的人C蛋白酶原，從酶原中除去活化肽即產(chǎn)生人活化C蛋白。這些新的人C蛋白酶原在治療與凝血有關(guān)的血液病時(shí)具有特殊的優(yōu)點(diǎn)。
C蛋白是一種維生素K依賴性血漿蛋白，其生理上的重要性主要在于控制止血，并在調(diào)節(jié)血液凝集方面起著重要的作用。C蛋白是以一種無活性的分子而合成的，本文將這種無活性分子稱為初生C蛋白。初生C蛋白經(jīng)過復(fù)雜的加工，產(chǎn)生數(shù)種不同的無活性分子，這將在下面作更詳細(xì)的描述。本文將無活性的、分泌形式的C蛋白稱為C蛋白酶原。血液中C蛋白的活化是通過一個(gè)與凝血調(diào)節(jié)蛋白-凝血酶復(fù)合物有關(guān)的反應(yīng)而進(jìn)行的?；罨疌蛋白及其輔因子S蛋白是具有重要生理意義的抗凝血?jiǎng)；罨疌蛋白能夠防止血管內(nèi)形成血栓并控制已有血塊的擴(kuò)展。近年來已搞清了活化型C蛋白的作用機(jī)制和將無活性酶原激活為活性蛋白酶的活化機(jī)制(綜述見J.E.GardinerandJ.H.Griffin，ProgressinHematology，Vol.ⅩⅢ，pp.265-278，ed.ElmerB.Brown，GruneandStratton，Inc.，1983)。
C蛋白的活化涉及凝血級(jí)聯(lián)中最后一個(gè)絲氨酸蛋白酶即凝血酶，以及一種稱為凝血調(diào)節(jié)蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞膜連結(jié)的糖蛋白。凝血調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶形成緊密的化學(xué)計(jì)量復(fù)合物。凝血調(diào)節(jié)蛋白與凝血酶形成復(fù)合物后，完全改變了凝血酶的功能特性。凝血酶通常使血纖維蛋白原凝結(jié)，使血小板活化，并使凝血輔因子Ⅴ和Ⅷ轉(zhuǎn)化為其活化形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶激活C蛋白，但很慢而且效率很低，并且其活化還受到生理Ca2+的抑制。相反，凝血酶與凝血調(diào)節(jié)蛋白形成復(fù)合物后，則不能使血纖維蛋白原凝結(jié)，不能激活血小板，也不能將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉(zhuǎn)化為其活化形式Ⅴa和Ⅷa，但卻能在生理Ca2+存在下非常有效地激活C蛋白酶原。凝血調(diào)節(jié)蛋白-凝血酶激活C蛋白酶原的速度常數(shù)比單獨(dú)的凝血酶的速度常數(shù)高1，000多倍。
為了了解活化C蛋白下降調(diào)節(jié)血液凝固的機(jī)制，下面簡(jiǎn)單描述凝血酶系統(tǒng)。最好將凝血系統(tǒng)視為一個(gè)鏈反應(yīng)，這一反應(yīng)依次將若干酶原激活為活性絲氨酸蛋白酶。這個(gè)鏈反應(yīng)最終產(chǎn)生凝血酶，凝血酶通過有限的蛋白水解而將血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的纖維蛋白凝膠。凝血級(jí)聯(lián)中的兩個(gè)關(guān)鍵步驟是通過凝血因子Ⅸa將凝血因子Ⅹ轉(zhuǎn)變?yōu)棰鷄;通過凝血因子Ⅹa將凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?。這兩個(gè)反應(yīng)都是在細(xì)胞表面發(fā)生的，最明顯的是在血小板表面。這兩個(gè)反應(yīng)都需要輔助因子。主要的輔因子為因子Ⅴ和Ⅷ，它們以活性較小的前體在該系統(tǒng)中循環(huán)，但如果形成了先頭的幾個(gè)凝血酶分子，凝血酶反過來進(jìn)入循環(huán)而通過有限的蛋白水解激活這兩個(gè)輔因子。激活后的輔因子Ⅴa和Ⅷa使凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶及因子Ⅹ轉(zhuǎn)化為因子Ⅹa的速度都增加大約5個(gè)數(shù)量級(jí)?；罨腃蛋白優(yōu)先作用于低活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式，使凝血輔因子Ⅴa和Ⅷa發(fā)生蛋白水解降解、水解和不可逆破壞。相反，凝血因子Ⅴ和Ⅷ在體內(nèi)幾乎不是活化C蛋白的底物。
一個(gè)重要的活化C蛋白的輔因子是S蛋白，它也是一個(gè)維生素K依賴性血漿蛋白。S蛋白使活化C蛋白介導(dǎo)的因子Ⅴa和Ⅷa的水解速度增加幾乎25倍。
C蛋白被認(rèn)為是一種有價(jià)值的治療劑(參見例如歐洲專利公告第0215548和0191606號(hào))?；罨疌蛋白是一種新的抗凝血?jiǎng)渲委熤笖?shù)比現(xiàn)有的抗凝血?jiǎng)┤绺嗡睾涂诜u基香豆素型抗凝血?jiǎng)┮獙?。在未產(chǎn)生凝血酶時(shí)，C蛋白酶原和活化C蛋白都不起作用，因?yàn)樾枰笇⒛蜃英蹀D(zhuǎn)化為Ⅴa，將Ⅷ轉(zhuǎn)化為Ⅷa;這兩種活化型輔因子是活化C蛋白的最佳底物。C蛋白酶原的激活也需要凝血酶，因?yàn)槿绻麤]有凝血調(diào)節(jié)蛋白-凝血酶復(fù)合物，C蛋白酶原就不能轉(zhuǎn)化為其活性形式。
活化C蛋白是一種急需的抗凝血?jiǎng)?，因?yàn)榛罨疌蛋白有使輔因子Ⅴa和Ⅷa失活的作用。由于需要凝血酶將因子Ⅴ和Ⅷ轉(zhuǎn)化為其活化形式Ⅴa和Ⅷa，所以C蛋白只是在產(chǎn)生凝血酶之后才起到抗凝血?jiǎng)┑淖饔?。與活化C蛋白相反，常規(guī)抗凝血?jiǎng)┲灰o予患者就在整個(gè)循環(huán)過程中保持恒定的抗凝血?jiǎng)顟B(tài)，因而，比起C蛋白或活化C蛋白，大大增加了發(fā)生出血并發(fā)癥的危險(xiǎn)性。因此活化C蛋白是一種有廣泛臨床應(yīng)用的急需的抗凝血?jiǎng)捎米鞲嗡睾土u基香豆素類化合物的替代物。
在某些疾病如遺傳性C蛋白缺陷癥中，C蛋白酶原具有很重要的治療作用。如果是先天性純合型C蛋白缺陷癥，則患者在童年早期就由于紫癜暴發(fā)而死亡，紫癜暴發(fā)是播散血管內(nèi)凝血的常見致死形式。如果是雜合型C蛋白缺陷癥，患者患有嚴(yán)重的陣發(fā)性血栓栓塞。據(jù)臨床上確認(rèn)，用來治療血友病B或因子Ⅸ缺陷癥的血漿蛋白濃縮物中含有C蛋白雜質(zhì)，這種濃縮物可有效地預(yù)防和治療雜合型C蛋白缺陷癥中的血管內(nèi)凝血。在血栓癥如播散血管內(nèi)凝血及某些易形成血栓的疾病如大創(chuàng)傷、大外科和腫瘤中，還觀察到C蛋白的異常低水平。
為便于理解本發(fā)明和C蛋白的活化，下面畫出初生人C蛋白的編碼順序及相應(yīng)的氨基酸殘基順序。就本發(fā)明的目的而言，這個(gè)氨基酸殘基順序及其相關(guān)部分也表示了“天然人C蛋白”的特征。
102030405′-ATG TGG CAG CTC ACA AGC CTC CTG CTG TTC GTG GCC ACC TGG GGA ATT H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE510155060708090TCCGGCACACCAGCTCCTCTTGACTCAGTGTTCTCCAGCAGCGAGCGTSERGLYTHRPROALAPROLEUASPSERVALPHESERSERSERGLUARG202530100110120130140GCCCACCAGGTGCTGCGGAAACGTGCCAACTCCTTCCTGGAGALAHISGLNVALLEUARGILEARGLYSARGALAASNSERPHELEUGLU354045150160170180190GAGCTCCGTCACAGCCTGGAGCGGGAGTGCATAGAGGAGATCTGTGLULEUARGHISSERSERLEUGLUARGGLUCYSILEGLUGLUILECYS505560200210220230240GACTTCGAGGAGGCCAAGGAAATTTTCCAAAATGTGGATGACACACTGASPPHEGLUGLUALALYSGLUILEPHEGLNASNVALASPASPTHRLEU65707580250260270280GCCTTCTGGTCCAAGCACGTCGACGGTGACCAGTGCTTGGTCTTGCCCALAPHETRPSERLYSHISVALASPGLYASPGLNCYSLEUVALLEUPRO859095290300310320330TTGGAGCACCCGTGCGCCAGCCTGTGCTGCGGGCACGGCACGTGCATCLEUGLUHISPROCYSALASERLEUCYSCYSGLYHISGLYTHRCYSILE100105110
340350360370380GACGGCATCGGCAGCTTCAGCTGCGACTGCCGCAGCGGCTGGGAGGGCASPGLYILEGLYSERPHESERCYSASPCYSARGSERGLYTRPGLUGLY115120125390400410420430CGCTTCTGCCAGCGCGAGGTGAGCTTCCTCAATTGCTCGCTGGACAACARGPHECYSGLNARGGLUVALSERPHELEUASNCYSSERLEUASPASN130135140440450460470480GGCGGCTGCACGCATTACTGCCTAGAGGAGGTGGGCTGGCGGCGCTGTGLYGLYCYSTHRHISTYRCYSLEUGLUGLUVALGLYTRPARGARGCYS145150155160490500510520AGCTGTGCGCCTGGCTACAAGCTGGGGGACGACCTCCTGCAGTGTCACSERCYSALAPROGLYTYRLYSLEUGLYASPASPLEULEUGLNCYSHIS165170175530540550560570CCCGCAGTGAAGTTCCCTTGTGGGAGGCCCTGGAAGCGGATGGAGAAGPROALAVALLYSPHEPROCYSGLYARGPROTRPLYSARGMETGLULYS180185190580590600610620AAGCGCAGTCACCTGAAACGAGACACAGAAGACCAAGAAGACCAAGTALYSARGSERHISLEULYSARGASPTHRGLUASPGLNGLUASPGLNVAL195200205630640650660670GATCCGCGGCTCATTGATGGGAAGATGACCAGGCGGGGAGACAGCCCCASPPROARGLEUILEASPGLYLYSMETTHRARGARGGLYASPSERPRO210215220680690700710720TGGCAGGTGGTCCTGCTGGACTCAAAGAAGAAGCTGGCCTGCGGGGCATRPGLNVALVALLEULEUASPSERLYSLYSLYSLEUALACYSGLYALA225230235240730740750760GTGCTCATCCACCCCTCCTGGGTGCTGACAGCGGCCCACTGCATGGATVALLEUILEHISPROSERTRPVALLEUTHRALAALAHISCYSMETASP245250255
770780790800810GAGTCCAAGAAGCTCCTTGTCAGGCTTGGAGAGTATGACCTGCGGCGCGLUSERLYSLYSLEULEUVALARGLEUGLYGLUTYRASPLEUARGARG260265270820830840850860TGGGAGAAGTGGGAGCTGGACCTGGACATCAAGGAGGTCTTCGTCCACTRPGLULYSTRPGLULEUASPLEUASPILELYSGLUVALPHEVALHIS275280285870880890900910CCCAACTACAGCAAGAGCACCACCGACAATGACATCGCACTGCTGCACPROASNTYRSERLYSSERTHRTHRASPASNASPILEALALEULEUHIS290295300920930940950960CTGGCCCAGCCCGCCACCCTCTCGCAGACCATAGTGCCCATCTGCCTCLEUALAGLNPROALATHRLEUSERGLNTHRILEVALPROILECYSLEU3053103153209709809901000CCGGACAGCGGCCTTGCAGAGCGCGAGCTCAATCAGGCCGGCCAGGAGPROASPSERGLYLEUALAGLUARGGLULEUASNGLNALAGLYGLNGLU32533033510101020103010401050ACCCTCGTGACGGGCTGGGGCTACCACAGCAGCCGAGAGAAGGAGGCCTHRLEUVALTHRGLYTRPGLYTYRHISSERSERARGGLULYSGLUALA34034535010601070108010901100AAGAGAAACCGCACCGTCCTCAACTTCATCAAGATTCCCGTGGTCLYSARGASNARGTHRPHEVALLEUASNPHEILELYSILEPROVALVAL35536036511101120113011401150CCGCACAATGAGTGCAGCGAGGTCATGAGCAACATGGTGTCTGAGAACPROHISASNGLUCYSSERGLUVALMETSERASNMETVALSERGLUASN37037538011601170118011901200ATGCTGTGTGCGGGCATCCTCGGGGACCGGCAGGATGCCTGCGAGGGCMETLEUCYSALAGLYILELEUGLYASPARGGLNASPALACYSGLUGLY385390395400
1210122012301240GACAGTGGGGGGCCCATGGTCGCCTCCTTCCACGGCACCTGGTTCCTGASPSERGLYGLYPROMETVALALASERPHEHISGLYTHRTRPPHELEU40541041512501260127012801290GTGGGCCTGGTGAGCTGGGGTGAGGGCTGTGGGCTCCTTCACAACTACVALGLYLEUVALSERTRPGLYGLUGLYCYSGLYLEULEUHISASNTYR42042543013001310132013301340GGCGTTTACACCAAAGTCAGCCGCTACCTCGACTGGATCCATGGGCACGLYVALTYRTHRLYSVALSERARGTYRLEUASPTRPILEHISGLYHIS4354404451350136013701380ATCAGAGACAAGGAAGCCCCCCAGAAGAGCTGGGCACCTTAG-3′ILEARGASPLYSGLUALAPROGLNLYSSERTRPALAPRO-COOH450455460其中A為脫氧腺苷酸、G為脫氧鳥苷酸、C為脫氧胞苷酸、T為胸苷酸、ALA為丙氨酸、ARG為精氨酸、ASN為天冬酰胺、ASP為天冬氨酸、-COOH為羧基末端、CYS為半胱氨酸、GLN為谷氨酰胺、GLU為谷氨酸、GLY為甘氨酸、HIS為組氨酸、H2N-為氨基末端、ILE為異亮氨酸、LEU為亮氨酸、LYS為賴氨酸、MET為甲硫氨酸、PHE為苯丙氨酸、PRO為脯氨酸、SER為絲氨酸、THR為蘇氨酸、TRP為色氨酸、TYR為酪氨酸、VAL為纈氨酸。
上面畫出的DNA順序得自由編碼人C蛋白的人肝mRNA制備的cDNA克隆。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道，遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性質(zhì)，因此能構(gòu)建出許多編碼相同氨基酸殘基順序的不同DNA順序。因此上面畫出的初生人C蛋白的cDNA順序只是許多可能的初生人C蛋白編碼順序中的一種。在構(gòu)建cDNA克隆時(shí)，在C蛋白編碼cDNA的末端構(gòu)建了一個(gè)5′多聚G順序、一個(gè)3′多聚C順序、以及5′和3′PstI限制酶識(shí)別順序。對(duì)其中的兩個(gè)cDNA克隆進(jìn)行操作，構(gòu)建出一個(gè)DNA分子，該分子既包含初生人C蛋白的編碼順序，也包含位于編碼區(qū)5′和3′端而編碼非翻譯mRNA的若干DNA區(qū)段。將該DNA分子插入質(zhì)粒pBR322的PstI位點(diǎn)，構(gòu)建出質(zhì)粒pHC7。這樣，質(zhì)粒pHC7就包含了上述編碼順序(仍只畫出該分子的一條鏈)，還分別在初生人C蛋白編碼順序編碼鏈的5′端和3′端含有下面兩個(gè)附加順序5′-CTGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTGTCATGGCGGCAGGACGGCGAACTTGCAGTATCTCCACGACCCGCCCCTACAGGTGCCAGTGCCTCCAGA-3′和5′-CGACCCTCCCTGCAGGGCTGGGCTTTTGCATGGCAATGGATGGGACATTAAAGGGACATGTAACAAGCACACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTGCAG-3′由于DNA堿基配對(duì)具有互補(bǔ)性質(zhì)，因此雙鏈DNA分子的一條鏈的順序足以確定相反鏈的順序。質(zhì)粒pHC7可用常規(guī)方法從大腸桿菌(E.coli)K12RR1/pHC7中分離，后者是寄存在北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(NRRL，Peoria，Illinois)永久貯存培養(yǎng)物保藏中心的一個(gè)菌株，并成為該保藏中心的一部分。可從NRRL得到登記號(hào)為NRRLB-15926的大腸桿菌K12RR1/pHC7培養(yǎng)物。附圖2表示了質(zhì)粒pHC7的限制位點(diǎn)和功能圖譜。
初生C蛋白也可以用簡(jiǎn)圖表示如下。
前肽原-初生人C蛋白的氨基酸殘基1-42，編碼人C蛋白的信號(hào)肽和肽原，它對(duì)指導(dǎo)C蛋白的分泌和γ-羧基化具有重要意義。
LC-初生C蛋白的氨基酸殘基43-197，這些殘基一經(jīng)翻譯后修飾，即構(gòu)成雙鏈酶原(由單鏈酶原除去KR二肽而形成，如下所述)和活化型C蛋白的輕鏈(LC)。
KR-初生人C蛋白的氨基酸殘基198-199，據(jù)信這兩個(gè)殘基可能由一個(gè)兩步反應(yīng)而除去(根據(jù)與牛C蛋白的同源性)，第一步為切割(或者在殘基197-198之間，或者在199-200之間)，接著是羧肽酶或氨肽酶作用，形成雙鏈C蛋白。
AP-初生C蛋白的氨基酸殘基200-211，構(gòu)成活化肽，將其從C蛋白的酶原形式中除去即得到活化C蛋白。
AHC-初生C蛋白的氨基酸殘基212-461，這些殘基一經(jīng)翻譯后修飾，即構(gòu)成活性C蛋白的活化重鏈(AHC)。
HC-雙鏈形式C蛋白酶原的重鏈，它一經(jīng)翻譯后修飾，即構(gòu)成氨基酸殘基200-461，即AP和AHC。
