專利名稱：非甲、非乙型肝炎病毒的中國分離種群、組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及非甲、非乙型肝炎病毒(NANBV)的中國分離種群的分離肽，蛋白質和核酸分子。具體說來，本發(fā)明涉及到NANBV的中國和朝鮮分離種群特有的分離肽、蛋白質和核酸分子。本發(fā)明也描述含上述分離分子的用于診斷方法和疫苗的組合物。
已確信非甲、非乙型肝炎(NANBV)是由既稱之為丙型肝炎病毒(HCV)也稱之為非甲、非乙型肝炎病毒(NANBV)的傳染性病毒引起的。雖然在多年以前就發(fā)現(xiàn)了該傳染性疾病，但有關病原體的完整特征仍待研究。
人們已經描述過大量的NANBV分離種群并命名為HCV-1，HCV-H，HCV-J1，HCV-J4，HCV-JH，HCV-J和HCV-BK。已經分離出這些NANBV種群，并對各種種群的部分或全部病毒基因組進行過分子克隆以及測序(Choo et al，Science，244359-362(1989);Choo et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882451-2455(1991);Takamizawa et al.，J.Virol.，651105-1113(1991);Kato et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879524-9528(1990);和Takeuchi et al.，Nucl.Acids Res.，184626(1990))。
NANBV基因組是核糖核酸(RNA)。不同NANBV種群之間核苷酸堿基序列的相似性說明它們是相關病毒家族中的一員(Okamoto et al.，Japan J.Exp.Med.，60163-177(1990);和Ogata et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，883392-3396(1991))。NANBV基因組的性質說明NANBV可能是黃色病毒(flavivirus)家族的遠親。但是，在結構蛋白大小和水療法方面的相似性說明NANBV病毒也可能是與鼠疫病毒(Pestivirus)家族有遠緣關系(Miller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，872057-2061(1990);和Okamoto et al.，Japan J.Exp.Med.，60163-177(1990))。
從分類學上很難描述NANBV種群的特征并且缺乏有關由NANBV基因組編碼的蛋白質的資料，因此，很難鑒定可用于診斷標記物和生產NANBV疫苗的相關基因產物。
NANBV基因組包含編碼和非編碼(NC)區(qū)。進一步描述編碼區(qū)特征為含有包括衣殼(C)區(qū)，包膜(E)區(qū)和非結構(NS)區(qū)的推測區(qū)。
E區(qū)含有兩個不同的稱為E1和E2的推測區(qū)。E區(qū)進一步含有稱為V0，V1和V2的可變(V)區(qū)。NS區(qū)含有5個稱為NS1，NS2，NS3，NS4和NS5的推測區(qū)。進一步在推測的NS5亞區(qū)鑒定出稱作V3的可變區(qū)。
已經證明V3和部分E1區(qū)特別適于分類各種NANBV分離種群。比較基因組和從基因組這些區(qū)域衍生出的氨基酸殘基序列表明存在兩種原始的分離種群美國類似型(第Ⅰ組)和日本類似型(第Ⅱ組)。美國類似型分離種群包括HCV-1和HCV-H，而日本類似型分離種群包括HCV-J和HCV-BK。
在V3區(qū)有高度的分離種群內同源性但低度的分離種群間同源性。因此，在該區(qū)域中，美國類似型分離種群(HCV-1和HCV-H)相互之間有87%的同源性，日本類似型分離種群間彼此有87%的同源性，但在美國和日本類似型分離種群間的同源性僅為12.5%(參見，如，Okamoto et al.，Japan J.Exp.Med.，60163-177，1990(HC-J1，HC-J4);Takeuchi et al.，Nucleic Acids Res.，184626，1990(HCV-JH);Choo et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882451-2455，1991，(HCV-1);Kato et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879524-9528，1990(HCV-J);Takamizawa et al.，J.Virol.，651105-1113，1991(HCV-BK);Takahashi et al.的美國專利申請No.5，032，511;Ogata et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，883392-3396，1991(HCV-Hh);和國際申請No.PCT/US88/04125)。
NANBV基因組含有一個編碼單一多蛋白的正鏈RNA分子。認為NANBV的基因產物既包括結構(C和E)也包括非結構(NS)蛋白質，基于表征過的，相關病毒的同源性。從這些同原性，可以預測，NANBV表達一個來自完整病毒基團組的單個多蛋白基因產物，然后，該多蛋白被切割成功能不同的結構和非結構蛋白質。
這種類型的病毒形態(tài)形成，阻礙了在個體成熟病毒蛋白被物理分離和表征之前作出可靠的鑒定。由于還沒有供NANBV用的體外繁殖病毒培養(yǎng)系統(tǒng)，因此，還沒有從生物樣品或NANBV-感染細胞中分離出NANBV結構或非結構基因產物。因此，NANBV蛋白質的鑒定，它們在病毒生命循環(huán)中的作用，以及引起疾病的作用還有待于測定。尤其是，對NANBV-誘導疾病的抗原標記物仍有待全面表征。
從部分NS3和NS4基因組區(qū)得到一個稱為C100-3抗原的一種NANBV基因產物，表達為一種融合蛋白，并將其用于檢測帶各種形式NANB肝炎的患者的抗-C100-3-抗體(參見如，Kuo et al.，Science，244362-364(1989);和國際申請No.PCT/US88/04125)。由Ortho Diagnostics，Inc.(Raritan，NJ)生產，可從市場上買到以C100-3抗原為基礎的診斷檢測。
這種C100-3檢測目前代表本領域在檢測NANBV感染方面的狀況。然而，已經報道C100-3抗原為基礎的免疫檢測僅僅能從慢性感染患者的血清中較好地檢測抗體。因為，肝炎發(fā)病后，一般4到6個月才發(fā)生C100-3血清轉換，因此，C100-3檢測不能檢測急性NANBV感染。另外，C100-3檢測包括范圍過分寬。其中用C100-3-為基礎的免疫檢測測定帶自體免疫慢性活性肝炎或由因子而不是NANBV引起的其它肝病的患者體內的抗體時，報道過假陽性結果(參見如，Alter et al.，New Eng.J.Med.，3211538-39(1989);Alter et al.，New Eng.J.Med.，3211494-1500(1989);Weiner et al.，Lancet，3351-3(1990);McFarlane et al.，Lancet，335754-757(1990);和Greyet al.，Lancet，335609-610(1990))。
一方面，本發(fā)明提供一種NANBV中國和朝鮮分離種群特定的分離肽(即，在日本或美國NANBV分離種群中沒有)，將該分離肽稱作HCV-PRC-Korean特有肽并且其氨基酸殘基序列為Gly-Gly-Ala-Ala-Xaa-Arg(SEQ ID NO17)其中Xaa是Gly或Ala;或Thr-Ala-Thr-Ala-Pro-Pro(SEQ ID NO64)。
本發(fā)明也提供一種含HCV-PRC-Korean特有肽的約25個氨基酸殘基的分離肽，該分離肽選自一組由SEQ ID NO2的從殘基約385到殘基約410，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8和SEQ ID NO10組成的氨基酸殘基序列。
本發(fā)明另外提供一種包括SEQ ID NO17氨基酸殘基序列的從6到約511氨基酸殘基的分離肽，該分離肽的其余氨基酸殘基定義一個NANBV結構蛋白或多蛋白。較好地是，結構蛋白質是HCV-PRC E2蛋白，該蛋白含有SEQ ID NO2從約381到約511殘基的氨基酸殘基序列。而多蛋白是HCV-PRC多蛋白，該蛋白含有SEQ ID NO2從殘基1到殘基511的氨基酸殘基序列。
另一方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，該融合蛋白包含將第一肽部分人工連接到第二肽部分;所述的第一肽部分定義非-HCV-PRC-Korean特有肽或鍵合于第二肽部份的蛋白肽的氨基酸殘基序列;所述的第二肽部分含有包括SEQ ID NO17氨基酸殘基序列在內的從6到約511氨基酸殘基，且其其余殘基定義一個NANBV結構蛋白或多蛋白。
優(yōu)選第二肽部分是選自一組由SEQ ID NO17，約385到約410殘基的SEQ ID NO2，從約381到約511殘基的SEQ ID NO2，從1到約511殘基的SEQID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8和SEQ ID NO10組成的氨基酸殘基序列。
優(yōu)選第一肽部分定義為一種切割的HCV-PRC E1結構蛋白并且有從約191到327殘基的SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列。
另一方面，本發(fā)明提供與NANBV的HCV-PRC和Korean分離種群發(fā)生免疫反應而不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-BK，HCV-JH或HCV-Hh反應的抗體分子。優(yōu)選抗體分子是一種抗(ⅰ)一種分離肽，或(ⅱ)一種融合蛋白的單克隆抗體，所述的一種分離肽含有包含SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列的從6到約511氨基酸殘基，并且其其余殘基定義NANBV的結構蛋白或多蛋白，所述的融合蛋白包括SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列。
另外本發(fā)明提供一種含有免疫有效量的前述肽或融合蛋白的接種物，所述的肽或融合蛋白或者單獨地或者與一種抗原載體連接并分散在藥物學可接受的賦形劑中。
本發(fā)明另外提供一種在哺乳動物中誘導抗體生產的方法，所述的抗體與NANBV的HCV-PRC或Korean分離種群發(fā)生免疫反應但不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-BK，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應，該方法包括步驟(a)給哺乳動物施用上述的接種物;且
(b)在哺乳動物體內保持足夠的時間以便產生免疫應答并產生NANBV抗體的抗-HCV-PRC或抗-Korean分離種群。
另外，本發(fā)明以藥盒形式提供一種檢測體液樣品中抗體存在的診斷系統(tǒng)，所述的抗體與NANBV的HCV-PRC或Korean分離種群發(fā)生免疫反應但不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-BK，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應，該系統(tǒng)含有上述的足夠量的分離肽或融合蛋白，所述的足夠量是指至少完成一個檢測的量。
本發(fā)明也提供一種檢測身體樣品中抗體存在的方法，所述的抗體與NANBV的HCV-PRC或Korean分離種群發(fā)生免疫反應但不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-BK，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-JH或HCV-Hh反應，該方法包括(a)通過將身體樣品與(ⅰ)一種分離肽，或(ⅱ)一種融合蛋白混合形成一種含水免疫反應混合物，所述的(ⅰ)一種分離肽含有包含SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列的從6到約511氨基酸殘基，并且其其余殘基限定NANBV結構蛋白或多蛋白，所述(ⅱ)融合蛋白包括SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列;
(b)將含水的免疫反應混合物保持一段足夠長的時間以便存在的任何抗體均能與肽或融合蛋白發(fā)生免疫反應以形成免疫反應產物;和(c)檢測是否存在任何形成的免疫產物并由此檢測抗體的存在。
本發(fā)明以藥盒形式也提供一種檢測體液樣品中是否存在NANBV HCV-PRC或Korean分離種群的診斷系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有足夠量完成一種檢測的與NANBV HCV-PRC或Korean分離種群發(fā)生免疫反應，但不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-BK，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-JH，或HCV-Hh發(fā)生免疫反應的抗體分子，比較適宜的是，抗體分子是一種抗本發(fā)明分離肽或融合蛋白的單克隆抗體。
另外本發(fā)明提供一種包含約18到1665核苷酸堿基對的分離DNA分子，該DNA分子編碼包括HCV-PRC-Korean獨特肽的HCV-PRC的氨基酸殘基序列。比較好的是，該分離的DNA分子有SEQ ID NO65，從約1266堿基位到1343堿基位的SEQ ID NO1，從約1254堿基位約1646堿基位的SEQ ID NO1，從約114堿基位到約1646堿基位的SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13和SEQ ID NO15的核苷酸堿基序列。
本發(fā)明也提供一種檢測身體樣品存在HCV-PRC-Korean獨特核酸分子(即，在NANBV中國和朝鮮分離種群中存在，但在NANBV日本或美國分離種群中不存在的核酸分子)的方法，該方法包括(a)通過將上述的本發(fā)明分離DNA分子與身體樣品混合形成一種含水的雜交混合物;
(b)將該含水雜交混合液在雜交條件下保持一段足夠長的時間以便存在的任何HCV-PRC-Korean獨特核酸分子均能與DNA分子雜交形成雜交產物;和(c)檢測任何形成的雜交產物的存在并由此檢測HCV-PRC-Korean獨特核酸分子的存在。
另外本發(fā)明還提供SEQ ID NO62的分離RNA分子。
在作為說明書一部分的附圖中

圖1是HCV基因組和稱作A到E的HCV-PRC1克隆cDNA片段的定位的圖解。帶有HCV-編碼多蛋白推測區(qū)的這些片段表現(xiàn)呈直線，A，B，C，D和E片段的大小分別是617堿基對(bp)，366bp，309bp，540bp和652bp。
圖2是一個條形圖，它比較四種中國分離種群(HCV-PRC1，HCV-PRC3，HCV-PRC4和HCV-PRC11)的V3區(qū)和NANBV美國(HCV-1和HCV-J)日本(HCV-BK)分離種群的V3區(qū)之間氨基酸殘基序列同源程度。
A定義氨基酸本文鑒定的所有氨基酸殘基均是自然界中的L-異構構型。為了與標準多肽命名法(J.Biol.Chem.，2433557-59，(1969))一致，在下列表中列出了氨基酸殘基的縮寫附加表1個字母代號 3個字母代號 氨基酸Y Tyr L-酪氨酸G Gly L-甘氨酸F Phe L-苯丙氨酸M Met L-蛋氨酸A Ala L-丙氨酸S Ser L-絲氨酸I Ile L-異亮氨酸
L Leu L-亮氨酸T Thr L-蘇氨酸V Val L-纈氨酸P Pro L-脯氨酸K Lys L-賴氨酸H His L-組氨酸Q Gln L-谷氨酰胺E Glu L-谷氨酸Z Glx 谷氨酰胺或谷氨酸W Trp L-色氨酸R Arg L-精氨酸D Asp L-天冬氨酸N Asn L-天冬酰胺B Asx 天冬氨酸或天冬酰胺C Cys L-半胱氨酸X Xaa 未知或其他應該說明的是本文中一般作為“殘基序列”提到的所有氨基酸殘基序列在本文中通過結構式表示，該序列從左到右的取向是氨基末端到羧基末端的標準方向。
抗原一種能與抗體特異性結合(與其免疫反應)并形成一種免疫反應產物(免疫復合體)的多肽或蛋白質?？乖c抗體結合的位點叫作抗原決定基或表位。
核苷酸由一個糖部分(戊糖)，一個磷酸基團，和一個含氮雜環(huán)堿基組成的DNA或RNA的單體單元。經配糖碳(戊糖的1′碳)堿基與糖部分連接，而堿基與糖結合便是核苷。當核苷包含一個與戊糖的3′或5′位結合的磷酸基團時，就叫做核苷酸。由核苷酸人工連接成的序列本文中一般稱作“堿基序列”，并且在本文中由結構式表示，該結構式從左到右的取向是5′-末端到3′-末端的標準方向。
雙鏈DNA一種含有兩個本質上互補的多核苷酸鏈的雙鏈核酸分子，以兩個鏈的堿基成對存在的互補核苷酸之間通過形成氫鍵而雜交在一起。由于形成堿基對的核苷酸可以是核糖核苷酸堿基或脫氧核糖核苷酸堿基，因此，術語“雙鏈DNA”是指兩個DNA鏈(ds DNA)的DNA-DNA雙鏈，或者是指含一個DNA和一個RNA鏈的RNA-DNA雙鏈。
堿基對(bp)在雙鏈DNA分子中，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)配對，或胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)配對。在RNA中，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶。
互補核苷酸序列在單鏈DNA或RNA分子中的核苷酸序列足以與另一單鏈互補，通過隨后形成的氫鍵特異性地(非隨機地)雜交在一起。
雜交互補核苷酸序列(核酸鏈)成對，通過在互補堿基對之間/中間形成氫鍵，而形成雙鏈，雜雙鏈或包含多于兩個單鏈核酸的復合體。它是一種可以競爭性地被抑制的互補多核苷酸之間/中間的特異性(即非隨機)的相互作用。
雜交產物當多核苷酸與單鏈或雙鏈核酸雜交時形成雜交產物。當多核苷酸與雙鏈核酸雜交時，形成的雜交產物稱作三螺旋或三鏈核酸分子(Moser et al.，Science，238645-50(1987))。
核苷酸類似物結構上與A，T，G，C或U不同，但具有足夠的相似性可取代核酸分子中的正常核苷酸的嘌呤或嘧啶核苷酸。次黃嘌呤(Ⅰ)是一種能與其他任何核苷酸A，T，G，C或U形成氫鍵的核苷酸。另外，已經知道甲基化的堿基在核酸雜交中也能使用。
多蛋白質在多順反子RNA上，通過兩個或多個相鄰基因的非間斷轉譯生產的蛋白質通過多蛋白的后轉譯或共轉譯裂解分離單獨的基因產物。
本發(fā)明提供有關NANBV中國分離種群的組合物和方法，本文中將該分離種群稱為HCV-PRC。具體說來，本發(fā)明提供分離的HCV-PRC核酸、蛋白質和肽分子，含上述分子的組合物以及在診斷和治療HCV感染中使用上述分子的方法。
關于本文所用的核酸，蛋白質和肽分子，術語“分離的”是指上述分子基本上不含其它類似分子，所述的類似分子不包含本文中特定的特定核苷酸或氨基酸殘基序列，不論這些特定序列是以顆粒制劑，組合物還是溶液-懸浮液形式存在。所用的短語“基本上沒有”是指特定的分離分子是以大于類似分子總重量50%且最好是大于90%的量存在。
本文中所用的術語“HCV-PRC”一般指NANBV中國分離種群。術語“HCV-PRC1，HCV-PRC3，HCV-PRC4和HCV-PRC11”指HCV-PRC的個別例子(參見下文的實施例1)。
