專利名稱：吸附劑及精制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種吸附劑及精制方法，特別涉及一種用于親合色譜分離的特殊吸附劑，以及使用該特殊吸附劑進行親合色譜分離精制的方法。
本發(fā)明是關(guān)于利用親合色譜有效地和高純度地精制β-淀粉酶、麥芽低聚糖生成酶等與糖類有關(guān)的酶。
在含有生物體物質(zhì)的各種領(lǐng)域中，親合色譜被用來對生物體進行分離、精制及定量分析，特別是用其解釋生物體之間的特殊的相互作用機能。
親合色譜的分離精制是利用具有親合力的二種物質(zhì)(A及B)間的相互作用，使一種物質(zhì)(A)以配位體形式與不溶性載體結(jié)合、固定，并從含有多種物質(zhì)的混合液中只選擇性地吸收結(jié)合另一種物質(zhì)(B)，然后，通過取出物質(zhì)B，而達到分離精制B的目的。
對于α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等，可以利用淀粉、多縮葡萄糖及這些物質(zhì)的各種衍生物(交聯(lián)葡聚糖類等，以下稱“來自淀粉物質(zhì)”)作為吸附劑，利用親合色譜進行分離精制。
將親合色譜應(yīng)用于工業(yè)精制的時候，對于來自淀粉物質(zhì)的單位重量的吸附劑要求盡量吸附大量的酶;若應(yīng)用于實驗室的精制時，還有必要在提高精制淀粉酶的純度上下一番功夫。
可是，目前在工業(yè)規(guī)模上需要純度高的酶，并還需要高純度地分離精制大量的目的產(chǎn)物。
使用上述來自淀粉物質(zhì)作為吸附劑的親合力色譜是不能滿足這些要求的。
鑒于以上的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是在利用親合色譜對有關(guān)的糖類酶進行分離精制時，提供了一種特殊的吸附劑以及高純度地精制大量目的產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明者們經(jīng)過銳意的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了使用葡糖基糖苷(Glucosyl Moranolines)類、低聚葡糖基糖苷(Oligo-glucosyl Moranolines)類或者其混合物(以下總稱為“葡糖基糖苷類等”)作為親合色譜的配位體一舉解決了上述的課題，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的要旨就在于以葡糖基糖苷類作為配位體。本發(fā)明提供了一種具有配位體的特殊的吸附劑、以及使用這種特殊的吸附劑的親合色譜精制法。
在本發(fā)明中的以葡糖基糖苷類等作為親合色譜的配位體的特殊吸附劑在此之前沒有任何報導(dǎo)，所以本發(fā)明方法是一種新方法。另外，關(guān)于麥芽三糖生成酶用親合色譜進行分離在此之前也沒有成功例，通過本發(fā)明才得的實現(xiàn)。
以下對本發(fā)明進行詳細描述。
本發(fā)明的特殊吸附劑是由配位體及不溶性載體而構(gòu)成的。本發(fā)明的特殊吸附劑，可以含有作為構(gòu)成要素的間隔基(Spacer)。
本發(fā)明的配位體是葡糖基糖苷類。通過它們可以達到本發(fā)明的特有效果。
此外，所謂的葡糖基糖苷類是指糖苷(Moranoline)、N-取代糖苷等的糖苷衍生物的葡糖基物質(zhì)或低聚葡糖基物質(zhì)。
本發(fā)明的葡糖基糖苷類沒有特殊的限制，但其代表例如下，即用通式[Ⅰ]表示的化合物。
式中，n表示0～30的整數(shù)。R表示氫、烷基、苯基烷基、苯基烯基、苯基炔基、苯氧烷基、苯氧烯基、苯氧炔基等。上述R，作為其構(gòu)造的一部分含有烷基時，其烷基是直鏈或支鏈的，可有不飽和鍵，也可以有氨基、亞氨基、羥基、烷氧基、羰基或羧基等官能基?；蛘呱鲜龅腞，作為其結(jié)構(gòu)的一部分含有苯基時，該苯基也可以用氨基、亞氨基、羥基、烷氧基、羰基或羧基等官能基所取代。
在本發(fā)明中，對所謂的間隔基沒有特別的限定，它是使不溶性載體和配位體相結(jié)合的(或者是夾在兩者的中間)構(gòu)成要素。間隔基具有二官能基時，通過一個官能基與不溶性載體結(jié)合，通過另一個官能基與配位體結(jié)合理，這二個官能基可以相同，也可以不同。另外也可以是二個以上的間隔基化合物結(jié)合后，構(gòu)成間隔基的一部分。