人C蛋白酶原是一種在肝臟內(nèi)合成的絲氨酸蛋白酶前體，并存在于血液中。C蛋白要經(jīng)過翻譯后修飾才能表達(dá)完全的生物活性，修飾過程需要維生素K。由二硫鍵連接的雙鏈C蛋白酶原是由單鏈酶原經(jīng)有限蛋白水解而產(chǎn)生的。據(jù)信這種有限蛋白水解包括切割并除去氨基酸殘基198和199。該雙鏈酶原活化為活性絲氨酸蛋白酶的過程包括ARG-LEU肽鍵(殘基211和212)的蛋白水解切割。這后一個(gè)切割反應(yīng)釋放出一個(gè)構(gòu)成雙鏈酶原分子較大鏈(重鏈)氨基末端的十二肽(殘基200-211)即活化肽。C蛋白被顯著糖基化，成熟酶含有～23%的糖。C蛋白還含有許多不常見的氨基酸，包括γ-羧基谷氨酸和β-羥基天冬氨酸(赤-L-β-羥基天冬氨酸)。γ-羧基谷氨酸(gla)是由谷氨酸殘基借助肝微粒體羧化酶進(jìn)行γ-谷氨?；然a(chǎn)生的，該羧化酶需維生素K作輔因子。
人C蛋白的活化也可以用簡(jiǎn)圖表示如下。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道，簡(jiǎn)圖中所示各步驟的順序并不一定反映體內(nèi)途徑的各步驟的順序。
本發(fā)明提供重組表達(dá)新的C蛋白酶原所用的新的化合物、載體、轉(zhuǎn)化體和方法。
就本文所公開并請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的目的而言，下列術(shù)語限定如下。
Ad2LP-2型腺病毒主要后期啟動(dòng)子。
本文所述的蛋白質(zhì)或肽中的氨基酸殘基簡(jiǎn)寫如下三字母縮寫氨基酸殘基單字母縮寫PHE苯丙氨酸FLEU亮氨酸LILE異亮氨酸IMET甲硫氨酸MVAL纈氨酸VSER絲氨酸SPRO脯氨酸PTHR蘇氨酸TALA丙氨酸ATYR酪氨酸YHIS組氨酸HGLN谷氨酰胺QASN天冬酰胺NLYS賴氨酸KASP天冬氨酸DGLU谷氨酸ECYS半胱氨酸C
TRP色氨酸WARG精氨酸RGLY甘氨酸GApR-氨芐青霉素抗性表型或賦予該表型的基因。
BK-BK病毒的DNA。
CAT-氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
Enh或增強(qiáng)子-BK病毒的增強(qiáng)子。
ep或SV40ep-一個(gè)DNA片段，包含T抗原基因的SV40早期啟動(dòng)子、T抗原結(jié)合位點(diǎn)、SV40增強(qiáng)子、SV40復(fù)制起點(diǎn)。
γ-羧基化-一種反應(yīng)，它將羧基加至谷氨酸的γ-碳上。
γ-羧基化蛋白-一種蛋白，其中有某些谷氨酸殘基已經(jīng)過γ-羧基化。
IVS-編碼一個(gè)內(nèi)含子的DNA，也稱為插入順序。
MMTpro-小鼠金屬硫因-I基因的啟動(dòng)子。
初生蛋白-mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯后產(chǎn)生的、未進(jìn)行任何翻譯后修飾的多肽。但諸如谷氨酸殘基的γ-羧基化和天冬氨酸殘基的羥基化等翻譯后修飾，可以在mRNA轉(zhuǎn)錄本完全翻譯為蛋白質(zhì)之前進(jìn)行。
NeoR-新霉素抗性基因，它也可用來賦予抗生素G418抗性。
pA-編碼多聚腺苷酸化信號(hào)的DNA順序。
啟動(dòng)子-指導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)錄為RNA的DNA順序。
C蛋白活性-人C蛋白的與蛋白水解、酰胺水解、酯水解和生物活性(抗凝血或血纖維蛋白原溶解活性)有關(guān)的任何性質(zhì)。測(cè)試蛋白抗凝血活性的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的(參見Grinnelletal.，Biotechnology51189，1987)。
重組DNA克隆載體-包括染色體整合劑、自主復(fù)制質(zhì)粒和噬菌體在內(nèi)的所有試劑，但不限于此。這些試劑中包含一個(gè)DNA分子，其上可以加入或已經(jīng)加入一個(gè)或多個(gè)另外的DNA片段。
重組DNA表達(dá)載體-已摻入啟動(dòng)子的任何重組DNA克隆載體，啟動(dòng)子的定位可驅(qū)動(dòng)基因產(chǎn)物的表達(dá)。
重組DNA載體-任何重組DNA克隆載體或表達(dá)載體。
復(fù)制子-控制并允許質(zhì)?；蚱渌d體自主復(fù)制的DNA順序。
限制片段-由一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶的作用而產(chǎn)生的任何線性DNA順序。
敏感宿主細(xì)胞-在給定抗生素或其它毒性化合物存在下，如果沒有賦予該毒性化合物抗性的DNA片段就不能生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞。
TcR-四環(huán)素抗性表型或賦予該表型的基因。
轉(zhuǎn)化-將DNA引入受體宿主細(xì)胞而改變受體細(xì)胞基因型的過程。
轉(zhuǎn)化體-已經(jīng)過轉(zhuǎn)化的受體宿主細(xì)胞。
翻譯激活順序-使mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯成肽或多肽的任何DNA順序，包括編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的DNA順序和翻譯起始密碼子，如5′-ATG-3′。
酶原-蛋白水解酶的無酶活性的前體。這里所用的C蛋白酶原一詞，指分泌的、無活性形式的C蛋白，而不管是單鏈的還是雙鏈的。


圖1由4部分組成，圖示質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建方案，pLPC是用于構(gòu)建起始質(zhì)粒pLAPC的原料。
圖1A圖示的是由BK病毒和質(zhì)粒pdBPV-MMTneo構(gòu)建質(zhì)粒pBKneo1。
圖1B圖示的是由腺病毒2和質(zhì)粒pSV2cat構(gòu)建質(zhì)粒pLPcat。
圖1C圖示的是由質(zhì)粒pBKneo1和質(zhì)粒pLPcat構(gòu)建質(zhì)粒pBLcat。
圖1D圖示的是由質(zhì)粒pBLcat和質(zhì)粒pL133構(gòu)建質(zhì)粒pLPC。
圖2圖示的是質(zhì)粒pL133的構(gòu)建，質(zhì)粒pL133是用于構(gòu)建質(zhì)粒pLPC的原料。
本發(fā)明涉及為表達(dá)新的人C蛋白酶原編碼的DNA化合物。幾種生產(chǎn)天然人C蛋白酶原和初生人C蛋白的方法已有描述(見歐洲專利公告215548和191606)。這些先有技術(shù)方法提供了與人血液中存在的酶原形式相同的人C蛋白酶原的表達(dá)方法。這些方法所產(chǎn)生的C蛋白酶原必須用某些物質(zhì)處理(無論是在體內(nèi)還是體外)才能得到活化的C蛋白，這些物質(zhì)有α-凝血酶、胰蛋白酶或凝血酶與凝血調(diào)節(jié)蛋白的混合物。此外，由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的與人血液中天然存在的人C蛋白酶原形式相同的人C蛋白酶原，將只能在體內(nèi)由有凝血酶-凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物參與的天然活化途徑來激活。天然人C蛋白酶原僅由凝血酶便能被激活，但是這一激活反應(yīng)需要在無Ca2+以及很高水平的凝血酶和/或C蛋白酶原的條件下才能進(jìn)行，所以它不是重要的體內(nèi)產(chǎn)生活化C蛋白的途徑。
本發(fā)明提供的人C蛋白酶原在體內(nèi)僅由凝血酶便可以具有臨床意義的速度被激活。此外，這些酶原形式與天然人C蛋白酶原相比，非常容易受凝血酶/凝血調(diào)節(jié)蛋白的激活。本發(fā)明還提供用于重組表達(dá)這些新的人C蛋白酶原的DNA化合物、重組DNA表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和方法。產(chǎn)生這些人C蛋白酶原形式的方法包括(A)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞，所述載體包括(ⅰ)編碼一個(gè)氨基酸殘基順序的DNA順序，所述氨基酸殘基順序從氨基末端到羧基末端含有a)一個(gè)羧基化的分泌蛋白的信號(hào)肽和肽原;
b)人C蛋白輕鏈;
c)一個(gè)選自LYS-ARG、ARG-LYS、LYS-LYS和ARG-ARG的二肽;
d)氨基酸殘基順序ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL R1R2ARG LEU ILE R3GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH
其中R1選自PHE、GLY、TYR和TRP，R2選自VAL和PRO，R3選自ASP和ASN，ARG為精氨酸、ASN為天冬酰胺、ASP為天冬氨酸、-COOH為羧基末端、CYS為半胱氨酸、GLN為谷氨酰胺、GLU為谷氨酸、GLY為甘氨酸、HIS為組氨酸、ILE為異亮氨酸、LEU為亮氨酸、LYS為賴氨酸、MET為甲硫氨酸、PHE為苯丙氨酸、PRO為脯氨酸、SER為絲氨酸、THR為蘇氨酸、TRP為色氨酸、TYR為酪氨酸、VAL為纈氨酸;
(ⅱ)一個(gè)啟動(dòng)子，其定位能驅(qū)動(dòng)所述DNA順序表達(dá);
(B)在允許所述DNA順序表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟(A)中轉(zhuǎn)化的所述宿主細(xì)胞。下面將更完整地描述該方法及該方法所用的化合物。
本發(fā)明還提供適用于這些新的人C蛋白酶原的生產(chǎn)方法的DNA化合物。這些新化合物都編碼一個(gè)前肽原，該前肽原含有一個(gè)指導(dǎo)分泌的信號(hào)肽和一個(gè)來自γ-羧基化(通過維生素K依賴性羧化酶的作用)蛋白的肽原。這些肽原順序是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的(參見例如Suttieetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.84634-637，1987)。信號(hào)肽編碼順序和肽原編碼順序最好都得自一種γ-羧基化蛋白的前肽原的氨基酸殘基順序，這樣也便于構(gòu)建。這類γ-羧基化蛋白的例子有因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原、S蛋白、Z蛋白、C蛋白，但不限于此。編碼人C蛋白前肽原的DNA順序最適用于本發(fā)明的載體。
本發(fā)明的DNA化合物還包含人C蛋白輕鏈編碼順序，其定位緊接前肽原編碼順序下游并與該順序同處翻譯讀碼內(nèi)。人C蛋白輕鏈含有初生C蛋白的氨基酸殘基43至197(包括兩頭)，如前面背景技術(shù)部分所示。維生素K依賴性血漿蛋白質(zhì)的氨基末端部分，如C蛋白輕鏈的氨基末端部分，負(fù)責(zé)這些蛋白質(zhì)的鈣結(jié)合活性。這些血漿蛋白如因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原和S蛋白的鈣結(jié)合區(qū)可以互換(見歐洲專利公告第0，215，548A1號(hào)，第12和13頁)，都相當(dāng)于人C蛋白輕鏈的鈣結(jié)合區(qū)。
本發(fā)明的DNA化合物還包含二肽LYS-ARG(KR)的編碼順序，其定位緊接輕鏈編碼順序下游并與該順序同處翻譯讀碼內(nèi)。在初生蛋白中有一個(gè)象LYS-ARG這樣的由二個(gè)堿性氨基酸組成的二肽，其位置在輕鏈的羧基末端。LYS-ARG二肽在所表達(dá)的蛋白質(zhì)中的取向與本發(fā)明的目的無關(guān)。諸如LYS-LYS或ARG-ARG等由二個(gè)堿性氨基酸組成的二肽對(duì)本發(fā)明的目的而言與LYS-ARG二肽等價(jià)。但是，就本發(fā)明的目的而言，最好是二肽LYS-ARG，因?yàn)樘烊蝗薈蛋白中就是這種二肽。
緊接LYS-ARG二肽密碼子下游的是活化肽編碼順序。在本發(fā)明的化合物中，活化肽編碼順序(及相應(yīng)的氨基酸順序)的變化主要與這些新酶原對(duì)凝血酶敏感性的增加有關(guān)。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的酶原與下面描述的天然人C蛋白酶原完全不同。在天然人C蛋白中，活化肽為200201202203204205206207208209210211ASP-THR-GLU-ASP-GLN-GLU-ASP-GLN-VAL-ASP-PRO-ARG，其中的編號(hào)指初生人C蛋白中氨基酸殘基的位置。根據(jù)本發(fā)明的公開，如果將209位的ASP變成PHE、GLY、TYR或TRP殘基，將導(dǎo)致相應(yīng)的酶原形式不但對(duì)凝血酶-凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物切割具有更高的敏感性，而且對(duì)僅由凝血酶切割也具有更高的敏感性。
連同209位替換的其它氨基酸替換，也可增強(qiáng)所得酶原對(duì)凝血酶的敏感性。短語“所得酶原”用來說明盡管這些替換是參照初生人C蛋白中氨基酸的位置而描述的，但必須先分泌初生人C蛋白(導(dǎo)致除去氨基酸殘基1-42)才能得到酶原形式。因此，除了上述209位的四種上替換之一外，以纈氨酸殘基代替初生人C蛋白210位的脯氨酸殘基(在活化肽中)也產(chǎn)生本發(fā)明的一個(gè)新酶原。除了上述209位上的四種替換之一外，無論上述210位替換與否，以天冬酰胺殘基替換初生人C蛋白214位上的天冬氨酸殘基(在活化重鏈中)，也產(chǎn)生本發(fā)明的一個(gè)新酶原。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選新人C蛋白酶原得自具有如下氨基酸殘基順序的初生人C蛋白分子的分泌和加工。
H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER LEU ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL
R1R2ARG LEU ILE R3GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中R1為PHE、GLY、TYR、或TRP;R2為PRO或VAL;R3為ASP或ASN。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，許多DNA化合物都可編碼上面所畫的多肽。因此，下面及所附實(shí)例所描述的本發(fā)明優(yōu)選DNA化合物、載體和轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建方案只是說明性的，并不限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的新編碼順序可容易地從已利用位點(diǎn)特異性誘變?nèi)笔Я薃P編碼區(qū)的初生人C蛋白的編碼順序開始進(jìn)行構(gòu)建。該編碼順序的結(jié)構(gòu)圖示如下
如所附的實(shí)例中所述，將該編碼順序插入重組DNA表達(dá)載體中，所得載體定名為質(zhì)粒pLAPC。質(zhì)粒pLAPC用作構(gòu)建本發(fā)明說明性載體的有用原料，該載體可驅(qū)動(dòng)本發(fā)明新人C蛋白酶原的高水平重組表達(dá)。實(shí)例1描述了由起始質(zhì)粒pHC7構(gòu)建質(zhì)粒pLAPC的方案。質(zhì)粒pHC7以大腸桿菌K12RR1/pHC7的形式得自北方地區(qū)研究中心(NRRL，Peoria，IL61604)，登記號(hào)為NRRLB-15926。
質(zhì)粒pLPC-167G為本發(fā)明說明性表達(dá)載體，其中初生人C蛋白209位天冬氨酸的密碼子已變?yōu)楦拾彼崦艽a子。實(shí)例3詳細(xì)描述了質(zhì)粒pLPC-167G的構(gòu)建方案。該構(gòu)建方案基本包括C蛋白編碼順序的位點(diǎn)特異性誘變。從質(zhì)粒pHC7中分離出含有活化肽編碼DNA的C蛋白編碼順序的一部分，插入噬菌體M13mp18中，然后通過位點(diǎn)特異性誘變進(jìn)行改變。將誘變后的編碼順序克隆到真核克隆載體中，得到的質(zhì)粒定名為pLPC-167G，它與質(zhì)粒pLAPC相同，只是插入了一個(gè)活化肽編碼順序，在該活化肽編碼順序中，209位天冬氨酸的密碼子已被甘氨酸密碼子替換。
質(zhì)粒pLPC-167F也是本發(fā)明的一個(gè)說明性表達(dá)載體，其中初生人C蛋白209位天冬氨酸的密碼子已變成苯丙氨酸密碼子。實(shí)例4詳細(xì)描述了質(zhì)粒pLPC-167F的構(gòu)建方案。除了構(gòu)建中所用的誘變寡核苷酸不同外，質(zhì)粒pLPC-167F的構(gòu)建方案基本上與質(zhì)粒pLPC-167G的構(gòu)建方案相同。
所附實(shí)例中描述的位點(diǎn)特異性誘變的方法只是說明性的，可用來產(chǎn)生本發(fā)明的其它化合物和載體。如上所述，本發(fā)明的這些其它化合物包括由本發(fā)明的DNA編碼順序產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯后產(chǎn)生的初生蛋白。本發(fā)明化合物還包括本發(fā)明初生蛋白分泌后產(chǎn)生的酶原。此外，如果本發(fā)明化合物中214位天冬氨酸殘基已變?yōu)樘於０窔埢?，則酶原活化產(chǎn)生的活化C蛋白衍生物也是本發(fā)明的化合物。因此，本發(fā)明的化合物包括DNA編碼順序、驅(qū)動(dòng)這些順序表達(dá)的表達(dá)載體、由這些編碼順序產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯產(chǎn)生的初生蛋白、由這些初生蛋白分泌產(chǎn)生的酶原、及某些酶原的活化衍生物。
在本發(fā)明的優(yōu)選編碼順序(及優(yōu)選初生蛋白、酶原和活化分子)中，編碼順序編碼一個(gè)與初生人C蛋白相同的氨基酸殘基順序，只是在209、210、214位上有替換。下列表1畫出了這些替換。
表1本發(fā)明優(yōu)選編碼順序中209、210和214位所編碼的氨基酸殘基化合物2092102141PHEPROASP2PHEPROASN3PHEVALASP4PHEVALASN5GLYPROASP6GLYPROASN7GLYVALASP8GLYVALASN9TYRPROASP10TYRPROASN11TYRVALASP12TYRVALASN13TRPPROASP14TRPPROASN15TRPVALASP16TRPVALASN本發(fā)明的DNA化合物還可以化學(xué)合成，或者通過合并限制片段來合成，或者結(jié)合使用本領(lǐng)域內(nèi)已知技術(shù)來合成。DNA合成儀也可以加以利用，可用來構(gòu)建本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的說明性載體質(zhì)粒pLPC-167G和pLPC-167F含有BK增強(qiáng)子，其定位能夠刺激本發(fā)明的編碼順序由腺病毒主要晚期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道，本領(lǐng)域內(nèi)已知有大量真核啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和表達(dá)載體，它們都可用于本發(fā)明的方法。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員還知道，真核表達(dá)載體能夠在沒有增強(qiáng)子成分的情況下起作用。本發(fā)明的關(guān)鍵方面并不在于特定的增強(qiáng)子(如果有的話)或用于驅(qū)動(dòng)C蛋白酶原表達(dá)的啟動(dòng)子，而在于由該順序產(chǎn)生的新編碼順序和相應(yīng)的蛋白。
