国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      具有氨基甲酸酯核苷間連鍵的結構單元和由其衍生的新型寡核苷酸的制作方法

      文檔序號:3548634閱讀:429來源:國知局
      專利名稱:具有氨基甲酸酯核苷間連鍵的結構單元和由其衍生的新型寡核苷酸的制作方法
      技術領域
      本發(fā)明涉及合成寡核苷酸。更具體地說,本發(fā)明涉及具有經(jīng)修飾的核苷間連鍵(該連鍵阻止核酸降解)的合成寡核苷酸。
      近年來,在使用合成的寡核苷酸作為基因表達調(diào)節(jié)劑方面有許多研究。(參見,例如,Agrawal,Trends in Biotechnology 10152-158(1992))。至少部分研究方向是開發(fā)經(jīng)修飾的寡核苷酸,這種寡核苷酸比常規(guī)寡核苷酸磷酸二酯具有更強的阻止核酸降解的能力。這種寡核苷酸包括具有不同類型的經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的嵌合寡核苷酸。例如,Pederson等人在美國專利5,149,797中公開了具有活化RNA酶H區(qū)域和不活化RNA酶H區(qū)域的嵌合寡核苷酸。
      已經(jīng)被應用于寡聚核苷酸中的經(jīng)修飾的核苷間連鍵有基于磷酸酯的和非基于磷酸酯的連鍵。前者包括公知的硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,甲基膦酸酯和氨基磷酸酯連鍵等等。后者包括砜,硫酸酯和氨基甲酸酯連鍵。這種連鍵以影響寡核苷酸核酸降解、具有正常氫鍵和堿基堆積、可結合到互補目標核酸及可被細胞吸收的能力的方式進行修飾。
      某些類型的氨基甲酸酯核苷間連鍵在現(xiàn)有技術中是已知的。Gait等人在J.Chem.Soc.,Perkin I1684-1686(1974)中首先公開了含有結構為5′-核苷-3′-OCONH-5′-核苷-3′的氨基甲酸酯核苷間連鍵的二核苷酸。Mungall和Kaiser在J.Org.Chem.42703-706(1977)中公開了具有相同結構的氨基甲酸酯連鍵的經(jīng)修飾的二核苷酸和三核苷酸的合成。Coull等人在Tetrahedron Lett.28745-748(1987)中指出具有相同核苷間連鍵的六聚體寡核苷酸氨基甲酸酯不進行堿基堆積,即使其大小和形狀不產(chǎn)生立體障礙。Sti-rchak等人在Nucleic Acids Res.176129-6141(1989)中公開了具有相同核苷間連鍵的六聚體聚C嗎啉寡核苷酸氨基甲酸酯形成多鍵復合體,而不是與互補聚(dG)形成Watson-Crick雙螺旋。Wang和Wellet在Tetrahedron Lett.327385-7388(1991)中公開了具有相同核苷酸間連鏈的寡核苷酸或嗎啉寡核苷酸氨基甲酸酯的固相合成。
      值得注意的是,盡管由于寡核苷酸氨基甲酸酯的寬pH范圍的穩(wěn)定性和阻止酶降解能力使其可用作基因表達調(diào)節(jié)劑,但是沒有堿基堆積和由未知機理形成的多鏈復合物阻礙了這種物質(zhì)的實際應用。因此,需要新的具有類似阻止降解的連鍵,而沒有阻礙寡核苷酸進行堿基堆積的能力,并且至少在某些構型中沒有使該寡核苷酸和其互補目標核酸之間形成的雙螺旋不穩(wěn)定。
      本發(fā)明提供了適用于組裝含有新的氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的結構單元。根據(jù)本發(fā)明,在結構單元和寡核苷酸中的氨基甲酸酯具有結構5′-核苷-3′-NHCOO-5′-核苷-3′,它是已知氨基甲酸酯核苷間連鍵的逆結構。令人驚奇的是,含有這種新的氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸確實進行堿基堆積,而不象已知的氨基甲酸酯連接的寡核苷酸。另外,當這種新的氨基甲酸酯連鍵存在于寡核苷酸的某些優(yōu)選位置時,含有本發(fā)明的寡核苷酸的雙螺旋的穩(wěn)定性沒有被嚴重破壞。
      第一方面,本發(fā)明提供了二聚、三聚和四聚的結構單元,其中至少兩個核苷是由這種新的氨基甲酸酯連鍵5′-核苷-3′-NHCOO-5′-核苷-3′連接的。為便于寡核苷酸合成,這種結構單元優(yōu)選在其5′端或3′端具有合適的保護基或離去基團。這些結構單元用液相化學方法可容易制備,并且象目前保護的單體被用于固相寡核苷酸合成中一樣可被用于組裝寡核苷酸。本發(fā)明的結構單元可被用于組裝在寡核苷酸的不同位置上具有新的氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸。