表示編碼HCV-PRC基因組(HCV-PRC1)結構區(qū)的分離的DNA分子是SEQ ID NO1從1位到1665位堿基。由SEQ ID NO1的DNA分子編碼的RNA分子表示在SEQ ID NO62中。SEQ ID NO2從氨基酸殘基1到氨基酸殘基511表示由DNA分子編碼的多蛋白。
SEQ ID NO2的多蛋白含有三個稱作衣殼、包膜-1(E1)和包膜-2(E2)蛋白的結構蛋白。衣殼蛋白有SEQ ID NO2的從1到約190殘基氨基酸殘基序列。E1蛋白含有SEQ ID NO2從約191到約380殘基的氨基酸殘基序列。E2蛋白含有SEQ ID NO2從約381到511殘基的氨基酸殘基序列。
本發(fā)明的分離核酸、蛋白和肽分子總的特征為對中國和朝鮮分離種群是特有的(即存在于NANBV的HCV-PRC和朝鮮分離種群，而不存在于NANBV的日本和美國分離種群)、對NANBV的中國和日本分離種群是特有的(不存在于NANBV的美國分離種群)或對HCV是特有的(即存在于NANBV，但不存在于甲型肝炎或乙型肝炎病毒分離種群中)。
1.中國和朝鮮分離種群獨特性a.分離的肽在一個實施方案中，本發(fā)明提供只有NANBV HCV-PRC和朝鮮分離種群才有的并用于將NANBV中國和朝鮮種群與NANBV美國和日本分離種群相區(qū)別的分離核酸，蛋白質和肽分子。本文將這些分子稱作“HCV-PRC-Korean特有”。
由HCV-PRC基因組結構區(qū)的VO區(qū)編碼一種上述的HCV-PRC-Korean特有肽并且其氨基酸殘基序列為Gly-Gly-Ala-Ala-Xaa-Arg(SEQ ID NO17)其中，Xaa是Ala或Gly。在HCV-PRC1(SEQ ID NO2的388到393殘基)，HCV-PRC3(SEQ ID NO6的3到8殘基)，HCV-PRC4(SEQ ID NO8的殘基4到9)，HCV-PRC11(SEQ ID NO10的殘基4到9)以及NANBV朝鮮分離種群中發(fā)現(xiàn)上述氨基酸殘基序列，但在NANBV美國和日本分離種群中沒有發(fā)現(xiàn)(參見本文實施例2)。
另一個只有NANBV HCV-PRC和朝鮮分離種群才有的肽是由部分V3區(qū)編碼的，且其氨基酸殘基序列為Thr-Ala-Thr-Ala-Pro-Pro(SEQ ID NO64)。在HCV-PRC1(SEQ ID NO4的殘基9到14)，HCV-PRC3(SEQ ID NO12的殘基9到14)，HCV-PRC4(SEQ ID NO14的殘基9到14)，HCV-PRC11(SEQ ID NO16的9到14)和NANBV朝鮮分離種群中發(fā)現(xiàn)上述氨基酸殘基序列，但在NANBV非中國非朝鮮分離種群中沒發(fā)現(xiàn)上述氨基酸殘基序列。
因此，本發(fā)明提供一種有SEQ ID NO17或SEQ ID NO64氨基酸殘基序列的分離HCV-PRC-Korean特有肽。
本發(fā)明也提供一種約25個氨基酸殘基的分離肽，該肽包括一個只有NANBV的HCV-PRC和Korean分離種群才有的氨基酸殘基序列。優(yōu)選肽是由HCV-PRC基因組的V0區(qū)編碼的并且選自由SEQ ID NO2的殘基385到410，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8和SEQ ID NO10組成的一組序列。
本發(fā)明也提供一種從6到約511氨基酸殘基的分離肽，該肽包括SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列并且其其余的氨基酸殘基定義NANBV結構蛋白或多蛋白。
在一個優(yōu)選的實施方案中，上述一種分離肽有HCV-PRC包膜蛋白的氨基酸殘基序列。在SEQ ID NO2的從殘基約381到約511中表示HCV-PRC包膜蛋白E2的氨基酸殘基序列。
在另一實施方案中，上述一種分離的肽有如在SEQ ID NO2的從殘基1到殘基511所示的HCV-PRC多蛋白的氨基酸殘基序列。
一種分離的HCV-PRC-Korean特有肽可以是融合蛋白的一部分。短語“融合蛋白”涉及一種通過肽鍵將第一肽部分與第二肽部分人工連接形成的蛋白質，該蛋白質定義一種如上文公開的HCV-PRC-Korean特有肽。
第一肽部分為非-HCV-PRC-Korean特有氨基酸殘基序列。一種優(yōu)選的第一肽部分其氨基酸殘基序列相當于一種免疫學上惰性的非-HCV蛋白質的全部或部分氨基酸序列。一種優(yōu)選的免疫學上惰性的非HCV蛋白質是蛋白質谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，在SEQ ID NO63中表示了它的氨基酸殘基序列。
換言之，第一肽部分有一種不包括HCV-PRC-Korean特有肽的HCV-PRC的氨基酸序列。一種優(yōu)選的上述第一肽部分定義為全部或部分的HCV-PRC E1結構蛋白。一種特別優(yōu)選的上述第一肽部分定義為一種沒有膜結合區(qū)的平頭HCV-PRC E1蛋白。在SEQ ID NO12的從殘基約191到約327顯示一種優(yōu)選的平頭E1蛋白質的氨基酸殘基序列。
在融合蛋白中定義HCV-PRC-Korean特有肽的優(yōu)選第二肽部分包括SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列。
在一個實施方案，一種融合蛋白可以包含一個以上定義HCV-PRC-Korean特有肽的肽部分。
b.分離的核酸分子在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離核酸分子，該核酸分子的核苷酸序列是只有NANBV的HCV-PRC和Korean分離種群才有的(即，一種HCV-PRC-Korean特有的核酸)。最好是，上述核酸分子編碼一個前面所述的HCV-PRC-Korean特有肽。
優(yōu)選編碼有SEQ ID NO17或SEQ ID NO64氨基酸殘基序列的肽的分離核酸。
一種優(yōu)選的編碼SEQ ID NO17肽的核酸分子是一種有下列核苷酸堿基序列的分離DNA分子GGGGGGGCGGCRGSCCGC(SEQ ID NO65)其中R是A或G，S是C或G。在HCV-PRC1(SEQ ID NO1的1275到1292位堿基)，HCV-PRC3(SEQ ID NO5的25到42位堿基)，HCV-PRC4(SEQ ID NO7的56到73位堿基)，和HCV-PRC11(SEQ ID NO9的25到42位堿基)中發(fā)現(xiàn)上述核苷酸堿基序列。
一種編碼SEQ ID NO65的肽的優(yōu)選核酸分子是一種有下列核苷酸堿基序列的分離DNA分子ATCGTCRGCCGYCGACAG(SEQ ID NO66)
其中R是G或A，Y是C或T。在HCV-PRC1(SEQ ID NO3的25到42位堿基)，HCV-PRC3(SEQ ID NO11的25到42位堿基)，HCV-PRC4(SEQ ID NO13的25到42位堿基)和HCV-PRC11(SEQ ID NO15的25到42位堿基)中發(fā)現(xiàn)上述核苷酸堿基序列。
本發(fā)明也提供一種包括SEQ ID NO65的核苷酸堿基序列的，從約75到約300核苷酸堿基對的分離DNA分子。這種典型核苷酸序列編碼HCV-PRC基因組的V0區(qū)并且包括SEQ ID NO1的從約1269堿基到約1343位堿基，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5和SEQ ID NO7核苷酸堿基序列。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種從約18到約1665堿基對的分離核酸分子，該核酸分子包括SEQ ID NO65的核苷酸堿基序列并且其其余的堿基編碼NANBV基因組序列。一種優(yōu)選的分離的核酸分子編碼一個HCV-PRC E2結構蛋白或HCV-PRC多蛋白。在SEQ ID NO1中從1254位堿基到約1646位堿基顯示編碼HCV-PRC E2蛋白的核苷酸堿基序列。在SEQ ID NO1中從約114位堿基到約1646位堿基顯示編碼HCV-PRC多蛋白的核苷酸堿基序列。
c.制備分離分子的方法可以用本領域專業(yè)人員已知的標準方法制備分離HCV-PRC-Korean特有肽，融合蛋白和核酸分子。從分離的病毒能夠很容易地制備本發(fā)明的分離核酸分子如DNA，所述的分離病毒是從中國分離種群NANBV-感染個體的(如下文所述，參見實施例1)血液中得到的，或可以通過化學方法重頭合成本發(fā)明的分離核酸分子。
例如可以利用自然產生的限制酶位點的有利條件，從SEQ ID NO1的DNA序列得到編碼某種HCV-PRC肽的DNA分子。用XcaⅠ和StuⅠ消化SEQ ID NO1 DNA分子產生可用于適當表達載體的有843堿基對平頭末端的DNA片段，可以得到編碼一種肽的核酸序列，所述的肽有SEQ ID NO1 201殘基以上的整個殘基的氨基酸殘基序列。
當在所需的位置沒有用于表達特定肽的自然產生的限制酶位點時，通過體外誘變技術，將上述限制酶位點引入到已知序列的DNA分子。根據(jù)上述方法，合成一個含所需限制位點序列和已知序列的寡核苷酸。用足夠長的側序列構建含新的限制酶位點的寡核苷酸以便達到與已知的靶天然序列充分雜交，而完成隨后的步驟。
與含非突變、野生型序列的單鏈模板雜交后，用T4DNA聚合酶延伸寡核苷酸引物以便形成帶1個或多個堿基錯配的雜雙鏈分子。通過將雜雙鏈分子轉染到適當?shù)腅.coli細胞中，固定由寡核苷酸引入突變的結果造成的上述錯配。通過上述過程破壞了模板鏈，而保留了含引入突變的互補鏈。因此，“固定”了突變并可分離含所需突變的質粒并定序證實存在適當?shù)男蛄小?br> 可在Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York 1989一書中找到完整的體外誘變方法和合成寡核苷酸的方法。
由于編碼序列將保留在表達多肽的框架中，所以引入平頭末端產生的限制位點使其大大容易克隆到表達載體中。因此，大多數(shù)被引入的限制位點是與平頭末端產生的限制酶相對應的。
通過實施例，為了在ID NO1的約676位堿基到約681位堿基引入一個有用的限制酶位點，在上述的體外誘變方法中使用下列的寡核苷酸序列Tyr Ala Tyr Glu (SEQ ID NO:71)ACC CCA GTA TAC GCT TAT GAA (SEQ ID NO:72)Xca I用粗黑體字表示的核苷酸說明相對于天然序列(SEQ ID NO1的669位堿基到692位堿基)有變化的堿基。突變結果，在表達的突變肽中的第一個氨基酸是酪氨酸，而在未突變的序列中，起始位置則編碼絲氨酸。趨于保守的這種氨基酸的取代作用并不影響形成肽的免疫反應活性。
可以在SEQ ID NO1的3′末端附近引入另一個限制位點以便產生編碼一種肽的DNA分子，所述的肽有SEQ ID NO2從約190到約511殘基的氨基酸殘基序列。例如使用下列誘變寡核苷酸在SEQ ID NO1的1644-1649位堿基引入StuⅠ位點Thr Pro ArgACC CCA AGG CCT GTTGTG (SEQ ID NO:73)Stu I用黑體字表示的核苷酸是變換的堿基。在該肽序列中的最后一個氨基酸(SEQ ID NO2的511殘基)從絲氨酸變精氨酸。用XcaⅠ和StuⅠ處理所得的DNA，得到一個編碼氨基酸191到511的序列。將因此產生的平頭末端片段克隆到一個適當?shù)钠筋^末端表達載體中。可以通過限制酶分析或測序所得構建體驗證插入序列的取向。
根據(jù)上述同樣的方法，用適當設計的誘變寡核苷酸，可以將限制位點插入到SEQ ID NO1的DNA分子的其它位點。例如，用下列誘變寡核苷酸可以將NaeⅠ位點引入到SEQ ID NO1的約1247位堿基到約1256位堿基Ala Gly ValCTC TTT GCC GGC GTT (SEQ ID NO:74)Nae I核苷酸序列中的這種變換可將SEQ ID NO2的380位氨基酸殘基從甘氨酸變成丙氨酸。
用下列誘變寡核苷酸可以在SEQ ID NO1的約1266位堿基到1271位堿基插入NspBⅡ限制位點Arg Val GlyGAT GGG ACA CCG CGC GTA GGG (SEQ ID NO:75)NspB II通過上述變化不改變SEQ ID NO2的386位氨基酸殘基。用下列誘變寡核苷酸可以在SEQ ID NO1的約1344位堿基到約1349位堿基插入PvuⅡ位點Asn Ile GlnAAC ATC CAG CTG GTG AAC (SEQ ID NO:76)Pvu II通過這種方法不改變SEQ ID NO2的第411位氨基酸殘基?？墒褂肗spBⅡ和PvuⅡ遺傳工程位點從SEQ ID NO1制備的DNA分子用于生產一種重組肽，該肽有SEQ ID NO2從約386位殘基到411位殘基的氨基酸殘基序列。
用下列誘變寡聚核苷酸，通過在SEQ ID NO1的約1274位堿基到約1279位堿基引入SmaⅠ限制位點并在SEQ ID NO1的約1288位堿基到約1293位堿基引入NarⅠ位點，可以得到編碼SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列的DNA分子Gly AlaACA ACC CGC CCC GGG GCG (SEQ ID NO:77)Sma IAla ArgGCG GCC CGG CGC CCC AGC (SEQ ID NO:78)Nar I該變換也未改變形成的肽的氨基酸殘基序列。用NarⅠ處理得到一個末端帶5′懸重2堿基的DNA片段。根據(jù)標準方法可以用S1核酸酶處理DNA除去上述懸重末端?？梢詫⒋?4堿基對的序列與其它有用序列相連以產生新的融合蛋白。
通過其它實施例，可以用下列誘變寡聚核苷酸在SEQ ID NO1的約1092位堿基到約1097位堿基插入一個NruⅠ限制位點Asn Trp SerAAC TGG TCG CGA ACA ACG GCC (SEQ ID NO:79)Nru I當進一步加工有該NruⅠ位點的構建體使具有上述的XcaⅠ位點時，產生一個編碼切成平頭的HCV-PRC E1結構蛋白的DNA分子，該結構蛋白有SEQ ID NO2從約191殘基到約327殘基的氨基酸殘基序列。用XcaⅠ和NruⅠ切割所得的構建體產生一個約414堿基對的DNA片段。然后根據(jù)標準方法，將上述54堿基對片段(用NarⅠ和SmaⅠ制備的)與該414堿基對片段平頭末端連接，并將所得的約468堿基對片段插入到平頭末端的表達載體中。所得的構建體包含框架中的全部編碼區(qū)以產生一個融合蛋白，該融合蛋白包含在框架中融合190-327氨基酸殘基于SEQ ID NO2的388到393氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^限制酶分析或DNA定序驗證各個DNA片段的取向。
上述公開的內容假設所選擇的表達載體包含所需DNA片段可以克隆進去的平頭末端限制酶位點。但是，如果得不到上述位點，則可以加入將限制酶位點加到末端的接頭來進一步修飾欲克隆的DNA末端。商業(yè)上可從，如New England Biolabs買到這些接頭。檢查所選擇的被表達序列和表達載體以便確定哪個位點最適于克隆。一旦選定位點，隨后進行操作以便保持用于所得構建體的適當讀碼。用這種方法，所得的肽的序列是正確的。
使用任何適當?shù)姆椒?，如磷酸三酯或磷酸三酯法都可以完成DNA分子的從頭化學合成(參見Narang et al.，Meth.Enzymol.6890(1979);美國專利No4，356，270;Itakura et al.，Ann.Rev.Biochem.，53323-56(1989);Brown et al.，Meth.Enzymol.，68109，(1979);和Matteucci et al.，J.Am.Chem.Soc.，1033185(1981)，本文引述的現(xiàn)有技術均引入本文作為參考)。通過化學合成結構基因部分，通過用適當?shù)膲A基取代那些編碼天然氨基酸殘基的堿基，可以很簡單地完成所需的修飾。通過首先合成相當于部分DNA分子的寡聚核苷酸，然后通過雜交和連結將該寡核苷酸裝配在一起形成一個完整的DNA分子來制備DNA分子。上述方法也是本領域專業(yè)人員已知的，參見如Paterson et al.，Cell 48441-452(1987);和Lindley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，859199-9203(1988)，其中介紹在大腸桿菌中表達化學合成的基因來生產重組肽，中性白細胞活性因子。
可以用多肽領域專業(yè)技術人員已知的任何技術合成本發(fā)明的分離肽或融合蛋白。由于純度，抗原特異性，沒有副產物，容易生產及類似的原因，如固相Merrifield-型合成法這類合成化學技術是優(yōu)選的，可以按照Merrifield et al.，在J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)和Houghten et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.，16311-320(1980)中描述的方法來完成?？梢詮腏.M.Steward和J.D.Young的“Solid Phase Peptide Synthesis”，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1969;M.Bodanszky et al.的“Peptide Sythesis”，John Wiley & Sons，Second Edition，1976和J.Meienhofer的“Hormonal Proteins and Peptides”，Vol.2，P.46Academic Press(NY)，1983這些書中找到有關固相肽合成，以及從E.Schroder和K.Kubke，“The peptides”，Vol.1，Academic Press(New York)(1965)一書中找到有關經典的溶液合成的許多適用技術的優(yōu)秀概括，上述每篇文獻均引入本文作為參考。
在上述書中和J.F.W.McOmie的“Protective Groups in Organic Chemistry”，Plenum Press，New York.1973(該文獻引入本文作為參考)中描述了在上述合成中可以使用的適當?shù)谋Ｗo基團。
另外可以以重組形式制備本發(fā)明的分離肽和融合蛋白。
由本發(fā)明提供的制備上述重組肽或融合蛋白的方法包括首先從培養(yǎng)包含宿主細胞(優(yōu)選大腸桿菌細胞)的營養(yǎng)培養(yǎng)基開始，用表達HCV-PRC-Korean獨特肽或融合蛋白的重組DNA分子轉化所述的宿主細胞。將培養(yǎng)物保持一段足夠長的時間以便被轉化的細胞能夠表達HCV-PRC-Korean獨特肽或融合蛋白。
上述方法中所用的重組DNA(rDNA)分子包括人工連接到一載體上的本發(fā)明的DNA分子。優(yōu)選本發(fā)明的rDNA在相容的宿主中直接表達本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽。在rDNA分子中所用的，優(yōu)選的DNA分子是上文中描述的那些DNA分子。然后從培養(yǎng)物中回收被表達的肽或融合蛋白。
HCV-PRC包膜蛋白含有可將這些蛋白固著于細胞膜(如，內質網)上的粘連區(qū)并且使得很難回收被表達的包膜蛋白。HCV-PRC E1蛋白的粘連區(qū)在E1蛋白的羧基末端(SEQ ID NO2的從約328殘基到380殘基)。HCV-PRC E2蛋白的粘連區(qū)定位于SEQ ID NO2的從511殘基朝向羧基末端的地方。
為了利于回收重組包膜蛋白，因此，優(yōu)選缺失上述粘連區(qū)的重組包膜蛋白。一種制成切成平頭的E1肽優(yōu)選含有SEQ ID NO2的從約191殘基到約327殘基的氨基酸殘基序列。一種切成平頭的E2肽優(yōu)選含有SEQ ID NO2的從約381殘基到約511殘基的氨基酸殘基。
在SEQ ID NO1中從約684位堿基到約1094位堿基顯示編碼切成平頭的E1肽的核酸分子。在SEQ ID NO1中從約1254位堿基到約1646位堿基顯示編碼切成平頭的(無粘連區(qū))E2肽的核酸分子。
