專利名稱：一種重組葡激酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)方法。
葡激酶(Staphylokinase，SaK)為金黃色葡萄球菌溶源性噬菌體合成的一種蛋白水解酶。自1948年Lack C.H.發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌合成的SaK能激活血漿蛋白酶以來(lái)，由于種種原因，如金黃色葡萄球菌合成和分泌SaK水平很低，純化SaK時(shí)很難去除內(nèi)毒素等雜質(zhì)，以致SaK結(jié)構(gòu)，功能及其臨床應(yīng)用價(jià)值的研究進(jìn)展緩慢。隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，Sako-T等從金黃色葡萄球菌中分離到含有SaK基因的噬菌體，從噬菌體基因組中切下SaK基因及其啟動(dòng)子等調(diào)控序列，與PBR322載體重組，構(gòu)建了含有r-SaK基因的克隆，并實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。Behnke-D等則用酵母表達(dá)SaK基因。1993年D.Collen等用Sako.T類似方法分離SaK基因，與PUC19重組后在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物存在于培液，周圍膜間隙和菌體內(nèi)，經(jīng)離子交換、親和層析和凝膠過(guò)濾后得純品＜6mg/L培養(yǎng)物。上述各家實(shí)驗(yàn)室建立的基因構(gòu)建和產(chǎn)物純化方法復(fù)雜，產(chǎn)率很低。
本發(fā)明的目的是提供一種新的制備重組葡激酶的方法。其中用PCR構(gòu)建基因，基因表達(dá)水平極高，r-SK以可溶性，活性狀態(tài)存在于菌體內(nèi)，純化方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)物純度高和產(chǎn)量高，成本低。
本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)從人體分離溶血性金黃葡萄球菌，選擇纖溶性最高者大量培養(yǎng)，從培養(yǎng)液提純葡激酶，測(cè)定其N和C端5個(gè)氨基酸順序作設(shè)計(jì)引物的參考，以該菌株大分子DNA作模板，通過(guò)PCR直接擴(kuò)增葡激酶基因，與PUC19質(zhì)粒載體重組后，經(jīng)核苷酸順序分析肯定基因結(jié)構(gòu)。
(2)r-SaK基因與原核表達(dá)質(zhì)粒(如含PL，PR啟動(dòng)子，CIt857基因，5SRNA終止信號(hào)等調(diào)控元件的載體)重組，形成表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用溫度誘導(dǎo)r-SaK基因的表達(dá);表達(dá)產(chǎn)物r-SaK以可溶性、活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，占菌體蛋白40%以上。工程菌命名PSTE-SAK-1。
(3)發(fā)酵技術(shù)用低營(yíng)養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)PSTE-SAK-1，溫度誘導(dǎo)前后用LB，葡萄糖，稀有元素溶液補(bǔ)料，發(fā)酵時(shí)溫度以30-42℃合宜，DO＝50-80%，PH＝6-8，攪拌速度隨DO升高而減少。
(4)工程菌用高壓破碎，離心后，經(jīng)離子交換、凝膠過(guò)濾二步法從上清液純化r-SaK。
純品r-SaK中加入人血清白蛋白、谷氨酸鈉、磷酸鹽等穩(wěn)定劑后，微孔濾膜過(guò)濾除菌，冷凍干燥成白色粉狀成品。成品用注射用水溶解后供注射用，以治療心肌梗塞，肺、腦、周圍血管栓性栓塞，血液透析通路和血液中血凝塊，防治介入治療時(shí)動(dòng)脈插管阻塞，顯微外科吻合口血栓，以及眼內(nèi)積血和滲出等疾患。
基因結(jié)構(gòu)和內(nèi)切酶圖譜見(jiàn)圖1，圖2。