      第二方面,本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的結構單元組裝含有新的氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法。在這一方面,本發(fā)明的結構單元可被用于常規(guī)寡核苷酸合成化學方法。
      第三方面,本發(fā)明提供了在寡核苷酸的一個或多個位置上含有氨基甲酸酯核苷間連鍵5′-核苷-3′-NHCOO-5′-核苷-3′的新寡核苷酸。這種寡核苷酸可很容易地用常規(guī)固相化學方法組裝,只是在一個或多個組裝循環(huán)中使用本發(fā)明的二聚、三聚或四聚結構單元。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案,這些寡核苷酸對于研究氨基甲酸酯核苷間連鍵在使雙螺旋不穩(wěn)定方面的位置依賴效應是有用的。在本發(fā)明寡核苷酸的一些優(yōu)選實例中,新氨基甲酸酯連鍵是在那些不造成寡核苷酸和互補目標核酸之間形成的雙螺旋十分不穩(wěn)定的位置上。更優(yōu)選是,這種新的氨基甲酸酯是在使寡核苷酸增加抵抗核酸降解的位置上。根據(jù)這些實例的寡核苷酸對調(diào)整基因表達是有用的,不論是在體外實驗系統(tǒng)中,還是在對植物、動物或人類疾病的治療中。


      圖1為本發(fā)明的二聚結構單元的一般結構。三聚和四聚結構單元具有類似的結構。
      圖2說明了合成本發(fā)明的二核苷氨基甲酸酯結構單元的一般流程。
      圖3說明二核苷氨基甲酸酯結構單元轉(zhuǎn)化為其亞磷酰胺衍生物。
      圖4為二核苷,三核苷和四核苷氨基甲酸酯中間體和結構單元的實例。其中每個化合物下面的數(shù)字對應于實施例1中給予每個化合物的數(shù)字。
      本發(fā)明涉及具有經(jīng)修飾的核苷間連鍵(該連鍵阻止核酸降解)的合成寡核苷酸。本發(fā)明提供含有新的氨基甲酸酯核苷間連鍵的結構單元和用這種結構單元組裝寡核苷酸的方法,及含有新的氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸。
      第一方面,本發(fā)明提供了組裝含有新的氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸的結構單元。本發(fā)明的結構單元具有兩個、三個或四個由具有結構5′-核苷-3′-NHCOO-5′-核苷-3′的新氨基甲酸酯核苷間連鍵連接的核苷,它是已知氨基甲酸酯核苷間連鍵的逆結構。本發(fā)明的二聚結構單元實例的通式結構示于圖1。為了減少例舉的化合物數(shù)量,在下列實施例中只構建了含有5′胸苷的結構單元。然而,5′或3′核苷的堿基可以是任何嘌呤或嘧啶,或它們的能在Wat-son-Crick雙螺旋或Hoogsteen三螺旋中實現(xiàn)堿基配對的任何類似物。該核苷可以是核糖核苷或脫氧核糖核苷。如圖1所示,R1或R2優(yōu)選為羥基,酸不穩(wěn)定保護基如二甲氧基三苯甲基,堿不穩(wěn)定保護基如乙酰丙基或離去基團如磷酸三酯,H-膦酸酯(H-phosphonate)或亞磷酰胺基團,最優(yōu)選的是β-氰基乙基亞磷酰胺基團。具體結構單元中的R1和R2的最優(yōu)選組合選自表I所示。
      表I結構單元的優(yōu)選結構如果R1是 則優(yōu)選R2是DMT 羥基,乙酰丙基,亞磷酰胺H-膦酸酯或磷酸三酯羥基羥基或DMT乙酰丙基或亞磷酰胺 DMT酯化成CPG 亞磷酰胺,H-膦酸酯或磷酸三酯本發(fā)明的三聚和四聚結構單元具有與上述二聚結構單元基本相同的結構。
      本發(fā)明結構單元的合成一般是通過單、二或三聚核苷5′-O-對-硝基苯基碳酸酯中間體與3′-氨基-3′-脫氧胸苷(或3′-氨基-3′-脫氧尿苷)反應而得到的,該反應是發(fā)生在3′-氨基的位置特異性反應。這樣得到的結構單元然后在5′-位用二甲氧基三苯甲基(DMT)保護,接著在氨中進行3′-乙?;?,得到3′-羥基。然后用標準方法將該結構單元轉(zhuǎn)化成相應的3′-亞磷酰胺。