然而，載體中的各成分如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和可選擇標(biāo)記的選擇，能夠?qū)φ婧怂拗骷?xì)胞所產(chǎn)生的蛋白的最終水平產(chǎn)生很強(qiáng)的影響。歐洲專利公告第0245949號(hào)公開了許多天然C蛋白酶原表達(dá)載體，這些載體利用BK增強(qiáng)子來刺激其定位能夠驅(qū)動(dòng)初生人C蛋白表達(dá)的真核啟動(dòng)子。如果將這些載體轉(zhuǎn)化入那些同時(shí)還表達(dá)大DNA病毒的直接早期基因產(chǎn)物(如腺病毒的E1A基因產(chǎn)物)的真核細(xì)胞中，這些載體尤其能夠驅(qū)動(dòng)高水平表達(dá)。從本文所公開的說明性載體pLPC-167G和pLPC-167F明顯可見，BK增強(qiáng)子-E1A基因產(chǎn)物表達(dá)方法特別適用于本發(fā)明的載體。
本發(fā)明的應(yīng)用不限于特定的真核宿主細(xì)胞。從諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，MD20852)這樣的保藏機(jī)構(gòu)可得到多種真核宿主細(xì)胞，它們都適用于本發(fā)明的載體。特定的宿主細(xì)胞的選擇在某種程度上取決于用來驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的C蛋白編碼DNA化合物表達(dá)的特定表達(dá)載體。但是，由于本發(fā)明的初生人C蛋白和初生人C蛋白衍生物要經(jīng)過實(shí)質(zhì)性的翻譯后修飾，所以某些宿主細(xì)胞更適用于本發(fā)明的載體。Grinnell等人(Grinnelletal.，Bio/Technology51189，1987)公開了用腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞特別適用于重組生產(chǎn)γ-羧基化蛋白如人C蛋白。293細(xì)胞系就是這樣一種用腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系，它可從ATCC得到，登記號(hào)為ATCCCRL1573。293細(xì)胞系還適用于本發(fā)明的載體。
但是，在腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中生產(chǎn)γ-羧基化蛋白如人C蛋白酶原的優(yōu)點(diǎn)不只是腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞才有。實(shí)際上，腺病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對(duì)生產(chǎn)γ-羧基化的人C蛋白來說一般是不常用的宿主。這類細(xì)胞中特別優(yōu)選的細(xì)胞系是AV12-664(以下簡(jiǎn)稱“AV12”)細(xì)胞系，它可從ATCC得到，登記號(hào)為ATCCCRL9595。AV12細(xì)胞系的建立，是在金黃倉鼠的頸背注射人腺病毒12，然后從所產(chǎn)生的腫瘤中分離細(xì)胞。下面的實(shí)例5描述了用說明性載體pLPC-167G和pLPC-167F轉(zhuǎn)化293細(xì)胞系和AV12細(xì)胞系的方法。
本發(fā)明的載體能夠轉(zhuǎn)化入多種真核宿主細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，并在其中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的那些不具有可選擇標(biāo)記(用來分離鑒定穩(wěn)定的真核轉(zhuǎn)化體)的載體，不僅可用于瞬時(shí)測(cè)定(transientassay)之目的，而且可用于共轉(zhuǎn)化之目的。共轉(zhuǎn)化是美國(guó)專利第4，399，216號(hào)所公開的一種方法。本發(fā)明的載體還含有促使載體在大腸桿菌中復(fù)制的順序，因?yàn)樵诖竽c桿菌中制備質(zhì)粒DNA通常比在其它宿主生物中更有效。
本發(fā)明載體上所含的人C蛋白編碼順序在那些其中的特定啟動(dòng)子與結(jié)構(gòu)基因的功能相關(guān)的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。適用于本發(fā)明的有代表性的宿主細(xì)胞列于表Ⅱ，其中加了適當(dāng)?shù)脑u(píng)注。
如表Ⅱ所表明，許多哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞具有對(duì)本發(fā)明初生蛋白上的信號(hào)肽進(jìn)行識(shí)別和正確加工所必需的細(xì)胞機(jī)構(gòu)，因而可進(jìn)行翻譯后修飾，如糖基化、γ-羧基化和β-羥基化，正如對(duì)血漿中存在的人C蛋白所觀察的那樣。下面討論的很不相同的各種載體都可用來轉(zhuǎn)化這樣一些真核宿主細(xì)胞，但下面列舉的具體載體決不是要限制本發(fā)明的范圍。
pSV2型載體含有SV40基因組的一些片段，這些片段構(gòu)成一個(gè)明確的真核轉(zhuǎn)錄單位-啟動(dòng)子(ep)、插入順序(IVS)和多聚腺苷酸化(pA)位點(diǎn)。在沒有SV40T抗原的情況下，質(zhì)粒pSV2型載體可通過整合入宿主細(xì)胞染色體DNA而轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和其它真核宿主細(xì)胞。已構(gòu)建出多種質(zhì)粒pSV2型載體(見EukaryoticViralVectors，ed.Gluzman，ColdSpringHarborLabora-tories，ColdSpringHarbor，NewYork，1982)，如質(zhì)粒pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、pSV2-hyg、pSV2-β-球蛋白，其中用SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)插入基因的轉(zhuǎn)錄。這些載體適用于本發(fā)明的編碼順序，并可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville，Maryland)或北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(NRRL，Peoria，Illinois)得到。
質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC37146)含有處在SV40早期啟動(dòng)子控制下的鼠類二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。已知dhfr基因在適當(dāng)?shù)臈l件下可在宿主染色體中擴(kuò)增或復(fù)制。這一擴(kuò)增(綜述見Schimke，Cell37705-713，1984)能夠連帶緊接dhfr基因的DNA順序，如本發(fā)明的初生人C蛋白編碼順序，因此可利用擴(kuò)增來提高本發(fā)明的C蛋白酶原的產(chǎn)量。
為在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和其它真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的初生C蛋白和C蛋白酶原而構(gòu)建的質(zhì)粒，能夠利用很多種不同的啟動(dòng)子。本發(fā)明決不僅限于應(yīng)用本文所列舉的特定真核啟動(dòng)子。諸如SV40晚期啟動(dòng)子或Bucher等人(Bucheretal.，Nuc.AcidsRes.14(24)1009，1986)所公開的真核啟動(dòng)子，或真核基因啟動(dòng)子，都易于分離和修飾而用在為在真核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)人C蛋白酶原而設(shè)計(jì)的重組DNA表達(dá)載體上。上述真核基因的例子有，雌激素誘導(dǎo)性雞卵清蛋白基因、干擾素基因、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因、胸苷激酶基因、主要早期和晚期腺病毒基因。還可以應(yīng)用串聯(lián)的真核啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的編碼順序的表達(dá)。此外，已知大量的還原病毒能感染范圍廣泛的真核宿主細(xì)胞。還原病毒DNA中長(zhǎng)段的末端重復(fù)順序常常編碼啟動(dòng)子活性，因此可用來驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的編碼順序的表達(dá)。
質(zhì)粒pRSVcat(ATCC37152)含有勞氏肉瘤病毒(RSV)長(zhǎng)段末端重復(fù)順序的若干部分，已知RSV是一種感染雞和其它宿主細(xì)胞的病毒。RSV長(zhǎng)段末端重復(fù)順序可在質(zhì)粒pRSVcat的～0.76kbNdeⅠ-HindⅢ限制片段上分離得到。RSV長(zhǎng)段末端重復(fù)順序中的啟動(dòng)子(Gormanetal.，P.N.A.S.796777，1982)適用于本發(fā)明的載體。質(zhì)粒pMSVi(NRRLB-15929)含有鼠類肉瘤病毒(MSV)的長(zhǎng)段末端重復(fù)順序，已知MSV是一種感染小鼠和其它宿主細(xì)胞的病毒。這些重復(fù)順序適于用作本發(fā)明載體中的啟動(dòng)子。小鼠金屬硫因(MMT)啟動(dòng)子也已被充分鑒定為可用于真核宿主細(xì)胞，因而適用于本發(fā)明的載體。MMT啟動(dòng)子存在于15kb質(zhì)粒pdBPV-MMTneo(ATCC37224)中，該質(zhì)粒可用作構(gòu)建本發(fā)明其它質(zhì)粒的原料。
有可能對(duì)本發(fā)明的說明性DNA順序和質(zhì)粒進(jìn)行多種修飾和改變。例如，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性允許替換整個(gè)多肽編碼區(qū)及翻譯終止信號(hào)中的核苷酸，而不改變所編碼的多肽編碼順序。這樣一些可替換的順序可以從人C蛋白已知的氨基酸順序或DNA順序推出，并可利用下列常規(guī)合成法或位點(diǎn)特異性誘變法進(jìn)行構(gòu)建。合成法可基本按照Itakura等人和Crea等人的方法進(jìn)行(Itakuraetal.，Science1981056，1977;Creaetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA755765，1978)。因此，本發(fā)明決不限于具體列舉的DNA順序和質(zhì)粒。
將本發(fā)明載體轉(zhuǎn)化入真核宿主細(xì)胞后，能夠靠可選擇表型來選擇轉(zhuǎn)化體。賦予這個(gè)可選擇表型的可選擇標(biāo)記，既可以存在于表達(dá)載體上，也可以存在于與該表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的另一個(gè)載體上。一旦選擇出轉(zhuǎn)化體，就需要鑒定哪些轉(zhuǎn)化體最高水平地表達(dá)表達(dá)載體上所編碼的所需蛋白。這種鑒定在進(jìn)行共轉(zhuǎn)化操作后尤其重要，因?yàn)楣厕D(zhuǎn)化產(chǎn)生許多僅含有可選擇標(biāo)記質(zhì)粒因而不含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。下面的實(shí)例6中描述了一個(gè)方案，該方案不僅用于鑒定表達(dá)和分泌所需蛋白的細(xì)胞，而且用于定量測(cè)定該細(xì)胞所分泌的蛋白相對(duì)于用本方法檢測(cè)的其它細(xì)胞的量。借助該方案還可分離分泌最高水平所需蛋白的存活細(xì)胞。
活化C蛋白具有顯著的抗血栓形成特性，表現(xiàn)在可阻止靜脈血栓擴(kuò)展、阻止動(dòng)脈血栓形成、阻止由革蘭氏陰性膿毒癥、內(nèi)毒素血癥及播散血管內(nèi)凝血造成的死亡和器官衰竭。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，注入天然C蛋白酶原對(duì)伴有休克的革蘭氏陰性敗血癥和播散血管內(nèi)凝血(DIC)沒有治療效果。這些陰性結(jié)果說明在這種形式的廣泛傳播的微血管血栓形成中，雖然產(chǎn)生大量的凝血酶，但凝血調(diào)節(jié)蛋白的量不足以與凝血酶形成復(fù)合物而激活注入的酶原。
與所有活化絲氨酸蛋白酶一樣，活化C蛋白的主要缺點(diǎn)是半壽期(T 1/2 )比酶原前體短。已確認(rèn)，在狗體內(nèi)T 1/2 為11分鐘，在猴體內(nèi)T 1/2 為22-26分鐘。而天然C蛋白酶原在人體內(nèi)的T 1/2 估計(jì)為6小時(shí)。至于活化絲氨酸蛋白酶(包括活化C蛋白)的生物半壽期為什么比其酶原短，其原因很復(fù)雜，涉及細(xì)胞和體液兩種機(jī)制?；罨z氨酸蛋白酶還可與血漿中正常存在的絲氨酸蛋白酶抑制劑形成復(fù)合物?；罨疌蛋白(APC)可與上述APC抑制劑及α-2巨球蛋白形成復(fù)合物。無活性酶原，包括本發(fā)明的C蛋白酶原，不與絲氨酸蛋白酶抑制劑反應(yīng)。
本發(fā)明C蛋白酶原的優(yōu)點(diǎn)在于，它們比天然C蛋白酶原更容易被凝血酶激活，因?yàn)樵贑a2+存在下，凝血酶不必與凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合就能激活這些酶原。因此，這些C蛋白酶原在施用后，可在產(chǎn)生血管內(nèi)凝血酶的位點(diǎn)被激活，即在正在形成血管內(nèi)血栓的任何位點(diǎn)被激活。因此，這些重組C蛋白酶原可用作前藥，并將只在產(chǎn)生凝血酶的位點(diǎn)被激活。由于這些凝血酶敏感性酶原能以酶原形式施用，所以它們不會(huì)與C蛋白抑制劑復(fù)合，并且其生物半壽期將與天然C蛋白酶原相同。
本發(fā)明的重組C蛋白酶原可用于預(yù)防和治療涉及血管內(nèi)凝血的各種獲得性疾病，包括深度靜脈血栓形成、肺栓塞、外周動(dòng)脈血栓形成、起源于心臟或外周動(dòng)脈的栓子、急性心肌梗塞、血栓發(fā)作、播散血管內(nèi)凝血。這些C蛋白衍生物還可有效地用于治療大批患有表現(xiàn)為陣發(fā)性深度靜脈血栓形成的雜合性C蛋白缺乏的患者和患有紫癜暴發(fā)的純合性C蛋白缺乏的患者。
實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)表明，常規(guī)抗凝血?jiǎng)?，特別是華法令，可用來治療侵入性腫瘤并起到阻止或減少這些惡性腫瘤的長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)移性損傷的作用。此外，現(xiàn)已確認(rèn)，一些發(fā)炎刺激物如內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素1，可減少內(nèi)皮細(xì)胞表面的凝血調(diào)節(jié)蛋白，這可能會(huì)觸發(fā)微血管和大血管血栓形成。在這些臨床狀況中，本發(fā)明的重組C蛋白酶原是常規(guī)抗凝血?jiǎng)┑睦硐胩娲铩?br> 在臨床治療中本發(fā)明C蛋白酶原的劑量大大少于活化C蛋白，因?yàn)槠銽 1/2 較長(zhǎng)。在純合型C蛋白缺乏癥中，本發(fā)明C蛋白酶原的劑量將在每次治療約5mg-100mg的范圍內(nèi)，在雜合型C蛋白缺乏癥中劑量將在每次治療約2.5mg-50mg的范圍內(nèi)。
活化C蛋白顯著的治療作用在于阻止深度靜脈血栓形成和肺栓塞，這些疾病目前用低劑量的肝素來治療。對(duì)有很大危險(xiǎn)的患者，尤其是正進(jìn)行外科手術(shù)的患者，用于阻止深度靜脈血栓形成的重組活化C蛋白的劑量范圍為1-10mg/天。而本發(fā)明的C蛋白酶原的劑量范圍將為約0.25-5mg/天。這些酶原的優(yōu)點(diǎn)還在于它們可以做快速濃注而非持續(xù)靜脈注射。由于活化C蛋白的T 1/2 短，因此該蛋白必須用持續(xù)靜脈注射來給予。對(duì)于已確認(rèn)的、有客觀描述的深度靜脈血栓形成和/或肺栓塞，活化C蛋白的劑量范圍為負(fù)荷劑量1-10mg，以后每天持續(xù)注射3-30mg。而本發(fā)明的C蛋白酶原可以以不超過約12mg/24小時(shí)的劑量通過反復(fù)大劑量注射而施用。
對(duì)于治療外周動(dòng)脈血栓，上述給藥方案同樣適用。注射本發(fā)明C蛋白酶原造成出血并發(fā)癥的可能性較低。因此，這些酶原可在血栓切除術(shù)和栓子切除術(shù)這些外科手術(shù)中和手術(shù)后代替肝素，這些手術(shù)在處理急性動(dòng)脈阻塞時(shí)對(duì)挽救缺血肢體免于截肢常常是必須的。由于這些酶原的半壽期比活化C蛋白長(zhǎng)，并且比較容易服用，因此比活化C蛋白更適于治療起源于心臟的動(dòng)脈栓子。長(zhǎng)期服用這些酶原對(duì)預(yù)防心原性栓子具有顯著效果，劑量與用于治療已發(fā)生的深度靜脈血栓形成-肺栓塞的劑量差不多。
本發(fā)明的C蛋白酶原同樣可用于治療起源于外周動(dòng)脈(最常見的是頸動(dòng)脈)血栓的栓子，這些栓子用目前所用的藥物得不到滿意的治療或預(yù)防，這些藥物包括能夠抑制血小板功能的藥物、口服抗凝血?jiǎng)┗蚱浣M合。正象對(duì)于心原性栓子那樣，這些酶原可以同樣的方式長(zhǎng)期服用，其主要功效是預(yù)防起源于頸動(dòng)脈血栓并導(dǎo)致栓子發(fā)作的栓子。