“直接表達”的意思是只通過轉譯形成蛋白質的成熟多肽鏈，這與從較大的轉譯前體蛋白上蛋白水解裂解兩個或多個末端氨基酸殘基不同。
用本領域專業(yè)人員已知的標準方法，通過將載體與本發(fā)明的DNA分子人工連接在一起生產本發(fā)明的重組DNA分子。
本文所用的術語“載體”是指在細胞中能夠自我復制的DNA分子，并能將其與另一DNA分子人工連接以便能夠帶動復制連接分子。典型的載體是質粒、噬菌體和類似物。能夠直接表達分離肽或融合蛋白的載體本文稱為“表達載體”。因此，重組DNA分子(rDNA)是一種含有天然情況下一般不在一起的至少兩種核苷酸序列的雜交DNA分子。
與本發(fā)明的DNA片段人工相連的載體的選擇直接取決于(如本領域專業(yè)人員已知的)所需的功能特性，如蛋白表達，被轉化的宿主細胞這些現(xiàn)有技術中構建重組DNA分子的固有限制條件。然而，本發(fā)明提供的載體至少能夠直接復制，并且最好也能表達包括在載體所人工連接的DNA片段中的重組肽結構基因。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的載體包括一種原核復制子(ori)，即在以此轉化的原核宿主細胞，如細菌宿主細胞中，DNA序列有染色體外直接自我復制并維持重組DNA分子的能力。上述復制是現(xiàn)有技術中已知的。另外，這些包含原核復制子的實施方案一般也包括表達后可使用來轉化的細菌宿主細胞具有藥物抗性的一種基因。在這些載體中一般所用的細菌藥物抗性基因是具有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的基因。典型的上述載體質粒是從Biorad Laboratories(Richmond CA)可得到的pUC8，pUC9，pBR322和pBR329。
包括原核復制子的那些載體也可以包括用以轉化的細菌宿主細胞，如大腸桿菌中能夠直接表達(轉錄和轉譯)編碼中國分離種群NANBV肽基因的原核啟動子。啟動子是由可以結合RNA多聚酶并隨后開始進行轉錄的DNA序列形成的一種表達控制元素。在包含能方便插入本發(fā)明DNA片段的限制位點的質粒載體中，一般提供與細菌宿主相容的啟動子序列，插入本發(fā)明的DNA片段是方便的。從Pharmacia(Piscataway，NJ)可得到一種典型的載體pPL-λ。
具有用IPTG可誘導的細菌啟動子的載體質粒是從Amersham(Arlington Heights，IL)得到的pTTQ質粒和從Pharmacia得到的pKK223-3質粒。其它的在原核細胞中用于生產克隆基因產物的表達載體是已知的并且是市場上可得到的。
從培養(yǎng)物中回收表達蛋白質的方法是現(xiàn)有技術已知的，并且包括用已知的生物化學技術如凝膠過濾，凝膠層析，超過濾，電泳，離子交換，親和層析等等方法分離培養(yǎng)物中含蛋白質的部分。另外，也可使用免疫化學法，如免疫親和，免疫吸附等方法。
按照上述的方法也可以以重組形式制備本發(fā)明的融合蛋白。
雖然可以用其它功能等同表達載體，但用上法中的優(yōu)選表達載體pGEX-3X和pGEX-2T優(yōu)選生產本文描述的融合蛋白。功能等同的表達載體包含一個可由IPTG誘導的用于在大腸桿菌中表達融合蛋白的表達啟動子和一種這樣的適宜構型，以便一旦將DNA片段插入載體中時，便能生產融合蛋白。市場上可得到的與本文所用的載體pGEX-3X和pGEX-2T功能等同的載體包括來自Promega(Madison，WI)的pGEMEX-1質粒載體(該載體能供T7基因10蛋白的氨基末端部分與被克隆的插入基因間產生融合)，來自NewEnglemd Biolabs(Beverly，MA)的pMAL質粒載體(該載體可產生同由mal E基因編碼的麥芽糖結合蛋白(MBP)的融合)，以及由Pharmacia提供的產生與酶谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合的pGEX-3X和pGEX-2T質粒。
已經由Smith et al.在Gene 6731-40(1988)中描述過pGEX-3X和pGEX-2T載體的構建和使用，該文獻引入本文作為參考。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，一種融合蛋白包含一種當附加的功能區(qū)人工連接到本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽上時的肽部分衍生GST。任何可啟動載體如上文描述的載體pTTQ，pKK223-3，pGEX-3X，或pGEX-2T和類似的載體的可誘導啟動子均可用于表達本發(fā)明的融合蛋白。因此，雖然pGEX-3X和pGEX-2T載體是被作為實例描述，但構建本發(fā)明的DNA分子并不限于上述載體，因為在一個實施方案中，本發(fā)明直接針對用于與GST融合的具有HCV-PRC-Korean特有肽的蛋白表達的rDNA而不側重載體本身。
已經發(fā)展了各種經互補粘性末端人工連接DNA片段與載體的方法。例如，可以將互補同聚物系加到準備插入的DNA片段和載體DNA上。然后通過互補同聚物尾之間的氫鍵，載體與DNA片段便連接在一起形成重組DNA分子。
含一個或多個限制位點的合成接頭提供了另一種連接DNA片段與載體的方法。一般，用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I(利用其3′-5′核外溶解(exonucleolytic)活性除去突起3′單鏈末端和用其聚合活性填平3′末端缺口的酶)處理由核酸內切酶限制消化產生的DNA片段。
因此這些活性結合產生了平頭末端DNA片段。然后在催化平頭末端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶存在的情況下，將平頭末端片段與大量過量的接頭分子一起培養(yǎng)。因此，反應的產物是在其末端帶聚合接頭序列的DNA片段。然后用適當?shù)南拗泼噶呀膺@些DNA片段并將其與用能產生與這些DNA片段末端相容的末端的酶裂解的表達載體連接。
可以從包括International Biotechnologies，Inc.New.Haven，CN的許多商業(yè)上來源得到含各種限制性核酸內切酶位點的合成接頭。
本發(fā)明也提供一種用本發(fā)明的重組DNA分子轉化的原核宿主細胞。在轉化宿主細胞中所用的優(yōu)選的rDNA分子是本文前面所述的那些rDNA分子，并且優(yōu)選能表達重組體或融合蛋白的rDNA。一種優(yōu)選的轉化細胞包含具有本文前述的優(yōu)選DNA分子之一的rDNA分子。
優(yōu)選的原核宿主細胞是細菌細胞，一般是大腸桿菌菌株，如可從Bethesda Research Laboratories，Inc.，Bethesda，MD得到的大腸桿菌菌株DH5。通過一般取決于所用載體類型的已知方法來完成用本發(fā)明的重組DNA分子轉化適當?shù)乃拗骷毎ｊP于原核宿主細胞的轉化，參見，如Cohen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，692110(1972);和Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd.Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor，NY(1989)。
可以通過已知的技術鑒定被成功地轉化的細胞，即含有本發(fā)明的重組DNA分子的細胞。例如，可以分離作為單個菌落的由導入本發(fā)明的rDNA產生的細胞?？梢允占芙鈦碜赃@些菌落的細胞。并用Southern，J.Mol.Biol.，98503(1975)或Berent et al.，Biotech，3208(1985)描述的方法檢測其DNA中rDNA的存在。
除可直接檢測rDNA的存在外，當rDNA能夠直接表達HCV-PRC-Korean特有肽或融合蛋白時，可以通過已知的免疫學方法鑒別用適當?shù)膔DNA轉化的細胞。例如，用本發(fā)明的表達載體成功地轉化的細胞產生表現(xiàn)出HCV-PRC和朝鮮分離種群抗原性的肽。收集估計被轉化過的細胞樣品并使用對該抗原特異的抗體檢測HCV-PRC-Korean特有肽的存在，將在下文進一步描述所述的抗體。
因此，除了被轉化的宿主細胞本身外，本發(fā)明也提供一種在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的這些細胞的培養(yǎng)物，優(yōu)選單克隆(均質克隆)培養(yǎng)物，或從單克隆培養(yǎng)物衍生的培養(yǎng)物。最好是，該培養(yǎng)物也包含表現(xiàn)出HCV-PRC抗原性的肽或蛋白質。
用于培養(yǎng)被轉化宿主細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術已知的并可從幾種商業(yè)來源得到。
本發(fā)明的分離HCV-PRC-Korean特有核酸，肽和融合蛋白分子作診斷和治療劑使用。
d.核酸探針可以將前面所述的HCV-PRC-Korean特有核酸分子用作檢測HCV-PRC和Korean NANBV分離種群核酸分子存在的雜交探針。
本文所用的術語“探針”是一種從核酸限制消化純化的或合成生產的核苷酸堿基序列(即，聚核苷酸)，優(yōu)選長約18到200個核苷酸，它有一個與在所研究基因中存在的預定特異性核酸序列(即靶核酸)基本上互補的核苷酸堿基序列。
聚核苷酸探針必須足夠長以便能夠在雜交條件下與在所需基因組中存在的特異核酸序列雜交。聚核苷酸探針的準確長度取決于包括雜交溫度和所探測的核苷酸序列在內的許多因素。例如，取決于靶序列的復雜性，雖然聚核苷酸探針可含較少的核苷酸，但它一般含15到25或更多的核苷酸(Studier et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.866917-21(1989))。通常短的聚核苷酸探針需要較低的溫度以便與靶序列形成足夠穩(wěn)定的復合體。
在一個優(yōu)選實施方案中，聚核苷酸探針有約18個核苷酸的長度。
“基本互補”和其語法等同物是指在主體聚核苷酸探針和所研究基因中存在的特異核酸序列之間有足夠的核苷酸堿基序列相似性，在雜交條件下，所述的探針與所述的特異的核酸序列雜交并形成由探針和特異序列組成的雙鏈。
因此，雖然聚核苷酸探針序列不一定反映靶序列的精確序列，但它與靶序列有足夠的互補性以便區(qū)別靶序列和非靶序列。為了與來自NANBV的HCV-PRC核酸分子和朝鮮分離種群的核酸雜交而不與來自其它NANBV分離種群的核酸雜交，最好是探針與SEQ ID NO65或SEQ ID NO66的核苷酸堿基序列至少是90%互補。例如，可以把一個非互補聚核苷酸連接到探針的一端，而探針序列的其余部分基本上與靶序列互補。上述的非一互補聚核苷酸可以編碼核酸內切酶限制位點或蛋白質結合位點。
另外，可以將非互補堿基或較長的序列分散到探針中，提供與靶鏈序列有足夠互補性的探針序列以便在雜交條件下能用其進行非隨機雜交并形成雜交產物。
為了達到最大效率以單鏈形式提供聚核苷酸探針，但另外也可是雙鏈的。如果是雙鏈的，在用于雜交制備雜交產物前，先處理聚核苷酸探針以便分開它的鏈。優(yōu)選探針是聚脫氧核糖核酸。
本發(fā)明的聚核苷酸探針用在雜交方法中以檢測身體樣品中HCV-PRC-Korean特有核酸的存在。該方法通常包括a)將身體樣品與本發(fā)明的聚核苷酸探針混合形成含水的雜交混合物;b)將水雜交混合物在雜交條件下保持一段足夠長的時間，身體樣品中的任何HCV-PRC-Korean特有核酸能夠與混合的聚核苷酸探針雜交以形成雜交產物;和c)檢測形成的任何雜交產物的存在，并由此檢測出身體樣品中HCV-PRC-Korean特有核酸分子的存在。
只要樣品處于與核酸雜交反應相容的有關純度和濃度形式，被檢測的HCV-PRC-Korean特有核酸序列(即靶核酸序列)可以存在于任何含核酸的樣品中。將核酸分離到適于雜交的程度一般是已知的并可通過各種方法完成。例如，可以從包括身體組織如皮膚，肌肉，頭發(fā)等和體液如血液、血漿、尿、羊水、腦脊髓液等各種含核酸的樣品中分離出核酸(參見如，Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Epring Harbor Laboratory(1982);和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecules Biology，John Wiley和Sons(1987))。
在所用的方法中，將雜交反應混合物在反應條件下保持一段足夠長的時間，使聚核苷酸探針與樣品中的互補核酸序列雜交形成雜交產物，即含探針和靶核酸的復合體。
當與保持時間一起用時，短語“雜交條件”和它的語法等同物表示使雜交反應混合物(在上下文中指混合物中的反應和伴隨試劑的濃度)經受的時間、溫度和pH值條件，要足以使聚核苷酸探針與靶序列退火，一般形成核酸雙鏈。上述完成雜交所需的時間、溫度和PH條件是現(xiàn)有技術已知的并取決于用于雜交的聚核苷酸探針長度，聚核苷酸探針和靶序列之間的互補程度，聚核苷酸中的鳥嘌呤和胞嘧啶的含量，所需雜交的嚴緊度，以及影響雜交反應動力學的雜交反應混合物中存在的鹽或其它試劑。為給定的雜交反應混合物選擇最佳雜交條件的方法是現(xiàn)有技術中已知的(參見，Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)，p388)。
用相似的序列長度，那么緩沖鹽濃度和溫度則提供適用的變量以此通過雜交技術來評估序列相同性(同源性)。例如，如果有至少90%的同源性，則是在68℃，用20xssc稀釋的6xscc這樣的緩沖鹽(Maniatis et al.，上文的p447)條件下完成雜交的。最后Southern印跡洗滌所用的緩沖鹽可在低濃度，如0.1xssc使用，并在相對溫度較高如68℃，在這種條件下兩個序列形成雜雙鏈(雜交)。上述雜交和洗滌條件一起使用叫作高嚴緊度條件或高嚴緊條件。
在雜交兩個享有至少約80%同源性的序列時，可以適度地使用高嚴緊度條件。這里指在約50-55℃溫度，用6xssc完成雜交。最后的洗滌鹽濃度為約1-3xssc，而溫度為約60-68℃。將這些雜交和洗滌條件稱為適度的高嚴緊度條件。
可用低嚴緊度條件雜交兩個享有至少40%同源性的序列。這里指在40-50℃溫度，用6xssc雜交，在40-60℃溫度，最后的洗滌緩沖鹽濃度為6xssc。將這些雜交和洗滌條件稱作低嚴緊度條件。
優(yōu)選的用于檢測HCV-PRC-Korean特有核酸的本發(fā)明的雜交方法使用高嚴緊度條件。
正如已知的，可以用均質或異質模式完成雜交。均質雜交反應完全發(fā)生在溶液中，其中，聚核苷酸探針和欲雜交的核酸序列(靶序列)都以可溶的形式存在于溶液中。異質反應涉及使用一種基質，或者聚核苷酸探針，或者靶核酸與之結合，該基質在反應介質中不溶解。例如，可以將被檢測的身體樣品接到固體基質上并進行原位雜交。
一般在以組織切片形式的身體樣品上進行原位雜交，所述組織切片的厚度在約1微米到約100微米的范圍，優(yōu)選約1微米到25微米，更優(yōu)選約1微米到約10微米?？梢杂檬袌錾峡傻玫降暮憷淝衅瑱C制備上述樣品。
另外，在Southern印跡方法中廣泛使用異質模式，其中在限制酶消化后將基因組DNA電泳，接著首先將電泳的DNA片段變性，然后轉移到不可溶的基質上。在該印跡方法中，然后聚核苷酸探針與含互補核酸(靶)序列的固定的基因組核酸雜交。
還有，可以在基因文庫的篩選過程中廣泛使用異質模式，其中，將許多菌落，通常為含質粒的細菌或含λ噬菌體的細菌放在平板上，培養(yǎng)及在不溶基質上形成克隆的核酸文庫的印跡。然后將印跡文庫與聚核苷酸探針雜交以鑒定含所需核酸片段的細菌菌落。
典型的異質雜交反應包括用玻璃片，硝化纖維紙和類似的物質作為固定含靶核酸片段的固體基質。
對于如將分離的mRNA反轉錄形成cDNA，雙脫氧定序以及其他的第一步是聚核苷酸雜交的使用引物延伸反應的方法來說，均質雜交反應也是優(yōu)選的。在經多聚酶鏈反應(PCR)擴增特異核酸序列中，均質雜交反應是特別優(yōu)選的。
當含靶序列的核酸是雙鏈(ds)形式時，在進行雜交反應前，最好首先將dsDNA變性，如通過加熱或堿處理。在與準備雜交的聚核苷酸混合前或在聚核苷酸與dsDNA混合后完成dsDNA的變性。如果聚核苷酸本身是雙鏈分子時，它也可以在雜交反應混合物混合前變性或可以與靶序列的dsDNA同時變性。
首先進行上述的雜交反應以形成雜交產物，然后檢測形成的雜交產物的存在，由此檢測出含核酸的樣品中特定核酸序列的存在來完成特定靶核酸序列的檢測方法。
含核酸的樣品可以是身體組織或體液，可按雜交反應混合物前面描寫的方法制備。
可通過各種方法檢測在雜交反應中形成的雜交產物。雖然本文公開了有關雜交產物檢測的優(yōu)選的實施方案，但應理解對于本領域專業(yè)人員來說顯而易見的其它已知檢測方法也適用于本發(fā)明的方法和有關診斷系統(tǒng)。
在檢測特定核酸序列存在的方法中，聚核苷酸探針包括一個標記或指示基團，這樣就使得有探針存在于其中的雜交產物成為可檢測之物。一般上述標記包括放射性原子，化學修飾的核苷酸堿基，和類似物。
將放射性元素人工連接到聚核苷酸探針上或作為聚核苷酸探針的一部分為便于雜交產物的檢測提供有用的方法。典型的放射性元素是產生β射線的元素。產生β射線的元素，如3H，14C，32P，和35S代表一類產生β射線輻射的放射性元素標記物。用DNA多聚酶通過將帶放射標記的核苷酸，通過酶促摻到核酸中，然后將被標記的核酸變性以形成放射性標記的聚核苷酸探針，這樣就完成了制備放射性聚核苷酸探針。
其它的放射標記的聚核苷酸探針是化學修飾的含金屬復合劑，含生物素基團，熒光化合物等等。
一種有用的金屬復合劑是由鑭和芳族β-二酮形成的鑭螯合物，經螯合形成的化合物如EDTA類似物將鑭結合到核酸或聚核苷酸上，以便形成熒光鑭復合物(參見美國專利No.4，374，120和No.4，569，790和公開的專利申請No.EP0139675和No.WO87/02708)。
已有人描述過生物素或吖啶酯標記的寡聚核苷酸和其在聚核苷酸中的應用(參見美國專利No.4，707，404，公開的專利申請EP0212951和歐洲專利No.0087636)。有用的熒光標記化合物包括熒光素，若丹明，Texas Red，NBD等。
在雜交產物中若有標記核苷酸存在則雜交產物本身便被標記，因此可以將其與被檢測樣品的其它核酸區(qū)別開。檢測雜交產物中標記物的存在并由此檢測到雜交產物的存在，一般涉及從沒有與雜交產物雜交的聚核苷酸探針中分離雜交產物。
從雜交產物中分離單鏈聚核苷酸如非雜交標記聚核苷酸探針的技術是已知的，一般涉及根據(jù)其化學性質從非單鏈核酸中分離出單鏈核酸。使用異質雜交模式涉及的分離技術更常見的是通過洗滌將非雜交探針與結合到固體基質上的雜交產物分離開來。如Southern印跡技術，其中固體基質是硝化纖維素紙，標記物是32P(Southern J.Mol.Biol.98503(1975))。
在另一實施方案中，雜交產物檢測步驟包括檢測擴增的核酸產物。被擴增的核酸產物是現(xiàn)有技術中已知的擴增過程的產物，該擴增過程被稱為多聚酶鏈反應(PCR)。
Mullis et al.的美國專利No.4，683，195和No.4，683，202;和PCR Technology，Erlich，ed.，Stockton Press(1989);Faloona et al.，Methods in Enzymol.，155335-50(1987);和Polymerase Chain Reaction，Erlich et al.，eds.cold Spring Harbor Laboratories Press(1989)等文獻中描述了有關擴增特定核酸序列的方法和系統(tǒng)。
e.接種物，疫苗和抗體可以將本發(fā)明的分離HCV-PRC-Korean特有肽和融合蛋白用作制備抗體的免疫原，所述的抗體與NANBV的HCV-PRC和朝鮮分離種群發(fā)生免疫反應而不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-BK，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應。