      在這里所說的合成方法中,被用于有機合成的有機化學品、HPLC-級和無水溶劑得自Aldrich和Fisher Scientific Co.,并以接收時的狀態(tài)使用。將購自R.I.Chemical Inc.的1克3H-1,2-苯并二硫雜環(huán)戊二烯-3-酮-1,1-二氧化物溶于100ml乙腈溶液中使用。TLC是在Merck′s DC alufolien上用Kieselgehl 60F-254完成的,柱層折是在硅膠(硅膠60,230-400目ASTM,Merck)上進行的。下文實施例1中有這些合成方法更詳細的說明。
      第二方面,本發(fā)明提供了用本發(fā)明結構單元組裝含有一或多個新的氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸。在使用這種方法的一個實例中,結構單元被直接共價連接到一個合適的固相載體基質(zhì)上。在一個優(yōu)選實施方案中,該載體是長鏈烷基酰氨基丙酸可控多孔玻璃(CPG),并且該羧基部分被直接用該結構單元3′羥基酯化。在這個實施方案中,一至三個新氨基甲酸酯連鍵被引入到合成的寡核苷酸的最3′核間位置上。依據(jù)要合成的寡核苷酸的性質(zhì),另外的新氨基甲酸酯核苷間連鍵可以通過使用本發(fā)明結構單元以1至3個為一組的形式引入到寡核苷酸中的其它位置上。此外,磷酸二酯,硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,烷基膦酸酯,烷基硫代膦酸酯,氨基磷酸酯或其它任何公知的核苷間連鍵都可以采用已知固相化學方法引入到分子的任何其它位置上。在其它實施方案中,本發(fā)明結構單元可被用于將新氨基甲酸酯連鍵引入到寡核苷酸中的不同位置上,而不是在最3′核苷間位置上引入這種連鍵。這是通過不將結構單元直接連接到固體載體上,而是連接到增長中的新生寡核苷酸鏈上完成的。該鏈是用其它類型的結構單元起始的,如核苷亞磷酰胺單體。
      總之,用本發(fā)明結構單元組裝含有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸的方法是用公知的、常規(guī)的合成化學(除了使用二、三或四聚結構單元外)方法。本文例舉的亞磷酰胺方法是最優(yōu)選的。然而,其它已知方法也可以使用,如美國專利5,149,798中公開的H-膦酸酯方法,其內(nèi)容在此引入作參考。甚至古老的磷酸三酯方法也可用于本發(fā)明結構單元。在這些情況下,使用同樣公知的化學(方法)(該化學方法目前被用來衍生核苷單體以形成相應的核苷H-膦酸酯或磷酸三酯),本發(fā)明結構單元被衍生形成相應的二、三或四核苷酸H-膦酸酯或磷酸三酯。然后,在已知的H-膦酸酯或磷酸三酯方法中該結構單元被用于組裝寡核苷酸。
      第三方面,本發(fā)明提供了含有新氨基甲酸酯核苷間連鍵(在寡核苷酸內(nèi)的一或多個核苷間位置上)的合成寡核苷酸。這些寡核苷酸的長度優(yōu)選從約8到約100核苷酸。這些核苷酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸。對于任何給定寡核苷酸,可存在的新氨基甲酸酯核苷間連鍵的最大數(shù)目可容易地用方程n=3x算出,其中n是存在于該寡核苷酸中的新氨基甲酸酯連鍵數(shù),x是用于組裝該寡核苷酸的結構單元數(shù)。因此,對于100聚體,若使用25個本發(fā)明四聚結構單元進行組裝,則新氨基甲酸酯核苷間連鍵的最大數(shù)目為75。
      在優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明寡核苷酸只在它們的最3′核苷間位置上有新氨基甲酸酯連鍵。最優(yōu)選地,這些寡核苷酸將只在它們最3′端的第一、第二和/或第三核苷間位置上含有新的氨基甲酸酯連鍵。此實施方案中的寡核苷酸比常規(guī)寡核苷酸更能阻止核酸降解,且能夠參與氫鍵、堿基堆積和雙螺旋形成。因此,當該實施方案的寡核苷酸具有在生理條件下可與來自病毒、原核或真核病原體、或細胞基因或基因表達控制區(qū)域的核酸雜交的核苷酸序列時,該寡核苷酸可用作反義或反基因劑。在最優(yōu)選實施方案中,這樣的寡核苷酸含有另外的經(jīng)修飾的核苷間連鍵,進一步增加該寡核苷酸的核酸酶抗性而不干擾其參與雙螺旋形成的能力。這樣的核苷間連鍵可選自任何已知的經(jīng)修飾的連鍵,優(yōu)選選自硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,烷基膦酸酯,烷基硫代膦酸酯,或氨基磷酸酯連鍵或它們的任一組合。最優(yōu)選的是硫代磷酸酯核苷間連鍵。
      下列實施例將進一步說明本發(fā)明某些優(yōu)選實施方案,但不以任何方式限制本發(fā)明。