本發(fā)明中，將葡糖基糖苷類等作為配位體制作親合色譜分離用的特殊吸附劑的方法，可以采用公知的一般制法。這些一般方法已記載在很多的的文獻、或各種報告中(例如，千煙一郎親合色譜分離法、講座報告。山峙誠等親合色譜分離法，講座報告)。
本發(fā)明中的所謂與糖類有關(guān)的酶可舉出，多糖類的分解及生成的酶，例如，α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、支鏈淀粉酶、麥芽低聚糖生成的淀粉酶(麥芽三糖生成的淀粉酶、麥芽四糖生成的淀粉酶、麥芽五糖生成的淀粉酶等)、環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶等。
本發(fā)明的特征是在于作為親合色譜中最重要的構(gòu)成要素-配位體是使用了葡糖基糖苷類等。
本發(fā)明的特殊吸附劑中，對于不溶性載體及間隔基沒有特別的限制，可以使用已廣泛使用的適當(dāng)物質(zhì)。
作為這些不溶性載體，可舉出有纖維素、瓊脂糖、交聯(lián)多縮葡萄糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺、多孔性硅珠等。
本發(fā)明的特殊吸附劑，可按通常的方法制造?？沙蔀殚g隔基化合物的具有二官能基化合物的例子如下，例如可將1，4-丁二醇二縮水甘油醚等直接與瓊脂糖凝膠等的瓊脂糖系不溶性載體反應(yīng)，通過洗滌除去過剩的環(huán)氧乙烷后，與本發(fā)明的葡糖基糖苷類進行反應(yīng)而得到。此時，可在0.5N的氫氧化鈉溶液中加入瓊脂糖凝膠、環(huán)氧乙烷，在室溫下使不溶性載體反應(yīng)約10小時，水洗后，同樣使其與葡糖基糖苷類反應(yīng)來制備的。
對于本發(fā)明的與糖類有關(guān)的酶的精制方法，除了使用本發(fā)明的親合色譜用的特殊的吸附劑之外，不用采用其他特別方法也可以實施。
例如，將本發(fā)明的特殊吸附劑充填到柱中，流過適當(dāng)溶液(通常為緩沖液)后，再流過適當(dāng)溶液(通常為緩沖液)，洗脫出非吸附物質(zhì)后，再流過含有可以吸附從吸附劑中游離出的酶的物質(zhì)(通常為基體或基體類似物質(zhì))的溶液，就可以得到所要求的酶。
實施例以下通過本發(fā)明的參考例及實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
參考例1 麥芽三糖生成酶的活性測定麥芽三糖生成酶(以下稱為“G3酶”)的活性測定使用了DNS(二硝基水楊酸)法。在400μ12%可溶性淀粉中加入100μ1G3酶、在40℃恒溫10分鐘后，加入1ml DNS，沸騰5分鐘。水冷后，加入4.5ml水、測定其在535nm的吸光度。另外將在1分鐘內(nèi)生成1微摩爾的麥芽三糖的酶量作為1U。蛋白質(zhì)是通過測定在280nm的吸光度或者使用測定生物吸收量(biorad)的儀器測定在595nm的吸光度來完成的。
參考例2 G3酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成 多縮葡萄糖 3%大豆粉 2%酵母浸汁 0.1%多胨 0.1%磷酸鉀 0.3%氯化鈣 0.5%硫酸銨 0.1%在上述的培養(yǎng)基中接種連霉菌屬·griseus NA-468(Streptomyces griseus NA-468)微工研菌寄存第2227號)，在pH為7、27℃振蕩培養(yǎng)4天。
參考例3 粗G3酶的制備將上述培養(yǎng)液離心分離(3000rpm、10分鐘)，向得到的離心分離上清液中加入硫酸銨使之達到40%飽和程度后，再進行離心分離(10000rpm、10分鐘)，向上清液中加入硫酸銨使之達到60%飽和程度。進行離心分離(10000rpm、10分鐘)、將沉淀溶解在0.5M醋酸緩沖液(pH5.8)中后，放進透析膜內(nèi)，使用0.01M醋酸(pH5.8)作為外液進行透析。將其離心分離上清液作為粗G3酶溶液。