本發(fā)明的C蛋白酶原也適用于血栓形成發(fā)作。目前，這種發(fā)作一般不是用常規(guī)抗凝血?jiǎng)﹣碇委?。用肝素或口服抗凝血?jiǎng)┲委煱l(fā)作雖然偶爾也是有益的，但卻帶來梗塞腦區(qū)內(nèi)出血從而加重伴隨發(fā)作而產(chǎn)生的神經(jīng)缺陷的高度風(fēng)險(xiǎn)。由于本發(fā)明的酶原引起出血并發(fā)癥的可能性小并具有選擇性，因此可給予發(fā)作患者，而且可能有益于防止閉塞動(dòng)脈血栓的局部擴(kuò)散，從而減輕由發(fā)作造成的神經(jīng)缺陷。與活化C蛋白比起來，可有效治療發(fā)作的酶原量可以較低，但劑量將隨每位患者發(fā)作的本質(zhì)和嚴(yán)重程度而不同。
本發(fā)明的酶原也能用于治療急性心肌梗塞，因?yàn)樗鼈円坏┗罨淳哂醒w維蛋白溶酶原水解特性。這些酶原可以在心肌梗塞的急性期與組織血纖維蛋白溶酶原激活劑一起使用。閉塞冠狀血栓溶解后，可再服用幾天酶原以預(yù)防急性心肌梗塞。如果在這種情況下服用活化C蛋白，則在開始進(jìn)行血纖維蛋白溶酶原激活劑治療時(shí)給予患者1-10mg的負(fù)荷劑量，然后以每天3-30mg的劑量連續(xù)注入活化C蛋白。相反，本發(fā)明的酶原可以以不超過約12mg/天的劑量通過每天3-4次的快速濃注來給予。
活化C蛋白可用于治療播散血管內(nèi)凝血。在大量臨床試驗(yàn)中，曾用肝素和口服抗凝血?jiǎng)┙o予播散血管內(nèi)凝血(DIC)患者，但效果不理想。在播散血管內(nèi)凝血中，活化C蛋白和本發(fā)明的酶原較之常規(guī)抗凝血?jiǎng)┚哂型怀龅膬?yōu)點(diǎn)。如上面所提到的，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)確認(rèn)，C蛋白酶原不能有效地預(yù)防由革蘭氏陰性敗血癥和播散血管內(nèi)凝血造成的死亡和器官損傷。相反，本發(fā)明的C蛋白酶原由于對(duì)凝血酶的激活作用很敏感，因此能有效地治療播散血管內(nèi)凝血。估計(jì)用活化C蛋白治療DIC所需的劑量大致為100mg/天，以反復(fù)快速濃注方式給藥時(shí)，用于治療DIC的本發(fā)明酶原形式的劑量不應(yīng)超過約30mg/天。
常規(guī)抗凝血藥特別是華法令，可用于治療侵入性惡性腫瘤。許多腫瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生一些觸發(fā)凝血系統(tǒng)激活而導(dǎo)致局部血纖維蛋白沉積的物質(zhì)。這些血纖維蛋白沉積物起到了“巢穴”的作用，腫瘤細(xì)胞能夠在其中分裂而形成轉(zhuǎn)移性損傷。但是，服用華法令或其他常規(guī)抗凝血?jiǎng)r(shí)，不可能結(jié)合使用更劇烈而有效形式的化學(xué)治療法，因?yàn)檫@類治療法總是使血小板計(jì)數(shù)陡降，而且，如果血小板減少再加以華法令治療則使患者有難以承受的嚴(yán)重出血并發(fā)癥的高度危險(xiǎn)。本發(fā)明的C蛋白衍生物和活化C蛋白一樣，由于比常規(guī)抗凝血?jiǎng)└哂羞x擇性，而且治療指數(shù)遠(yuǎn)比肝素或口服抗凝血?jiǎng)楦撸虼丝梢暂^為安全地給予血小板減少癥患者，這樣便有可能用有效而劇烈的化學(xué)治療法與本發(fā)明的C蛋白酶原結(jié)合對(duì)侵入性腫瘤患者進(jìn)行治療。治療所遵循的給藥方案，應(yīng)與深度靜脈血栓形成-肺栓塞所用的給藥方案差不多。
本發(fā)明的酶原及其活化形式可以按已知方法進(jìn)行配制而制成可藥用的組合物，從而使本發(fā)明的人C蛋白酶原或活化C蛋白與可藥用的載體結(jié)合而形成混合物。合適的載體及其制劑，包括其它人蛋白如人血清清蛋白，見于文獻(xiàn)中(Remington′sPharmaceuticalSciences16thed.，1980，MackPublishingCo.，ed.Osoletal.，此文獻(xiàn)列為本文參考文獻(xiàn))。這些組合物將含有有效量的C蛋白酶原或其活化形式，以及適量的載體，以便制出適于患者有效服藥的可藥用的組合物。C蛋白組合物可以非腸道給藥，也可以用能確保它以有效形式釋放入血流中的其它方法給藥。
還應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明的酶原可用來在體外制備活化C蛋白。雖然直接在真核細(xì)胞中生產(chǎn)活化C蛋白的重組方法是已知的，但這些方法要求活化C蛋白長(zhǎng)時(shí)間保留在培養(yǎng)基中。此外，必須從培養(yǎng)基中純化出活化C蛋白，而這是一個(gè)昂貴的多步驟過程。因?yàn)榛罨疌蛋白較不穩(wěn)定，所以這些直接表達(dá)方法只能產(chǎn)生少量的活化C蛋白。相反，本發(fā)明的酶原能夠僅由凝血酶而激活，甚至在Ca2+存在下就能被激活，這使它比已知的活化C蛋白生產(chǎn)方法具有顯著優(yōu)點(diǎn)。
下列實(shí)例說明本發(fā)明的方法并描述本發(fā)明具有代表性的化合物、載體和轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建方案，但并不限制本發(fā)明。
實(shí)例1質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建本實(shí)例提供了一個(gè)構(gòu)建質(zhì)粒pLAPC的詳細(xì)方案。簡(jiǎn)單地說，實(shí)例1A描述了從質(zhì)粒pHC7中分離編碼包括活化肽在內(nèi)的一部分C蛋白分子的DNA片段。實(shí)例1B描述了將該DNA片段克隆到噬菌體M13mp18中，并通過位點(diǎn)特異性誘變從所得重組噬菌體中除去編碼活化肽的DNA。實(shí)例1C描述了質(zhì)粒pLAPC構(gòu)建的最后步驟，更具體地說是分離誘變片段并將其與得自質(zhì)粒pLPC的兩個(gè)片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pLAPC。質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建方案在實(shí)例2中描述。
A.含有人C蛋白活化肽編碼順序的DNA片段的分離質(zhì)粒pHC7含有初生人C蛋白的完整編碼順序。在1升含有15μg/ml四環(huán)素的L液體培養(yǎng)基(10g蛋白胨、10gNaCl、5g酵母抽提物)中接種大腸桿菌K12RR1/pHC7(NRRLB-15926)培養(yǎng)物，并在一空氣培養(yǎng)搖床中37℃下培養(yǎng)，直到在590nm處的光密度(O.D.)為～1個(gè)光吸收單位，這時(shí)，向培養(yǎng)物中加入150mg氯霉素。繼續(xù)培養(yǎng)約16小時(shí)。氯霉素的加入抑制了蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而抑制了細(xì)胞分裂，但允許繼續(xù)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制。
將培養(yǎng)物在SorvallGSA轉(zhuǎn)子(DuPontCo.，Instrum-entProducts，BiomedicalDivision，Newtown，CN06470)中于4℃下以6000rpm離心5分鐘。棄去所得上清液，用40mlTES緩沖液(10mMTris-HCl，pH＝7.5;10mMNaCl;1mMEDTA)洗滌細(xì)胞沉淀，然后再離心沉淀。再棄去上清液，細(xì)胞沉淀在干冰-乙醇浴中冰凍，然后融化。融化的細(xì)胞沉淀在10ml25%蔗糖/50mMEDTA溶液中再懸浮。向溶液中加入約1ml5mg/ml的溶菌酶溶液;3ml0.25MEDTA，pH＝8.0;100μl10mg/mlRNA酶A，然后在冰上保溫15分鐘。向溶菌酶處理過的細(xì)胞中加入3ml溶胞溶液(其制備是混合3ml10%曲拉通-X100;75ml0.25MEDTA，pH＝8.0;15ml1MTris-HCl，pH＝8.0;7ml水)，混合后，所得溶液再在冰上保溫15分鐘。溶解的細(xì)胞在干冰-乙醇浴中冰凍，然后融化。
在SW27轉(zhuǎn)子(Beckman，7360N.LincolnAve.，Lin-colnwood，IL60646)中以25，000rpm離心40分鐘，從溶液中除去細(xì)胞碎片。向溶液中加入約30.44gCsCl及～1ml5mg/ml溴化乙錠溶液，然后將溶液的體積調(diào)到40ml。將溶液輕輕倒入Vti50超離心管(Beckman)。將管密封，然后在Vti50轉(zhuǎn)子中以42，000rpm離心～16小時(shí)。分離用紫外光顯現(xiàn)的所得質(zhì)粒帶，然后放入ti75離心管及轉(zhuǎn)子(Beckman)中，以55，000rpm離心16小時(shí)。利用含有0.761g/mlCsCl的TES作任何必要的體積調(diào)節(jié)。再次分離質(zhì)粒帶，用鹽飽和的異丙醇提取溴化乙錠，最后用TES緩沖液稀釋3倍。然后向溶液中加入2倍體積的乙醇，所得混合物在-20℃下保溫過夜。在SS34轉(zhuǎn)子(DuPontCo.)中以10，000rpm將溶液離心15分鐘，沉淀出質(zhì)粒DNA。
將由該方法得到的～1mg質(zhì)粒pHC7DNA懸浮于1mlTE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.6，0.1mMEDTA)中，于-20℃下貯存。質(zhì)粒pHC7的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖2。
將約7μg(7μl)質(zhì)粒pHC7 DNA加入25μl 10X Core緩沖液TM(Core緩沖液TM，BRL，為500mM Tris-HCl，pH＝8.0;500mM NaCl;100mM MgCl2)、198μl H2O、和12μl限制酶SstⅠ(～60單位，Bethesda Research Laboratories(BRL)，Gaithersburg，MD20877;除非特別說明，這些實(shí)例中提到的所有的酶均由BRL或New England Biolabs(NEB)，Beverly，MA 01915-9990提供，并基本根據(jù)制造商的建議使用)，及8μl(80單位)限制酶SalⅠ。反應(yīng)混合物在37℃下保溫4小時(shí);然后，先用苯酚，再用氯仿提取用SstⅠ-SalⅠ消化過的質(zhì)粒pHC7 DNA，通過乙醇沉淀及離心進(jìn)行收集，最后懸浮于15μl TE/10緩沖液(10mM Tris堿，pH＝7.6，0.1mMEDTA)中。
然后，反應(yīng)混合物在Tris-乙酸緩沖液中，在～0.6%低膠凝點(diǎn)瓊脂糖(FMCCorporation，MarineColloidsDiv-ision，Rockland，Maine04841)凝膠上以～130V的電壓和～65mA的電流電泳2-3小時(shí)。凝膠在稀溴化乙錠的溶液中染色，用長(zhǎng)波紫外光進(jìn)行觀察，從凝膠上切下構(gòu)成～0.7kbSstⅠ-SalⅠ限制片段的DNA條帶的小條。由小條的重量和密度確定小條的體積，向含有小條的試管中加入4倍體積的含有0.25MNaCl的TE。然后在72℃下保溫熔化小條。得到約0.5μg質(zhì)粒pHC7的～0.7kbSstⅠ-SalⅠ限制片段，體積約為400μl。根據(jù)廠商的建議，使DNA溶液通過NACS-prepac
柱(BRL)而使DNA得到進(jìn)一步的純化，純化的片段再懸浮于15μl去離子水中。
B.通過位點(diǎn)特異性誘變構(gòu)建重組噬菌體并除去活化肽編碼DNA基本根據(jù)實(shí)例1A所述的方法，用限制酶SstⅠ和SalⅠ消化約1μg噬菌體M13mp18(得自NewEnglandBiolabs)RF(復(fù)制形式)DNA。通過用苯酚再用氯仿提取反應(yīng)混合物而終止反應(yīng);然后沉淀出DNA，離心收集，并再懸浮于約15μlTE緩沖液中。在～0.6%低膠凝點(diǎn)瓊脂糖凝膠上分離兩個(gè)消化得到的片段，從凝膠上切下較大的片段，如實(shí)例1A所述進(jìn)行純化。
將約0.1μg(7μl H2O中)質(zhì)粒pHC7的～0.7kb SstⅠ-SalⅠ限制片段加入5μl SstⅠ-SalⅠ消化的M13mp18 RF DNA及2μl 10 X連接酶緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH＝7.8;60mM MgCl2;0.2M二硫蘇糖醇(DTT))、2μl 1mg/ml BSA、1μl 25mM ATP、1μl(～400單位)T4DNA連接酶(NEB)、2μl H2O中。連接反應(yīng)物在25℃下保溫過夜，連接后的DNA構(gòu)成所需的雙鏈形式噬菌體M13mp18-HE1 DNA。
用約300μl大腸桿菌K12 JM101(New England Biolabs)的過夜培養(yǎng)物接種30ml 2X TY液體培養(yǎng)基(TY液體培養(yǎng)基為10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、5g/L酵母提取液)，所得培養(yǎng)物在37℃下通氣培養(yǎng)，直到O.D.600為～0.5。將培養(yǎng)物在冰水浴中冷卻10分鐘，離心收集，再懸浮于15ml冷的10mM NaCl中。再離心收集細(xì)胞，并再懸浮于15ml冷的30mM CaCl2中。將細(xì)胞在冰上放置20分鐘，離心收集。將細(xì)胞再懸浮于1.5ml冷的30mM CaCl2中;取出200μl細(xì)胞樣品，加到9μl上述制備的連接DNA中，在冰上保溫約30分鐘。然后，在42℃下培養(yǎng)細(xì)胞-DNA混合物2分鐘，將其加入3ml表面瓊脂(top agar)(TY液體培養(yǎng)基加上在45℃下保持熔融的0.5%瓊脂)，該瓊脂還含有50μl 2%X-Gal(“X-Gal”為5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)、50μl 100mM IPTG(“IPTG”為異丙基β-D-吡喃硫代半乳糖苷)、100μl對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌K12 JM101。然后，用細(xì)胞-表面瓊脂混合物鋪TY-瓊脂板，瓊脂板在37℃下培養(yǎng)過夜。
第二天早上，分別用4個(gè)清晰的噬菌斑接種2ml 2X TY液體培養(yǎng)基，所得培養(yǎng)物在37℃下通氣培養(yǎng)6小時(shí)。然后，離心培養(yǎng)物，將500μl所得上清液(細(xì)胞沉淀用于制備噬菌體DNA而用于限制酶分析)加到500μl大腸桿菌K12 JM101培養(yǎng)物(O.D.550＝0.5)和50ml 2X TY液體培養(yǎng)基中。這些培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)過夜。利用實(shí)例1A所述方法但縮小規(guī)模，從細(xì)胞沉淀中分離噬菌體RF DNA，與實(shí)例1A不同的是培養(yǎng)基中不含抗生素，超離心步驟由苯酚和氯仿提取代替。含有噬菌體M13mp18-HE1 DNA的轉(zhuǎn)化體由其噬菌體DNA的限制酶分析來鑒定。
將過夜培養(yǎng)物離心，每5ml上清液中加入約1ml由20%聚乙二醇(PEG)6000和2.5mMNaCl組成的溶液，然后在室溫下培養(yǎng)10分鐘。將混合物以10，000rpm離心10分鐘，所得沉淀含有單鏈?zhǔn)删wM13mp18-HE1DNA，將其再懸浮于500μlTES緩沖液(20mMTris-HCl，pH＝7.5;0.1MEDTA;10mMNaCl)中。該DNA溶液先用氯仿提取，然后用TE飽和的苯酚提取兩次，再用氯仿提取。然后利用NaOAc和乙醇沉淀出單鏈DNA，離心，沉淀用70%乙醇洗滌并干燥，然后將所得沉淀溶于80μl H2O中。該噬菌體制劑用于在下一步即位點(diǎn)特異性誘變中除去活化肽編碼DNA。
在自動(dòng)DNA合成儀上合成用于誘變除去活化肽編碼DNA的單鏈DNA片段，所合成的DNA片段如下5′-GCGCAGTCACCTGAAACGACTCATTGATGGGAAGATGA-3′在37℃下，將約30微微摩爾(1μl)上述單鏈DNA片段(“誘變寡核苷酸”)和1.5μl(7.5微微摩爾)M13通用引物(由Boehringer-Mannheim Biochemical(BMB)，7941 Castleway Drive，P.O.Box 50816，Indianapolis，IN 46250出售)分別用5單位T4多核苷酸激酶(Pharmacia，P-L Biochemicals，Inc.，800 Centennial Avenue，Piscataway，NJ 08854)在含有1μl 1mMATP的10μl 1X激酶緩沖液(100mM Tris-HCl，pH＝8.3;100mM DDT;100mM MgCl2)中處理30分鐘，接著在65℃保溫10分鐘，然后冰凍。激酶處理后的DNA用于下述誘變步驟。
在誘變操作的第一步，使誘變寡核苷酸和M13通用引物與單鏈?zhǔn)删wDNA退火。進(jìn)行退火反應(yīng)時(shí)，將300毫微克(0.5μl)單鏈?zhǔn)删wM13mp18-HE1加到1微微摩爾(1.2μl)通用引物、1微微摩爾(0.3μl)誘變寡核苷酸、2μl10X退火緩沖液(100mMTris-HCl，pH7.5;1mMEDTA;500mMNaCl)，及16μl水中，混合物在80℃下保溫2分鐘，然后在50℃保溫5分鐘，最后使混合物冷卻到室溫。
一旦寡核苷酸退火，噬菌體DNA便在DNA聚合酶作用下由引物延伸而形成雙鏈DNA。進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，在退火的DNA混合物中加入3μl 10X延伸緩沖液(500mM Tris-HCl，pH＝8;1mM EDTA;120mM MgCl2);3μl 10X連接酶緩沖液;1.5μl 0.2mM DTT;3μl dNTP混合物(每種dNTP 0.5mM);1.2μl 25mM ATP;0.5μl Klenow酶(5U/μl，BMB);1μl T4DNA連接酶(400U，NEB);19.8μl H2O。延伸反應(yīng)物在室溫下保溫30分鐘，然后在37℃下保溫4小時(shí)，然后在4℃下過夜。
用苯酚-氯仿提取并用乙醇和乙酸鈉(NaOAc)沉淀DNA使反應(yīng)停止。離心收集DNA，并再懸浮于40μl S1緩沖液(0.3M NaCl;0.03M NaOAc，pH＝4.5;0.3mM ZnCl2)中。據(jù)報(bào)道下述S1處理對(duì)位點(diǎn)特異性誘變操作很有益。但本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)S1處理無顯著長(zhǎng)處，所以在本文隨后的實(shí)例所述的構(gòu)建方案中完全省去了S1處理。
將DNA溶液等分到兩個(gè)試管中，并在其中一個(gè)試管中加入100單位(BMB)S1核酸酶。S1反應(yīng)物在室溫下保溫5分鐘，用TE-飽和的苯酚-氯仿(50∶50)提取反應(yīng)混合物終止反應(yīng)。用NaOAc和乙醇從反應(yīng)混合物及非S1處理樣品中沉淀出DNA。