      實施例1僅含有作為核苷間連鍵的新氨基甲酸酯連鍵5′-核苷-3′-NHCOO-5′-核苷-3′的二聚、三聚或四聚結構單元的合成。
      3′-氨基-3′-脫氧胸苷的合成是根據(jù)標準氫化方法,用3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷和用Pd/C-10%Pd作催化劑,甲醇作溶劑來完成的。根據(jù)已知方法(參見,例如,Stirchak and Summerton,J.Org.Chem.,524202(1987);Mungell and Kaiser,J.Org.Chem.,42703(1977)),通過3′-O-乙?;?脫氧胸苷與碳酸雙(對-硝基苯基)酯反應來制備3′-O-乙酰基-脫氧胸苷5′-碳酸對-硝基苯酯。
      首先,合成3′-氨基-3′-脫氧胸苷基(deoxythymidylyl)-(3′-5′-氨基甲酰基)-3′-O-乙?;?脫氧胸苷[1]。這一合成的一般流程示于圖2。在室溫下將3′-O-乙?;?脫氧胸苷5′-碳酸對-硝基苯酯(324.68mg,0.72mmol)和3′-氨基-3′-脫氧胸苷(122.87mg,0.50mmol)溶解于5ml無水吡啶。將反應混合物在氮氣中攪拌過夜。減壓除去溶劑,并用快速柱色譜法在硅膠上將殘余物分離,用二氯甲烷∶甲醇23∶2作洗脫劑。得到的產(chǎn)物為白色固體,276.6mg(99%)。IR(KBr)3500-2800;1700;1550;1500;1300;1100;800cm-1.1H-NMR(DMSO;δ(ppm))1.70(s,6H;2xCH3);2.10(s,3H;CH3);2.10-2.40(m,4H;H-2′+H-2″);3.40-370(m,2H;H-4′+H-4″);3.80(bs,1H;OH);4.00-4.30(m,4H;H-5′+H-5″);5.10-5.30(m,2H;H-3′+H-3″);6.10-6.30(m,2H;H-1′+H-1″);7.50和7.80(2s,2H;2xH-6);7.90(bs,H;NH);11.30和11.40(2s,2H;2xNH)。
      下一步是合成5′-O-二甲氧基三苯甲基-3′-氨基-3′-脫氧胸苷基-(3′-5′-氨基甲?;?-3′-O-乙?;?脫氧胸苷[3]。在室溫下將3′-氨基-3′-脫氧胸苷基-(3′-5′-氨基甲?;?-3′-O-乙?;?脫氧胸苷([1],203.5mg,0.366mmol)和4,4′-二甲氧基三苯甲基氯(186.02mg,0.55mmol)溶解于5ml無水吡啶。將反應混合物在氮氣中攪拌過夜。然后,將所得懸浮液倒入冰水中并用二氯甲烷(3×50ml)萃取。將合并的萃取液用水(3×50ml)洗滌,無水硫酸鈉干燥,過濾并真空蒸發(fā)至干。用快速柱色譜法在硅膠上將固體殘余物分離,用二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(23∶1∶1)的混合物作洗脫劑。得到的產(chǎn)物為白色固體,309mg(98%)。IR(KBr)3500-2800;1700;1600;1500;1300;1150;1000;950;850;790;750;550cm-1。1H-NMR(DMSO;δ(ppm));1.78和1.80(2s;6H;2xCH3);2.10(s,3H;CH3);2.30-2.50(m,4H;H-2′+H-2″);3.30-3.60(m,2H;H-4′+H-4″);3.75(s,6H;2xOCH3);3.90-4.10(m,2H;H-5′);4.30-4.50(m,2H;H-5″);5.40(m,H;H-3′);6.0(m,H;H-3″);6.30-6.40(m,2H;H-1′+H-1″); 6.80-6.90(m,苯基);7.20-7.30(m,苯基);7.40(bs,2H;H-6);7.60(bs;1H;NH);10.30(bs,2H;2xNH)。
      然后如下制備5′-保護的二聚結構單元5′-O-二甲氧基三苯甲基-3′-氨基-3′-脫基胸苷基-(3′-5′-氨基甲?;?脫氧胸苷[4]。將5′-O-二甲氧基三苯甲基-3′-氨基-3′-脫氧胸苷基-(3′-5′-氨基甲酰基)-3′-O-乙?;?脫氧胸苷[3](309mg)溶解于5ml濃縮氨水中,并在室溫下攪拌3小時。真空除去氨后,將殘余固體在硅膠上用快速柱色譜法分離,用二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(22∶2∶1)的混合物洗脫,得到290mg(98%)產(chǎn)物,為白色固體。