一般用含本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽的接種物免疫接種哺乳動物來產生本發(fā)明的抗體，所述特定肽是(ⅰ)一種有從6到約511氨基酸殘基的含SEQ ID NO17氨基酸殘基序列的分離肽，其其余殘基限定NANBV結構蛋白或多蛋白，或(ⅱ)一種包括SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列的融合蛋白，并由此在哺乳動物中誘發(fā)對HCV-PRC和朝鮮分離種群抗原有免疫特異性的抗體分子。然后從哺乳動物體中收集該抗體分子并通過已知技術如DEAESephadex將抗體分子分離到所需的程度以得到IgG組份。
本文所用的以各種語法形出現(xiàn)的詞“接種物”是描述一種含本發(fā)明HCV-PRC-Korean特有肽的作為活性組份的組合物，用于制備與HCV-PRC和朝鮮分離種群抗原具免疫活性的抗體。
制備并使用接種物以生產本發(fā)明的抗體的方法在很大程度上類似于本文對疫苗的描述，就疫苗來說也是用來誘導產生抗體的，是制備并使用接種物的例子。正如已知道的，其主要的不同在于接種物是用于動物而不是人類。
為了增強抗體的特異性，可以用固相粘合的免疫接種中國分離種群NANBV結構蛋白(即衣殼或包膜蛋白)，通過免疫親和層析法純化抗體。將抗體與固相粘合的中國分離種群NANBV結構蛋白接觸一段時間，使中國分離種群NANBV結構蛋白足以與抗體分子發(fā)生免疫反應以形成固相粘合的免疫復合體。通過標準技術從復合體中分離被結合的抗體。
為了生產一種不與C-100-3抗原或非中國非朝鮮NANBV分離種群發(fā)生免疫反應的抗體分子，可用免疫吸附法除去不需要的免疫特異性物質。免疫吸附法除去免疫特性一般是已知的，涉及首先將抗體分子與其上粘合有一種或多種非中國，非朝鮮NANBV分離種群抗原的固相相接觸以形成一種免疫吸附混合物。比較好的是，在免疫吸附混合物中，按不希望的免疫特異性組合物所占抗體的比例來說，固相中擁有過量的HCV-PRC或朝鮮分離種群抗原。
然后在免疫反應條件下將免疫吸附混合物保持一段時間，使其足以在固相中形成免疫復合體。然后將液相和固相分開，保持液相，不需要的抗體分子被吸附到固相上。
特別優(yōu)選的是一種含中國分離種群特異抗血清的抗體分子，該抗體分子是用中國分離種群，或最好用本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽免疫接種形成的，本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽如本文所定義的，具只有NANBV中國和朝鮮分離種群才有的氨基酸序列。然后正如本文所述，免疫吸附所生產的抗體分子除去了對中國和朝鮮分離種群以外的NANBV分離種群具免疫活性的抗體。
優(yōu)選的抗體分子與在HCV-PRC上的HCV-PRC-Korean特有的抗原決定基發(fā)生免疫反應。優(yōu)選的HCV-PRC-Korean特有的抗原決定基是一種HCV-PRC-Korean特有肽如SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列。
尤其在本發(fā)明的診斷方法和系統(tǒng)中可以使用這樣生產的抗體以便如下文所述檢測在身體樣品中存在的NANBV的HCV-PRC或朝鮮分離種群。
優(yōu)選的抗體是單克隆抗體其使用方法可以用本文所公開的用于本發(fā)明抗體的同樣方法。
一般單克隆抗體是由稱作雜交瘤的單個細胞克隆生產的抗體組成的，該雜交瘤僅分泌(產生)一種抗體分子。雜交瘤細胞是通過將一種生產抗體的細胞與骨髓瘤或其它自我永存的細胞系融合形成的。首先由Kohler和Milstein，在Nature 256497(1975)中描述過制備上述抗體的方法，該文獻引入本文作為參考。可以將這樣制備的雜交瘤上懸物加以篩選，擇出對HCV-PRC或朝鮮分離種群抗原具免疫反應活性者，例如HCV-PRC-Korean特定肽用于接種誘導產生抗體細胞。生產單克隆抗體、雜交瘤細胞和雜交瘤細胞培養(yǎng)物的其它方法也是已知的。
本發(fā)明也提供生產本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細胞，和含雜交瘤細胞的培養(yǎng)物。
可以用本發(fā)明的分離HCV-PRC-Korean特有肽進一步制備抗HCV-PRC或朝鮮分離種群NANBV感染的疫苗。
本文以各種語法形式出現(xiàn)的詞“疫苗”，它描述一種含一種或多種本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽作為活性成份及藥物學上適用的賦形劑的接種物，以誘導產生對NANBV HCV-PRC和朝鮮分離種群具免疫反應活性的抗體，且最好在哺乳動物宿主中誘導抗HCV-PRC或Korean分離種群的活性免疫性。
因為一般將接種物用來誘導特異的抗體，所以最好一種接種物含一種僅含HCV-PRC-Korean特有肽而沒有其它肽的HCV-PRC-Korean特有肽(正如融合蛋白中所述)。因此，優(yōu)選的接種物包含一種本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽，該肽包括含在SEQ ID NO17或SEQ ID NO64中的氨基酸殘基序列。
一種接種物可以含一種或多種本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽作為活性成份。由于可以將該肽用來定義一種小的且特有的HCV-PRC或Korean分離種群多蛋白的抗原決定基，所以上述接種物特別用于生產一種與NANBV HCV-PRC和朝鮮分離種群有免疫反應活性的抗體。上述抗體是如本文所定義的HCV-PRC-特異的。
另外，還提供多價接種物，它含有一個以上HCV-PRC-Korean特定肽的融合蛋白，并用于誘導對不同抗原特異性的抗體類型。即本文所述的第一種HCV-PRC-Korean特有肽，或來自HCV的不同菌株的相應區(qū)域和在不同病原體上存在的另外的抗原。優(yōu)選的另外的抗原是一般從NANBV-感染的患者中同時發(fā)現(xiàn)的病原體中衍生的，即乙型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒(HIV)等。
相關實施方案提供兩種致免疫的HCV-PRC-Korean特有的肽，這兩種肽分別來自不同的HCV-PRC區(qū)域以便單個接種物便能誘導對編碼多肽的HCV-PRC或朝鮮分離種群兩個區(qū)域特異的抗體。
制備一種包含肽作為活性成份的接種物是現(xiàn)有技術已知的。一般將上述接種物制備成可注射的液體溶液或懸浮液。可以在注射前將適用于溶液或懸浮液的固體形式配制成液體。也可將制劑乳化。
將活性致免疫成份溶解，分散或混合在藥物學上可接受的且與活性組份相容的賦形劑中是已知技術。短語“適用于人的”和“藥物學上可接受的”(生理學相容的)指當給人施用時，分子實體和組合物一般不產生過敏性的或相似的不適反應，如胃不適，頭暈等。適宜的賦形劑隨試圖采用的應用形式而變化很大，可以是如含鹽、磷酸緩沖鹽(PBS)，右旋糖，甘油，乙醇等或其結合物的含水溶液。另外，如果需要，接種物可含少量的可增強接種物效果的輔助物質如潤濕劑或乳化劑，PH緩沖劑，礦物油，載體或輔助劑。一個優(yōu)選的實施方案包含至少約0.01%到約99%的作為活性成份的HCV-PRC-Korean特有肽或融合蛋白，一般每毫升(ml)賦形劑含約10到200μg的活性成份。
為了便于在被免疫的哺乳動物中產生免疫應答，接種物可含有與載體，或抗原載體相連的本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特有肽。
可將一種或多種附加的氨基酸殘基加到特有肽的氨基-或羧基-末端以便有助于將該肽與載體相連(如果它在肽上不存在)。在肽的氨基-或羧基-末端加半胱氨酸特別有助于經二硫鍵形成多聚物。然而，也可以使用現(xiàn)有技術中已知的制備共軛物的其它方法。另外的連接方法的例子包括用Michael加成反應產物，二醛類如戊二醛[Klipstein et al.，J.Infect Dis.，147318-326(1983)]等，或用碳化二亞胺技術，如用水溶的碳化二亞胺形成與載體相連的酰胺。
有用的載體是現(xiàn)有技術中已知的，并且一般是蛋白質本身。此類載體的例子是鍵孔(Keyhole)域形血蘭蛋白(KLH)，麻仁球蛋白，甲狀腺球蛋白，白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)，紅血細胞如羊紅血細胞(SRBC)，破傷風類毒素，霍亂類毒素以及聚氨基酸如聚(D-賴氨酸D-谷氨酸)等等。
如現(xiàn)有技術中已知的，通常通過中間體(連接基團)，將HCV-PRC-Korean特有肽與其載體結合是很有利的。如上文指出的，戊二醛就是這樣一種連接基團。然而，當用半胱氨酸時，中間的連接基團最好是間-馬來酰亞胺苯氧基N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)。
另外，通過酯-胺交換反應，可將MBS首先加到載體中，此后，通過加進嵌入巰基如硫羥乙酸(CH3COSH)交聯(lián)馬來酰亞胺雙鍵而加成。?；度牖鶊F裂解后，在被解封的連接基團硫醇和蛋白質半胱氨酸殘基的硫醇間便形成二硫鍵。
可以用抗原載體增強或促進免疫應答(免疫加強)，或通過使用與載體結合的接種物控制免疫應答類型(參見如，美國專利Nos.4，599，231;4，599，230和4，683，136和Milich et al.的說明，和美國專利Nos.4，818，527和4，882，145中Thornton et al.的說明)。
免疫增強作用的其它方法包括使用脂質體和免疫刺激復合物(ISCOM)顆粒。脂質體的特有多樣性取決于它們大小的可調性，表面特征，脂類組合物和它們可以接納抗原的方法。形成脂質體的方法是現(xiàn)有技術中已知的(參見，如，Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Vol.XIV，Academic Press，NY(1976)P.33et seq.)。在ISCOM顆粒中，籠形基質包括Quil A，從一種南美樹的樹皮中提取的。通過與基質表面疏水相互作用而相連的抗原蛋白或肽，激發(fā)出強烈的免疫應答。
載體的選擇更多地取決于免疫原的最終使用，而不是免疫原的抗原決定基部分，并且是根據(jù)不特別包括在本發(fā)明中的標準。例如，如果將一種接種物用于動物，則應選擇特別對動物不產生不適反應的載體。
應當理解除上文中所述的載體成份外，藥物學上可接受的配方可包括適當?shù)囊环N或多種其它載體成份如稀釋劑，緩沖液，粘合劑，表面活性劑，增稠劑，潤滑劑，防腐劑(包括抗氧化劑)等物質。以及為了提供與預定受體的血液等滲的配方所包括的物質。一般即使在接種物的制造中使用了無菌技術，也要加入防腐劑如硫柳汞(以1∶5000稀釋1%溶液)以防止微生物污染的危險。
習慣上，接種物是胃腸外給藥的，通過注射，如皮下或肌肉內注射。適用于其它給藥模式的其它制劑包括栓劑，在某些情況下可為口服制劑。對于栓劑來說，可包括傳統(tǒng)的粘合劑和載體，如聚二醇或甘油三酯;以含0.5%到10%，最好1-2%的活性成份的混合物來制備上述栓劑。口服配方包括下面通常使用的賦形劑，如甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。組合物采取溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，持續(xù)釋放制劑或粉劑的形式，并含10%-95%，最好25-70%的活性成份。
可將HCV-PRC-Korean肽按中性或鹽形式配制接種物。藥物可接受的鹽包括酸加成鹽(用蛋白質或抗原的游離氨基形成的)，可與無機酸如鹽酸或磷酸形成，或者與有機酸如乙酸，草酸、酒石酸、扁挑酸等形成。也可以用無機堿如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣，或氫氧化鐵，或有機堿，如異丙胺，三甲胺、組氨酸、普魯卡因等與游離羧基形成鹽。
以與劑量配方相容的方式施用接種物，并以能致免疫和能有效誘導免疫應答的量給藥。當作為疫苗使用時，為了達到所需的完全保護免疫，施用的接種物量取決于被免疫的主體，主體的免疫系統(tǒng)合成抗體或誘導細胞介導的應答的能力。所需服用的精確的活性組分量取決于專業(yè)人員的判斷并隨個體的不同而異。但一般限定一個適用于大多數(shù)人的量。適宜的劑量范圍是對每個成年人來說，每單個免疫接種量，從約10微克(μg)到數(shù)毫克(mg)，優(yōu)選約10-500微克更優(yōu)選約100微克活性成分這樣一個數(shù)量級。開始給藥和加強注射的適宜方式是可變的，典型方式是第一次給藥后間隔2-6周接著再注射一次，或以其它方式給藥。
接種物也可以包括作為賦形劑一部分的輔助劑。在實驗室哺乳動物中所用的輔助劑如完全Freund′s輔劑(CFA)，非完全Freund′s輔劑是現(xiàn)有技術中已知的。也可以使用藥物學上可接受的輔劑如明礬。作為實例的一種接種物含有1ml磷酸緩沖鹽水(PBS)，該磷酸緩沖鹽包含約50到200μg吸附在約0.5mg到約2.5mg明礬，或0.1%到1%Al(OH)3上的HCV-PRC-Korean特有肽。一種優(yōu)選的接種物含有1ml包含100μg吸附在2.5mg明礬載體上的HCV-PRC-Korean特有肽的PBS。
施用接種物后，使接受接種物的哺乳動物或人持續(xù)一段時間，足以使哺乳動物的免疫系統(tǒng)通過產生對免疫原具免疫活性的抗體而產生免疫應答，正如已知的，這段時間一般為2到8星期。
可以將本發(fā)明的分離HCV-PRC-Korean特有肽，抗-HCV-PRC抗體和抗-Korean分離種群抗體用于檢測HCV-PRC和Korean分離種群NANBV感染的診斷系統(tǒng)和診斷方法。
f.診斷系統(tǒng)藥劑盒形式的診斷系統(tǒng)包括足夠用于上述至少一種檢測方法的一定量的本發(fā)明HCV-PRC-Korean特有肽或融合蛋白，或本發(fā)明的抗-HCV-PRC或抗-Korean分離抗體組合物，這種試劑是獨立包裝的。一般還包括這種試劑的使用說明。
“使用說明”一般包括具體的描述內容，要描述試劑的使用濃度或至少一種檢測方法參數(shù)，如試劑的相對用量，所要混合的樣本，試劑/樣本混合保持的時間長短，溫度、緩沖條件等等。
在優(yōu)選方案中，本發(fā)明的診斷系統(tǒng)還包括一種標記物，或一種能夠指示含有HCV-PRC或Korean分離抗原、重組蛋白、抗-HCV-PRC或Korean分離抗體的復合物形成的指示物質。
如本文所述，術語“標記物”和“指示物質”不管以什么不同語法形式使用，都是指涉及到直接或間接產生一種可檢測的信號以表示復合物存在的單個元素或分子。任何標記物或指示物質都可以連接到或摻入到一種試劑中，如抗體或單克隆抗體，或者是單獨使用，而且這些元素或分子可以單獨使用或與其他試劑聯(lián)合使用。這些標記物本身在臨床診斷化學中是公知的，只有與新蛋白、方法和/或系統(tǒng)一起使用時才構成本發(fā)明的一部分。
標記物可以是一種熒光標記試劑，它可通過化學方法結合到抗體或抗原上，而不使其變性，以形成一種可用作免疫熒光示蹤劑的熒光染料。合適的熒光標記試劑是熒光染料如熒光素異氰酸鹽(FIC)，熒光素異硫蘭晶石(FITC)，5-二甲胺-1-萘磺酰氯(DANSC)，四甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)，麗絲胺，若丹明8200磺酰氯(RB200SC)，一種螯合鑭素元素鍵合物(如，銪，鋱，釤)等。對免疫熒光分析技術的描述見Deluca，“Immunofluorescence Analysis”，in Antibody As a Tool，Marchalonis，et al.，eds.，John Wiley and Sons，Ltd.，pp.189-231(1982)，列入本文作為參考。
優(yōu)選方案中，標記物是酶，如辣根過氧化物酶(HRP)，葡萄糖氧化酶，堿性磷酸酶等。在這種主要標記物是酶的情況下，例如是HRP或葡萄糖氧化酶，還需要其他的試劑以便看到抗體-抗原復合物(免疫反應劑)的存在。用于HRP的其他試劑包括過氧化氫和一種氧化染料前體如二氨基聯(lián)苯胺?？膳cHRP一起使用的其他試劑是2，2′-連氮基-二-(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)。
放射性元素也可以用作標記試劑，本文對它們的使用進行了描述。有代表性的放射性標記試劑是可產生γ射線的放射性元素。本身可以釋放γ射線的元素，如124I，125I，128I，131I，和51Cr代表了一類可產生γ射線的放射性元素族。特別優(yōu)選的是125I。另一組有用的標記物是本身可釋放正電子的元素如11C，18F，15O和13N。釋放的正電子在遇到動物體內存在的電子時可產γ射線。另一種有用的物質是β放射性物質如111In，3H，35S，14C，或32P。
現(xiàn)有技術中還描述了其他的標記物，它們都適用于本發(fā)明的診斷學。例如，可以利用分子對之間存在的特異親和性，一個分子可作為標記物親和到特異性結合劑上，另一個分子做為工具檢測存在的物質。有代表性的分子對是生物素抗生物素蛋白，其中生物素是標記物，而過氧化物酶抗過氧化物酶(PAP)這一對中，則過氧化物酶是標記物。
標記物的聯(lián)結，也即多肽和蛋白質的標記在本領域中是公知的。例如，可以通過代謝摻合含放射性同位素的氨基酸，使其在培養(yǎng)基中作為一種成份，來標記由雜交瘤產生的抗體分子。例如，參見Galfre et al.，Meth.Enzymol.，733-46(1981)。通過活化功能團使蛋白連接或偶合的技術尤其適用。例如，見，Aurameas，et al.，Scand.J.Immunol.，Vol.8 Suppl.77-23(1978)，Rodwell et al.，Biotech.，3889-894(1984)，和美國專利號4，493，795。
診斷系統(tǒng)還可以包括(最好是分別包裝)一種特異性結合試劑?！耙环N特異性試劑”是指一種選擇性結合某種試劑的分子實體，隨后可以和本發(fā)明的產物發(fā)生反應，但它本身并不是本發(fā)明的蛋白表達產物。有代表性的特異性結合試劑是抗體分子如抗人體IgG或抗人體IgM，補體蛋白或其片段，蛋白質A等等。優(yōu)選的特異性結合試劑能夠結合欲檢測的抗-HCV-PRC或抗-Korean分離抗體，此時這種抗體做為免疫復合物的一部分存在。
在一個優(yōu)選方案中，標記特異性結合試劑。不過，如果診斷系統(tǒng)包括一種特異性試劑未被標記，一般這種試劑被用作放大物質或反應物。在這些方案中，當放大物質被結合到含有一種反應物的復合物上時，標記的特異性結合試劑能特異性地與放大物質結合。
本發(fā)明的診斷藥盒可以“ELISA”的形式使用，以檢測體液樣本如血清、血漿和唾液中抗體的存在及含量?！癊LISA”是指酶聯(lián)免疫吸附試驗，它利用被結合到一種固相載體上的抗體或抗原以及酶-抗原或酶-抗體結合物來檢測和定量樣本中存在的抗原或抗體含量。對ELISA技術的描述見《基礎和臨床免疫學》的第4版第22章，1982年Lange Medical Publications of Los Altos，CA出版，作者D.P.Sites et al.，并參見美國專利號3，654，090;No.3，850，752，和No.4，016，043，所有的上述文獻引入本文作為參考。
因此，在優(yōu)選方案中，可將本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特異性肽、融合蛋白、抗-HCV-PRC抗體或抗-Korean分離抗體親合到一種固相基質上形成一種固相載體，將其分別包裝進本主題診斷系統(tǒng)中。