將DNA沉淀再懸浮于60μl H2O中，并根據(jù)構(gòu)建噬菌體M13mp 18-HE1時(shí)所用的方法用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12 JM101，只是不向平板中加IPTG或X-Gal。利用誘變寡核苷酸的一小部分5′-TGAAACGACTCATTGA-3′(經(jīng)放射標(biāo)記)作探針以噬菌斑和斑點(diǎn)吸印雜交選擇突變體。挑出幾個(gè)呈現(xiàn)陽性雜交的噬菌斑，分別接種到2ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大腸桿菌K12 JM101的培養(yǎng)物中。這些培養(yǎng)物在37℃下通氣培養(yǎng)約6小時(shí)，然后如上面對(duì)噬菌體M13mp18-HE1所述，用這些培養(yǎng)物來制備單鏈DNA。
利用雙脫氧測(cè)序法(J.H.Smith，1980，MethodsinEnzymology65560-580)測(cè)定單鏈DNA的順序。借助所期望的突變鑒定出幾個(gè)噬菌體。缺失活化肽編碼順序的噬菌體定名為噬菌體M13mp18-HE2。噬菌體M13mp18-HE2中的突變使其大小比天然編碼順序減少了36bp，可利用這一差異來簡(jiǎn)化含突變區(qū)DNA的鑒定。制備噬菌體M13mp18-HE2的RF形式用于隨后的構(gòu)建。
C.由噬菌體M13mp18-HE2和質(zhì)粒pLPC最后構(gòu)建質(zhì)粒pLAPC基本上按照實(shí)例1A的方法，將RF型噬菌體M13mp18-HE2的誘變的SstⅠ-SalⅠ(～0.7kb)限制片段從噬菌體上切下并分離。然而，如下所述，～100μl含有～0.1μg所需～0.7kb片段的溶液在1∶2稀釋的低膠凝點(diǎn)瓊脂糖中未通過任何純化柱，而直接用于進(jìn)行連接反應(yīng)而產(chǎn)生質(zhì)粒pLAPC。
將以下三個(gè)DNA片段連接在一起形成質(zhì)粒pLAPC上述噬菌體M13mp18-HE2的～0.7kbSstⅠ-SalⅠ限制片段，及來自質(zhì)粒pLPC的兩個(gè)DNA片段。實(shí)例2描述了質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建方案。質(zhì)粒pLPC的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1。由于質(zhì)粒pLPC上的SalⅠ、SstⅠ和EcoRⅠ限制酶識(shí)別位點(diǎn)定位的原因，制備所需EcoRⅠ-SalⅠ和EcoRⅠ-SstⅠ限制片段時(shí)必須分別進(jìn)行消化。
為了制備EcoRⅠ-SstⅠ片段，將在25μl水中的約40μg質(zhì)粒pLPC加入10μl 1mg/ml BSA、10μl 10X Core緩沖液TM(BRL)、5μl限制酶EcoRⅠ(50U，BRL)、5μl限制酶SstⅠ(25U，BRL)、45μlH2O，所得反應(yīng)物在37℃下保溫1.5小時(shí)。通過乙醇沉淀及離心收集SstⅠ-EcoRⅠ消化的質(zhì)粒pLPCDNA。將SstⅠ-EcoRⅠ消化的DNA再懸浮于水中，然后上到～0.6%低膠凝點(diǎn)瓊脂糖凝膠上，電泳分離DNA片段。
為了制備EcoRⅠ-SalⅠ片段，先用限制酶ApaⅠ處理在9μl水中的約15μg質(zhì)粒pLPC，以消除由于相同大小的限制片段造成的污染。在質(zhì)粒pLPC DNA溶液中加入約10μl 10X ApaⅠ緩沖液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.4;60mM MgCl2;60mM DTT)、10μl 1mg/ml BSA、69μl H2O、2μl限制酶ApaⅠ(50U，NEB)，所得反應(yīng)物在37℃下保溫1小時(shí)。然后在ApaⅠ消化的質(zhì)粒pLPC DNA溶液中加入15μl 2M NaCl、69μl H2O、8μl限制酶SalⅠ(NEB)、8μl限制酶EcoRⅠ(NEB)，所得反應(yīng)物在37℃下保溫1小時(shí)。先用苯酚，然后用氯仿提取ApaⅠ-SalⅠ-EcoRⅠ消化的質(zhì)粒pLPC DNA，然后通過用乙醇沉淀和離心收集，最后再懸浮于25μl H2O中。然后，將DNA上到～0.6%低膠凝點(diǎn)瓊脂糖凝膠上，電泳分離DNA片段。
如實(shí)例1A所述，從凝膠上切下～3.76kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段和～2.0kbEcoRⅠ-SstⅠ限制片段，加入等體積10mMTris-HCl，pH＝7.6使凝膠片熔化。于是，在～200μl10mMTris-HCl，pH＝7.6中得到約2μg質(zhì)粒pLPC的～3.76kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段，該緩沖液中還含有熔化的瓊脂糖。在另一份200μl含瓊脂糖的10mMTris-HCl，pH＝7.6的緩沖液中得到約2μg質(zhì)粒pLPC的～2.0kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段。
分別將約12.5μl兩個(gè)純化的限制片段(質(zhì)粒pLPC的～3.76kbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段和～2.0kbEcoRⅠ-SstⅠ限制片段)的溶液加入20μl噬菌體M13mp18-HE2的～0.7kb SstⅠ-SalⅠ限制片段、10μl 1mg/ml BSA、10μl 10mM ATP、10μl 10X連接酶緩沖液、2μl(～800U，NEB)T4DNA連接酶、23μl H2O，所得連接反應(yīng)物在15℃下保溫過夜。連接后的DNA構(gòu)成了所要的質(zhì)粒pLAPC。質(zhì)粒pLAPC與質(zhì)粒pLPC(圖1)的不同僅在于缺失了活化肽編碼DNA。
為了檢查質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，并得到大量的質(zhì)粒pLAPC以進(jìn)行真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及進(jìn)一步的構(gòu)建，用含有質(zhì)粒pLAPC的連接后的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12RV308(得自NRRL，登記號(hào)NRRLB-15624)。
將50ml大腸桿菌K12 RV308在L液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物培養(yǎng)到在590nm處的光密度(O.D.)為～0.6。將培養(yǎng)物在冰上冷卻10分鐘，離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀再懸浮于25ml冷的10mM NaCl中。再通過離心沉淀細(xì)胞，將沉淀再懸浮于25ml冷的30mM CaCl2中，在冰上保溫30分鐘。再離心收集細(xì)胞，并再懸浮于2.5ml冷的30mM CaCl2中。
將200μl該細(xì)胞懸浮液與含有質(zhì)粒pLAPC的連接后的DNA混合，并在冰上保溫60分鐘。然后將混合物在42℃下培養(yǎng)2分鐘，接著在室溫下培養(yǎng)10分鐘。將約10ml2XTY液體培養(yǎng)基加到細(xì)胞-DNA混合物中，然后將細(xì)胞放在125ml培養(yǎng)瓶中在空氣培養(yǎng)搖床上37℃下培養(yǎng)2小時(shí)。
將細(xì)胞混合物的等分試樣鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的TY-瓊脂(TY液體培養(yǎng)基加15g/l瓊脂)平板上，然后將平板在37℃下培養(yǎng)過夜。大腸桿菌K12RV308/pLAPC轉(zhuǎn)化體通過其質(zhì)粒DNA的限制酶分析來證實(shí)?；靖鶕?jù)實(shí)例1A的方法，從大腸桿菌K12RV308/pLAPC轉(zhuǎn)化體得到質(zhì)粒DNA，與實(shí)例1A不同的是用50μg/ml氨芐青霉素作選擇性試劑而不是用四環(huán)素。
實(shí)例2質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建在質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建中，以質(zhì)粒pLPC作中間載體(參見實(shí)例1C)。質(zhì)粒pLPC包括一個(gè)編碼BK病毒增強(qiáng)子和腺病毒2晚期啟動(dòng)子的DNA片段，該啟動(dòng)子的定位能夠驅(qū)動(dòng)人C蛋白的表達(dá)。質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建方案實(shí)質(zhì)上導(dǎo)致了質(zhì)粒pLPC上的人C蛋白編碼順序由另一個(gè)已除去活化肽編碼DNA的人C蛋白編碼順序所代替。
質(zhì)粒pLPC和pLAPC上的BK增強(qiáng)子/腺病毒后期啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控順序的活性由于大DNA病毒的直接早期基因產(chǎn)物即腺病毒的E1A基因產(chǎn)物的存在而受到極大刺激。
下面敘述質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建方案。附圖1圖示了質(zhì)粒pLPC的整個(gè)構(gòu)建方案。簡(jiǎn)言之，實(shí)例2A描述了BK病毒DNA的分離，由該DNA可得到BK增強(qiáng)子。實(shí)例2B敘述了質(zhì)粒pBKneo1的構(gòu)建方案，質(zhì)粒pBKneo1是由BK增強(qiáng)子插入質(zhì)粒pdBPV-MMTneo而得到的質(zhì)粒。實(shí)例2C敘述了質(zhì)粒pLPcat的構(gòu)建方案，質(zhì)粒pLPcat是由腺病毒2后期啟動(dòng)子插入質(zhì)粒pSV2cat而得到的質(zhì)粒。實(shí)例2D敘述了質(zhì)粒pBLcat的構(gòu)建方案，質(zhì)粒pBLcat含有能刺激腺病毒后期啟動(dòng)子活性的BK增強(qiáng)子。實(shí)例2E描述了C蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒pL133的構(gòu)建方案，該方案以原料質(zhì)粒pHC7開始，進(jìn)行中間質(zhì)粒pSV2-HPC8的構(gòu)建，最后構(gòu)建出質(zhì)粒pL133。最后，實(shí)例2F敘述了質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建方案，該質(zhì)粒含有插入到質(zhì)粒pL133中而驅(qū)動(dòng)人C蛋白表達(dá)的質(zhì)粒pBLcat的BK增強(qiáng)子/腺病毒后期啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控順序。
A.BK病毒DNA的制備BK病毒得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號(hào)為ATCC VR-837。所提供的病毒為凍干形式，將其再懸浮于Hank氏平衡鹽(Gibco，3175 Staley Road，Grand Island，NY 14072)中，使其效價(jià)約為105噬菌斑形成單位(pfu)/ml。制備BK病毒DNA所選擇的宿主為初生人胚腎(PHEK)細(xì)胞，該細(xì)胞可從Flow Labora-tories，Inc.，7655 Old Springhouse Road，MoLean，VA 22101得到，目錄號(hào)0-100，也可從M.A.Bioproducts得到，目錄號(hào)70-151。
用約5個(gè)含有約106個(gè)PHEK細(xì)胞的匯合單層的75mm2聚苯乙烯瓶來制備病毒。向每個(gè)瓶中加入約1ml效價(jià)為105pfu/ml的BK病毒，在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，然后加入新鮮培養(yǎng)基(Dulbecco氏修改的Eagle培養(yǎng)基，Gibco，Grand Island，NY 14072，添加10%胎牛血清，將感染的細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)10-14天或直到觀察到病毒的完全的致細(xì)胞病變效應(yīng)。不同細(xì)胞系和不同病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)不同，但這種效應(yīng)一般都包括細(xì)胞的集攏、結(jié)塊、從培養(yǎng)皿上脫落。
通過3次凍-融循環(huán)，將病毒從細(xì)胞中釋放出來，以5000xg離心除去細(xì)胞碎片。取1升上清液，加入100gPEG-6000，在4℃下保溫該溶液24小時(shí)，以5000xg離心20分鐘沉淀并收集病毒。將沉淀以1/100的原始體積溶于0.1XSSC緩沖液中(1XSSC＝0.15MNaCl和0.015M檸檬酸鈉，pH＝7)。在試管中將病毒懸浮液鋪到15ml飽和KBr溶液上，以75，000xg離心3小時(shí)。離心后，KBr溶液中有兩條明顯的條帶。較低的條帶含有完整的病毒顆粒，收集該條帶，并在Sephadex
G-50柱(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO 63178)上脫鹽，利用TE(10mM Tris-HCl，pH＝7.8，1mM EDTA)作洗脫緩沖液。
在從柱中得到的純化病毒顆粒的溶液中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至濃度為1%;加入鏈霉蛋白酶
(Sigma)至濃度為100μg/ml，將溶液在37℃下保溫2小時(shí)。然后向溶液中加入氯化銫至密度為1.56g/ml，向溶液中加入溴化乙錠至終濃度為100μg/ml。將溶液在Sorvall 865轉(zhuǎn)子(Dupont Co.，Newton，CT 06470)或相似的垂直轉(zhuǎn)子中以260，000xg離心24小時(shí)。離心后，分離病毒DNA條帶并用100mM Tris-HCl，pH＝7.8飽和的異戊醇提取5次。然后將BK病毒DNA溶液對(duì)TE緩沖液透析，直到DNA的260nm/280nm光吸收比在1.75到1.90之間。將NaCl濃度調(diào)到0.15M，加入2倍體積的乙醇，在-70℃下保溫溶液至少2小時(shí)，以12，000xg離心溶液10分鐘沉淀出DNA。將所得的BK病毒DNA沉淀以1mg/ml的濃度懸浮于TE緩沖液中。BK病毒的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1。
B.質(zhì)粒pBKneo1的構(gòu)建大腸桿菌K12HB101/pdBPV-MMTneo細(xì)胞以冰凍干燥形式得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號(hào)為ATCC37224。將冰凍干燥的細(xì)胞鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂板上，在37℃下培養(yǎng)得到單菌落分離菌。
用一個(gè)大腸桿菌K12HB101/pdBPV-MMTneo菌落接種1升含有50μg/ml氨芐青霉素的L液體培養(yǎng)基(每升含10g胰蛋白胨、10g NaCl、5g酵母提取液)，在空氣搖床上37℃下培養(yǎng)，直到O.D.590為～1個(gè)光吸收單位，這時(shí)，向培養(yǎng)物中加入150mg氯霉素。繼續(xù)培養(yǎng)約16小時(shí)。氯霉素的加入抑制了蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而抑制了細(xì)胞分裂，但允許質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制。接著，基本根據(jù)實(shí)例1A所述的方法由該培養(yǎng)物制備質(zhì)粒pdBPV-MMTneo DNA。
將由該方法得到的～1mg質(zhì)粒pdBPV-MMTneoDNA懸浮于1mlTE緩沖液中，并貯存于-20℃下。如果需要大量純度很高的質(zhì)粒DNA則一般利用實(shí)例1A所述的質(zhì)粒分離方法。該方法經(jīng)修飾可快速得到較少量的、不很純的DNA(這在篩選具有特定質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體時(shí)是需要的)，即僅用約5ml培養(yǎng)細(xì)胞，在適當(dāng)減量的溶胞緩沖液中溶解細(xì)胞，用苯酚和氯仿提取代替離心步驟。
如上所述制備的約5μg(5μl)質(zhì)粒pdBPV-MMTneo DNA和5μg(5μl)BK病毒DNA分別在含有2μl 10X BamHI緩沖液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA)、1μl(～10單位)限制酶BamHⅠ、7μl H2O的溶液中在37℃下消化2小時(shí)。用等體積苯酚提取一次，用氯仿提取兩次而終止反應(yīng)。然后將每個(gè)BamHⅠ消化的DNA沉淀，離心收集，并再懸浮于5μl H2O中。
向BamHⅠ消化的質(zhì)粒pdBPV-MMTneo(1μl)和BamHⅠ消化的BK病毒DNA(1μl)的混合液中加入約1μl 10X連接酶緩沖液。向DNA混合液中加入1μl(～5單位)T4DNA連接酶和6μl水，所得的反應(yīng)物在16℃下保溫過夜。連接后的DNA構(gòu)成了所需的質(zhì)粒pBKneo1和pBKneo2，它們的區(qū)別僅在于BK病毒DNA的取向不同。質(zhì)粒pBKneo1的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1。
大腸桿菌K12 HB101細(xì)胞可以冰凍干燥形式從北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室得到，登記號(hào)為NRRL B-15626。將50ml L液體培養(yǎng)基中的大腸桿菌K12 HB101培養(yǎng)物培養(yǎng)至在650nm處的光密度(O.D.650)約為0.4個(gè)光吸收單位。將培養(yǎng)物在冰上冷卻10分鐘，離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀再懸浮于25ml冷的100mM MgCl2中，并在冰上保溫25分鐘。再次離心沉降細(xì)胞，沉淀再懸浮于2.5ml冷的100mM CaCl2中，并在冰上保溫30分鐘。保溫后，細(xì)胞便可吸收轉(zhuǎn)化DNA。
