專利名稱：一種重組葡激酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種重組的生產(chǎn)方法，特別是純化和除熱原的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
葡激酶(staphylokinase Sak)是90年代誕生的一種新型生物技術(shù)治療藥物，是金黃色葡萄球菌分泌的一種胞外蛋白質(zhì)，它類似尿激酶(Uk)和鏈激酶(Sk)，具有溶血栓的特性。通常葡激酶的生產(chǎn)方法是利用已構(gòu)建好的工程菌株，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)到一定OD值，離心收集菌體，然后高壓勻漿泵或超聲波破碎細(xì)胞高速離心獲得上清液，再用兩步法純化。這種常規(guī)的方法具有如下缺點(diǎn)一、在破碎細(xì)胞的過程中引起葡激酶表達(dá)量的損失；二、這種常規(guī)方法操作過程需要提供昂貴的超聲波或高壓勻漿泵設(shè)備和高速離心裝置；三、細(xì)胞打碎后影響除去雜質(zhì)，雜質(zhì)含量高；四、雜質(zhì)含量高的上清液縮短了昂貴的分離介質(zhì)的使用壽命；五、生產(chǎn)過程復(fù)雜、繁瑣。中國專利CN1186106A和CN1207414A中也使用上述的超聲波破碎、離心收集上清液的葡激酶生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的目的在于提供一種重組葡激酶的生產(chǎn)方法，能降低生產(chǎn)過程中葡激酶表達(dá)量損失，延長分離介質(zhì)使用壽命，設(shè)備成本低，能保持細(xì)胞完整，排除壓榨法局部高溫對葡激酶活性的損害，生產(chǎn)過程簡單、方便、穩(wěn)定。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的葡激酶純化和除熱原雜質(zhì)采用將構(gòu)建好的葡激酶工程菌菌體經(jīng)冰凍-解凍-冰凍反復(fù)循環(huán)至少2次；在經(jīng)過循環(huán)后的菌體中加入凍融液；將凍融液離心提取上清液；上清液經(jīng)兩步法純化；上樣經(jīng)洗脫、收集、超濾脫鹽、濃縮、除菌過濾得到葡激酶原液，經(jīng)凍干后得重組葡激酶產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的還可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)葡激酶基因的工程菌菌體經(jīng)冰凍-解凍-冰凍的反復(fù)循環(huán)2至10次；冰凍溫度為-100℃至-15℃；凍融液為磷酸鹽緩沖液(PBS)；離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為4000至5000rpm；兩步純化過程采用SP.sepharoseFF和Phenyl SepharoseFF柱層析；重組葡激酶具有高表達(dá)的工程菌株EcoliH15(中國微生物保藏中心保藏號CGMCC0432)；重組葡激酶具有如下核苷酸全序列及其編碼的氨基酸序列TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTSer Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GATTyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val AspAGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTSer Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu AspGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCAla Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCTGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe ProATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTIle Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn ProGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAAGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys End上述的葡激酶基因的高表達(dá)工程菌株，具有引物Ⅰ，其核苷酸序列為5′ATCCATGGCCATGCTCAAAAGAAGT 3′引物Ⅱ，其核苷酸序列為5′CTTATAGAAAAGAAATAAGGATCCCC 3′本發(fā)明相比已有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1．本發(fā)明將已構(gòu)建的葡激酶工程菌菌株，通過反復(fù)冷凍-解凍-冷凍，可瞬時(shí)性改變細(xì)胞膜壁的通透性，使可溶性的葡激酶(分子量15,000)逸出在凍融液中，凍融液提供合適的離子強(qiáng)度和pH等條件，讓葡激酶保持了較高的活性，而此時(shí)大部分細(xì)胞的細(xì)胞壁并未破碎，因此Ecdi細(xì)胞內(nèi)的絕大部分菌體蛋白和細(xì)胞器等仍留在胞體內(nèi)，不需要通過昂貴的高速離心機(jī)即可離心除去，獲取含高活性的，占可溶性蛋白20％以上的葡激酶的澄清液中，大大降低設(shè)備成本和下游純化壓力。
2．本方法采用陽離子交換層析和疏水層析，兩步即得純度達(dá)99％以上的高活性葡激酶，在pH值不變的前提下，采用改變鹽濃度的梯度洗脫和階段洗脫相結(jié)合的方式，可以獲取活性損失很小，低熱源及蛋白純度很高的葡激酶。
3．本發(fā)明的生產(chǎn)方法，大大降低生產(chǎn)過程中葡激酶表達(dá)量損失，延長分離介質(zhì)使用壽命，設(shè)備成本低，能保持細(xì)胞完整，排除壓榨法局部高溫對葡激酶活性的損害，生產(chǎn)過程簡單、方便、穩(wěn)定。


圖1本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程2為離子交換層析峰形3為SDS-PAGE(電泳)照片復(fù)印4疏水層析峰形5 SDS-PAGE(電泳)照片復(fù)印圖本發(fā)明下面將結(jié)合附圖作進(jìn)一步詳述如圖1所示葡激酶高表達(dá)工程菌株EcoliH15 375g置于-70℃冰凍→解凍→冰凍，循環(huán)重復(fù)三次，加入凍融液為磷酸鹽緩沖液PBS(10mMPB,10mM NaCl,2mMEDTA,2mMEGTA,pH8.0)，用離心機(jī)以4000rpm離心取上清液，將沉淀物置于-70℃再冷凍一次，重復(fù)上述過程，將兩次上清液合并得7000ml，F(xiàn)olin酚法測得3.01mg/ml，總蛋白21000mg，平板溶纖法測得比活性為3.1×104Au/ml，總活性為6.3×108Au/ml。
離子交換層析層析柱型號100×35上海錦華廠層析介質(zhì) SP Sepharose FF pharmacia Co.