IR(KBr)3500-2800,1750;1500;1450;1300;1200;1100-1000;900;700;600cm-1。1H-NMR(CDCl3;δ(ppm))1.35和1.80(2s,6H;2xCH3);2.0(s,2H;H-2′);2.40(bs,H;OH);2.70(s,2H;H-2″);3.25-3.50(m,2H;H-4′+H-4″);3.75(s,6H;OCH3);4.0-4.30(m,2H,H-5′);4.30-4.50(m,2H;H-5″);5.90-6.0(m,2H,H-3′+H-3″);6.20-6.40(m,2H;H-1′+H-1″);6.70-6.90(m,苯基);7.15-7.30(m,苯基);7.40(bs,2H;H-6);7.60(bs,H;NH)。
      然后,將二聚結構單元轉(zhuǎn)化成三聚結構單元或其3′-亞磷酰胺二聚體形式。對于三聚體合成,首先用碳酸(雙-對-硝基苯基)酯將該二聚體在5′位活化,見圖1,得到5′-碳酸酯,然后進一步與3′-氨基-3′-脫氧胸苷反應。然后,對這樣得到的三聚體在5′位保護,得到5′-O-DMT-保護的三聚體。接著在氨水中水解,產(chǎn)生游離3′-羥基。得到產(chǎn)物[5],為白色粉末(產(chǎn)率78%)。IR(KBr)3500-2800,1750;1500;1460;1250;1180;1150-1050;850;800cm-1。1H-NMR(DMSO;δ(ppm))1.50,1.70和1.80(3s,9H;3xCH3);1.75(bs,H;OH);2.10-2.50(m,6H;H-2′+H-2″+H-2);3.10-3.40(m,3H;H-4′+H-4″+H+4);3.75(s,6H;2xOCH3)3.90-4.40(m,6H;H-5′+H-5″+H-5);6.10-6.30(m,3H;H-3′+H-3″+H-3);6.80-6.90(m,苯基);7.20-7.40(m,苯基,和3H;H-1′+H-1″+H-1);7.40-7.60(m,3H;H-6);7.80-8.0(m,2H;2xNH),11.40(m,3H;3xNH)。
      重復進行這些步驟實現(xiàn)三聚體到四聚體的轉(zhuǎn)化,得到產(chǎn)物[6]為白色粉末(產(chǎn)率83.8%)。IR(KBr)3600-2800,1750;1500;1490;1350;1200;1100-1000;800;750cm-1。1H-NMR(DMSO;δ(ppm))1.50,1.70,1.80和1.90(4s,12H;4xCH3);1.60(bs,H;OH);2.00-2.50(m,8H;H-2′+H-2″+H-2+H-2″″);3.0-3.40(m,4H;H-4′+H-4″+H-4+H-4″″);3.70(s,6H;2xOCH3);3.80-4.40(m,8H,H-5′+H-5″+H-5+H-5″″);6.10-6.30(m,4H;H-4′+H-4″+H-4+H-4″″);6.80-7.0(m,苯基);7.20-7.40(m,苯基;和4H;H-6);7.80-8.0(m,3H;3xNH);11.30-14.40(m,4H;4xNH)。
      二聚體通過下述化學方法被轉(zhuǎn)化成它們相應的β-氰基乙基亞磷酰胺。將5′-O-DMT保護的二聚體[4],三聚體[5]或四聚體[6]在70℃真空用P2O5干燥24小時并與無水苯和無水二氯甲烷(3×2ml二氯甲烷和5ml苯的混合物)一起蒸發(fā),然后溶解于無水二氯甲烷(2ml)。在溶液中加入三乙胺(1ml),接著加入(N,N-二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)氯膦(173.96mg,0.735mmol)。將反應物在氮氣下攪拌60分鐘,然后將反應混合物倒入冷碳酸氫鈉飽和水溶液,并將產(chǎn)物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。將合并的有機萃取液用鹽水(3×10ml)洗滌,用無水硫酸鈉干燥,過濾,然后真空蒸發(fā)至干。將殘余固體溶于二氯甲烷(2ml),并在-78℃用含N,N-二異丙基乙胺(2ml)的己烷(600ml)沉淀。濾除白色沉淀,收集,并用P2O5真空干燥。對于二聚結構單元,得到182mg,(73%),白色固體,可直接用于寡核苷酸的合成。31P-NMR(CDCl3;δ(ppm));144.65和144.20??捎猛瑯臃椒óa(chǎn)生三聚體和四聚體亞磷酰胺。由于位阻現(xiàn)象,預期在它們的自動DNA合成時,產(chǎn)率和配對效率將降低。