將200μl該細(xì)胞懸浮液與上面制備的連接后的DNA混合，并在冰上保溫30分鐘。保溫結(jié)束后，將細(xì)胞在42℃水浴中放置2分鐘，然后再在冰上放置10分鐘。離心收集細(xì)胞，再懸浮于1mlL液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂平板上。大腸桿菌K12HB101/pBKneo1和大腸桿菌K12/pBKneo2轉(zhuǎn)化體由其氨芐青霉素抗性表型及其質(zhì)粒DNA的限制酶分析而鑒定。質(zhì)粒pBKneo1的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1A。
C.構(gòu)建用于構(gòu)建質(zhì)粒pBLcat的中間質(zhì)粒pLPcat腺病毒2(Ad2)的病毒顆粒DNA為大小約為35.94Kb的雙鏈線性分子。在Ad2基因組的～0.32KbAccⅠ-PvuⅡ限制片段上可分離出Ad2后期啟動(dòng)子，這個(gè)～0.32Kb的限制片段相應(yīng)于位于Ad2基因組5755位和6071位核苷酸之間的順序。為了分離所需的～0.32KbAccⅠ-PvuⅡ限制片段，先用限制酶BalI消化Ad2DNA，并分離出包括～0.32KbAccⅠ-PvuⅡ限制片段整個(gè)順序的～2.4KbBalⅠ限制片段。然后用AccⅠ和PvuⅡ消化～2.4KbBalⅠ限制片段，得到所需的片段。
將約50μg Ad2 DNA(得自BRL)溶于80μl H2O和10μl 10X BalⅠ緩沖液(100mM Tris-HCl，pH＝7.6;120mM MgCl2;100mM DTT;1mg/ml BSA)中。向Ad2 DNA溶液中加入約10μl(～20單位)限制酶BalⅠ，所得反應(yīng)物在37℃下保溫4小時(shí)。
將BalⅠ消化的DNA加到瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，直到限制片段完全分離。用溴化乙錠稀溶液(0.5μg/ml)染色凝膠并將染色后的凝膠置于長(zhǎng)波紫外(UV)光下觀察電泳得到的DNA條帶。以下敘述一種從瓊脂糖中分離DNA的方法。在凝膠上所需片段的前沿切一小口，在每個(gè)小口中放一小片NA-45DEAE膜(SchleicherandSchuell，Keene，NH03431)。進(jìn)一步電泳后，DNA便非共價(jià)地結(jié)合到DEAE膜上。在所需片段結(jié)合到DEAE膜上之后，取出膜，用低鹽緩沖液(100mMKCl;0.1mMEDTA;20mMTris-HCl，pH＝8)沖洗。接著，將膜放在小試管中浸在高鹽緩沖液(1MNaCl;0.1mMEDTA;20mMTris-HCl，pH＝8)中，然后在65℃下保溫1小時(shí)，從DEAE膜上除去DNA。65℃保溫后，收集保溫緩沖液并用高鹽緩沖液沖洗膜。合并高鹽沖洗溶液和高鹽保溫緩沖液。
調(diào)整高鹽DNA溶液的體積，使NaCl濃度為0.25M，然后向溶液中加入3倍體積的冷無水乙醇。將所得的溶液混合并在-70℃下放置10-20分鐘。然后以15，000rpm離心溶液15分鐘。再進(jìn)行一次沉淀除去殘余的鹽，然后用乙醇沖洗DNA沉淀，干燥后再懸浮于20μlTE緩沖液中，構(gòu)成約3μg所需的Ad2的限制片段。將所得的純化片段溶于10μlTE緩沖液中。
向Ad2的～2.4Kb BalⅠ限制片段溶液中加入約6μl H2O和2μl 10X AccⅠ緩沖液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.5;60mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)。向DNA溶液中加入約2μl(～10單位)限制酶AccⅠ后，反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。AccⅠ消化后，利用乙醇沉淀收集DNA，并再懸浮于16μl H2O和2μl 10X PvuⅡ緩沖液(600mMNaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.5;60mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)中。向DNA溶液中加入約2μl(約10單位)限制酶PvuⅡ后，將反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。
將AccⅠ-PvuⅡ消化的Ad2的～2.4Kb BalⅠ限制片段加到～6%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，直到含有Ad2后期啟動(dòng)子的～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段與其它消化產(chǎn)物分開為止。凝膠用溴化乙錠染色，并利用紫外光進(jìn)行觀察，從凝膠上切下含有～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段的膠條，切碎，在～250μl提取緩沖液(500mM NH4OAc;10mM MgOAc;1mM EDTA;0.1% SDS)中室溫下浸泡過夜。第二天早晨，將混合物離心，棄去沉淀。用乙醇沉淀上清液中的DNA，加入約2μg tRNA以保證所需片段完全沉淀出來。得到約0.2μg～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段，并懸浮于7μl H2O中。
為了將AccⅠ-PvuⅡ限制片段轉(zhuǎn)化成AccⅠ-BclⅠ限制片段，將BclⅠ連接子連到～0.32KbAccⅠ-PvuⅡ限制片段上。由于BclⅠ連接子是平末端，所以連接子只附著于限制片段的PvuⅡ末端。用下列方法用激酶處理并制備用于連接的BclⅠ連接子(NewEng-landBiolabs)，該連接子具有下列順序
將4μl連接子(～2μg)溶于20.15μl H2O和5μl 10X激酶緩沖液(500mM Tris-HCl，pH＝7.6，100mM MgCl2)，在90℃下保溫2分鐘，然后冷卻到室溫。向混合物中加入5μl γ-32P-ATP(～20μCi)、2.5μl 1M DTT、5μl多核苷酸激酶(～10單位)，然后在37℃下保溫30分鐘。然后加入3.35μl 0.01M ATP和5μl激酶，反應(yīng)物繼續(xù)在37℃下再保溫30分鐘。借助放射性ATP測(cè)定連接子是否已與靶DNA連接。
向～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段的溶液中加入約0.25μg(0.5μl)經(jīng)激酶處理的BclⅠ連接子，然后向DNA溶液中加入1μl(～1000單位)T4DNA連接酶和1μl 10X連接酶緩沖液，將所得反應(yīng)物在16℃下保溫過夜。BclⅠ連接子只能連到AccⅠ-PvuⅡ限制片段的PvuⅡ末端上。后來的DNA順序分析揭示出有4個(gè)BclⅠ連接子連到了AccⅠ-PvuⅡ限制片段的PvuⅡ末端上。通過BclⅠ消化和再連接可除去這些多余的BclⅠ連接子。但是，這些連接子不干擾含有這些多余連接子的載體發(fā)揮正常功能，因此未除去這些多余的BclⅠ連接子。
大腸桿菌K12HB101/pSV2cat細(xì)胞以冰凍干燥的形式得自ATCC，登記號(hào)為ATCC37155?；靖鶕?jù)實(shí)例1A的方法從細(xì)胞中分離出質(zhì)粒pSV2catDNA，與實(shí)例1A不同的是用50μg/ml氨芐青霉素代替四環(huán)素。質(zhì)粒pSV2cat的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1B。得到約1mg質(zhì)粒pSV2cat DNA并溶于1ml TE緩沖液中。將約3μg(3μl)質(zhì)粒pSV2cat DNA加到2μl 10X AccⅠ緩沖液和16μl H2O中，然后再向pSV2cat DNA溶液中加入3μl(約9單位)限制酶AccⅠ，所得的反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。然后加入3μl 10X StuⅠ緩沖液(1.0M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝8.0;100mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)、5μl H2O、約2μl(約10單位)限制酶StuⅠ，從而用限制酶StuⅠ消化經(jīng)AccⅠ消化的質(zhì)粒pSV2cat DNA。將所得的反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。反應(yīng)物用苯酚提取一次，用氯仿提取兩次而終止反應(yīng)。得到約0.5μg所需片段并溶于20μl TE緩沖液中。
將約4μl AccⅠ-StuⅠ消化的質(zhì)粒pSV2cat與約7μl Ad2的～0.32Kb AccⅠ-PvuⅡ(連有BclⅠ連接子)限制片段混合，加入3μl 10X連接酶緩沖液、15μl H2O和2μl(約1000單位)T4DNA連接酶，然后將連接反應(yīng)物在16℃下保溫過夜。連接后的DNA構(gòu)成了所需的質(zhì)粒pLPcat，該質(zhì)粒含有Ad2后期啟動(dòng)子，其定位可驅(qū)動(dòng)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。質(zhì)粒pLPcat的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1B。
基本根據(jù)實(shí)例2B的方法用連接后的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12HB101細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪在含有50μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂平板上，利用質(zhì)粒DNA的限制酶分析來鑒定大腸桿菌K12HB101/pLPcat轉(zhuǎn)化體?；靖鶕?jù)實(shí)例1A所述的質(zhì)粒分離方法，從轉(zhuǎn)化體中分離出質(zhì)粒pLPcatDNA，用于隨后的構(gòu)建步驟，與實(shí)例1A不同的是用氨芐青霉素代替四環(huán)素作選擇性試劑。
D.質(zhì)粒pBLcat的構(gòu)建將50μl含約88μg質(zhì)粒pBKneo1 DNA的TE緩沖液加到7.5μl 10X AccⅠ緩沖液、30μl H2O和15μl(約75單位)限制酶AccⅠ中，將所得反應(yīng)液在37℃下保溫2小時(shí)。將AccⅠ消化的質(zhì)粒pBKneo1 DNA加到瓊脂糖凝膠上，使含有BK增強(qiáng)子的～1.4Kb片段與其它消化產(chǎn)物分離。然后從凝膠上分離出1.4Kb AccⅠ限制片段并純化。將約5μg片段再懸浮于5μl 10X PvuⅡ緩沖液、45μl H2O和5μl(約25單位)限制酶PvuⅡ中，所得反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。然后分離出PvuⅡ消化的DNA，純化后準(zhǔn)備進(jìn)行連接。得到約2μg所需的～1.28Kb AccⅠ-PvuⅡ片段，并溶于5μl TE緩沖液中。
將約1μg質(zhì)粒pLPcat DNA溶于5μl 10X AccⅠ緩沖液和40μl H2O中。向質(zhì)粒pLPcat DNA溶液中加入約5μl(～25單位)限制酶AccⅠ，所得反應(yīng)物在37℃下保溫。用乙醇沉淀AccⅠ消化的質(zhì)粒pLPcat DNA，并再懸浮于5μl 10X StuⅠ緩沖液、40μl H2O、5μl(約25單位)限制酶StuⅠ中，所得反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。將AccⅠ-StuⅠ消化的質(zhì)粒pLPcat DNA用乙醇沉淀數(shù)次，純化出～4.81Kb AccⅠ-StuⅠ限制片段，該片段含有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和Ad2后期啟動(dòng)子。另一個(gè)消化產(chǎn)物為大小約為16bp的限制片段。得到約1μg所需的～4.81Kb限制片段，并溶于20μl TE緩沖液中。
將5μl質(zhì)粒pLPcat的～4.81Kb AccⅠ-StuⅠ限制片段加到5μl質(zhì)粒pBKneo1的～1.28Kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段中。在DNA混合物中加入3μl 10X連接酶緩沖液、15μl H2O、2μl(約10單位)T4DNA連接酶后，所得的連接反應(yīng)物在16℃下保溫過夜。連接后的DNA構(gòu)成所需質(zhì)粒pBLcat。質(zhì)粒pBLcat的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1C。
基本根據(jù)實(shí)例2B所述的方法，用連接后的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12HB101細(xì)胞。大腸桿菌K12HB101/pBLcat轉(zhuǎn)化體由其質(zhì)粒DNA的限制酶分析來鑒定?；靖鶕?jù)實(shí)例1A的方法制備質(zhì)粒pBLcatDNA用于隨后的構(gòu)建步驟，與實(shí)例1A不同的是用氨芐青霉素代替四環(huán)素作選擇性試劑。
E.質(zhì)粒pL133的構(gòu)建質(zhì)粒pL133是一種人C蛋白表達(dá)載體。如下所述，可利用起始載體質(zhì)粒pSV2gpt和pHC7(質(zhì)粒pHC7的制備如實(shí)例1A所述)構(gòu)建質(zhì)粒pL133，先構(gòu)建出中間載體質(zhì)粒pSV2-HPC8，然后將其與質(zhì)粒pSV2-β-球蛋白結(jié)合產(chǎn)生質(zhì)粒pL133。質(zhì)粒pL133的構(gòu)建方案詳細(xì)描述如下，并圖示于附圖2。
將50μl(～50μg)質(zhì)粒pHC7 DNA與5μl(～50單位)限制酶BanⅠ、10μl 10X BanⅠ反應(yīng)緩沖液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl;1mg/ml BSA)和35μl H2O混合，并保溫至消化完全。然后將BanⅠ消化的質(zhì)粒pHC7 DNA在3.5%聚丙烯酰胺凝膠(29∶1，丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)上進(jìn)行電泳，直到～1.25Kb BanⅠ限制片段與其它消化產(chǎn)物分離。
從凝膠上切下含～1.25KbBanⅠ限制片段的凝膠區(qū)，置于試管中，搗成小碎片。向裝有碎片的試管中加入1ml提取緩沖液(500mMNH4OAc、10mM MgOAc、1mM EDTA、1%SDS、10mg/ml tRNA)，將試管在37℃下放置過夜。離心沉淀細(xì)胞碎片，將上清液移入一新試管中。細(xì)胞碎片用200μl提取緩沖液洗滌一次;洗滌上清液與來自過夜提取的第一批上清液合并。使上清液通過一玻璃毛塞后，加入2倍體積的乙醇與上清液混合。將所得溶液在干冰-乙醇浴中放置～10分鐘，然后離心沉淀DNA。
由該方法得到約8μg～1.25KbBanⅠ限制片段。將純化的片段懸浮于10μlTE緩沖液中并貯存于-20℃。BanⅠ限制片段必須加入連接子進(jìn)行修飾才能構(gòu)建出質(zhì)粒pSV2-HPC8。用于構(gòu)建連接子的DNA片段利用Systec1450ADNA合成儀(SystecInc.，3816ChandlerDrive，Minneapolis，MN)或ABS380ADNA合成儀(AppliedBiosystems，Inc.，850LincolnCentreDrive，F(xiàn)osterCity，CA94404)來合成。本領(lǐng)域已知的許多DNA合成儀都可用于DNA片段的合成。此外，還可基本按照Itakura等人的方法(Itakuraetal.，Science，1981056，1977)和Crea等人的方法(Creaetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，755765，1978)用常規(guī)方法制備這些片段。
每種單鏈連接子各取500微微摩爾在20μl反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行激酶處理，該反應(yīng)緩沖液含有15單位(～0.5μl)T4多核苷酸激酶、2μl 10X連接酶緩沖液、10μl 500μM ATP、7.5μl H2O。將激酶反應(yīng)物在37℃下保溫30分鐘，在100℃下保溫10分鐘使反應(yīng)終止。為了保證激酶反應(yīng)完全，將反應(yīng)物在冰上冷卻，向反應(yīng)混合物中加入2μl 0.2M二硫蘇糖醇、2.5μl 5mM ATP、15單位T4多核苷酸激酶，混合后將反應(yīng)混合物在37℃下再保溫30分鐘。在100℃下再保溫10分鐘終止反應(yīng)，然后在冰上冷卻。
兩條單鏈DNA連接子雖然分別用激酶處理，但在激酶反應(yīng)后仍然混合在一起。為了將這兩條鏈退火，在含有～150ml水的水浴中，將激酶反應(yīng)混合物在100℃下保溫10分鐘。保溫后，關(guān)閉水浴使其冷卻到室溫，該過程大約需要3小時(shí)。然后將仍裝有經(jīng)激酶處理的DNA試管的水浴在4℃下保溫過夜，該過程使兩條單鏈退火。所構(gòu)建的連接子具有下列結(jié)構(gòu)
使用前將該連接子貯存于-20℃下。
將～8μg～1.25Kb BanⅠ片段加入～50μl連接子(～500微微摩爾)、1μl T4DNA連接酶(～5單位)、10μl 10X連接酶緩沖液、29μl H2O中，混合后將所得的連接反應(yīng)物在4℃下保溫過夜。在65℃下保溫10分鐘終止連接反應(yīng)。加入NaOAc到終濃度為0.3M，加入2倍體積的乙醇，在干冰-乙醇浴上冷卻，然后離心該溶液使DNA沉淀出來。
將DNA沉淀溶于10μl 10X ApaⅠ反應(yīng)緩沖液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.4;60mM MgCl;60mM 2-巰基乙醇)、5μl(～50單位)限制酶ApaⅠ、85μl H2O中，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。然后如上所述終止反應(yīng)并沉淀DNA。將DNA沉淀溶于10μl 10X HindⅢ反應(yīng)緩沖液、5μl(～50單位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。HindⅢ消化后，將反應(yīng)混合物加到3.5%聚丙烯酰胺凝膠上，從凝膠中分離出所需的～1.23Kb HindⅢ-ApaⅠ限制片段并進(jìn)行純化。得到約5μg所需片段，懸浮于10μl TE緩沖液中，并貯存于-20℃下。