參考例4 環(huán)氧活性化瓊脂糖凝膠6B的制備將抽吸干燥的瓊脂糖凝膠6B(PHARMASIA社制)10g懸浮在10ml的0.6N氫氧化鈉水溶液中，加入10ml 1，4-丁二醇醚，在25℃下，輕微振蕩8小時。在玻璃過濾器上充分進行水洗，這樣就得到環(huán)氧活性化瓊脂糖凝膠6B。
參考例5 4-O-α-D-吡喃葡糖基糖苷的制備按照江連等在(Y，Ezure Agnic，Biol，chem，491 2159(1985))中描述的方法調(diào)制。以下把4-O-α-D-吡喃葡糖基糖苷簡稱為葡糖基糖苷。
參考例6 低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切斷殘渣的制備將按照江連等的方法(Y，Ezore Agnic，Biol，Chem 49，2159(1985)制備的低聚葡糖基糖苷配成50mg/ml的溶液，用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH為5.0后，向其中加入來自甘薯的β-淀粉酶水溶液(生化學(xué)工業(yè)社制)，其量相當(dāng)于反應(yīng)液量的0.5%，在40℃下反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液吸附在適當(dāng)量的強酸性離子交換樹脂(道克斯50W×2(H+))上，充分水洗后，用1N的氨水洗脫。減壓干燥洗脫液得到低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切斷殘渣。用高速液相色譜分析的結(jié)果，此物質(zhì)是由糖苷42%、葡糖基糖苷31.9%、麥芽糖基糖苷23.5%、麥芽三糖基糖苷2.5%而組成的混合物。
參考例7 麥芽五糖生成酶的活性測定麥芽五糖生成酶(以下稱“G5酶”)的活性測定可使用DNS法。即在250μl、2%可溶性淀粉(0.1M醋酸緩沖液、pH5.8)中，加入250μlG5酶，在40℃下，恒溫20分鐘后，加入DNS溶液1ml，在沸水中加熱5分鐘。水冷后，加入4.5ml水，在535nm測定吸光度。按照參考例1測定酶蛋白量。
參考例8 G5酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成 肉浸汁 0.8%
硫酸銨 1.0%麥芽糖 0.8%瓊脂 1.9%在以上組成的斜面培養(yǎng)基中將假單胞細菌SP.KO-8940(FERM P-7456)在40℃培養(yǎng)2小時。將1個白金線圈插入到500ml麥耶氏中(マイヤ-に)，加入組成相同的100ml液體培養(yǎng)基，在40℃振蕩培養(yǎng)3天。
參考例9 粗G5酶的制備離心分離(9000rpm 20分鐘)參考例8得到的培養(yǎng)液，向得到的上清液中加入硫酸銨直到50%飽和為止，離心分離(10000rpm15分鐘)，收集沉淀，將沉淀溶在0.5M醋酸緩沖液(pH5.8)中，使用0.01M醋酸緩沖液(pH5.8)作為外液進行透析。其離心上清液為粗G5酶液。
參考例10 低聚葡糖基糖苷的G5酶切斷殘渣的制備按照基本上與參考例6相同的方法進行調(diào)制，即將低聚葡糖基糖苷10g溶解在100ml的水中(pH不調(diào)整)、加入在參考例9調(diào)制的G5酶液50ml，在30℃反應(yīng)20小時。將此反應(yīng)液吸附在適量的強酸性陽離子交換樹脂上(道克斯50W×2)，用水充分洗滌。用1N氨水洗脫后、減壓濃縮，得到約2.6g低聚葡糖基糖苷的G5切斷殘渣。
實施例1 使用葡糖基糖苷的G3酶特殊吸附劑的制備使用212g瓊脂糖凝膠6B按照參考例4記載的方法得到了處于吸干狀態(tài)的環(huán)氧活性化瓊脂糖凝膠6B，再將其懸浮在300ml0.1N的氫氧化鈉水溶液中，加入15g葡糖基糖苷，在40℃下輕輕振蕩27小時。在玻璃過濾器上水洗，用0.1M醋酸緩沖液(pH4.0)1000ml洗滌、水洗、用0.1M硼酸緩沖液(pH8.0)1000ml洗滌、而后充分水洗。將此凝膠懸浮在400ml的1M乙醇胺中，在室溫下，緩慢振蕩過夜。在玻璃過濾器上水洗，用含有0.5M氯化鈉的0.1M醋酸緩沖液(pH4.0)1000ml洗滌、水洗，得到了使用葡糖基糖苷的G3酶特殊吸附劑。
實施例2 使用低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切斷殘渣的G3酶特殊吸附劑的制備使用低聚葡糖基糖苷的β-淀粉酶切斷殘渣代替葡糖基糖苷，按照實施例1的方法得到使用低聚葡糖基糖苷β的淀粉酶的G3特殊吸附劑。