      對于上述各產(chǎn)物的分析,是用Varian Unity 300譜儀測量1H-和31P-NMR譜,用TMS作為內(nèi)標,85%H3PO4作為外標。將樣品做成KBr片在Nicolet 800譜儀上記錄IR譜。
      實施例2合成在不同位置上含有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸。
      為了合成在最3′端具有1,2或3個新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸,5′-保護的二聚體[4],三聚體[5]或四聚體[6]結構單元被連接到長鏈烷基酰氨基丙酸可控多孔玻璃(CPG)珠上,因為羧基部分可以直接用二聚體[4],三聚體[5]或四聚體[6]的3′-羥基,在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽存在下,用標準方法(參見,例如,Damha et al.,Nucleic Acids Res.,183813(1990))酯化。對于二聚[4],三聚[5]和四聚[6]結構單元,初次裝載量分別是37.4,27.5和2.2μmol/g CPG。對于三聚和四聚結構單元,為了改進裝載值,它們首先被在3′-OH位琥珀酸酯化,然后用標準方法(見,例如,Caruthers et al.,Methods In Enzymol-ogy,154287(1987);Damha et al.,Nucleic Acids Res.,183813(1990))通過酰胺鍵連接到長鍵烷基氨基可控多孔玻璃載體上。這一操作分別將三聚[5]和四聚[6]結構單元的裝載值修改為25.0和14.6μmol/g CPG。
      把約10mg CPG連接的二甲氧基三苯甲基二,三或四核苷氨基甲酸酯放入10ml燒瓶,用0.2ml HClO4∶乙醇(3∶2)處理1分鐘以釋放二甲氧基三苯甲基。然后加入9.8ml乙腈,測量498nm光吸收以根據(jù)下列方程確定裝載效率 對于分別僅在最3′端具有一、二或三核苷間連鍵的寡核苷酸,分別將與CPG連接的二聚體、三聚體或四聚體用于起始寡核苷酸的合成。合成是根據(jù)標準方法進行的,使用單體核苷氰基乙基亞磷酰胺,只是在某些循環(huán)中單體被本發(fā)明的二核苷氨基甲酸酯氰基乙基亞磷酰胺所代替。采用這種方法,在不同位置含有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸就被組裝起來,如下面表II所示。
      表II 在不同位置含有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸SEQ.ID.NO.15’-CTCGCACCCATCTCTCTCCT*T-3’; POSEQ.ID.NO.25’-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCT*T*T-3’; POSEQ.ID.NO.35’-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCT*T*T*T-3’; POSEQ.ID.NO.45’-CTCGCACCCATCTCTCTCCT*TT*TT*T-3’; POSEQ.ID.NO.55’-T*TCTCGCACCCT*TT*TATCTCTCTCCT*T-3’; POSEQ.ID.NO.65’-T*TGT*TCT*TCT*TGT*TGT*TCT*TCT*T*T*T-3;POSEQ.ID.NO.75’-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCT*T*T*T*-3’;PSPO=磷酸二酯PS=硫代磷酸酯*=5′-核苷-3′-NH-CO-O-5′-核苷-3′將寡核苷酸與CPG分裂開,并在室溫下用濃氫氧化銨去保護1小時,然后在55℃去保護5小時。將所得5′-O-DMT-保護的寡核苷酸在制備性C-18反相柱上通過用線性梯度溶劑A(0.1M乙酸銨水溶液)和溶劑B(20%0.1M乙酸銨+80%乙腈)洗脫來純化。將該寡核苷酸在室溫下在80%乙酸水溶液中脫三苯甲基30分鐘,然后再重復上述C-18色譜步驟進行純化。
      實施例3評價在不同位置具有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸的核酸酶抗性測定表II所示各寡核苷酸阻止核酸外切酶消化的能力。將0.2O.D.單位的寡核苷酸溶解于含5μl/ml蛇毒磷酸二酯酶I(得自Crotu-lus atrox的VIII S型,Sigma,St.Louis,Missouri的0.5ml 10mM Tris(pH 8.5),10mM MgCl2中,并在37℃溫育。通過監(jiān)測在260nm處的紫外線吸收來測定消化。對各寡核苷酸的消化結果示于下表III。