將50μl(～50μg)質(zhì)粒pHC7 DNA與5μl(～50單位)限制酶pstⅠ、10μl 10X PstⅠ反應(yīng)緩沖液(1.0M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝7.5;100mM MgCl2;1mg/ml BSA)、35μlH2O混合，在37℃下保溫2小時(shí)。然后基本根據(jù)上述方法將PstⅠ消化的質(zhì)粒pHC7 DNA在3.5%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，純化出所需的～0.88Kb片段。得到約5μg所需片段，懸浮于10μl TE緩沖液中，并貯存于-20℃下。
將～5μg～0.88KbPstⅠ片段加到～50μl下列連接子中并混合，該連接子在自動(dòng)DNA合成儀上構(gòu)建
向DNA混合物中加入約1μl T4DNA連接酶(～10單位)、10μl 10X連接酶緩沖液、29μl H2O，將所得的連接反應(yīng)物在4℃下保溫過夜。
在65℃下保溫10分鐘終止連接反應(yīng)。使連接后的DNA沉淀后，將DNA沉淀溶于10μl 10X ApaⅠ反應(yīng)緩沖液、5μl(～50單位)限制酶ApaⅠ、85μl H2O，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。然后終止反應(yīng)并再一次沉淀DNA。將DNA沉淀于10μl 10X BglⅡ反應(yīng)緩沖液(1M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝7.4;100mM MgCl2;100mM2-巰基乙醇;1mg/ml BSA)、5μl(～50單位)限制酶BglⅡ、85μl H2O中，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。BglⅡ消化后，基本按照上述方法將反應(yīng)混合物加到3.5%聚丙烯酰胺凝膠上，分離所需的～0.19Kb ApaⅠ-BglⅡ限制片段。得到約1μg所需片段，懸浮于10μl TE緩沖液中，并貯存于-20℃。
將約10μg質(zhì)粒pSV2gpt DNA(ATCC37145)溶于10μl 10X HindⅢ反應(yīng)緩沖液、5μl(～50單位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。然后在反應(yīng)混合物中加入NaOAc至濃度為0.25M，加入2倍體積的乙醇并在干冰-乙醇浴上保溫后，離心沉淀DNA。將DNA沉淀溶于10μl 10X BglⅡ緩沖液、5μl(～50單位)限制酶BglⅡ、85μl H2O中，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。BglⅡ消化后，將反應(yīng)混合物加到1%瓊脂糖凝膠上，電泳分離各片段。將凝膠用溴化乙錠染色并在紫外光下觀察，將含有所需的～5.1Kb HindⅢ-BglⅡ片段的條帶從凝膠上切下并置于一透析管中，繼續(xù)電泳至DNA走出瓊脂糖為止。含有來自透析管的DNA的緩沖液用苯酚和氯仿提取，然后沉淀DNA。將沉淀再懸浮于10μl TE緩沖液中，構(gòu)成～5μg所需的質(zhì)粒pSV2gpt的～5.1Kb HindⅢ-BglⅡ限制片段。
將2μl～1.23Kb HindⅢ-ApaⅠ限制片段、3μl～0.19Kb ApaⅠ-BglⅡ片段、2μl～5.1Kb HindⅢ-BglⅡ片段混合在一起，然后加10μl 10X連接酶緩沖液、1μl T4DNA連接酶(～500單位)、82μl H2O在16℃下保溫過夜。連接后的DNA構(gòu)成了所需質(zhì)粒pSV2-HPC8，該質(zhì)粒的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖2。
基本根據(jù)實(shí)例2B對(duì)大腸桿菌K12HB101所述的方法，使大腸桿菌K12RR1(NRRLB-15210)細(xì)胞成為轉(zhuǎn)化感受態(tài)。用上面制備的連接后的DNA轉(zhuǎn)化上述細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化混合物的等分試樣涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂平板上。將瓊脂平板在37℃下培養(yǎng)。大腸桿菌K12RR1/pSV2-HPC8轉(zhuǎn)化體通過其質(zhì)粒DNA的限制酶分析來證實(shí)。基本根據(jù)實(shí)例1A的方法，由轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒pSV2-HPC8DNA，與實(shí)例1A不同的是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中用氨芐青霉素而非四環(huán)素作選擇性試劑。
將50μg質(zhì)粒pSV2-HPC8溶于10μl 10X HindⅢ反應(yīng)緩沖液、5μl(～50單位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。HindⅢ消化后，沉淀DNA，并將DNA沉淀溶于10μl 10X SalⅠ反應(yīng)緩沖液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;60mM 2-巰基乙醇;1mg/ml BSA)、5μl(～50單位)限制酶SalⅠ、85μl H2O中。將所得的SalⅠ反應(yīng)混合物在37℃下保溫2小時(shí)。將HindⅢ-SalⅠ消化的質(zhì)粒pSV2-HPC8加到3.5%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，直至所需～0.29Kb HindⅢ-SalⅠ限制片段與其它反應(yīng)產(chǎn)物分離。從凝膠上分離所需片段，得到約2μg片段并懸浮于10μl TE緩沖液中。
將50μg質(zhì)粒pSV2-HPC8溶于10μl 10X BglⅡ反應(yīng)緩沖液、5μl(50單位)限制酶BglⅡ、85μl H2O中，反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。BglⅡ消化后，沉淀DNA，并將DNA沉淀溶于10μl 10X SalⅠ反應(yīng)緩沖液、5μl(～50單位)限制酶SalⅠ、85μl H2O中。將所得的SalⅠ反應(yīng)混合液在37℃下保溫2小時(shí)。將SalⅠ-BglⅡ消化的質(zhì)粒pSV2-HPC8加到3.5%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，直至所需的～1.15KbSalⅠ-BglⅡ限制片段與其它反應(yīng)產(chǎn)物分離。從凝膠上分離出～1.15KbSalⅠ-BglⅡ限制片段，得到約8μg片段并懸浮于10μlTE緩沖液中。
將約10μg質(zhì)粒pSV2-β-球蛋白DNA(NRRL B-15928)溶于10μl 10X HindⅢ反應(yīng)緩沖液、5μl(～50單位)限制酶HindⅢ、85μl H2O中，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。然后，在反應(yīng)混合物中加入NaOAc使其濃度為0.25M，在加入2倍體積的乙醇并在干冰-乙醇浴中保溫后，離心沉淀DNA。將HindⅢ消化的質(zhì)粒pSV2-β-球蛋白溶于10μl 10X BglⅡ緩沖液、5μl(～50單位)限制酶BglⅡ、85μl H2O中，將反應(yīng)物在37℃下放置2小時(shí)。BglⅡ消化后，將反應(yīng)混合物加到1%瓊脂糖凝膠上，電泳分離各片段。將所需的～4.2Kb HindⅢ-BglⅡ限制片段從凝膠上分離出來，得到約5μg所需片段并懸浮于10μl TE緩沖液中。
將2μl質(zhì)粒pSV2-HPC8的～0.29Kb HindⅢ-SalⅠ片段、2μl質(zhì)粒pSV2-HPC8的～1.15Kb SalⅠ-BglⅡ片段、2μl質(zhì)粒pSV2-β-球蛋白的～4.2Kb HindⅢ-BglⅡ片段混合在一起，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接后的DNA構(gòu)成了所需的質(zhì)粒pL133，質(zhì)粒pL133的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖2。用連接后的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12 RR1，所需的大腸桿菌K12 RR1/pL133轉(zhuǎn)化體通過其氨芐青霉素抗性表型及其質(zhì)粒DNA的限制酶分析來鑒定。
F.由質(zhì)粒pL133及pBLcat構(gòu)建質(zhì)粒pLPC將約20μg質(zhì)粒pBLcat DNA溶于10μl 10X HindⅢ緩沖液和80μl H2O中。向質(zhì)粒pBLcat DNA溶液中加入約10μl(～100單位)限制酶HindⅢ，將所得反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。將HindⅢ消化的質(zhì)粒pBLcatDNA加到瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，直至含有BK增強(qiáng)子和Ad2后期啟動(dòng)子的～0.87KbHindⅢ限制片段與其它消化產(chǎn)物分離。然后，分離純化～0.87Kb片段，并準(zhǔn)備用于連接。得到約2μg所需片段并溶于5μlTE緩沖液中。
將約1.5μg質(zhì)粒pL133 DNA溶于2μl 10X HindⅢ緩沖液和16μl H2O中。向該DNA溶液中加入約1μl(～10單位)限制酶HindⅢ，所得反應(yīng)物在37℃下保溫2小時(shí)。然后用TE緩沖液將DNA稀釋至100μl并用～0.06單位小牛腸堿性磷酸酯酶處理，所得反應(yīng)物在37℃下保溫30分鐘。調(diào)節(jié)該溶液使其含有1X SET(5mM Tris-HCl，pH＝7.8;5mM EDTA;150mM NaCl)、0.3M NaOAc、0.5% SDS，然后在65℃下保溫45分鐘。然后將HindⅢ消化的質(zhì)粒pL133 DNA用苯酚提取兩次，用氯仿提取一次，用乙醇沉淀，并再懸浮于10μl TE緩沖液中。
將約5μl質(zhì)粒pBLcat的～0.87Kb HindⅢ限制片段加到1.5μg(10μl)HindⅢ消化的質(zhì)粒pL133中，然后向DNA溶液中加入2μl 10X連接酶緩沖液、1μl(～10單位)T4DNA連接酶、2μl H2O，所得反應(yīng)物在16℃下保溫過夜。連接后的DNA構(gòu)成了所需的質(zhì)粒pLPC。
基本根據(jù)實(shí)例2B的方法用連接后的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12HB101。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪在含有氨芐青霉素的L-瓊脂平板上，通過限制酶分析來檢察氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA，以此來鑒定大腸桿菌K12HB101/pLPC轉(zhuǎn)化體。編碼BK增強(qiáng)子和Ad2后期啟動(dòng)子的～0.87KbHindⅢ限制片段能夠以兩種取向之一插入HindⅢ消化的質(zhì)粒pL133，其中只有一種取向產(chǎn)生質(zhì)粒pLPC。質(zhì)粒pLPC的限制位點(diǎn)和功能圖譜示于附圖1D。
實(shí)例3質(zhì)粒pLPC-167G的構(gòu)建基本根據(jù)實(shí)例1所述的位點(diǎn)特異性誘變和其它用于構(gòu)建質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建方案，構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167G。但用于構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167G的緩沖液和退火條件如Zoller和Smith所述(ZollerandSmith，DNA3479-489，1984)。
在質(zhì)粒pLPC-167G的構(gòu)建中，將噬菌體M13mp18-HE1(見實(shí)例1B)利用下面的誘變寡核苷酸進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變5′-GACCAAGAAGACCAAGTAGGCCCGCGGCTCATTGATG-3′。
得自位點(diǎn)特異性誘變的誘變的噬菌體定名為M13mp18-HE4。
質(zhì)粒pLPC-167G的最后構(gòu)建用類似于實(shí)例1C所述的質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建方法進(jìn)行。但是，質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建利用了兩個(gè)來自質(zhì)粒pLPC的限制片段。在構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167G時(shí)，相同的兩個(gè)片段卻是得自質(zhì)粒pLAPC。之所以用質(zhì)粒pLAPC代替質(zhì)粒pLPC作片段的來源，是為了在鑒定質(zhì)粒pLPC-167G轉(zhuǎn)化體時(shí)簡(jiǎn)化限制分析。由于質(zhì)粒pLPC和pLPC-167G的大小非常相近，所以很難區(qū)別質(zhì)粒pLPC-167G和“親本”(質(zhì)粒pLPC)。盡管對(duì)用于連接的片段進(jìn)行了純化，但由于多種因素還是會(huì)有親本存在。但是，由于質(zhì)粒pLAPC比質(zhì)粒pLPC-167G小，所以如果從質(zhì)粒pLAPC中得到上述的兩個(gè)片段，就很容易將親本(質(zhì)粒pLAPC)與所需質(zhì)粒pLPC-167G區(qū)別開。因此，為了構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167G，將噬菌體M13mp18-HE4的～0.7KbSstⅠ-SalⅠ限制片段與質(zhì)粒pLAPC的～3.76KbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段和質(zhì)粒pLAPC的～2.0KbEcoRⅠ-SstⅠ限制片段相連接。連接后的DNA構(gòu)成了所需的質(zhì)粒pLPC-167G，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌K12RV308。用所得的大腸桿菌K12RV308/pLPC-167G轉(zhuǎn)化體來大規(guī)模制備質(zhì)粒pLPC-167GDNA用于進(jìn)行真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
實(shí)例4質(zhì)粒pLPC-167F的構(gòu)建基本根據(jù)實(shí)例1所述的位點(diǎn)特異性誘變和其它用于構(gòu)建質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建方案，構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167F。但用于構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167F的緩沖液和退火條件如Zoller和Smith所述(ZollerandSmith，DNA3479-489，1984)。
在質(zhì)粒pLPC-167F的構(gòu)建中，將噬菌體M13mp18-HE1(見實(shí)例1B)利用下面的誘變寡核苷酸進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變5′-GACCAAGAAGACCAAGTATTCCCGCGGCTCATTGATG-3′。
得自位點(diǎn)特異性誘變的誘變的噬菌體定名為M13mp18-HE5。
質(zhì)粒pLPC-167F的最后構(gòu)建用類似于實(shí)例1C所述的質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建方法進(jìn)行。但是，質(zhì)粒pLAPC的構(gòu)建利用了兩個(gè)來自質(zhì)粒pLPC的限制片段。在構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167F時(shí)，相同的兩個(gè)片段卻是得自質(zhì)粒pLAPC。之所以用質(zhì)粒pLAPC代替質(zhì)粒pLPC作片段的來源，是為了在鑒定質(zhì)粒pLPC-167F轉(zhuǎn)化體時(shí)簡(jiǎn)化限制分析。由于質(zhì)粒pLPC和pLPC-167F的大小非常相近，所以很難區(qū)別質(zhì)粒pLPC-167F和“親本”(質(zhì)粒pLPC)。但是，由于質(zhì)粒pLAPC比質(zhì)粒pLPC-167F小，所以如果從質(zhì)粒pLAPC中得到上述的兩個(gè)片段，就很容易將親本(質(zhì)粒pLAPC)與所需質(zhì)粒pLPC-167F區(qū)別開。因此，為了構(gòu)建質(zhì)粒pLPC-167F，將噬菌體M13mp18-HE5的～0.7KbSstⅠ-SalⅠ限制片段與質(zhì)粒pLAPC的～3.76KbEcoRⅠ-SalⅠ限制片段和質(zhì)粒pLAPC的～2.0KbEcoRⅠ-SstⅠ限制片段相連接。連接后的DNA構(gòu)成了所需的質(zhì)粒pLPC-167F，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌K12RV308。用所得的大腸桿菌K12RV308/pLPC-167F轉(zhuǎn)化體來大規(guī)模制備質(zhì)粒pLPC-167FDNA用于進(jìn)行真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
實(shí)例5利用質(zhì)粒pLPC-167G和pLPC-167F構(gòu)建腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系293和腺病毒轉(zhuǎn)化的金黃倉鼠細(xì)胞系A(chǔ)V12轉(zhuǎn)化體人胚腎細(xì)胞系293可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心得到，登記號(hào)為ATCCCRL1573。腺病毒轉(zhuǎn)化的金黃倉鼠細(xì)胞系A(chǔ)V12也可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心得到，登記號(hào)為ATCCCRL9595。下面描述的轉(zhuǎn)化方法用293細(xì)胞作宿主細(xì)胞系;但該方法普遍適用于大多數(shù)真核細(xì)胞系，包括AV12細(xì)胞系，也適用于本發(fā)明的表達(dá)載體。