一般是從水培養(yǎng)基中通過吸附把反應物親合到固相基質上，當然也可以使用本領域熟練技術人員公知的其他親合方式。
可用的固相基質在現(xiàn)有技術中是公知的。這些物質包括以SEPHADEX商標從Pharmacia Fine Chemicals公司(Piscataway，NJ)可買到的交聯(lián)葡聚糖;瓊脂糖，可從Abbott實驗室(North Chicago，IL)得到的直徑大約1微米至5毫米的聚苯乙烯珠;聚氯乙烯，聚苯乙烯，交聯(lián)聚丙烯酰胺，硝基纖維素或尼龍基質編織物，如薄片，條或棒;或管、平板或微升平板的孔，例如用聚苯乙烯或聚氯乙烯制作的。
本發(fā)明還包括一種用于檢測身體樣本中HCV-PRC或Korean分離核酸存在的診斷系統(tǒng)，方法是根據(jù)本發(fā)明所述的方法用本發(fā)明的多核苷酸與HCV-PRC-Korean特定核酸雜交。
用于檢測中國或朝鮮分離NANBV核酸存在的試劑盒形式的診斷系統(tǒng)包括足夠用于至少一次檢測的本發(fā)明分離的HCV-PRC-Korean特定核酸分子，做為一種單獨包裝的反應物。一般還包括這種包裝的反應物的使用說明。
在優(yōu)選方案中，該方案的診斷系統(tǒng)還包括一種標記物或能夠表示含有中國分離NANBV核酸的雜交復合物形成的指示劑。
本發(fā)明所述任何診斷系統(tǒng)的HCV-PRC-Korean特定肽，融合蛋白、抗-HCV-PRC抗體，抗-Korean分離抗體，標記的特異性結合試劑或放大反應物可以是溶液，如一種分散液或是一種基本干燥的粉末，如凍干粉末。假如指示劑是一種酶，系統(tǒng)中還可以分開包裝提供該酶的底物。在這種診斷系統(tǒng)中還可以包括一種固相載體如前面所述的微升平板和一種或多種緩沖液，這些成份都要分開包裝。
本發(fā)明診斷系統(tǒng)相關的所述包裝物是診斷系統(tǒng)中慣用的。這些包裝物包括玻璃、塑料(如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶，小藥瓶、塑料和襯底的塑料薄膜口袋和類似物。
g.診斷方法本發(fā)明的診斷方法是指檢測軀體樣本中的抗-HCV-PRC抗體，抗Korean分離抗體，HCV-PRC結構抗原，或Korean分離NANBV結構抗原。本發(fā)明方法使用本發(fā)明的一種HCV-PRC-Korean特定肽、融合蛋白、抗-HCV-PRC抗體或抗-Korean分離抗體作為一種免疫化學反應物，形成一種免疫反應產物，這種產物的生成量與樣本中所要檢測的物質含量直接或間接相關。本領域中的熟練技術人員可以看出，有很多公知的臨床診斷化學方法中可以使用本發(fā)明的一種免疫化學反應物形成一種與軀體樣本中特定抗體或抗原含量相關量的免疫反應產物。
可以使用各種異源或同源方案，具競爭性或不具競爭性的，來完成本發(fā)明的檢測方法。因此，盡管本文描述了有代表性的方法，但本發(fā)明并不受此限制。
為了檢測病人抗-HCV-PRC或抗-Korean分離抗體的存在，將體內樣本特別是體液樣本如病人的血液、血漿、血清、尿液或唾液在生物檢測條件下與本發(fā)明的一種HCV-PRC-Korean特定肽或融合蛋白混合接觸，所說的肽或融合蛋白是(ⅰ)一種具有6至大約511個氨基酸殘基的分離肽，這些氨基酸含有SEQ ID NO17氨基酸殘基序列，其余的殘基定義NANBV結構性蛋白或多蛋白，或(ⅱ)一種包括SEQ ID NO17的氨基酸殘基序列的融合蛋白，形成一種免疫反應混合物。然后將混合物置于生物檢測條件下一段時間以足夠形成HCV-PRC或Korean分離NANBV抗原分子-抗體分子免疫反應產物(免疫復合物)。按照本發(fā)明所述檢測該免疫反應產物的存在，最好也測定含量。免疫反應產物的存在表明樣本中存在有抗-HCV-PRC或抗-Korean分離抗體。
在一個優(yōu)選方案中，按照本文所述用一種特異性結合反應物檢測HCV-PRC-Korean特定肽與病人抗體之間形成的免疫反應產物的存在。例如，首先將免疫反應產物與一種標記的特異性結合試劑混合形成一種標記混合物。標記的特異性結合試劑包括一種特異性結合試劑和一種本文所述的標記物。然后將標記混合物在適合于特異性結合的條件下保持一段時間，足以使存在的任何免疫反應產物與標記的特異性結合試劑結合，形成一種標記產物。測定有形成的標記產物存在(最好測定含量)，以表明免疫反應產物的存在及含量。
在一個優(yōu)選方案中，本發(fā)明診斷方法的實施方式是，形成免疫反應產物，并在固相中進行檢測，方法如本發(fā)明的診斷系統(tǒng)所述。
因此，在一種優(yōu)選診斷方法中，將HCV-PRC-Korean特定肽親合到一種固相基質上形成固相。優(yōu)選該特異性結合試劑是蛋白質A，或一種抗人體Ig，如IgG，或IgM，它可以與在固相中與HCV-PRC-Korean特定肽結構蛋白已進行免疫復合的抗-HCV-PRC或抗Korean分離抗體復合。最優(yōu)選使用一種標記的特異性結合試劑，其中標記物是放射性同位素，一種酶，生物素或一種熒光標記物如診斷系統(tǒng)已描述過的鑭系元素，下面的參考文獻將詳細描述。
要這種固相方案中，特別優(yōu)選使用一種重組蛋白，前面敘述的有關融合蛋白中已具體體現(xiàn)出。
在另一種優(yōu)選診斷方法中，按上述方法將本發(fā)明的HCV-PRC-Korean特定肽或融合蛋白親和到固相基質上，并使生物樣本的稀釋液與固相表面接觸使生物學樣本稀釋液進行免疫復合步驟，并去除未結合的物質。由于感染個體的生物學樣本中所存在抗體的多價性(IgG是二價的，IgM是五價的)，隨后加入的標記HCV-PRC-Korean特定肽或融合蛋白則通過樣本抗體作為固相HCV-PRC-Korean特定肽或融合蛋白與可溶性的標記過的分子之間的橋，而將其連接到固相上。固相中標記物的存在表明了樣本中特異性抗體的存在(最好還表示出其含量)。本領域中的熟練技術人員可以確定稀釋液的范圍，從中可確定固相中標記抗原的濃度。
可以在把生物學樣本與固樣結合之前或同時，將生物學樣本與本發(fā)明標記的HCV-PRC-Korean特定肽或融合蛋白混合，通過利用兩價或多價特異性抗體的橋特性使固相上形成三分子復合物。作為特別適用的標記物，本發(fā)明的生物素化HCV-PRC-Korean特定肽是標記的抗原，以便通過加入酶-抗生蛋白鏈菌素或酶-抗生物素蛋白復合物，接著再加入合適的底物進行檢測。這些酶如辣根過氧化酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或脲酶是常用的酶，這些和其他的酶以及幾種合適的底物都是可從商業(yè)上買到的。優(yōu)選的標記物，它包括使用放射性同位素，如，碘，或鑭系元素的螯合劑如銪。
在另一個方案中，將樣本(如血液、血漿、血清、尿液或唾液)在生物學測定條件下與本發(fā)明的抗-HCV-PRC或抗-Korean分離抗體混合接觸形成一種免疫反應混合物。然后將該混合物在生物學測定條件下保持一段時間，足以能夠形成一種抗原抗體免疫反應產物，該產物含有與本發(fā)明抗體復合的HCV-PRC-Korean特定肽抗原。從而測定復合物的存在(最好是測出含量)，由此表明體液樣本中抗原的存在。
在一個優(yōu)選方案中，抗體存在于固相中。最好是通過競爭性免疫測定方法測定所形成的免疫復合物的量，該方法是使病人體液樣本中的抗原與本發(fā)明的標記的重組抗原相競爭結合到固相抗體上。該方法包括將體液與下面成份混合(1)已經親和上一種本發(fā)明抗體的固相載體和(2)一種本發(fā)明的標記的HCV-PRC-Korean特定肽或融合蛋白，它與固相抗體進行免疫反應形成一種既有液相又有固相的競爭性免疫反應混合物。然后將該混合物保持一段時間，以足以在固相中形成一種含有標記的HCV-PRC-Korean特定肽的免疫反應產物。之后，測定固相中存在的標記物的含量，從而表明了體液樣本中HCV-PRC或Korean分離NANBV抗原的含量。
酶免疫檢測技術，不管是直接的還是利用同源或異源檢測形式的競爭性測定，在現(xiàn)有技術中已廣泛的描述過。有代表性的方法見Maggio，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Cleveland，OH(1981);和Jijssen，“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”，Elsevier，Amsterdam(1988)。
生物學測定條件是指能保持免疫反應混合物中HCV-PRC-Korean特定肽或融合蛋白以及抗HCV-PRC或抗-Korean分離抗體的免疫反應活性的條件。這些條件包括大約4°-45℃的溫度范圍，優(yōu)選37℃，大約5至9的PH值范圍，優(yōu)選7，和從蒸餾水至1摩爾氯化鈉之間的離子強度的不同值，優(yōu)選生理鹽水的離子強度。達到這些最佳條件的方法在本領域中是已知的。
本發(fā)明還包括一種在不使用標記物情況下能夠檢測免疫反應產物形成的免疫學測定方法。這種方法使用了一種“檢測方法”，這種檢測方法意味著在臨床診斷化學中其本身是公知的，只有在與新的多肽、方法和系統(tǒng)一起使用時才構成本發(fā)明的一部分。有代表性的檢測方法包括被稱作生物傳感器的方法和包括生物傳感法，該方法的依據(jù)是檢測表面反射活性(表面細胞質基因組共振)的變化，光學纖維對消失波吸收的變化或表面聲波傳播的變化。
另一種方案是利用時間解析熒光測定術(TR-FIA)檢測免疫反應產物，其中所使用的標記物能夠產生可被TR-FIA檢測到的信號。適用于TR-FIA的典型標記物是金屬配合試劑如由鑭系元素和一種芳香族β-二酮形成的鑭系元素螯合物，鑭系元素通過一種EDTA類似物被結合到抗原或抗體上，從而形成一種熒光鑭系元素復合物。
時間解析熒光測定術的方法見Soini et al，Clin.Chem.25353-361(1979)，并且已被廣泛應用于免疫測定中。例如，見Halonen et al.，Current Topics in Microbiology and Immunology，104133-146(1985);Suonpaa et al.，Clinica Chimica Acta，145341-348(1985);Lovgren et al.，Talanta，31909-916(1984);美國專利號4，374，120和4，569，790;以及公開的國際專利申請?zhí)朎PO 139675和WO 87/01708。用于TR-FIA的優(yōu)選鑭系元素是銪。
用于實施TR-FIA方法的試劑及系統(tǒng)可從市場上買到(Pharmacia Diagnostics，Uppsala，Sweden)。
特別優(yōu)選的是固相免疫測定方法，操作過程可以說是一種典型的“Western印跡分析”。
本診斷方法的實施可以與其他的用于檢測感染有NANBV的HCV-PRC或Korean分離種群中物種抗-HCV-PRC或抗-Korean分離種群抗體出現(xiàn)的獨立方法聯(lián)合使用。例如，可以在檢測方法中將本發(fā)明的一種組合物與商業(yè)上獲得的C100-3抗原(Ortho Diagnostics，Inc.，Raritan，N.J.)一起使用，以測定抗體種類與兩種抗原免疫反應活性之一種或二種存在。
2.中國和日本特定分離種群本發(fā)明的另一方面還涉及到與NANBV的中國、朝鮮和日本分離種群相同但不同于NANBV美國分離種群的分離核酸、肽和蛋白分子。本發(fā)明將這些核酸、肽、和蛋白分子稱之為“HCV-PRC-Japanese”特定分子。
已發(fā)現(xiàn)由HCV-PRC基因組的V3區(qū)編碼的肽存在于NANBV的中國和日本分離種群中，但不存在于美國的分離種群中。該肽具有下面的氨基酸殘基序列Xaa1-Ser-Ser-Ala-Val-Asp-Ser-Xaa2-Thr-Ala-Thr-Ala-Pro-Pro-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Ser-Asp-Xaa6-Xaa7-Asp-Lys-Gly(SEQ ID NO67);
其中Xaa1是Gly，Glu或Arg;
Xaa2是Ala或Gly;
Xaa3是Asp或Glu;
Xaa4是Gln或Glu;
Xaa5是Ala或Thr;
Xaa6是Asp或Gly;和Xaa7是Asp或Gly。
這種肽存在于HCV-PRC1(SEQ ID NO4)，HCV-PRC3(SEQ ID NO12)，HCV-PRC4(SEQ ID NO14)和HCV-PRC11(SEQ ID NO16)，HCV-J(SEQ ID NO60)和HCV-BK(SEQ ID NO61)中。
由HCV-PRC基因組的V3區(qū)編碼的氨基酸殘基序列與由NANBV的日本分離種群基因組的相同V3區(qū)編碼的氨基酸殘基序列有大約80-90%的同源性，但是與由NANBV的美國分離種群基因組的V3區(qū)編碼的氨基酸殘基序列的同源性不到12%(見后面的實施例2)。
本發(fā)明還提供了大約具有24個氨基酸殘基的HCV-PRC-Japanese特定肽，它與SEQ ID NO67具有至少75%，最好至少90%的同源性。
在一個優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供了一種包含于SEQ ID NO67的HCV-PRC-Japanese特定肽，這種肽具有下面的氨基酸殘基序列Ser-Ser-Ala-Val-Asp-Ser(SEQ ID NO68)用本發(fā)明的HCV-PRC-Japanese特定肽可用以產生直接抗這種肽以及抗NANBV的HCV-PRC或Japanese分離種群的抗體。根據(jù)上述的方法產生并篩選能與NANBV的中國和日本分離種群但不與美國分離種群發(fā)生免疫反應的抗體。
而且，根據(jù)前面所述的方法可用本發(fā)明的HCV-PRC-Japanese特定肽制備接種物和疫苗。
本發(fā)明還提供了用于檢測NANBV的HCV-PRC和Japanese分離種群的診斷系統(tǒng)和方法。這些診斷系統(tǒng)和方法與前面敘述過的用于HCV-PRC-Korean特定肽和抗體的診斷系統(tǒng)和方法相同，不同的只是用HCV-PRC-Japanese特定肽和抗體替代了HCV-PRC-Korean特定肽和抗體。
本發(fā)明還提供了HCV-PRC-Japanese特定的核酸分子。其中一種HCV-PRC-Japanese特定核酸分子編碼本發(fā)明的SEQ ID NO67的HCV-PRC-Japanese特定肽。
該HCV-PRC-Japanese特定核酸分子的核苷酸堿基序列如下RRATCGTCRG CCGYCGACAG CGSSACGGCGACYGCCCCYC CTGAHSAGRC CTCCGACGRCGRCGACAAAG GA (SEQ ID NO:69)其中R是A或G，Y是C或T，S是C或G和H是A，C或T。
由于在V3區(qū)NANBV的中國和日本分離種群之間存在著高度的同源性以及V3區(qū)NANBV的中國和美國分離種群之間的同源程度較低(見后面的實施例2)，本發(fā)明還提供了一種含有與SEQ ID NO69至少有50%同源性的大約72個堿基對的核苷酸堿基序列的分離DNA分子。
本發(fā)明還提供了包括SEQ ID NO69的核苷酸堿基序列的大約110個堿基對的分離DNA分子。這種分離DNA分子的代表是SEQ ID NO3，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13和SEQ ID NO15的核苷酸堿基序列，這些序列編碼HCV-PRC基因組的V3區(qū)。
可以將本發(fā)明的HCV-PRC-Japanese特定核酸分子作為雜交探針，根據(jù)前面所述的雜交系統(tǒng)和方法將它用于該系統(tǒng)和方法中檢測HCV-PRC和日本分離種群NANBV核酸的存在。
如果雜交方法中使用SEQ ID NO69的HCV-PRC-Japanese特定核酸分子作為探針，該方法要求很嚴格的雜交條件。如果雜交方法中用含HCV-PRC基因組V3區(qū)的核酸分子作為探針，該方法所要求的雜交條件較低。這種低要求的條件可使核酸探針與HCV-PRC和日本分離NANBV雜交，但不與美國分離NANBV靶序列雜交。
3.NANBV(HCV)特定種群HCV-PRC基因組的區(qū)域，編碼這些區(qū)域的DNA分子和由這些區(qū)編碼的某些肽與其他已知NANBV分離種群的編碼肽和類似區(qū)表現(xiàn)出相當高的同源性。與所有的NANBV(HCV)已知分離種群相同的核酸、肽和蛋白分子，本發(fā)明稱之為HCV特定種群。
例如，由HCV-PRC基因組的衣殼，和包膜-E1和E2區(qū)編碼的肽與來源于其他NANBV分離種群的類似肽具有大約70%至97%的氨基酸殘基序列同源性(見下面的實施例2)。
因此在其中一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有大約200個殘基的氨基酸殘基序列的HCV特定種群肽，它與由HCV-PRC編碼的殼蛋白具有大于90%，優(yōu)選大于95%的同源性。該殼蛋白的氨基酸殘基序列表示于SEQ ID NO2中從殘基1至殘基190。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有200個殘基的氨基酸殘基序列的HCV特定種群肽，它與HCV-PRC基因組編碼的E1蛋白的氨基酸殘基序列具有大于70%的同源性。該E1蛋白的氨基酸殘基序列表示于SEQ ID NO2中從殘基191至殘基380。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有大約320個殘基的氨基酸殘基序列的HCV特定種群肽，它與由HCV-PRC基因組的包膜E編碼的氨基酸殘基序列具有大約70%的同源性。由E區(qū)編碼的氨基酸殘基序列表示于SEQ ID NO2中從殘基191至殘基511。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有下列氨基酸殘基序列的HCV特定肽Arg-Arg-His-Xaa1-Asp-Leu-Leu-Val-Gly-Xaa2-Ala-Thr-Xaa3-Cys-Ser-Ala-Xaa4(SEQ ID NO70)其中Xaa1是Ile或Val;
Xaa2是Ala，Ser或Thr;
Xaa3是Phe或Leu;和Xaa4是Met或Leu。
這種HCV特定種群肽存在于由下述序列的V1區(qū)域編碼的肽中HCV-PRC1(SEQ ID NO2由殘基259至殘基275)，HCV1(SEQ ID NO45由殘基14至殘基30)，HCV-V1(SEQ ID NO46從殘基14至殘基30)，HCV-J(SEQ ID NO47從殘基14至殘基30)，HCV-BK(SEQ ID NO48從殘基14至殘基30)，HCV-J4(SEQ ID NO50從殘基14至殘基30)，HCV-Hh-h77(SEQ ID NO51從殘基14至殘基30)和HCV-Hh-H90(SEQ ID NO52從殘基14至殘基30)(見下述實施例2)。
本發(fā)明的HCV特定種群肽可以以融合蛋白的形式存在。
可用該HCV特定種群肽和蛋白質制備能夠與NANBV的中國、朝鮮、日本和美國分離種群發(fā)生免疫反應的抗HCV抗體。
用HCV特定種群肽或蛋白作為免疫原或接種物根據(jù)前面所述的方法制備這種HCV特定種群抗體。
本發(fā)明的HCV特定種群肽、蛋白和抗體可用于檢測HCV感染的診斷系統(tǒng)和方法中。
本發(fā)明的另一方面還提供了與NANBV的中國、朝鮮、日本和美國分離種群相同的分離核酸分子(也就是HCV核酸)。