      表III對寡核苷酸的核酸外切酶消化寡核苷酸 t1/2(分鐘)全部為PO的27聚體 1.25SEQ.ID.NO.1 3.70SEQ.ID.NO.2 5.85SEQ.ID.NO.3 5.80SEQ.ID.NO.4 2.15SEQ.ID.NO.5 4.05SEQ.ID.NO.6 3.33SEQ.ID.NO.7 >30這些結果表明,含有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸比只含磷酸二酯核苷間連鍵的寡核苷酸更能阻止核酸外切消化。如果這些連鍵是相連的而沒有被磷酸二酯連鍵分散開,則穩(wěn)定性隨3′氨基甲酸酯連鍵數(shù)目的增加而增加。具有3′氨基甲酸酯連鍵而其余的為硫化磷酸酯連鍵的寡核苷酸特別穩(wěn)定,30分鐘消化后仍無法觀察出降解。
      實施例4在不同位點具有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸的結合性質(zhì)對表II所示各寡核苷酸進行試驗以測定其對互補寡核苷酸磷酸二酯的結合性質(zhì)。對于每個寡核苷酸,將0.2 O.D.單位的寡核苷酸和0.2 O.D.單位其互補體溶解于溫度范圍為25-80℃的封閉容器(Lambda 2TM光譜儀,Perkin Elmer,Uberlingen,Germany)內(nèi)的1ml 10mM Na2HPO4(pH7.4)和100mM NaCl中。將溫度在上述范圍內(nèi)以1℃/分鐘升高,測量A260的增加。對各寡核苷酸的測量結果示于下表IV。
      表IV寡核苷酸的結合性能寡核苷酸 Tm(氨基甲酸酯℃) Tm(℃,全部為PO的類似物)SEQ.ID.NO.1 63.3 63.8SEQ.ID.NO.2 67.5 67.7SEQ.ID.NO.3 67.4 67.7SEQ.ID.NO.4 65.3 66.5SEQ.ID.NO.5 58.6 65.5SEQ.ID.NO.6 16.9 56.2SEQ.ID.NO.7 59.8 60.12SEQ.ID.NO.81---- 67.9SEQ.ID.NO.3365.0 65.0SEQ.ID.NO.83---- 62.9SEQ.ID.NO.3461.9 61.9SEQ.ID.NO.84---- 59.91、5′-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCCCCC-3′,全部為PO;除了最后4個核苷酸被變成C以外,序列與SEQ.ID.NO.3是相同的,在其雙鏈對應體中具有4個不配對堿基。
      2、全部為硫代磷酸酯的類似物。
      3、在5mM Na2HPO4(pH7.4)和50mM NaCl中進行的第二次實驗。
      4、在2.5mM Na2HPO4(pH7.4)和25mM NaCl中進行的第三次實驗。
      這些結果至少支持兩個結論。第一,在一個寡核苷酸的最3′端上引入一個、兩個或三個新氨基甲酸酯連鍵對其與互補核酸結合的能力幾乎或根本沒有影響。相反,在較內(nèi)部位置引入三個新氨基甲酸酯將產(chǎn)生適度抑制作用,而將更多的新氨基甲酸酯連鍵引入寡核苷酸中會引起結合能力顯著降低。因此,在最3′端含有三個或更少的新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸可能是反義藥劑的最佳候選者。
      第二,當三個或較少新氨基甲酸酯連鍵存在于寡核苷酸3′端附近時,這些連鍵對涉及相鄰核苷的堿基堆積沒有顯著影響。這一點可通過比較含3′不匹配(并因此缺乏進行末端堿基堆積的能力)寡核苷酸雙螺旋和含3′末端新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸雙螺旋的穩(wěn)定性可以說明。在高離子強度下,雙螺旋結構被穩(wěn)定,兩者的Tm相似,分別為67.9℃和67.4℃。然而,當離子強度降低時,這時有利于雙螺旋分解,后一種寡核苷酸變得較穩(wěn)定(Tm在50mM鹽時分別為62.9℃和65.0℃,在25mM鹽時分別為59.9℃和61.9℃)。這些結果表明,在含新氨基甲酸酯的寡核苷酸中發(fā)生了末端堿基配對和堿基堆積。因而相對于具有末端錯配的雙螺旋來說,這樣穩(wěn)定化了它與寡核苷酸磷酸二酯形成的雙螺旋。
      序列表(1)一般資料(i)申請人Hybridon,Inc.