柱床體積 1440ml以25ml/分的流速，床柱用10mMPB pH6.0緩沖液進(jìn)行平衡，然后將樣品用HCl調(diào)至pH5.8上樣，上樣流速為50ml/分，上樣總體積為7000ml，總蛋白21g，將上樣后的柱用平衡液洗滌，280nm波長處測定約至基線。
洗脫1用10mMPB pH6.0 0.5050ml/分洗脫洗脫2用10mMPB,0.25M NaCl梯度洗脫，洗脫后收集活性峰，如圖1所示，其體積總蛋白、總活性見總結(jié)表1和表2。
如圖2所示為SDS-PAGE分析1為上樣液(凍融樣品)2為穿流峰3-7為活性峰隨機(jī)取樣分析疏水層析材料層析柱型號55×35上海錦華廠層析介質(zhì) Phenyl Sepharose FF pharmacia Co.
柱床體積 430ml以15ml/分的流速，對10MmPB、1M NaCl pH6.2的床柱體積，進(jìn)行平衡，然后在離子交換洗脫活性峰加入去熱原NaCl，使其成為1M，保持pH值不變，過0.45μ膜去雜質(zhì)。
上樣流速為15ml/分，上樣總體積為3250ml，總蛋白6.1g，上樣后用平衡液將A280洗至基線。
洗脫1用0.5M NaCl、10mMPB、pH6.2,15ml/分速度洗脫洗脫2用10mMPB,pH6.2洗脫，洗脫后收集活性峰，如圖3所示，圖中Lane 1.marker 2.9603 3.9603 4.9603 5.Marker其體積總蛋白、總活性見總結(jié)表1和表2。
如圖4所示，SDS-PAGE分析SDSPAGE分析標(biāo)準(zhǔn)蛋白為31KD,20.4/19.7KD,16.9KD,14.4KD,8.1KD,6.2KD和2.5KD,左右兩邊為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，中間三個(gè)樣品為洗脫活性峰混合后的取樣。
表1出發(fā)菌株375g，經(jīng)凍融、離子交換、疏水層析，其蛋白活性、比活性比較

表2出發(fā)菌株375g，用勻漿法(壓榨法)破菌與凍融法提取，其蛋白活性比較

本發(fā)明與各研究單位的葡激酶核苷酸序列及其對應(yīng)氨基酸異同的比較氨基酸次序 11 34 35 36 43 92 116資料來源上海植生所 AAA AGT AAA GGA CAT TAT TTA本發(fā)明Lys Ser Lys Gly His Tyr Leu成都地奧AAA GGT AAA GGA GAT TTT TTA專利申請?zhí)?5111222Lys Gly Lys Gly His Phe Leu上海醫(yī)大AAA GGT AAA AGA CGT TAT ATA專利申請?zhí)?4112105Lys Gly Lys Arg Arg Tyr Leu青島雙龍AAA GGT AAG GGA CGT TAT TTA專利申請?zhí)?7105988Lys Gly Lys Gly Arg Tyr Leu醫(yī)科院 AAA GGT AAA GGA CGT TAT ATA專利申請?zhí)?8102132流研所 Lys Gly Lys Gly Arg Tyr Leu醫(yī)科院 AAA GGT AAA GGA CGT TAT TTA專利申請?zhí)?8102132基礎(chǔ)所 Lys Gly Lys Gly Arg Tyr Leu日本AAG GGT AAA GGA CAT TAT TTA Nucleic Acid Research 11Lys Gly Lys Gly Ilis Tyr Leu (22)P.679(83)德國AAG GGT AAA AGA CGT TAT TTA M.G.G.210,528(87)Lys Gly Lys Arg Arg Tyr Leu比利時(shí) AAG AGT AAA GGA CAT TAT TTA Fibrinolysis 6,226(92)Lys Ser Lys Gly His Tyr Leu
權(quán)利要求
1．一種重組葡激酶的生產(chǎn)方法，包括利用已構(gòu)建好的葡激酶工程菌株，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，達(dá)到一定OD值，離心收集菌體，將菌體處理后，離心收集上清液，再用兩步純化得到產(chǎn)品，其特征在于葡激酶純化和除熱原雜質(zhì)，采用(1)將葡激酶基因的高表達(dá)工程菌菌體經(jīng)冰凍-解凍-冰凍反復(fù)循環(huán)至少兩次；(2)在經(jīng)過循環(huán)后的菌體中加入凍融液；(3)將凍融液離心提取上清液；(4)上清液經(jīng)兩步柱層析純化；(5)上樣經(jīng)洗脫、收集、超濾脫鹽、濃縮、除菌過濾得到葡激酶原液；加入保護(hù)劑，凍干后得到重組葡激酶產(chǎn)品。
2．如權(quán)利要求1所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于菌體冰凍-解凍-冰凍反復(fù)循環(huán)2-10次。
3．如權(quán)利要求1所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于冰凍溫度為-100℃～-15℃。
4．如權(quán)利要求1所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于凍融液為磷酸鹽緩沖液(PBS)。
5．如權(quán)利要求1或4所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于凍融液離心提取上清液時(shí)，高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為4000-5000rpm。