例如，編碼HCV-PRC基因組殼區(qū)的DNA分子與編碼HCV-1，HCV-J1，HCV-J4，HCV-JH，HCV-J和HCV-BK的殼區(qū)的DNA分子具有大于90%的同源性。而且，編碼殼包膜E1區(qū)的DNA分子與編碼其他NANBV分離種群中相同區(qū)域的DNA分子具有大約大于65%的同源性(見下面的實施例2)。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種大約570個核苷酸堿基對的分離DNA分子，它與編碼HCV-PRC基因組的殼區(qū)的DNA分子具有大于90%的同源性。編碼HCV-PRC基因組殼區(qū)的DNA分子在SEQ ID NO1中表示了它的114位堿基至683位堿基。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了大約570個堿基對的分離DNA分子，它與編碼HCV-PRC基因組的E1區(qū)的DNA分子具有大于65%的同源性。
編碼E1區(qū)的DNA分子在SEQ ID NO1中表示了從684位左右的堿基。
優(yōu)選本發(fā)明的HCV特定種群核酸編碼HCV-PRC特定肽。更優(yōu)選HCV特定核酸包含有一個有51個核苷酸堿基對的分離DNA分子，它編碼SEQ ID NO71的氨基酸殘基序列。
編碼SEQ ID NO70的氨基酸殘基序列的分離DNA分子，在SEQ ID NO1中表示了其從888位至938位的堿基。
根據(jù)前面所描述的方法，可將本發(fā)明的HCV特定核酸分子用作雜交探針檢測HCV核酸。
實施例1.生產重組DNA分子A.分離HCV-PRC克隆并進行序列分析(1)分離中國分離種群NANBV RNA從中國北京國家藥物和生物制品控制中心獲得11個表現(xiàn)有肝炎相關癥狀的診斷為非甲非乙型肝炎的病人血清，作為NANB病毒粒子源。用從市場上買到的含有C100-3抗原的篩選藥盒(Ortho Diagnostics，Inc.，Raritan，NJ)和殼抗原按照Nasoff et al所述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885462-5466(1991)對血清樣本進行測試。結果見下表1。
表1對中國非甲非乙型肝炎病人HCV標記物的篩選ELISA HCV-RNA (PCR)病人Anti-C100-3 Anti-Cap 5'NC C1 + + + +2 + + - -3 + + + +4 + + + +5 - - - -6 + + - -7 - + - -8 + + + -9 - - - -10 - + + +11 + + + +11份血清樣本中有7份含有抗-C100-3抗體，而11份中有9份含有抗殼抗體。另外，用下面所述的PCR基礎檢測方法檢測所有11份血清樣本中HCV RNA的存在。9份抗殼陽性血清中有六份，包括1份樣本是抗-C100-3陰性，含有病毒RNA。有兩份血清所含的病毒RNA滴度等于或大于104CID50/ml。從這些表現(xiàn)最高滴度的病人中選擇4份血清作為克隆中國相關序列的HCV-PRC病毒粒子源。采集來源于病人1，3，4和11的血清樣本，從每份樣本中純化病毒粒子，從其中得到的序列分別命名為HCV-PRC1，HCV-PRC3，HCV-PRC4和HCV-PRC11。
通過對蛋白提取樣本進行異丙醇沉淀從分離的血漿樣本中純化HCV-PRC1，3，4和11RNA。方法大致如下，用一種冰冷的含有4.2M異硫氰酸鈲，0.5%Sarkosyl和0.025MTris-HCl(鹽酸三[羥甲基]氨基甲烷)，PH8.0的緩沖液，將50微升(μl)血漿稀釋。然后把稀釋的血漿與含有100mM Tris-HCl，PH8.0，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)和1%十二烷基硫酸鈉(SDS)的50μl提取緩沖液混合，形成一種提取混合物。
將混合物渦流振蕩，在65℃下保溫5分鐘開始提取。然后用酚/氯仿于65℃下提取，再單獨用氯仿提取一次，從混合物中去除血清蛋白。加入兩體積的冰冷卻異丙醇和1/10體積3M乙酸鈉并將混合物在-20℃下過夜保存，從不含蛋白的混合物中沉淀出HBV-PRC1，3，4和11RNA。在Eppendorff離心機中以1400rpm轉速于4℃離心30分鐘使之沉淀，用70%乙醇洗滌HCV RNA一次，真空干燥，然后再懸浮于9升無RNA酶的水中。按照下述方法進行cDNA合成之前于65℃加熱純化的HBV-PRC1，HCV-PRC3，HCV-PRC4，和HCV-PRC11 RNA樣本5分鐘。
(2)合成用于克隆HCV的構件區(qū)的寡聚核苷酸(a)HCV-PRC1選擇與丙型肝炎構件區(qū)相應的寡聚核苷酸，假定它編碼HCV構件殼和包膜蛋白(HCJ1序列Okamoto et al.，Jap.J.Exp.Med.，60167-177，1990)。在Applied Biosystem 391DNA合成儀上根據(jù)廠家的說明合成選擇的寡聚核苷酸，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純化。所合成的寡聚核苷酸具有下面表2所示的核苷酸堿基序列和命名的SEQ ID NO′s(號)，與Okamoto等人所述的相同(Japan.J.Exp.Med.，60167-177(1990))。
表2用于從HCV-PRC1分離物進行構件區(qū)域PCR放大的合成寡聚核苷酸引物SEQ ID 引物 核苷酸序列 極性NO18 15 TAAGGTCATCGATACCCT (+)19 16 GGACCAGTTCATCATCATAT (-)20 14 TGGGTAAGGTCATCGATAC (+)21 17 CAGTTCATCATCATATCCCAT (-)22 23 TTCCGAGCGGTCGCAACCTCGAGGT (+)23 24 AGGGTATCGATGACCTTACCCA (-)24 693 CGAGGAAGACTTCCGAGC (+)25 691 ACCCAAATTGCGCGACCTA (-)26 LK4 GGGCAGTCCTGTTGATGTGCC (-)27 LK5 CAACTGCTCAATCTATCCCGGCC (+)28 LK6 CAGCGCGGCAAGGAACCCAG (-)29 LK7 GGCACATCAACAGGACTGCCC (+)30 LK9 CCAACGGCAGCTGGCACATC (+)31 LK10 GAAACGATCGGTCGTCCCCA (-)32 LK12 TTCTCCCCCCAGCTATACGTAG (-)33 LK11 CCCGCTCAATGCCTGGAGA (+)34 LK16 TGCCAAGGCCCTGGCAGCGC (-)35 LK13 TGGGCGCGCCCCCGCAAGAC (+)36 LK14 GGCGCCGACGAGCGGAATAT (-)1每個單一寡聚核苷酸的極性表示為(+)和(-)，這表示該序列分別與HCV的有意義和反意義編碼鏈相對應。所有的序列是從5′端向3′端方向排列的。
(b)克隆HCV-PRC1 cDNA用5至10μg的按照實施例1A(1)方法制備的血漿衍生HBV RNA作為引物擴展反應的模板，以制備HCV-PRC1 cDNA。用來源于HCV基因組構件區(qū)的不同區(qū)域的特異性寡聚核苷酸引物(表2)起始該反應。該反應引物含有選擇的反意義寡聚核苷酸引物，dNTPs和反轉錄酶以形成第一股cDNAs。引物擴展反應是對Gubler等人，Gene，25263-269(1983)所述的cDNA合成方法的修改。
主要步驟是，在94℃下將5-10μg的模板RNA加熱5分鐘變性之后，用濃度為100μg/ml的引物在20μl的反應液中合成第一股cDNAs。在65℃下使引物退火5分鐘成為變性模板。接著，將混合物調節(jié)為1.5mM dATP，dcTP，dGTP和dTTP，40mMTris-HCl，PH8.0，8mM MgCl2，50mM Nacl和2mM亞精胺。加入26單位的丙二酰-鼠白血病病毒反轉錄酶(Stratagem，La Jolla，CA)，形成一種cDNA合成混合物。然后使該混合物在37℃下保溫1小時，合成第一股cDNA。
用得到的第一股cDNAs作為模板在含有DNA聚合酶I和RNA酶H的反應混合物中合成第二股cDNAs，形成雙股(ds)cDNAs(Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook et al.，eds.Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989))。用一種不對稱合成引物-連接體系放大合成的ds cDNAs，其中的有意義和反意義引物互相退火，并在平整末端條件下用Tc連接酶連接到雙股HCV cDNAs的末端上，形成cDNA-連接體分子。然后用得到的放大HCV cDNA序列作為模板，在分開的PCR反應中按照下述方法用特異性HCV寡聚核苷酸引物進行進一步的放大。
(c)HCV-PRC1 cDNA的PCR放大把實施例1A(3)中制備的20μl引物連接的放大cDNA序列與0.25μg的表2中的合成寡聚核苷酸對混合，進行PCR放大。所得到的PCR反應混合物含有引物連接的放大cDNA模板，特異性配對的寡聚核苷酸，200mM的上述dNTPs混合物，10mM KCl，2mM MgCl2，10mM Tris-HCl，PH8.3，和2單位的Thermus aquaticus(TAQ)DNA聚合酶(Promega Biotec.Madison，WI)。
用礦物油覆蓋反應混合物，在DNA熱循環(huán)儀中(Perkin-Elmer Cetus，CT)進行PCR的兩個回合，形成放大的HCV-PRC1 cDNAs。PCR的每個回合包括，先在95℃下變性5分鐘，接著再進行35次循環(huán)反應，每次循環(huán)分別是95℃下1分半鐘，55℃下兩分鐘和72℃下3分鐘，之后在72℃下進行7分鐘的擴展步驟。為了保證所有的cDNA轉錄都達到雙股，向放大的cDNA混合物中加入1μg的引物，在72℃下再進行擴展20分鐘完成最后一輪循環(huán)操作。
通過混合下列的寡聚核苷酸引物(表2)的結合物，進行第一個回合的放大反應，以引發(fā)HCV-PRC1構件基因組不同區(qū)域的放大反應A區(qū)-引物對14和16;B區(qū)-引物對693和24;C區(qū)-引物對LK5和LK6;D區(qū)-引物對LK9和LK12;E區(qū)-引物對LK11和LK16;F區(qū)-引物對LK5和LK12。使用下列聯(lián)合的寡聚核苷酸引物(表2)在相同條件下對來自上述第一個回合放大反應的等分樣本進行再次放大A區(qū)-引物對15和17;B區(qū)-引物對23和691;C區(qū)-引物對LK5和LK4;D區(qū)-LK7和LK10;E區(qū)-LK13和LK14;和F區(qū)-LK5和LK10。
從上述用特異性寡聚核苷酸引物進行的PCR放大反應回合中獲得了6種不同的PCR產物。放大的HCV-PRC cDNA的大小范圍是309至652個核苷酸，并且分別對應于A、B、C、D和E區(qū)。圖1表示了5個片段的排列以及它們在HCV基因組上的定位圖。來源于cDNA克隆A至E的核苷酸序列包括了絕大部分的構件區(qū)(C、E和E2)以及部分5′非編碼(NC)區(qū)。接著分離放大的序列，使之平頭末端化，并用實施例1A(5)所述的標準方法插入到pUC或pBluescript(Stratagene)克隆載體中。
(d)制備含有PCR放大dsHCV-PRC1 DNA的載體將來源于上述第二個回合的PCR放大反應制備的等份樣分別在5%丙烯酰胺凝膠上進行電泳。分離PCR反應產物之后，將含有對應于上述所需放大產物A區(qū)至E區(qū)的DNA片段的凝膠各分離的區(qū)域切下，并按標準的電洗脫技術(Sambrook et al.，如前所述)進行純化。將純化的片段分別激酶化，并克隆到pBluescript質?？寺≥d體(Stratagene)的SmaⅠ多聚接頭位點，形成一種含有被人工連接到pBluescript上的DNA片段A至E的質粒。
分別將得到的含有pBluescript載體和對應于A至E區(qū)的DNA片段的混合物轉化到大腸桿菌菌株DH5α中。含有插入物的質粒在含有青霉素的Xgal培養(yǎng)基上被識別為lac-(白)菌落。通過限制酶分析和在瓊脂糖凝膠上進行電泳對含有對應于A至E區(qū)的克隆DNA片段的質粒進行鑒定，并命名為pBluescript-HCV-PRC1-A，B，C，D和E重組DNA分子。
(e)對編碼構件區(qū)域的HCV-PRC1克隆測序為了獲得來源于上述制備的放大rDNA分子的HCV-PRC1的序列，從pBluescript載體中分離三個獨立的菌落，該載體具有與包括完整構件區(qū)的A區(qū)至E區(qū)相對應的每一種DNA片段。按照標準方法(Sambrook et al.，如前所述)通過CsCl密度梯度離心從18個選擇出的克隆的每一個中制備質粒DNA。利用35S雙脫氧鏈末端法，在Dupont自動測序儀上，用pBluescript衍生引物，KS和SK，以及實施例1A(4)中所述的起始放大反應方法中所用的引物和其他內部引物，對質粒進行測序。分別對三種質粒的DNA雙鏈進行測序，以準確地測定該序列。
所得到的一致序列信息匯編在一起代表了完整的HCV-PRC1構件區(qū)，并以SEQ ID NO1表示，其中列舉了核苷酸序列和編碼的氨基酸序列。這種HCV-PRC1序列已寄存在基因庫(Genbank)中，寄存日期是1991年8月5日，入藏號是_。來源于cDNA克隆A區(qū)至E區(qū)的序列包括了絕大部分的構件區(qū)(C，E1和E2，如SEQ ID NO1所示，從114位至1646位堿基)。
如SEQ ID NO1所示，編碼構件區(qū)的衣殼區(qū)的核苷酸區(qū)起始于第114位核苷酸堿基，終止于第683位核苷酸堿基。編碼包膜1(E1)和E2蛋白的核苷酸序列分別起始于684和1254位核苷酸，終止于1253和1646位核苷酸(SEQ ID NO1)。9個假定的糖基化位點位于196，233，250，305，325，416，429和447位氨基酸殘基(SEQ ID NO2)。
(3)制備cDNA克隆以獲得與HCV高度可區(qū)V0和HCV非構件區(qū)V3一致的序列從來源于實施例1A(1)和1A(2)所述的病人1，3，4和11的高度可變區(qū)V0獲得一致序列。所得到的核苷酸序列分別列舉于SEQ ID NO1，從1269位堿基至1343位堿基，和SEQ ID NO′s5、7、和9。也可以從來源于四個相同病人定義HCV基因組的非構件區(qū)V3得到一致序列。所得到的HCV-PRC1，3，4和11的V3區(qū)核苷酸序列分別列于SEQ ID NO′s3，19，13和15中。下面對這些序列與來源于不同地理區(qū)域HCV基因組的相應序列進行了比較。
2.HCV-PRC構件區(qū)和非構件區(qū)的表征A.限定構件區(qū)的HCV-PRC1與異源HCV分離種群的核苷酸和多肽序列比較。
將HCV-PRC1分離種群的C、E1和E2區(qū)的序列與各種報道的HCV序列，主要是來源于美國和日本種群的序列進行比較，以確定基因組異源性的程度，從而確定中國種群序列的獨特性。推斷的核苷酸與氨基酸殘基序列的同源性(一致性)的百分比見下面表3。HCV-PRC1與四種主要的原型HCV-1，HCV-J和HCV-BK之間的總同源性性是核苷酸水平的同源性分別為79.8%，90.1%和89.0%，予見的氨基酸水平的同源性分別為82.6%，88.2%和81.5%。當將表3中的全部6種分離種群比較時，從蛋白水平上來說，衣殼區(qū)同源性大于95%，這證實了衣殼區(qū)是高度保守的。
相比而言，包括E1或E2蛋白的區(qū)表現(xiàn)出了更多的不同性，分別為66.3%和80.4%的氨基酸同源性。見Weiner等人，Virol.，1808842-8848(1991)。
不一致性最顯著的是位于V0區(qū)，從SEQ ID NO1的1269位的核苷酸堿基至1343位核苷酸堿基。在這個區(qū)域中，氨基酸水平的同源性(45.8-62.5%)低于核苷酸水平的同源性(53.6-71.4%)，反映了這種變化主要發(fā)生在第1和/或第2位。HCV-PRC1和HCV-JH之間E2/NS1區(qū)的比較只是部分的，因為后者序列不能擴展到足夠的長度?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明在中國型和日本型HCV之間存在著較為密切的關系。這個區(qū)域中的高度不一致性證實了這個區(qū)域是處于顯著的免疫學壓力之下。
當與其他分離種群相比較時，HCV-PRC1序列的一個非常見特征是V0區(qū)的一排(一個氨基酸)中缺失了三個核苷酸，在下面的表4V0區(qū)一欄中以虛線表示。對6個獨立分離的克隆進行測序后證實了這一發(fā)現(xiàn)。這是在HCV基因組的V0區(qū)發(fā)現(xiàn)氨基酸缺失的第一個例子。對6個不同HCV分離種群(美國和意大利)及七個(日本)菌株進行V0區(qū)序列比較。見Weiner et al.，如前所述Jijikata et al.，Biochem.Biophys.Res.Chron.，175220-228(1991)。各種研究中都沒有發(fā)現(xiàn)缺失。而且，在對自然感染十三年過程中HCV的H菌株基因組核苷酸突變率的最近分析中，Ogata等人報道沒有發(fā)現(xiàn)V0區(qū)有缺失和插入(研究分析發(fā)現(xiàn)也不存在于任何其他基因組區(qū))，見Proc.Natl.Acad.Sci.USA，883392-3396(1991)。
這些數(shù)據(jù)進一步證實了丙型肝炎病毒包膜E2區(qū)的高度可變性特征。由于HCV的潛在中和決定基可定位于其包膜區(qū)，在開發(fā)疫苗時應考慮到V0區(qū)存在氨基酸缺失(或插入)這一因素。
表41SEQ分離種群2ID NOV0區(qū)HCV-PRC1 1 -RVGGAAARTTSSFASLLTHGPSQNIHCV-PRC3 6 YVS...SI.G.T..F.P.A..K.
HCV-PRC4 8 YAS...G.A.YGIT..FAP.A...
HCV-PRCll 10 YAS...G...HG.T..FST.AR...
HCV-l 37 HVT..S.GH.V.G.V...AP.AK..VHCV-Jl38 HVT..Q...AM.GLV..F.P.AK...
HCV-J 39 HVT..RV.SS.Q.LV.W.SQ...KHCV-BK40 HVT...Q.KT.NRLV.MFAS...KHCV-J441 YTS...SHT..TL...FSP.A.R..
HCV-JH42 HVT..VQGHV..TLT..FRP.A..K.
HCV-Hh-H7743 HVT..S.G...AGLVG...P.AK...
HCV-Hh-H9044 HVT..S.G.SVLGI..F..R..K...
V1區(qū)HCV-PRCl 1 LAARNASIPTTQLRRHIDLLVGAATFCSAMHCV-145 V.T.DGKL.A...S..L...LHCV-Jl 46 V.T.DGKL.A...S..L...LHCV-J47 ..A..S...TI...V...L...
HCV-BK 48 ..A..VT....TI...V...
HCV-J4 49 ..A...V...TI...V...
HCV-JH 50 ..A...V...T...V...THCV-Hh-H77 51 V.T.DGKL...S..L...
HCV-Hh-H90 52 V.T.DGKL...S..L...
V2區(qū)HCV-PRCl 1 MASCRSLDKFDQGWGPITYDDSGGKDQHCV-153L...P.TD...S.ANGS.P..
HCV-Jl 54L...R.TD...SHANGS.P..
HCV-J55...PI.E.A...H.MPESS..
HCV-BK 56..Q..TI...AE.SRS..
HCV-J4 57...PIQW.A...TEPDSP..
HCV-Hh-H77 58L...R.TD.A...S.ANGS.L.EHCV-Hh-H90 59L...R.TD...S.ANGS.P.EV3 區(qū)HCV-PRCl 4 GSSAVDSATATAPPEQASDDDDKGHCV-PRC312 R...G...DE...GG...
HCV-PRC414 ...DE...G...
HCV-PRCll 16 E...G...D.T...G...
HCV-J 60 ...G...G..D...G...
HCV-BK 61 E...G...L.D...G...