葡激酶分子量約為15.5KD，激活纖溶酶原(plasminogen，plg)的過(guò)程類似于鏈激酶，首先SaK和plg結(jié)合形成1∶1的復(fù)合物，然后該復(fù)合物激活另一分子plg，形成纖溶酶，后者催化纖維蛋白水解，溶解血栓，恢復(fù)血液循環(huán)。在血漿中，SaK和plg形成復(fù)合物SaK-plg后，如果沒(méi)有纖維蛋白存在，則該復(fù)合物很快被α2-抗纖溶酶中和，然后被巨噬細(xì)胞吞噬;在有纖維蛋白存在時(shí)，SaK-plg復(fù)合物中plg分子上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)和纖維蛋白結(jié)合，喪失了與α2-抗纖溶酶的結(jié)合位點(diǎn)，不受其抑制，因此不僅能高效激活血栓中plg，特異地溶解血栓，而且不易誘發(fā)系統(tǒng)性纖溶狀態(tài)。動(dòng)物溶血栓模型亦證明，SaK在溶解血栓的同時(shí)，沒(méi)有引起纖維蛋白原的明顯降低。此外SaK尚有以下突出優(yōu)點(diǎn)分子量小，穿透性能好，對(duì)富含血小板的血栓，尤其是腦動(dòng)脈血栓和肢體動(dòng)靜脈血栓的溶解作用比其他溶栓藥物強(qiáng)，具有更好的療效，本發(fā)明構(gòu)建的SaK基因，用大腸桿菌高效表達(dá)r-SaK，不僅產(chǎn)品得率高，每升發(fā)酵液可得純品400-500mg，而且純度達(dá)97-99%，與D.Collen等方法每升發(fā)酵液6mg得率相比，本發(fā)明的效果顯著提高，其成本則低廉得多。
實(shí)施例(一)1、從人體鼻咽部分離60株金黃色葡萄球菌，分別接種于LB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)過(guò)夜，離心收集細(xì)菌，上清用纖維蛋白板測(cè)SaK活性，有8株能分泌SaK，其中No.4活性最高，在纖維蛋白板中用牛纖溶酶原代替人纖溶酶原作鑒別試驗(yàn)，證明No.4分泌的是SaK。
大量培養(yǎng)No.4金黃色葡萄球菌，經(jīng)離子交換和分子篩純化15KD蛋白質(zhì)，并用反轉(zhuǎn)纖維蛋白板等方法證明此15KD蛋白具有纖溶活性，然后進(jìn)行N-末端和C-末端氨基酸順序分析，用于設(shè)計(jì)PCR引物。
國(guó)外文獻(xiàn)或?qū)＠墨I(xiàn)報(bào)道的均從噬菌體基因組中分離Sak基因及其調(diào)控序列，本發(fā)明直接以金黃色葡萄球菌大分子DNA作模板通過(guò)PCR擴(kuò)增和制備Sak基因。
2、用PCR擴(kuò)增葡激酶基因培養(yǎng)No.4金黃色葡萄球菌，按Frederick M.Ananbel et al方法制備菌體高分子DNA。
挑單個(gè)菌落接種于LB培液(37℃過(guò)夜培養(yǎng))，5000rpm離心10分鐘，取菌塊懸于緩沖液，加SDS和Proteinse K后，50℃保溫4小時(shí)。用等體積氯仿/異戊醇抽提，再離心分層，上層液再用等體積酚/氯仿/異戊醇抽提，上層液加入0.6 Vol異丙醇。離心沉淀，用75%酒精洗滌兩次，抽干后溶于TE緩沖液，紫外分光檢測(cè)證明A260/A280大于2.0。
N、C末端氨基酸順序測(cè)定結(jié)果設(shè)計(jì)PCR引物，并用固相磷酸三酯法藉DNA合成儀合成，純化后用于擴(kuò)增葡激酶基因。兩個(gè)PCR引物的5’末端分別含有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。
PCR反應(yīng)總體積100μl，含模板DNA 0.5μg引物Ⅰ 50.0pmoles引物Ⅱ 50.0pmolesdNTP 2.0mmol/L10×PCR緩沖液ddH2OTaq DNA聚合酶 2.5UPCR反應(yīng)時(shí)92℃變性90秒，70℃延伸60秒，52℃退火60秒。15個(gè)循環(huán)后再加2.5UTaqDNA聚合酶，再進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后取2μl作瓊脂糖凝膠電泳，用紫外燈檢測(cè)，在400～500bp之間出現(xiàn)一條十分明亮的條帶，其中所含核酸片段的長(zhǎng)度符合完整葡激酶基因長(zhǎng)度。
3、葡激酶基因克隆的構(gòu)建和鑒定PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶水解后，加入經(jīng)相應(yīng)的酶完全水解后的PUC19質(zhì)粒載體和T4DNA連接酶反應(yīng)體系，室溫放置1小時(shí)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83，用氨芐青霉素-LB平板在37℃溫箱中篩選培養(yǎng)。
挑取單個(gè)菌落按Sambrook方法制備質(zhì)粒，用酶切鑒定，呈現(xiàn)特征性條帶者命名pST-Sak-1。
質(zhì)粒pST-SaK-1經(jīng)核苷酸順序分析證明pST-SaK-1質(zhì)粒中SaK基因的核苷酸順序和閱讀框架。