6．如權(quán)利要求1所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于上清液在兩步純化過程中采用SP.sepharose FF和Phenyl Sepharose FF柱層析。
7．如權(quán)利要求1所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于重組葡激酶具有高表達(dá)的工程菌株EcoliH15(中國微生物保藏中心保藏號CGMCC0432)。
8．如權(quán)利要求1或7所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于重組葡激酶具有如下核苷酸全序列及其編碼的氨基酸序列TCA AGT TCA TTC GAC AAA GGA AAA TAT AAA AAA GGC GAT GAC GCG AGTSer Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala SerTAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTA AAT GTG ACT GGA GTT GATTyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val AspAGT AAA GGA AAT GAA TTG CTA TCC CCT CAT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTSer Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAA TAC TAT GTC GAA TGG GCA TTA GATGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu AspGCG ACA GCA TAT AAA GAG TTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCAla Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAA GAA ACG AAG TCT TTC CCTGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe ProATA ACA GAA AAA GGT TTT GTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTIle Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn ProGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAG AAA TAAGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys End
9．如權(quán)利要求1或7或8所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于將葡激酶活性高的菌株中分離的噬菌體α的DNA為模板，采用引物Ⅰ和引物Ⅱ經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到含有完整葡激酶基因的DNA小片段，該基因DNA片段與pJLA502載體質(zhì)粒，分別以BamHⅠ和NcoⅠ酶切；再將酶切后的上述質(zhì)粒和葡激酶基因DNA小片段，用T4 DNA連接酶連接獲得含有葡激酶基因的pJLA502質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入HB101大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建成葡激酶高表達(dá)的工程菌株EcoliH15(中國微生物保藏中心保藏號CGMCC0432)。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的溶血栓藥物重組葡激酶，其特征在于所述的引物Ⅰ，其核苷酸序列為5′ATCCATGGCCATGCTCAAAAGAAGT3′；引物Ⅱ，其核苷酸序列為5′CTTATAGAAAAGAAATAAGGATCCCC 3′。
全文摘要
一種重組葡激酶的生產(chǎn)方法,屬于生物醫(yī)學(xué)基因工程技術(shù)領(lǐng)域,其特征是將已構(gòu)建好的葡激酶基因工程菌菌體經(jīng)冰凍—解凍—冰凍反復(fù)循環(huán)數(shù)次,加入凍融液,將凍融液離心提取上清液,經(jīng)兩步柱層析純化,上樣經(jīng)洗脫、收集、超濾脫鹽、濃縮,除菌過濾得到葡激酶原液、凍干后得到本發(fā)明產(chǎn)品。該方法大大降低生產(chǎn)過程中葡激酶表達(dá)量的損失,延長分離介質(zhì)使用壽命。設(shè)備成本低,能保持細(xì)胞完整,生產(chǎn)過程簡單、方便、穩(wěn)定。
文檔編號C12N15/57GK1307129SQ0011267
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月3日
發(fā)明者王家馴, 王世鵬, 佟彬 申請人:成都金鵬生物技術(shù)有限公司, 中國科學(xué)院上海植物生理研究所