1HCV-PRC1與其他美國、日本和中國分離種群的V0、V1、V2和V3區(qū)的推斷氨基酸殘基序列的排列。
2 分離種群HCV-1-美國種群;Choo et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，882451-2455(1991);基因庫(Gen Bank)入藏號M62321;
HCV-1-5′端-Han et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，881711-1715(1991);基因庫入藏號M58407;
HCV-1-3′端-Han et al.，如前所述，基因庫(Gene Bank)入藏號M58406;
HC-J1-美國種群;OKamoto et al.，Japan.J.Exp.Med.，60167-177(1990);
HCV-J-日本種群;Kato et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.，USA，879524-9528(1990);
HCV-BK-日本種群;Takamizawa et al.，J.Virol.651105-1113(1991);
HC-J4-日本種群;OKamoto et al.，如前所述;
HCV-JH-日本;Takeuchi et al.，Nuel.Acids Res.，184626(1990);
HCV-Hh-H77和H90;American/人;Ogata et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，883392-3396(1991)。
在這種比較分析中發(fā)現(xiàn)的最明顯的區(qū)別就是編碼HCV-PRC1 V0區(qū)中一個氨基酸殘基的完整密碼子的缺失。這種缺失是中國NANBV序列的獨有特征。高度可變區(qū)V0中一個氨基酸的缺失意義重大，因為在該處抗原決定基會發(fā)生病毒中和反應。由于氨基酸殘基缺失所產生的三維改變對美國菌株有抗體活性則可能不會中和中國菌株。HCV-PRC1的這種特征，以及與美國或美國類似分離種群(HCV和HCV-J1)或與日本分離種群(HCV-J4，HCV-JH，HCV-BK和HCV-J)在包括E1和E2的完整包膜區(qū)內的總同源性，如下面的表5所示在73.7%和84.3%之間，這一事實表明，中國HCV分離種群屬于HCV病毒族中的第三特定組。
為確定前面發(fā)現(xiàn)的缺失是否是中國HCV分離種群的特征，將來自三個其他病人(病人3、4和11)的包括V0區(qū)的cDNAs克隆。所獲得的三個一致序列菌株HCV-PRC3，HCV-PRC4和HCV-PRC11與PRC1菌株的V0區(qū)所作的比較見表4。如表中所示，在這三個序列的任何一種中都沒有檢測出缺失。因此，HCV-PRC1中的缺失看來不是中國分離種群特有的，而是HCV-PRC1菌株的一個獨特基因組特征。
盡管，即使在中國分離種群中，這個區(qū)域中會發(fā)現(xiàn)非常高度的變異性，當兩個與兩個進行比較時，氨基酸同源性在50.0%與76.9%之間變化。但是，哪怕有這么大的變化性，在這四個菌株中保留有一個6氨基酸鏈，Gly-Gly-Ala-Ala-Xaa-Arg(SEQ ID NO17)。與來源于表4所示的處不同地理位置HCV菌株的其他公開V0區(qū)的序列相比，這個一致序列是中國分離種群所特有的，V3區(qū)無同一類似的部位。
建議將簇生在包膜E1區(qū)中的氨基酸進行組特異性分離，這看來有益于將HCV種群按兩個主要組(組Ⅰ和Ⅱ)分類的建議。見Houghton et al.，Hepatology，14381-388(1991)。在該方案中，對于PRC1菌株來說，三十個氨基酸中有22個是組Ⅱ特異性的(類似日本的)。這一發(fā)現(xiàn)與上述發(fā)現(xiàn)相結合說明中國和日本分離種群之間有密切的同源性。考慮到只有在中國組的分離種群中發(fā)現(xiàn)有特定保守部位(SEQ ID NO17)的存在，HCV中國菌株可以代表組中的一個特定亞型。
B.將定義V3區(qū)的HCV-PRC1分離種菌與異源HCV分離種菌的核苷酸及多肽序列進行比較。
V3表現(xiàn)為HCV分離種群基因組分類的非常好的標記，并且被鑒定為在推斷的HCV基因組NS5區(qū)域中。在這個區(qū)中，發(fā)現(xiàn)了HCV分離種群的兩個主要組，也即美國和日本之間的不同。盡管在兩個美國原型HCV-1上和HCV-H之間該區(qū)是相同的，并且在日本原型HCV-BK和HCV-J之間發(fā)現(xiàn)有87%的氨基酸殘基序列同源性，當這兩個組進行比較時發(fā)現(xiàn)只有12%的蛋白同源性。
為了進一步對中國HCV分離種群基因組類型進行表征，克隆來源于四個中國病人1、3、4、11的包括V3區(qū)的cDNA片段，并按實施例1的所述進行序列測定。將該一致序列與來源于4個原型HCV-1，HCV-H，HCV-BK和HCV-J的序列進行比較的結果如圖2所示。
在中國與日本分離種群之間發(fā)現(xiàn)有高度的同源性(79.2-87.5%)，而中國和美國分離種群之間的同源性是非常有限的(8.3-16.7%)。當互相一起比較時，四個中國分離種群表現(xiàn)出78.3%至87.5%的同源性，表明是一個相當同源的病毒組。
針對涉及來源于HCV基因組非構件區(qū)的不同區(qū)域基因組分型，進行比較序列分析。見Kato et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，879524-9528(1990)。將19個日本分離種群的位于病毒基因組NS5區(qū)的離V3區(qū)下游的1千堿基處的一個區(qū)進行比較(核苷酸對核酸)，結果表明這個區(qū)域在全部分離種群中尤其保守(89.0-97.5%的氨基酸同源性)。來源于臺灣分離種群的病毒基因組NS3區(qū)的序列(4377位核苷酸至4929位核苷酸)表現(xiàn)出與日本分離種群的97.3%氨基酸同源性。見Chen et al.，Hepatology，1473-78(1991)。從中國攜帶者的收集血清中獲得的HCV基因組NS3區(qū)(4347核苷酸至4929核苷酸)的cDNA片段序列與來源于日本分離種群HCV-J1的同源序列有95.2%的同源性。見Cong et al.，中國病毒學雜志71-3(1991)。匯總在一起，這些數(shù)據(jù)有力地說明了中國和日本菌株之間的密切關系。得出的結論是中國型HCV分離種群與日本型的分離種群來源相同祖先。
上述的描述及實施例只是為了說明，但不起限制作用。還可以在本發(fā)明的范圍和精神內進行其他的變動，而本領域中的熟練技術人員可容易地實現(xiàn)。其他的方案包括在下述的權利要求中。
序列目錄1.一般資料(ⅰ)申請人Prince，AlfredKe，LiuInchauspe，Genevieve(ⅱ)發(fā)明題目非甲非乙肝炎病毒的中國分離種群組合物和方法(ⅲ)序列數(shù)目79(ⅳ)相關的地址(A)收信人Dressler，Goldsmith，Shore，Sutker & Milnamow(B)街道180N.Stetson st.
(C)城市芝加哥
(D)州IL(E)國家USA(F)郵政編碼60601(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型Floppy盤(B)計算機IBM PC兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)目前的申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(ⅷ)代理人/代理資料(A)名字Northrup，Thomas E(B)注冊號33，268(C)查詢/備審案件號nybooolp(ⅸ)通訊資料(A)電話13126165400(B)電傳13126165460(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度1665個堿基對(B)類型核酸
(2)SEQ ID NO17的資料(ⅰ)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅸ)特殊表征(A)名稱/關鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒別方法Xaa＝Ala或Gly(xi)序列描述SEQ ID NO17Gly Gly Ala Ala Xaa Arg1 5(2)SEQ ID NO18的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO18TAAGGTCATC GATACCCT
(2)SEQ ID NO19的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO19GGACCAGTTC ATCATCATAT(2)SEQ ID NO20的資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO20TGGGTAAGGT CATCGATAC(2)SEQ ID NO21的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO21CAGTTCATCA TCATATCCCA T(2)SEQ ID NO22的資料(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO22TTCCGAGCGG TCGCAACCTC GAGGT(2)SEQ ID NO23的資料(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO23
AGGGTATCGA TGACCTTACC CA(2)SEQ ID NO24的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO24CGAGGAAGAC TTCCGAGC(2)SEQ ID NO25的資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO25ACCCAAATTG CGCGACCTA(2)SEQ ID NO26的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO26GGGCAGTCCT GTTGATGTGC C(2)SEQ ID NO27的資料(ⅰ)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO27CAACTGCTCA ATCTATCCCG GCC(2)SEQ ID NO28的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO28CAGCGCGGCA AGGAACCCAG(2)SEQ ID NO29的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO29GGCACATCAA CAGGACTGCC C(2)SEQ ID NO30的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO30CCAACGGCAG CTGGCACATC
(2)SEQ ID NO31的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO31GAAACGATCG GTCGTCCCCA(2)SEQ ID NO32的資料(ⅰ)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO32TTCTCCCCCC AGCTATACGT AG(2)SEQ ID NO33的資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO33CCCGCTCAAT GCCTGGAGA(2)SEQ ID NO34的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO34TGCCAAGGCC CTGGCAGCGC(2)SEQ ID NO35的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO35
TGGGCGCGCC CCCGCAAGAC(2)SEQ ID NO36的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO36GGCGCCGACG AGCGGAATAT
(2)SEQ ID NO64的資料(ⅰ)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO64(2)SEQ ID NO65的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(Ⅸ)特征表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置14(D)其它資料/標記＝R/注釋＝“R是A或G”(Ⅸ)特征表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基
(B)位置16(D)其它資料/標記＝S/注釋＝“S是C或G”(xi)序列描述SEQ ID NO65GGGGGGGCGG CGGCRGSCCG C(2)SEQ ID NO66的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置7(D)其它資料/標記＝R/注釋＝“R是A或G”(Ⅸ)特征表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置12(D)其它資料/標記＝Y/注釋＝“Y是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO66ATCGTCRGCC GYCGACAG
(2)SEQ ID NO67的資料(ⅰ)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Gly，Glu或Arg”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置8(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Ala或Gly”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置15(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Asp或Glu”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置16(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Gln或Glu”
(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置17(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Ala或Thr”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置20(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Asp或Gly”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置21(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Asp或Gly”(xi)序列描述SEQ ID NO67
(2)SEQ ID NO69的資料(ⅰ)序列特征(A)長度72個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置1(D)其它資料/標記＝R/注釋＝“R是A或G”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置2(D)其它資料/標記＝R/注釋＝“R是A或G”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置9(D)其它資料/標記＝R/注釋＝“R是A或G”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置23(D)其它資料/標記＝S/注釋＝“S是C或G”(Ⅸ)特殊表征
(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置24(D)其它資料/標記＝S/注釋＝“S是C或G”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置33(D)其它資料/標記＝Y/注釋＝“Y是C或T”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置39(D)其它資料/標記＝Y/注釋＝“Y是C或T”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置45(D)其它資料/標記＝H/注釋＝“H是A，C或T”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置46(D)其它資料/標記＝S/注釋＝“S是C或G”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的堿基(B)位置49(D)其它資料/標記＝R/注釋＝“R是A或G”(Ⅸ)特殊表征
(2)SEQ ID NO70的資料(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置1(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Ile或Val”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置10(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Ala Ser或Thr”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置13(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Phe或Leu”(Ⅸ)特殊表征(A)名字/關鍵詞被修飾的位點(B)位置17(D)其它資料/標記＝Xaa/注釋＝“Xaa是Met或Leu”
(2)SEQ ID NO72的資料(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO72ACCACCCCAG TATACGCTTA TGAA(2)SEQ ID NO73的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO73ACCCCAAGGC CTGTTGTG(2)SEQ ID NO74的資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO74CTCTTTGCCG GCGTT(2)SEQ ID NO75的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO75GATGGGACAC CGCGCGTAGG G(2)SEQ ID NO76的資料(ⅰ)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO76
AACATCCAGC TGGTGAAC(2)SEQ ID NO77的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO77ACAACCCGCC CCGGGGGGGC G(2)SEQ ID NO78的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO78GCGGCCCGGC GCCCCAGCAG C(2)SEQ ID NO79的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(xi)序列描述SEQ ID NO79AACTGGTCGC GAACAACGGC C
權利要求
1.一種含有GlyGlyAlaAlaXaaArg，其中Xaa是Ala或Gly，orThrAlaThrAlaProPro氨基酸殘基序列的分離HCV-PRC-Korean特有肽。
2.一種包含HCV-PRC-Korean特有肽的約25個氨基酸殘基的分離肽，其中所述的分離肽選自由下列序列組成的一組氨基酸殘基Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile,Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ser SerPhe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser Gln AsnIle,Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Ala Thr TyrGly Ile Thr Ser Leu Phe Ala Pro Gly Ala Ser GlnAsn Ile, 和Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Thr Thr HisGly Phe Thr Ser Leu Phe Ser Thr Gly Ala Arg GlnAsn Ile.
3.一種從6到約511個氨基酸殘基的分離肽，該肽包括下列氨基酸殘基序列Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly，且它的其余氨基酸殘基限定一種NANBV結構蛋白或多蛋白。
4.根據(jù)權利要求3的肽，含有如下氨基酸殘基序列Val Asp Gly Thr Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala AlaArg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Leu Thr HisGly Pro Ser Gln Asn Ile Gln Leu Val Asn Thr AsnGly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn CysAsn Asp Thr Leu Lys Thr Gly Phe Leu Thr Ala LeuPhe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys ProGlu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Leu Asp Lys PheAsp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp SerGly Gly Lys Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His TyrAla Pro Gln Arg Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser GlnVal Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser.
5.根據(jù)權利要求3的肽，含有如下氨基酸殘基序列Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr LysArg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys PhePro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr LeuLeu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaThr Arg Lys Ala Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg GlyArg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro GluGly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp ProLeu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly TrpLeu Leu Ser Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ser Trp GlyPro Arg Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu GlyLys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala AspLeu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro LeuGly Gly Val Val Arg Ala Leu Ala His Gly Val ArgVal Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly AsnLeu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu AlaLeu Leu Ser Cys Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala TyrGlu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val ThrAsn Asp Cys Ser Asn Thr Asn Ile Val Tyr Glu ThrAla Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Ala ProCys Val Arg Asp Asn Gly Thr Ser Arg Cys Trp ValAla Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala SerIle Pro Thr Thr Ala Ile Arg Arg His Ile Asp LeuLeu Val Gly Ala Ala Thr Phe Cys Ser Ala Met TyrVal Gly Asp Leu Cys Gly Ser Ile Phe Leu Val SerGln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Gln His Glu ThrVal Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly HisVal Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met MetAsn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser GlnLeu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met ValAla Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile AlaTyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val LeuIle Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly ThrThr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp HisIle Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Thr LeuLys Thr Gly Phe Leu Thr Ala Leu Phe Tyr Thr HisLys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met AlaSer Cys Arg Ser Leu Asp Lys Phe Asp Gln Gly TrpGly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Gly Gly Lys AspGln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln ArgCys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly ProVal Tyr Cys Phe Thr Pro Ser.
6.一種含有第一肽部分人工連接到第二肽部分的融合蛋白;所述的第一肽部分定義為非-HCV-PRC-Korean特有肽或鍵合于第二肽部分的蛋白肽的氨基酸殘基序列;所述第二種肽部分含有6到約511個氨基酸殘基，它包括下述氨基酸殘基序列Gly Gly Ala Ala Xaa Arg, wherein Xaa is Ala orGly,并且它的其余殘基定義一種NANBV結構蛋白或多蛋白。
7.根據(jù)權利要求6的融合蛋白，其中所述的第二種肽部分選自由下列序列組成的一組氨基酸殘基序列Gly Gly Ala Ala Xaa Arg, wherein Xaa is Ala orGly,Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile,Val Asp Gly Thr Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala AlaArg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Leu Thr HisGly Pro Ser Gln Asn Ile Gln Leu Val Asn Thr AsnGly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn CysAsn Asp Thr Leu Lys Thr Gly Phe Leu Thr Ala LeuPhe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys ProGlu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Leu Asp Lys PheAsp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp SerGly Gly Lys Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His TyrAla Pro Gln Arg Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser GlnVal Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr LysArg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys PhePro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr LeuLeu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaThr Arg Lys Ala Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg GlyArg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro GluGly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp ProLeu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly TrpLeu Leu Ser Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ser Trp GlyPro Arg Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu GlyLys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala AspLeu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro LeuGly Gly Val Val Arg Ala Leu Ala His Gly Val ArgVal Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly AsnLeu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu AlaLeu Leu Ser Cys Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala TyrGlu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val ThrAsn Asp Cys Ser Asn Thr Asn Ile Val Tyr Glu ThrAla Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Ala ProCys Val Arg Asp Asn Gly Thr Ser Arg Cys Trp ValAla Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala SerIle Pro Thr Thr Ala Ile Arg Arg His Ile Asp LeuLeu Val Gly Ala Ala Thr Phe Cys Ser Ala Met TyrVal Gly Asp Leu Cys Gly Ser Ile Phe Leu Val SerGln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Gln His Glu ThrVal Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly HisVal Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met MetAsn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser GlnLeu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met ValAla Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile AlaTyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val LeuIle Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly ThrThr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp HisIle Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Thr LeuLys Thr Gly Phe Leu Thr Ala Leu Phe Tyr Thr HisLys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met AlaSer Cys Arg Ser Leu Asp Lys Phe Asp Gln Gly TrpGly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Gly Gly Lys AspGln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln ArgCys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly ProVal Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ser SerPhe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser Gln AsnIle,Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Ala Thr TyrGly Ile Thr Ser Leu Phe Ala Pro Gly Ala Ser GlnAsn Ile, andTyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Thr Thr HisGly Phe Thr Ser Leu Phe Ser Thr Gly Ala Arg GlnAsn Ile.
8.根據(jù)權利要求6的融合蛋白，其中所述的第一種肽部分含有如下氨基酸殘基序列Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys GlyLeu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr LeuGlu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg AspGlu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu LeuGly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile AspGly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile IleArg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly GlyCys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu GluGly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser ArgIle Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys ValAsp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys MetPhe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu AsnGly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu TyrAsp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro MetCys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe LysLys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys TyrLeu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu GlnGly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His ProPro Lys Ser Asp Leu.
9.根據(jù)權利要求6的融合蛋白，其中，所述的第一種肽部分含有如下氨基酸殘基序列Ala Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr HisVal Thr Asn Asp Cys Ser Asn Thr Asn Ile Val TyrGlu Thr Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly CysAla Pro Cys Val Arg Asp Asn Gly Thr Ser Arg CysTrp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg AsnAla Ser Ile Pro Thr Thr Ala Ile Arg Arg His IleAsp Leu Leu Val Gly Ala Ala Thr Phe Cys Ser AlaMet Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Ile Phe LeuVal Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Gln HisGlu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr ProGly His Val Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp MetMet Met Asn Trp Ser.
10.一種與NANBV的HCV-PRC和朝鮮分離種群發(fā)生免疫反應而不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-BK，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應的抗體分子。
11.根據(jù)權利要求10的抗體分子，其中，該抗體分子是一種抗HCV-PRC-Korean特有肽或融合蛋白的單克隆抗體，即(ⅰ)含有6至約511個氨基酸的包含Gly Gly Ala Ala Xaa Arg,其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列的分離肽，并且其其余殘基定義一種NANBV結構蛋白或多蛋白，或(ⅱ)包括Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly的氨基酸殘基序列的融合蛋白。
12.一種接種物，該接種物含有免疫有效量的下述物質(ⅰ)含有6到約511個氨基酸殘基的分離肽，其中包括Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列，并且其其余的殘基定義一種NANBV結構蛋白或多蛋白，或(ⅱ)一種包括Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列的融合蛋白;將所述的肽或融合蛋白或者單獨或者與一種抗原載體連接并分散在藥物學上可接受的賦形劑中。
13.權利要求12的接種物，其中所述的肽選自下列序列組成的一組氨基酸殘基序列Gly Gly Ala Ala Xaa Arg, wherein Xaa is Ala orGly,Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile,Val Asp Gly Thr Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala AlaArg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Leu Thr HisGly Pro Ser Gln Asn Ile Gln Leu Val Asn Thr AsnGly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn CysAsn Asp Thr Leu Lys Thr Gly Phe Leu Thr Ala LeuPhe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys ProGlu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Leu Asp Lys PheAsp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp SerGly Gly Lys Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His TyrAla Pro Gln Arg Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser GlnVal Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr LysArg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys PhePro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr LeuLeu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaThr Arg Lys Ala Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg GlyArg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro GluGly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp ProLeu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly TrpLeu Leu Ser Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ser Trp GlyPro Arg Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu GlyLys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala AspLeu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro LeuGly Gly Val Val Arg Ala Leu Ala His Gly Val ArgVal Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly AsnLeu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu AlaLeu Leu Ser Cys Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala TyrGlu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val ThrAsn Asp Cys Ser Asn Thr Asn Ile Val Tyr Glu ThrAla Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Ala ProCys Val Arg Asp Asn Gly Thr Ser Arg Cys Trp ValAla Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala SerIle Pro Thr Thr Ala Ile Arg Arg His Ile Asp LeuLeu Val Gly Ala Ala Thr Phe Cys Ser Ala Met TyrVal Gly Asp Leu Cys Gly Ser Ile Phe Leu Val SerGln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Gln His Glu ThrVal Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly HisVal Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met MetAsn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser GlnLeu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met ValAla Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile AlaTyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val LeuIle Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly ThrThr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp HisIle Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Thr LeuLys Thr Gly Phe Leu Thr Ala Leu Phe Tyr Thr HisLys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met AlaSer Cys Arg Ser Leu Asp Lys Phe Asp Gln Gly TrpGly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Gly Gly Lys AspGln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln ArgCys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly ProVal Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ser SerPhe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser Gln AsnIle,Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Ala Thr TyrGly Ile Thr Ser Leu Phe Ala Pro Gly Ala Ser GlnAsn Ile, andTyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Thr Thr HisGly Phe Thr Ser Leu Phe Ser Thr Gly Ala Arg GlnAsn Ile.