4、葡激酶基因克隆在大腸桿菌中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建-pST-SaK質(zhì)粒經(jīng)雙酶解后，用瓊脂糖凝膠電泳分離，回收400～500bpSaK基因，并與原核表達(dá)載體如pLY-4(含PL，PR啟動(dòng)子，CIt857基因，55RNA終止信號(hào)等調(diào)控元件)重組，反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K802，用氨芐青霉素-LB平板篩選培養(yǎng)。
挑取單個(gè)菌落，制備質(zhì)粒，用酶解鑒定，含SaK基因特征性片段者，稱表達(dá)質(zhì)粒為pSTE-SaK-1，工程菌為PSTE-SAK-1。
葡激酶基因誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的鑒定-挑取PSTE-SaK單個(gè)菌落，在LB培液中30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日用低營(yíng)養(yǎng)培液按1∶100稀釋后，在搖瓶中30℃培養(yǎng)至A600～0.6(約4～5小時(shí))，然后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)，5000r.p.m.離心收集細(xì)菌，用PBS(pH7.4)洗滌二次，保存于-20℃或立即作表達(dá)產(chǎn)物的分離。
5、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定SDS凝膠電泳-按Laemmli方法進(jìn)行。
樣品溶解液含0.0625M Tris-HCl(pH6.7)，2% SDS，10%甘油，5%巰基乙醇，0.001%溴酚蘭。
樣品處理和點(diǎn)樣1ml誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液，離心后，沉淀懸于100μl樣品溶解液，置沸水浴中5分鐘，使沉淀溶解。對(duì)照細(xì)菌或誘導(dǎo)前細(xì)菌用同樣方法培養(yǎng)，用同樣條件處理樣品。點(diǎn)樣量為10μl，并使所含蛋白量基本相等。
凝膠染色考馬斯亮蘭或銀染色。
凝膠中蛋白帶掃描島津CS-910雙波長(zhǎng)掃描儀作透射掃描，計(jì)算機(jī)處理，打印各蛋白條帶所占百分比。
誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)菌裂解液在分子量相當(dāng)于15KD處有非常濃集的條帶，誘導(dǎo)前細(xì)菌的裂解液或培液在相同部位幾乎不見(jiàn)此帶。
表達(dá)產(chǎn)物纖溶活性的鑒定-上述凝膠依次用2.5%Triton X-100溶液和蒸餾水充分洗滌，覆蓋于含纖維蛋白原、人纖溶酶原及凝血酶的瓊脂糖凝膠板上，37℃保溫2hr后，15KD處出現(xiàn)十分明現(xiàn)的透亮區(qū)，即此部位纖維蛋白已經(jīng)溶解，顯示表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶活性。
表達(dá)產(chǎn)物在菌體內(nèi)存在狀態(tài)-細(xì)菌用高壓勻漿器壓碎后，35000rpm(約100000g)超速離心60分鐘后，沉淀和上清分別進(jìn)行SDS-PAGE和纖溶活性鑒定，結(jié)果顯示15Kd含有纖溶活性的條帶，分布在上清中，沉淀部分幾乎不見(jiàn)此條帶，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物重組葡激酶(Recombinant Staphylokinase，r-SaK)以可溶性，有活性狀態(tài)存在于菌體內(nèi)，未形成包涵體。此特性與D.Collen等報(bào)導(dǎo)不同。
表達(dá)水平的檢測(cè)-用島津CS-910光密度計(jì)對(duì)SDS-PAGE.考馬斯亮蘭染色的凝膠行掃描，結(jié)果顯示表達(dá)菌中r-SaK占菌體總蛋白的40%以上。
6、葡激酶活性的測(cè)定用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
r-SaK活性測(cè)定-鑒于目前尚無(wú)SaK活性單位及其標(biāo)準(zhǔn)，我們用纖維蛋白凝塊溶解法測(cè)定r-SaK活性。并對(duì)活性規(guī)定如下在1ml反應(yīng)體系中，含有牛纖維蛋白原2mg，纖溶酶原100ug，凝血酶0.4NIH單位，使纖維蛋白凝塊在10分鐘內(nèi)完全溶解的r-SaK的量為1HU。