293細(xì)胞得自ATCC，登記號(hào)為CRL 1573，所得細(xì)胞為含有約5.5×106個(gè)細(xì)胞的匯合單層的25mm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為加有10%熱失活馬血清的Eagle氏最低必需培養(yǎng)基(Gibco)。將培養(yǎng)瓶在37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)基一星期換兩次。培養(yǎng)基的組成為DMEM(Gibco)添加10%胎牛血清、50μg/ml慶大霉素、10μg/ml Aqua MEPHYTON 維生素K1(Merck Sharp and Dohme，Merck and Co.，Inc.，West Point，PA19486)。除去培養(yǎng)基，用Hank氏平衡鹽溶液(Gibco)沖洗，加入0.25%胰酶(含有0.2g/LEDTA)作用1～2分鐘，用新鮮培養(yǎng)基沖洗，將細(xì)胞吸出，以1∶5或1∶10的轉(zhuǎn)種比將細(xì)胞分裝到新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
在轉(zhuǎn)化的前一天，以每個(gè)100mm培養(yǎng)皿0.7×106細(xì)胞的密度接種細(xì)胞。用溶于TE緩沖液的乙醇沉淀的無菌質(zhì)粒DNA來制備2X DNA-CaCl2溶液，該溶液含有25μg/ml轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA(對(duì)質(zhì)粒pLPC-167F或pLPC-167G的轉(zhuǎn)化，通常用兩個(gè)質(zhì)粒，即質(zhì)粒pLPC-167F或pLPC-167G和含有可選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，討論如下)和250mM CaCl2。制備含有280mM NaCl、50mM Hepes、1.5mM磷酸鈉的2X HBSS，將pH調(diào)至7.05-7.15。將2X DNA-CaCl2溶液滴加到等體積的無菌2X HBSS中。將一個(gè)帶棉塞的1ml無菌塑料吸管插到含有2X HBSS的混合管中，邊加DNA邊通氣。在室溫下靜置30-45分鐘，使之形成磷酸鈣-DNA沉淀。
接著，用一個(gè)塑料吸管輕輕抽吸，使沉淀混合，將1ml(每平皿)沉淀直接加到10ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使之覆蓋受體細(xì)胞。在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)后，用新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，使細(xì)胞再培養(yǎng)72小時(shí)，然后提供選擇壓力。對(duì)于那些不含有在真核細(xì)胞中起作用的可選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，如質(zhì)粒pLPC-167F或pLPC-167G，轉(zhuǎn)化方法利用下列質(zhì)粒的混合物缺少可選擇標(biāo)記的本發(fā)明的表達(dá)載體;一個(gè)含有在真核細(xì)胞中起作用的可選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。可用于這種共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的許多不同載體包括質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC37146)、pSV2-neo(ATCC37149)、pSV2-gpt(ATCC37145)、pSV2-hyg(NRRLB-18039)。質(zhì)粒pSV2-hyg賦予真核宿主細(xì)胞潮霉素B抗性。借助這種共轉(zhuǎn)化技術(shù)可選擇含有帶可選擇標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的檢查，鑒定出同時(shí)含有兩種轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞。當(dāng)然，本發(fā)明還包括那些含有適用于真核細(xì)胞的可選擇標(biāo)記的表達(dá)載體，因此不需要用共轉(zhuǎn)化技術(shù)。
對(duì)于用含有潮霉素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將潮霉素B加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使其終濃度為約200μg/ml。然后將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)2-4周，每3-4天換一次培養(yǎng)基。將所得的潮霉素抗性集落分別轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行特征鑒定。質(zhì)粒pSV2-neo賦予新霉素抗性(也用G418來代替新霉素)，基本根據(jù)潮霉素抗性細(xì)胞的選擇方法對(duì)G418抗性集落進(jìn)行選擇，不同的是加入G418至終濃度為400μg/ml。
現(xiàn)有的文獻(xiàn)已充分確認(rèn)，可用二氫葉酸還原酶(dhfr)基因或dhfr基因的氨甲喋呤抗性衍生物(dhfr-mtx)作可選擇標(biāo)記，將基因或質(zhì)粒引入dhfr缺陷細(xì)胞系，繼而可用氨甲喋呤擴(kuò)增質(zhì)粒的拷貝數(shù)。293細(xì)胞為dhfr陽性，所以含有含dhfr基因質(zhì)粒的293轉(zhuǎn)化體，不能僅靠dhfr陽性表型進(jìn)行選擇，dhfr陽性表型即為在缺少次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力。缺乏功能性dhfr基因并用含dhfr質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，可以靠dhfr+表型進(jìn)行選擇。雖然還未充分研究過在dhfr生成細(xì)胞中用dhfr作可擴(kuò)增的可選擇標(biāo)記，但文獻(xiàn)中有證據(jù)表明在dhfr生成細(xì)胞中可以用dhfr作可選擇標(biāo)記并用于基因擴(kuò)增。本發(fā)明并不限于表達(dá)載體上所用的可選擇標(biāo)記。而且，可以利用可擴(kuò)增的標(biāo)記基因，如金屬硫因基因、腺苷脫氨酶基因或者多基因抗性基因，例如P-糖蛋白基因。
用質(zhì)粒pLPC-167F或pLPC-167G和潮霉素抗性載體的混合物轉(zhuǎn)化293和AV12細(xì)胞系，然后選擇潮霉素抗性細(xì)胞，得到許多轉(zhuǎn)化體。(利用質(zhì)粒pSV2-neo作共轉(zhuǎn)化載體并選擇G418抗性細(xì)胞，得到另一些轉(zhuǎn)化體。)如實(shí)例6所述分析這些轉(zhuǎn)化體，確定哪些潮霉素抗性細(xì)胞含有質(zhì)粒pLPC-167F或pLPC-167G。
實(shí)例6高分泌轉(zhuǎn)化體的選擇在100mm2組織培養(yǎng)皿上以每個(gè)組織培養(yǎng)皿幾百個(gè)細(xì)胞克隆的密度培養(yǎng)實(shí)例5獲得的潮霉素抗性轉(zhuǎn)化體。倒出培養(yǎng)基，細(xì)胞用5ml等份的Hank氏平衡鹽溶液(Gibco)沖洗兩次。將1ml 1.8%瓊脂(Sigma 4型瓊脂糖，目錄號(hào)A3643，Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)(47℃)與3ml Dulbecco氏修改的Eagle氏(DME)鹽(Gibco)(37℃)混合，制得無菌的0.45%瓊脂溶液，取2ml該溶液鋪在細(xì)胞上。
將若干硝酸纖維素濾膜(SchleicherandSchuell，Inc.，Keene，NH03431)煮沸，然后高壓滅菌2小時(shí)除去對(duì)細(xì)胞有毒的潤(rùn)濕劑。然后把這些濾膜放在瓊脂層上，除去氣泡后，將這些平板于37℃下保溫1-3小時(shí)。然后取下濾膜置于PBS(50mMTris-HCl，pH7.2，150mMNaCl)中。濾膜預(yù)先作好記號(hào)標(biāo)出濾膜在培養(yǎng)皿上的原始取向，以便以后對(duì)集落進(jìn)行鑒定。
為保持培養(yǎng)皿上的細(xì)胞在濾膜分析期間存活，細(xì)胞上鋪一層8ml的混合物，該混合物中含有2ml1.8%瓊脂(47℃)、2mlDME鹽(37℃)、以及4ml含20%胎牛血清的DME鹽(37℃)。然后將細(xì)胞放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。
在濾膜上進(jìn)行的所有洗滌和反應(yīng)都在濾膜放在搖床上時(shí)進(jìn)行。首先將濾膜放在含5%牛奶的PBS中室溫下保溫阻斷濾膜。然后用PBS沖洗濾膜4次(每次沖洗5分鐘)。將10μg/ml生物素化的羊抗人C蛋白多克隆抗體在2.5%牛血清清蛋白中的溶液加到濾膜上(加入量足以覆蓋濾膜)，然后于37℃下保溫1小時(shí)。
可以用Kisiel所述的方法(Kisiel，J.Clin.Invest.64761，1979)進(jìn)行C蛋白的純化以便以后用來制備抗C蛋白抗體?？梢杂肊.A.Kabat所公開的方法(E.A.Kabat，in Struc-tural Concepts in Immunology and Immunochemi-stry，1968，由Holt，Rhinehart和Winston出版)來制備多克隆抗體。單克隆抗體也適用于測(cè)定，其制備可以用Kohler和Milstein所公開的方法(Kohler and Milstein，Natu-re，256495，1975)，也可以用美國(guó)專利第4，696，895;EPO公告第205046號(hào);Laurell et al.，F(xiàn)EBS 191(1)75，1985;Suzuki et al.，J.Biochem.97127-138，1985;以及EPO公告第138，222號(hào)所公開的方法。用于測(cè)定的抗生物素蛋白D和生物素化的辣根過氧化物酶(HRP)為Vectastai-nTM試劑盒(Vector Laboratories，Inc.，30 Ingold Road，Burlingame，CA 94010)。生物素也得自Vector Laboratories，Inc。
在4℃下用PBS沖洗濾膜4次。然后按廠家在VectastainTM(Vector Laboratories)試劑盒中的說明制備并加入抗生物素蛋白D和生物素化辣根過氧化物酶。在4℃下使濾膜與結(jié)合有HRP的抗生物素蛋白D一起保溫1小時(shí)(如果只分泌出少量蛋白，則可采用更長(zhǎng)的保溫時(shí)間即過夜);然后在4℃下用PBS沖洗濾膜4次。
為在濾膜上顯示指示劑顏色，將溶于冰冷的100%甲醇中的約30mg HRP顯色劑(4-氯-1-萘酚，Sigma)加到50ml PBS和30μl 30%H2O2中。將該混合液加到硝酸纖維素濾膜上，室溫下保溫至顯色。分泌本發(fā)明人C蛋白酶原最多的集落將在濾膜上顯現(xiàn)出來，它不僅顏色出現(xiàn)最早，而且在濾膜上的斑點(diǎn)較深。
濾膜已顯色后，再用原始平板將濾膜重新排列，以確定哪些集落與濾膜上的斑點(diǎn)相聯(lián)系。然后選擇出分泌本發(fā)明人C蛋白酶原最多的集落并用來生產(chǎn)酶原。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，上述測(cè)定法僅僅是說明高分泌細(xì)胞系的鑒定方法。該方法可成功地應(yīng)用各種不同的測(cè)定法。例如，可以應(yīng)用雙抗體反應(yīng)，其中用羊抗C蛋白抗體(IgG)和生物素化抗羊IgG抗體代替生物素化羊抗C蛋白抗體。
權(quán)利要求
1.一種制備重組DNA載體的方法，該方法包括將以下兩個(gè)DNA化合物連接在一起(I)含有一個(gè)蛋白編碼順序的DNA化合物，該蛋白從氨基末端到羧基末端含有a)一個(gè)r-羧基化的分泌蛋白的信號(hào)肽和肽原；b)人c蛋白輕鏈；c)一個(gè)選自賴氨酸-精氨酸、精氨酸-賴氨酸、賴氨酸-賴氨酸、或精氨酸-精氨酸的二肽；d)氨基酸殘基順序ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VALR1R2ARG LEU ILE R3GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PROTRP GLN VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG GRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER THR THR ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN RHR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TYP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA CLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP GLY GLY PRO MET VAL SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中R1為PHE、GLY、TYR、或TRP，R2為VAL或PRO，R2為ASP或ASN，ARG為精氨酸，ASP為天冬酰胺，ASP為天冬氨酸，-COOH為羧基末端，CYS為半胱氨酸，GLN為谷氨酰胺，GLU為谷氨酸，GLY為甘氨基酸，HIS為組氨酸，ILE為異亮氨酸，LEU為亮氨酸，LYS為賴氨酸，MET為甲硫氨酸，PHE為苯丙氨酸，PRO為脯氨酸，SER為絲氨酸，THR為蘇氨酸，TRP為色氨酸，TYR為酪氨酸，VAL為纈氨酸；(II)含有一個(gè)啟動(dòng)子的DNA化合物，該啟動(dòng)子的定位在連接后能夠驅(qū)動(dòng)編碼順序的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于由DNA編碼的多肽為H2N-MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARG ALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO LEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE ASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLY ARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN GLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYS LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL R1R2ARG LEU ILE R3GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS METASPGLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中-H2N為氨基末端;R1為PHE、GLY、TYR或TRP;R2為PRO或VAL;R3為ASP或ASN。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，該方法產(chǎn)生質(zhì)粒pLPC-167F。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，該方法產(chǎn)生質(zhì)粒pLPC-167G。
5.一種靠從真核宿主細(xì)胞分泌重組生產(chǎn)人C蛋白酶原的方法，該方法包括(A)用一個(gè)重組DNA載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞，所述載體含有(ⅰ)一個(gè)編碼氨基酸殘基順序的DNA順序，所述氨基酸殘基順序從氨基酸末端到羧基末端含有a)一個(gè)γ-羧基化的分泌蛋白的信號(hào)肽和肽原;b)人C蛋白輕鏈;c)選自LYS-ARG、ARG-LYS、LYS-LYS或ARG-ARG的二肽;d)氨基酸殘基順序ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VAL R1R2ARG LEU ILE R3GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中R1為PHE、GLY、TYR或TRP，R2為VAL或PRO，R3為ASP或ASN，ARG為精氨酸，ASN為天冬酰胺，ASP為天冬氨酸，-COOH為羧基末端，CYS為半胱氨酸，GLN為谷氨酰胺，GLU為谷氨酸，GLY為甘氨酸，HIS為組氨酸，ILE為異亮氨酸，LEU為亮氨酸，LYS為賴氨酸，MET為甲硫氨酸，PHE為苯丙氨酸，PRO為脯氨酸，SER為絲氨酸，THR為蘇氨酸，TRP為色氨酸，TYR為酪氨酸，VAL為纈氨酸;(ⅱ)一個(gè)啟動(dòng)子，其定位能夠驅(qū)動(dòng)DNA順序的表達(dá);(B)在允許DNA順序表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟(A)中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其特征在于重組DNA表達(dá)載體為質(zhì)粒pLPC-167F。
7.權(quán)利要求5的方法，其特征在于重組DNA表達(dá)載體為質(zhì)粒pLPC-167G。
8.權(quán)利要求5、6或7的方法，其特征在于宿主細(xì)胞為293或AV12宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于步驟(B)所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞為293/pLPC-167F、293/pLPC-167G、AV12/pLPC-167F或AV12/pLPC-167G宿主細(xì)胞。
全文摘要
描述了一種重組生產(chǎn)人C蛋白酶原的方法。這些酶原與天然C蛋白酶原的不同在于，它們對(duì)凝血酶和凝血酶/凝血調(diào)節(jié)蛋白的激活作用更為敏感。還公開了用于該方法的DNA化合物、載體和轉(zhuǎn)化體。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1035526SQ88105199
公開日1989年9月13日 申請(qǐng)日期1988年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1987年12月28日
發(fā)明者尼爾斯·烏爾里克·班, 赫特穆特·約瑟夫·埃爾里哈, 殷秀慈 申請(qǐng)人:伊萊利利公司