14.一種在哺乳動物體內誘導抗體產生的方法，所述的抗體與NANBV的HCV-PRC和朝鮮分離種群發(fā)生免疫反應而不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-BK，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應，該方法有下述步驟(a)給所述的哺乳動物施用權利要求12的接種物，且(b)將該哺乳動物保持一段時間，使所述哺乳動物足以產生免疫應答并產生抗-HCV-PRC或抗-朝鮮分離種群抗體。
15.一種藥盒形式的檢測體液樣品中抗體存在的診斷系統(tǒng)，所述抗體只與NANBV的HCV-PRC或朝鮮分離種群發(fā)生免疫反應而不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-BK，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應，上述藥盒含有足以完成至少一個檢測的足夠量的(ⅰ)含有6到約511個氨基酸殘基的分離肽，其中包含Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly，的氨基酸殘基序列，并且其其余的殘基定義一種NANBV結構蛋白或多蛋白，或(ⅱ)一種包括Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列的融合蛋白。
16.根據(jù)權利要求15的診斷系統(tǒng)，其中所述的肽選自下列一組序列組成的氨基酸殘基序列Gly Gly Ala Ala Xaa Arg,其中Xaa是Ala或Gly,Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile,Val Asp Gly Thr Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala AlaArg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Leu Thr HisGly Pro Ser Gln Asn Ile Gln Leu Val Asn Thr AsnGly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn CysAsn Asp Thr Leu Lys Thr Gly Phe Leu Thr Ala LeuPhe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys ProGlu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Leu Asp Lys PheAsp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp SerGly Gly Lys Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His TyrAla Pro Gln Arg Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser GlnVal Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr LysArg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys PhePro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr LeuLeu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaThr Arg Lys Ala Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg GlyArg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro GluGly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp ProLeu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly TrpLeu Leu Ser Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ser Trp GlyPro Arg Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu GlyLys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala AspLeu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro LeuGly Gly Val Val Arg Ala Leu Ala His Gly Val ArgVal Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly AsnLeu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu AlaLeu Leu Ser Cys Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala TyrGlu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val ThrAsn Asp Cys Ser Asn Thr Asn Ile Val Tyr Glu ThrAla Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Ala ProCys Val Arg Asp Asn Gly Thr Ser Arg Cys Trp ValAla Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala SerIle Pro Thr Thr Ala Ile Arg Arg His Ile Asp LeuLeu Val Gly Ala Ala Thr Phe Cys Ser Ala Met TyrVal Gly Asp Leu Cys Gly Ser Ile Phe Leu Val SerGln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Gln His Glu ThrVal Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly HisVal Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met MetAsn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser GlnLeu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met ValAla Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile AlaTyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val LeuIle Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly ThrThr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp HisIle Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Thr LeuLys Thr Gly Phe Leu Thr Ala Leu Phe Tyr Thr HisLys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met AlaSer Cys Arg Ser Leu Asp Lys Phe Asp Gln Gly TrpGly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Gly Gly Lys AspGln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln ArgCys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly ProVal Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ser SerPhe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser Gln AsnIle,Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Ala Thr TyrGly Ile Thr Ser Leu Phe Ala Pro Gly Ala Ser GlnAsn Ile, 和Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Thr Thr HisGly Phe Thr Ser Leu Phe Ser Thr Gly Ala Arg GlnAsn Ile.
17.一種藥盒形式的檢測體液樣品中是否存在NANBV的HCV-PRC或朝鮮分離種群的診斷系統(tǒng)，所述的藥盒含有足以完成至少一個檢測的足夠量的抗體分子，該抗體分子只與NANBV的HCV-PRC和朝鮮分離種群發(fā)生免疫反應，而不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-BK，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應。
18.根據(jù)權利要求17的診斷系統(tǒng)，其中所述的抗體分子是一種單克隆抗體，該單克隆抗體抗(ⅰ)一種含有6到約511個氨基酸殘基的分離肽，它包含Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列，并且其其余殘基定義一種NANBV結構蛋白或多蛋白，或(ⅱ)一種包括Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列的融合蛋白。
19.根據(jù)權利要求16的診斷系統(tǒng)，其中所述的肽選自下列序列組成的一組氨基酸殘基序列Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly，Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile,Val Asp Gly Thr Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala AlaArg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Leu Thr HisGly Pro Ser Gln Asn Ile Gln Leu Val Asn Thr AsnGly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn CysAsn Asp Thr Leu Lys Thr Gly Phe Leu Thr Ala LeuPhe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys ProGlu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Leu Asp Lys PheAsp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp SerGly Gly Lys Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His TyrAla Pro Gln Arg Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser GlnVal Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr LysArg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys PhePro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr LeuLeu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaThr Arg Lys Ala Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg GlyArg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro GluGly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp ProLeu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly TrpLeu Leu Ser Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ser Trp GlyPro Arg Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu GlyLys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala AspLeu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro LeuGly Gly Val Val Arg Ala Leu Ala His Gly Val ArgVal Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly AsnLeu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu AlaLeu Leu Ser Cys Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala TyrGlu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val ThrAsn Asp Cys Ser Asn Thr Asn Ile Val Tyr Glu ThrAla Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Ala ProCys Val Arg Asp Asn Gly Thr Ser Arg Cys Trp ValAla Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala SerIle Pro Thr Thr Ala Ile Arg Arg His Ile Asp LeuLeu Val Gly Ala Ala Thr Phe Cys Ser Ala Met TyrVal Gly Asp Leu Cys Gly Ser Ile Phe Leu Val SerGln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Gln His Glu ThrVal Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly HisVal Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met MetAsn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser GlnLeu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met ValAla Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile AlaTyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val LeuIle Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly ThrThr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp HisIle Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Thr LeuLys Thr Gly Phe Leu Thr Ala Leu Phe Tyr Thr HisLys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met AlaSer Cys Arg Ser Leu Asp Lys Phe Asp Gln Gly TrpGly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Gly Gly Lys AspGln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln ArgCys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly ProVal Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ser SerPhe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser Gln AsnIle,Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Ala Thr TyrGly Ile Thr Ser Leu Phe Ala Pro Gly Ala Ser GlnAsn Ile, 和Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Thr Thr HisGly Phe Thr Ser Leu Phe Ser Thr Gly Ala Arg GlnAsn Ile.
20.一種檢測身體樣品中抗體存在的方法，所述抗體只與NANBV的HCV-PRC或朝鮮分離種群發(fā)生免疫反應，而不與NANBV分離種群HCV-1，HCV-BK，HCV-J，HCV-J1，HCV-J4，HCV-JH或HCV-Hh發(fā)生免疫反應，該方法含有(a)通過所述的身體樣品與(ⅰ)一種有6到約511個氨基酸殘基的分離肽，其中包含Gly Gly Ala Ala Xaa Arg,其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列，并且其其余殘基定義一種NANBV結構蛋白或多蛋白，或(ⅱ)一種包括Gly Gly Ala Ala Xaa Arg，其中Xaa是Ala或Gly氨基酸殘基序列的融合蛋白混合，形成一種含水免疫反應混合物(b)在生物檢測條件下，將所述的含水免疫反應混和物保持一段時間，使得存在的所述的任何抗體足以與所述肽或融合蛋白發(fā)生免疫反應以形成一種免疫反應產物;且(c)檢測形成的任何所述免疫反應產物的存在并由此檢測出抗體的存在。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中所述的肽選自下列序列組成的一組氨基酸殘基序列Gly Gly Ala Ala Xaa Arg, 其中 Xaa 是 Ala 或Gly,Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile,Val Asp Gly Thr Thr Arg Val Gly Gly Ala Ala AlaArg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Leu Thr HisGly Pro Ser Gln Asn Ile Gln Leu Val Asn Thr AsnGly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn CysAsn Asp Thr Leu Lys Thr Gly Phe Leu Thr Ala LeuPhe Tyr Thr His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys ProGlu Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Leu Asp Lys PheAsp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp SerGly Gly Lys Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His TyrAla Pro Gln Arg Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser GlnVal Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr LysArg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys PhePro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr LeuLeu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaThr Arg Lys Ala Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg GlyArg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro GluGly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp ProLeu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly TrpLeu Leu Ser Pro Gln Gly Ser Arg Pro Ser Trp GlyPro Arg Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu GlyLys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala AspLeu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro LeuGly Gly Val Val Arg Ala Leu Ala His Gly Val ArgVal Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly AsnLeu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu AlaLeu Leu Ser Cys Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala TyrGlu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val ThrAsn Asp Cys Ser Asn Thr Asn Ile Val Tyr Glu ThrAla Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Ala ProCys Val Arg Asp Asn Gly Thr Ser Arg Cys Trp ValAla Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala SerIle Pro Thr Thr Ala Ile Arg Arg His Ile Asp LeuLeu Val Gly Ala Ala Thr Phe Cys Ser Ala Met TyrVal Gly Asp Leu Cys Gly Ser Ile Phe Leu Val SerGln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Gln His Glu ThrVal Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly HisVal Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met MetAsn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser GlnLeu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met ValAla Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile AlaTyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val LeuIle Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly ThrThr Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr SerSer Phe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser GlnAsn Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp HisIle Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Thr LeuLys Thr Gly Phe Leu Thr Ala Leu Phe Tyr Thr HisLys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met AlaSer Cys Arg Ser Leu Asp Lys Phe Asp Gln Gly TrpGly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Gly Gly Lys AspGln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln ArgCys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly ProVal Tyr Cys Phe Thr Pro Ser,Arg Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ser SerPhe Ala Ser Leu Leu Thr His Gly Pro Ser Gln AsnIle,Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Ala Thr TyrGly Ile Thr Ser Leu Phe Ala Pro Gly Ala Ser GlnAsn Ile, 和Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Ala Gly Arg Thr Thr HisGly Phe Thr Ser Leu Phe Ser Thr Gly Ala Arg GlnAsn Ile.
22.一種含約18到約1665個核苷酸堿基對的分離DNA分子，它編碼包括HCV-PRC-Korean特有肽的HCV-PRC氨基酸殘基序列。
23.根據(jù)權利要求22的分離DNA分子，含有選自下列序列組成的一組核苷酸堿基序列GGGGGGGCGG CGGCRGSCCG C，其中R是A或G，和S是C或G，和S 是 C 或 G，ACC CGC GTA GGG GGG GCG GCG GCC CGC ACC ACC AGCAGC TTC GCA TCC TTG CTT ACA CAT GGG CCA TCT CAGAAC ATC,GTT GAT GGG ACA ACC CGC GTA GGG GGG GCG GCG GCCCGC ACC ACC AGC AGC TTC GCA TCC TTG CTT ACA CATGGG CCA TCT CAG AAC ATC CAG CTC GTG AAC ACC AACGGC AGC TGG CAC ATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGTAAT GAC ACC CTC AAG ACA GGG TTC CTT ACT GCG TTGTTC TAC ACG CAT AAG TTC AAT TCG TCC GGA TGT CCAGAG CGC ATG GCC AGC TGC CGC TCC CTC GAC AAA TTCGAT CAG GGA TGG GGT CCA ATC ACC TAT GAT GAT TCTGGC GGC AAG GAT CAG AGG CCT TAT TGC TGG CAC TACGCG CCT CAG CGA TGC GGT ATC GTA CCT GCG TCG CAGGTG TGT GGT CCA GTG TAT TGC TTC ACC CCA AGC,ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAACGT AAC ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTCCCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTGTTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCGACT AGG AAG GCT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGAAGG CGA CAG CCT ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAGGGC AGG ACC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCCCTC TAT GGC AAT GAG GGT ATG GGG TGG GCA GGA TGGCTC CTG TCA CCC CAA GGC TCT CGG CCT AGT TGG GGCCCC AGA GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAC TTG GGTAAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GACCTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTAGGG GGC GTT GTC AGG GCC CTG GCG CAT GGT GTC CGGGTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AATTTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTT TTG GCTCTG CTG TCC TGT TTG ACC ACC CCA GCT TCC GCT TATGAA GTG CGC AAC GCG TCC GGG GTA TAC CAT GTC ACGAAC GAC TGC TCC AAC ACA AAC ATC GTA TAT GAG ACAGCG GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGT GCA CCCTGC GTT CGG GAT AAT GGC ACC TCC CGT TGC TGG GTAGCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AGG AAT GCT AGCATC CCC ACT ACG GCA ATA CGA CGT CAC ATC GAC TTGCTT GTG GGG GCG GCC ACT TTC TGC TCC GCC ATG TACGTG GGG GAT CTC TGC GGA TCC ATT TTC CTT GTC TCCCAG CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CAA CAT GAG ACGGTA CAG GAC TGC AAT TGC TCG ATC TAT CCT GGC CACGTA ACA GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATGAAC TGG TCA CCC ACA ACG GCC TTA GTG GTG TCG CAGTTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT ATC ATG GAC ATG GTGGCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC ATT GCCTAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTGATT GTG ATG CTA CTC TTT GCT GGC GTT GAT GGG ACAACC CGC GTA GGG GGG GCG GCG GCC CGC ACC ACC AGCAGC TTC GCA TCC TTG CTT ACA CAT GGG CCA TCT CAGAAC ATC CAG CTC GTG AAC ACC AAC GGC AGC TGG CACATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGT AAT GAC ACC CTCAAG ACA GGG TTC CTT ACT GCG TTG TTC TAC ACG CATAAG TTC AAT TCG TCC GGA TGT CCA GAG CGC ATG GCCAGC TGC CGC TCC CTC GAC AAA TTC GAT CAG GGA TGGGGT CCA ATC ACC TAT GAT GAT TCT GGC GGC AAG GATCAG AGG CCT TAT TGC TGG CAC TAC GCG CCT CAG CGATGC GGT ATC GTA CCT GCG TCG CAG GTG TGT GGT CCAGTG TAT TGC TTC ACC CCA AGC,GTTGATGGGG ATACCTACGT GTCGGGGGGG GCGGCAGCCCGCTCCATCTC CGGGTTCACG TCCCTCTTTA CACCTGGGGCCTCTCAGAAG ATCCAGCTTG TAAATACCAA TGGTAGCTGGCATATCAACA GGACTGCCCT GAACTGCAAT GACTCCCTCAATACTGGGTT TCTTGCCGCG CTGTTCTATA CACACAG,GGTTTTGATT GTGATGCTAC TCTTCGCCGG CGTTGATGGGGATACCTACG CGTCGGGGGG GGCGGCAGGC CGCGCCACCTACGGAATCAC GTCCCTCTTT GCACCTGGGG CCTCTCAGAACATCCAGCTT ATAAATACCA ATGGTAGCTG GCATATCAACAGGACTGCCC TGAACTGCAA TGACACCCTC AGGACTGGGTTTATTGCCGC GCTGTTCTAT ACACGCAAGT TCAACGCGTCCGGATGCCCA GAGCGCATGG CCAGCTGCTG CCCCATTGATACGTTCGATC AGGGCTGGG,GTTGACGGGA GAACCTACGC GTCGGGGGGG GCGGCAGGCCGCACCACACA CGGCTTTACG TCCCTCTTTT CAACCGGGGCGCGTCAGAAT ATCCAGCTTA TAAACACCAA TGGCAGCTGGCACATCAATA GGACTGCCCT GAACTGCAAT GACTCTCTTAACACTGGGTT TATTGCTGCG CTGTTCTATG CACACAA,TACTAAGACC TTCGGCAGCT CCAGATCGTC GGCCGTCGACAGCGGCACGG CGACTGCCCC TCCTGACGAG GCCTCCGACGGCGGCGACAA AGGATCCGAC GTTGAGTCG,TACTAAGACC TTCGGCAGCT CCGGATCGTC GGCCGTCGACAGCGCGACGG CGACTGCCCC TCCTGACGAG GCCTCCGACGGCGACGACAA AGGATCCGAC GTTGAGTCG, 和TACTAAGACC TTCGGCAGCT CCGAATCGTC AGCCGCCGACAGCGGCACGG CGACCGCCCC TCCTGATCAG ACCTCCGACGACGGCGACAA AGGATCCGAC GTTGAGTCG.
24.一種檢測身體樣品中HCV-PRC-Korean特有核酸分子存在的方法，該方法包括(a)通過將所述的身體樣品與權利要求22的DNA分子混和形成一種含水的雜交混和物;(b)在雜交條件下將所述的含水雜交混和物保持一段時間，使存在的任何所述的HCV-PRC-Korean特有核酸分子足以與所述的DNA分子雜交形成雜交產物;且(c)檢測形成的任何雜交產物的存在并由此檢測出所述HCV-PRC-Korean特有核酸分子的存在。25、有下列序列的一種分離DNA分子UACUCGUGCU UAGGAUUUGG AGUUUCUUUU UGGUUUGCAUUGUGGUUGGC GGCGGGUGUC CUGCAGUUCA AGGGCCCGCCACCAGUCUAG CAACCACCUC AAAUGGACAA CGGCGCGUCCCCGGGGUCCA ACCCACACGC GCGCUGAUCC UUCCGAAGGCUCGCCAGCGU UGGAGCACCU UCCGCUGUCG GAUAGGGGUUCCGAGCGGCC GGGCUCCCGU CCUGGACCCG AGUCGGGCCCAUGGGAACCG GGGAGAUACC GUUACUCCCA UACCCCACCCGUCCUACCGA GGACAGUGGG GUUCCGAGAG CCGGAUCAACCCCGGGGUCU CUGGGGGCCG CAUCCAGCGC AUUGAACCCAUUCCAGUAGC UAUGGGAGUG UACGCCGAAG CGGCUGGAGUACCCCAUGUA AGGCGAGCAG CCGCGGGGGG AUCCCCCGCAACAGUCCCGG GACCGCGUAC CACAGGCCCA AGACCUCCUGCCGCACUUGA UACGUUGUCC CUUAAACGGG CCAACGAGAAAGAGAUAGAA GGAAAACCGA GACGACAGGA CAAACUGGUGGGGUCGAAGG CGAAUACUUC ACGCGUUGCG CAGGCCCCAUAUGGUACAGU GCUUGCUGAC GAGGUUGUGU UUGUAGCAUAUACUCUGUCG CCUGUACUAG UACGUAUGGG GGCCCACACGUGGGACGCAA GCCCUAUUAC CGUGGAGGGC AACGACCCAUCGCGAGUGAG GGUGCGAGCG CCGGUCCUUA CGAUCGUAGGGGUGAUGCCG UUAUGCUGCA GUGUAGCUGA ACGAACACCCCCGCCGGUGA AAGACGAGGC GGUACAUGCA CCCCCUAGAGACGCCUAGGU AAAAGGAACA GAGGGUCGAC AAGUGGAAGAGCGGAGCGGU UGUACUCUGC CAUGUCCUGA CGUUAACGAGCUAGAUAGGA CCGGUGCAUU GUCCAGUGGC GUACCGAACCCUAUACUACU ACUUGACCAG UGGGUGUUGC CGGAAUCACCACAGCGUCAA UGAGGCCUAG GGUGUUCGAU AGUACCUGUACCACCGCCCC CGGGUGACCC CUCAGGACCG CCCGUAACGGAUGAUAAGGU ACCACCCCUU GACCCGAUUC CAAAACUAACACUACGAUGA GAAACGACCG CAACUACCCU GUUGGGCGCAUCCCCCCCGC CGCCGGGCGU GGUGGUCGUC GAAGCGUAGGAACGAAUGUG UACCCGGUAG AGUCUUGUAG GUCGAGCACUUGUGGUUGCC GUCGACCGUG UAGUUGUCCU GACGGGACUUGACAUUACUG UGGGAGUUCU GUCCCAAGGA AUGACGCAACAAGAUGUGCG UAUUCAAGUU AAGCAGGCCU ACAGGUCUCGCGUACCGGUC GACGGCGAGG GAGCUGUUUA AGCUAGUCCCUACCCCAGGU UAGUGGAUAC UACUAAGACC GCCGUUCCUAGUCUCCGGAA UAACGACCGU GAUGCGCGGA GUCGCUACGCCAUAGCAUGG ACGCAGCGUC CACACACCAG GUCACAUAACGAAGUGGGGU UCGGGACAAC ACC.
全文摘要
本發(fā)明提供中國分離種群非甲非乙型肝炎病毒的分離核酸，肽和蛋白質分子。具體說來，本發(fā)明涉及中國分離種群非甲非乙型肝炎病毒的分離核酸、肽和蛋白質分子，該分離分子只有NANBV的中國和朝鮮分離種群才有。本發(fā)明也提供抗這些分離分子的抗體和組合物以及在診斷方法和疫苗中用這些分子和抗體的方法。
文檔編號C07H21/00GK1075147SQ9310170
公開日1993年8月11日 申請日期1993年1月9日 優(yōu)先權日1992年1月10日
發(fā)明者劉克, G·安紹斯普, A·普林斯 申請人:紐約血中心