活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備(體積單位均為ul)管號(hào) 1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)r-Sak(100u/ml) 100 80 60 40 20 0人纖溶酶原(1mg/ml) 100 100 100 100 100 100PBS-0.01%Tween20(PH7.4) 590 610 630 650 670 690搖勻 37℃ 5min人凝血酶 10 10 10 10 10 10人纖維蛋白原(10mg/ml) 200 200 200 200 200 200搖勻 37℃保溫通常經(jīng)1-2分鐘時(shí)形成凝塊，按下秒表，凝塊完全溶解時(shí)，再按下秒表，每管需要一只秒表，記錄形成凝塊到凝塊完全溶解的時(shí)間(分)以10×1gT和1gSak活性(U)作圖。
樣品的測(cè)定1mg/ml樣品稀釋104-105倍后按上述方法測(cè)定凝塊溶解所需的時(shí)間(分)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查知并計(jì)算樣品中Sak的活性。
比活性單位體積溶液內(nèi)r-SaK活性單位數(shù)/單位體積溶液中蛋白質(zhì)含量(mg)
實(shí)施例(二)基因工程葡激酶(r-SaK)的大規(guī)模制備工程菌的發(fā)酵-搖瓶發(fā)酵PSTE-SAK-1單個(gè)菌落接種于LB-Amp培液，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日用基礎(chǔ)培養(yǎng)液1∶100稀釋，充分振搖培養(yǎng)至A6000.6-0.8后誘導(dǎo)培養(yǎng)3-4小時(shí)，菌液用已知空重的離心管，5000r.p.m.，4℃離心10分鐘，棄上清，沉淀菌塊用PBS(pH7.4)洗滌一次，稱重，計(jì)算菌塊重量。
5L NBS Bio FIII罐發(fā)酵PSTE-SAK-1單個(gè)菌落在100ml LB-培液中30℃培養(yǎng)過(guò)夜，測(cè)A600，作為種子液，供發(fā)酵用。
發(fā)酵罐內(nèi)換入基礎(chǔ)培液，設(shè)定溫度30℃，pH6-8，溶氧量50-80%，攪拌速度600次/分(攪拌速度隨氧含量而變速)，各項(xiàng)參數(shù)穩(wěn)定后，按1∶100(菌種液∶培液)體積比，接種PSTE-SAK-1菌液。
A600達(dá)1.0左右時(shí)，在維持上述參數(shù)的條件下誘導(dǎo)發(fā)酵3-4小時(shí)，菌體收集方法同搖瓶培養(yǎng)。菌塊可保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> r-SaK的純化-1、細(xì)菌的破碎濕菌用1000ml PBS(pH 7.4)洗滌3次，懸浮于PBS中(10gm/100ml)，高壓勻漿泵壓榨，15000r.p.m.離心10分鐘，收集上清。
2、離子交換S-Sepharose柱經(jīng)緩沖液平衡，加上述樣品，用緩沖液洗脫雜蛋白(3倍床體積)，PH梯度和鹽梯度緩沖液洗脫γ-SAK，合并含SaK活性的各管溶液進(jìn)行超濾濃縮。
3、凝膠過(guò)濾凝膠柱用PBS.PH 7.4平衡，加上步超濾濃縮液用PBS PH7.4洗脫收集并合并含SaK活性各管溶液。用0.22μ微孔濾膜過(guò)濾后無(wú)菌分裝，凍干為半成品。0.22μ微孔濾膜過(guò)濾后，加人血清白蛋白等穩(wěn)定劑后無(wú)菌分裝凍干為成品。
68g濕菌經(jīng)壓榨破菌后，用Lowry法測(cè)得總蛋白為8.21g，用纖維蛋白凝塊溶解法測(cè)得總活性為2.96×108HU，比活性0.36×105HU/mg。壓榨物上清液總蛋白為7.16g，總活性2.93×108HU，比活性為0.41×105HU/mg。
r-SaK粗制品用S-Sepharose分離后，得r-Sak 2.0g，活性1.8×108HU。比活性0.9×105HU/mg。
上述r-Sak樣品用凝膠過(guò)濾脫鹽后，得r-Sak 1.6g，活性1.6×108HU，比活性為105HU/mg，r-Sak純度達(dá)99%。
以上各步純化過(guò)程中蛋白含量，活性以及比活性總結(jié)如表。