實施例3 使用葡糖基糖苷的G3酶的特殊吸附劑的親合色譜分離將實施例1得到的250mlG3酶特殊吸附劑充填到柱中，用0.02M醋酸緩沖液(pH5.8)緩沖后，加入165ml粗G3酶液(25493U、蛋白質(zhì)523mg、比活性48.7U/mg蛋白質(zhì))，用含有0.2M氯化鈉的0.62M醋酸緩沖液(pH5.8)2150ml展開后，用1%麥芽三糖水溶液展開。其結(jié)果表示在

圖1中。得到G3酶活性和蛋白質(zhì)一致的流分。流分9的G3酶的比活性為286.4U/mg蛋白質(zhì)，上升到約5.9倍。G3酶的回收率，僅流分9為82.6%。
在圖1中，表示了實施例3的結(jié)果。縱軸表示G3酶效力(U/ml)和蛋白質(zhì)量(O.D.595)。橫軸表示流分號。圖中·表示吸光度、口表示酶效力。流分1～6是300ml、流分7為350ml、流分為250ml、流分9～10為300ml。
實施例4 使用低聚葡糖基糖苷β淀粉酶切斷殘渣的G3酶特殊吸附劑進行的親合色譜分離將實施例2得到的G3酶特殊吸附劑5ml充填到柱中，用0.2M醋酸緩沖液(pH5.8)緩沖后，加入粗G3酶溶液5ml(773U、蛋白質(zhì)18.5mg)，用含有1.0M氯化鈉的0.02M醋酸緩沖液(pH5.8)充分展開。接著用3%麥芽糖水溶液展開。結(jié)果表示在圖2中。
從軸表示G3酶效力(O.D.535)和蛋白質(zhì)量(O.D.280)。橫軸表示流分號。圖中·表示在280nm的吸光度、口表示在535的吸光度。每個流分約5ml。
實施例5 使用低聚葡糖基糖苷的G5酶切斷殘渣的G5酶特殊吸附劑的制備使用低聚葡糖基糖苷的G5酶切斷殘渣代替葡糖基糖苷按照實施例1的方法，將低聚葡糖基糖苷的G5切斷殘渣作為配位體，制成G5酶特殊吸附劑。
實施例6 使用低聚葡糖基糖苷的G5酶切斷殘渣的G5酶特殊吸附劑而進行的親合色譜分離將在實施例5得到的G5酶特殊吸附劑5ml充填到柱中，用0.2M醋酸緩沖液(pH5.8)緩沖后，加入在參考例9得到的粗G5酶液5ml，用同樣的緩沖液充分展開。接著，用低聚糖混合物的Sun低聚物5.6(參松工業(yè)社制)的3%溶液進行洗脫時，確認洗脫出了G5酶。結(jié)果表示在圖3中。
縱軸表示G5酶效力(O.D.535)和蛋白質(zhì)量(O.D.595)。橫軸表示洗脫液量(ml)。圖中·表示在595nm的吸光度、口表示在535nm的吸光度。
實施例7[N-(5-羧基戊基)葡糖基糖苷與EAH-瓊脂糖凝膠的偶合將N-(5-羧基戊基)葡糖基糖苷100mg和EDC385mg溶解在5ml水中，調(diào)節(jié)pH為4.5，加入5mlEAH-瓊脂糖凝膠4B(PHARMSIA社制)，在室溫下，振蕩24小時，用400ml水洗滌，得到α-淀粉酶特殊吸附劑。
實施例8 通過將[N-(5-羧基戊基)葡糖基糖苷結(jié)合在EAH-瓊脂糖凝膠上的α-淀粉酶特殊吸附劑而進行的親合色譜分離將實施例7得到的α-淀粉酶特殊吸附劑5ml充填到柱中，用0.01M醋酸緩沖液(pH6.0)緩沖后，向其中加入α-淀粉酶(液化型，來自Bacillus subtilis)溶液，用上述緩沖液充分展開。而后，用2%可溶性淀粉溶液(0.01M醋酸緩沖液、pH6.0)展開。在淀粉溶液的初流中，確認α-淀粉酶已洗脫出來。
權(quán)利要求
1.一種親合色譜分離用的特殊吸附劑，其特征在于所述的特殊吸附劑中的配位體是葡糖基糖苷類、低聚葡糖基糖苷類、或其混合物。
2.一種與糖類有關(guān)的酶的精制方法，其特征是使用權(quán)利要求1記載的特殊吸附劑進行親合色譜分離。
全文摘要
在本發(fā)明涉及一種用于親合色譜分離的特殊吸附劑，該特殊吸附劑中的配位體為葡糖基糖苷類，低聚葡糖基糖糖苷類或其混合物。本發(fā)明還涉及一種用所述的特殊吸附劑進行親合色譜分離和精制的方法。
文檔編號C07K1/22GK1075663SQ9310178
公開日1993年9月1日 申請日期1993年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1992年2月21日
發(fā)明者丸尾重昭, 小川博嗣, 江連洋治 申請人:日本新藥株式會社