      (ii)發(fā)明名稱具有氨基甲酸酯核苷間連鍵的結構單元和由其衍生的新型寡核苷酸(iii)序列數(shù)7(iv)聯(lián)系地址(A)收件人Allegretti &amp; Witcoff,Ltd.
      (B)街名10 S.Wacker Drive,Suite 3000(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)國家美國(F)區(qū)碼60603(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0,Version#1.25(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(viii)律師/事務所(A)姓名Michael S.Greenfield
      (B)注冊號37,142(C)參考/案號93,508-A(ix)通訊號碼(A)電話617/345-9100(B)傳真617/345-9111(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCGCACCCA TCTCTCTCCT T 21(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定否
      (iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO2CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTT 24(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO3CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTTT 25(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO4
      CTCGCACCCA TCTCTCTCCT TTTTT 25(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO5TTCTCGCACC CTTTTATCTC TCTCCTT27(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO6TTGTTCTTCT TGTTGTTCTT CTTTT 25(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假定否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO7CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTTT 2權利要求
      1.一種用于寡核苷酸合成的結構單元,含有具有結構5′-核苷-3′-NHCOO-5′-核苷-3′的二核苷氨基甲酸酯。
      2.用于寡核苷酸合成的結構單元,含有具有一個或多個氨基甲酸酯連鍵的三核苷,該連鍵具有權利要求1的二核苷氨基甲酸酯的氨基甲酸酯連鍵的結構和取向。
      3.一種用于寡核苷酸合成的結構單元,含有具有一個或多個氨基甲酸酯連鍵的四核苷,該連鍵具有權利要求1的二核苷氨基甲酸酯的氨基甲酸酯連鍵的結構。
      4.用權利要求1的結構單元組裝含新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法,該方法包括將該結構單元共價連接到適于寡核苷酸合成的固體載體上,然后將附加的核苷酸共價連接到該結構單元上的步驟。
      5.用權利要求2的結構單元組裝含新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法,該方法包括將該結構單元共價連接到適于寡核苷酸合成的固體載體上,然后將附加的核苷酸共價連接到該結構單元上的步驟。
      6.用權利要求3的結構單元組裝含新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法,該方法包括將該結構單元共價連接到適于寡核苷酸合成的固體載體上,然后將附加的核苷酸共價連接到該結構單元上的步驟。
      7.用權利要求1的結構單元組裝含新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法,該方法包括將該結構單元共價連接到正進行化學合成的新生寡核苷酸鏈上的步驟。
      8.用權利要求2的結構單元組裝含新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法,該方法包括將該結構單元共價連接到正進行化學合成的新生寡核苷酸鏈上的步驟。
      9.用權利要求3的結構單元組裝含新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法,該方法包括將該結構單元共價連接到正進行化學合成的新生寡核苷酸鏈上的步驟。
      10.一種含有一個或多個氨基甲酸酯核苷間連鍵的寡核苷酸,該連鍵具有權利要求1的二核苷氨基甲酸酯的氨基甲酸酯連鍵的結構。
      11.根據(jù)權利要求10的寡核苷酸,其中該氨基甲酸酯核苷間連鍵位于該寡核苷酸中的三個最3′端核苷間位置中的一個或多個上。
      12.根據(jù)權利要求11的寡核苷酸,其中一個或多個非氨基甲酸酯核苷間連鍵是硫代磷酸酯連鍵。
      13.根據(jù)權利要求11的寡核苷酸,其中一個或多個非氨基甲酸酯核苷間連鍵是磷酸二酯連鍵。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了含有新氨基甲酸酯核苷間連鍵的合成子,用這種合成子制造含這種新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸的方法,以及含這種新氨基甲酸酯連鍵的寡核苷酸。
      文檔編號C07H21/00GK1131951SQ94193565
      公開日1996年9月25日 申請日期1994年7月27日 優(yōu)先權日1993年7月28日
      發(fā)明者伊凡·哈布斯, 薩德海爾·阿格拉沃爾 申請人:海布里頓公司
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1