蛋白質(zhì)含量 總活性 比活性 純化倍數(shù)(g) (×108HU) (×105HU/mg)全菌(68g濕菌) 8.21 2.96 0.36上清 7.1 2.93 0.41 1.2S-Sepharose 2.0 1.8 0.9 2.5凝膠過(guò)濾 1.6 1.6 1.0 2.78應(yīng)用本發(fā)明所制備的r-SAK經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明具有良好的溶血栓功能，如(1)r-SaK治療實(shí)驗(yàn)性狗股動(dòng)脈血栓，用動(dòng)脈造影顯示，治療前股動(dòng)脈中斷以下不顯影，靜脈注射r-Sak 0.1mg/Kg，60分鐘后再造影，股動(dòng)脈充盈完全，循環(huán)恢復(fù)，而對(duì)照動(dòng)物未見(jiàn)股動(dòng)脈充盈。共做狗8只(治療組5只、對(duì)照3只)。
(2)r-SAk對(duì)實(shí)驗(yàn)性家兔眼前房滲出的治療作用眼內(nèi)注射r-SAK10-20μg，2-4小時(shí)后滲出物消失。對(duì)照組在48小時(shí)內(nèi)幾乎無(wú)變化。共做實(shí)驗(yàn)組6只眼，對(duì)照組4只眼。
(3)r-Sak對(duì)實(shí)驗(yàn)性家兔眼前房積血的治療作用眼內(nèi)注射r-SAK10-20μg，4小時(shí)后可見(jiàn)前房血凝塊溶解，紅細(xì)胞沉降后與房水形成一界面，至24小時(shí)，眼內(nèi)積血已被清除。對(duì)照兔眼前房積血明顯未見(jiàn)變化。共做實(shí)驗(yàn)組6只眼，對(duì)照組4只眼。


圖一是表達(dá)質(zhì)粒pSTE-SAK構(gòu)建二是葡激酶基因的核苷酸順序
權(quán)利要求
1.一種重組葡激酶的制備方法，包括葡激酶基因克隆的構(gòu)建，在大腸桿菌中的表達(dá)，以及工程菌的發(fā)酵，和表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化等，其特征在于(1)從人體分離溶血性金黃色葡萄球菌，選擇纖溶活性最高者大量培養(yǎng)，從培養(yǎng)液提純葡激酶，測(cè)定其N和C端5個(gè)氨基酸順序作設(shè)計(jì)引物的參考，以該菌株大分子DNA作模板，通過(guò)PCR直接擴(kuò)增葡激酶基因，與質(zhì)粒載體重組后，比核苷酸順序分析基因結(jié)構(gòu)；(2)r-SaK基因與原核表達(dá)載體，含PL、PR啟動(dòng)子、CIt857基因、5SRNA終止信號(hào)等調(diào)控元件的PLY-4質(zhì)粒重組，形成表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用溫度誘導(dǎo)r-SaK基因的表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物r-SaK以可溶性、活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中；占菌體總蛋白40%以上。(3)發(fā)酵技術(shù)用低營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)工程菌，溫度誘導(dǎo)前后用LB，葡萄糖，稀有元素溶液補(bǔ)料，發(fā)酵時(shí)溫度為30-42℃，DO=50-80%，PH=6-8，攪拌速度隨DO升高而減少；(4)工程菌用壓榨破碎，離心后，經(jīng)離子交換、凝膠過(guò)濾二步法從上清液純化r-SaK。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所制備的純化r-SAK中加入穩(wěn)定劑，無(wú)菌過(guò)濾、分裝凍干，保存于普通冰箱。
全文摘要
一種重組葡激酶的制備方法，現(xiàn)有技術(shù)中重組質(zhì)粒表達(dá)水平低，純度低，而且得率也很低。本發(fā)明通過(guò)PCR擴(kuò)增葡激酶基因，與原核表達(dá)載體如PLY-4質(zhì)粒重組，形成pSTE-SAK-1表達(dá)質(zhì)粒，pSTE-SaK-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用溫度誘導(dǎo)基因表達(dá)。工程菌經(jīng)發(fā)酵擴(kuò)增，壓榨破碎細(xì)菌，用離子交換和凝膠過(guò)濾二步法從上清液純化r-Sak，本方法得到的葡激酶產(chǎn)品純度和得率都很高，成本低。
文檔編號(hào)C07K14/31GK1096325SQ9411210
公開(kāi)日1994年12月14日 申請(qǐng)日期1994年4月4日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月4日
發(fā)明者宋后燕 申請(qǐng)人:上海醫(yī)科大學(xué)