一種法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性測(cè)定方法
【專(zhuān)利摘要】目前對(duì)于在紫外-可見(jiàn)沒(méi)有吸收的酶的底物，只能通過(guò)放射性同位素或者熒光基團(tuán)標(biāo)記方法等測(cè)定酶的活性。這些檢測(cè)方法成本高，對(duì)環(huán)境不友好，且不易操作。本發(fā)明的法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性測(cè)定方法特征是采用比色法檢測(cè)其中產(chǎn)生的產(chǎn)物焦磷酸或者磷酸，再用特定試劑與其反應(yīng)，還原后形成有顏色的化合物，該方法具有高效，敏感，經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。該方法具有廣譜性，除法呢基焦磷酸合成酶外，還可檢測(cè)牻牛兒牻牛兒焦磷酸合酶(GGPPS)，角鯊烯合成酶(SS)，法尼基轉(zhuǎn)移酶(FTase)，牻牛兒牻牛兒轉(zhuǎn)移酶(GGTase)，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MDD)等酶的活性，并且可高通量地用于這些酶抑制劑的篩選和藥物的開(kāi)發(fā)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性測(cè)定方法，屬于酶學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 磷酸或焦磷酸在生物體代謝中有著重要地位，生物體中的很多酶在催化反應(yīng)中利 用或產(chǎn)生磷酸或焦磷酸。例如，法呢基焦磷酸合成酶，櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合酶（GGPPS)，角 鯊烯合成酶（SS)，法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase)，櫳牛兒櫳牛兒轉(zhuǎn)移酶（GGTase)，甲羥戊酸焦磷酸 脫羧酶（MDD)等。這些酶是甲輕戊酸途徑（Mevalonate pathway)中重要的酶。甲輕戊酸 途徑（Mevalonate pathway)是以乙酰輔酶A為原料合成異戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦 磷酸的一條代謝途徑，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。該途徑的產(chǎn)物可以看作是 活化的異戊二烯單位，是類(lèi)固醇、類(lèi)萜等生物分子的合成前體。
[0003] 目前發(fā)現(xiàn)甲羥戊酸途徑與很多疾病有關(guān)，如心血管疾病、老年癡呆癥、骨質(zhì)疏松 癥，癌癥等都直接或間接的與甲羥戊酸有聯(lián)系。所以調(diào)節(jié)甲羥戊酸途徑對(duì)治療這些疾病有 重要作用。而抑制這個(gè)途徑中的酶的活性是最直接有效的方法。對(duì)這些酶抑制的藥物開(kāi)發(fā) 得到了廣泛而深入的研究，但這些酶活力的檢測(cè)方法目前主要有發(fā)射性同位素和熒光分光 光度方法。前者需要價(jià)格昂貴的放射性底物才可檢測(cè)，并且不可連續(xù)操作，步驟復(fù)雜，對(duì)環(huán) 境危害也較大。后者熒光光度方法，需要對(duì)底物進(jìn)行不要而精確的熒光集團(tuán)的修飾而有可 能進(jìn)行檢測(cè)，而且對(duì)檢測(cè)體系要求較高，干擾因素較多，準(zhǔn)確度不高，有些體系不適合水溶 液操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是利用酶比色法技術(shù)檢測(cè)這些酶其一產(chǎn)物磷酸或者焦 磷酸的濃度，從而檢測(cè)這些酶的活性。這種方法可方便的制備成試劑盒，利用96板多384 板，可高通量的檢測(cè)這些酶的活性，大批量的研究開(kāi)發(fā)這些酶的抑制劑，檢測(cè)速度快，精度 和靈敏度可以和放射同位素方法比擬，比色法檢測(cè)環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)便、干擾因素少，適合 切實(shí)的推廣和應(yīng)用。其原理為通過(guò)檢測(cè)法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶在催化反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷 酸或磷酸的量，得到酶的催化反應(yīng)活性。產(chǎn)生的焦磷酸或者磷酸與酸性化合物試劑反應(yīng)，經(jīng) 還原劑還原后得到的有顏色的化合物，比色法檢測(cè)其濃度，用于測(cè)算法呢基焦磷酸合酶等 類(lèi)酶的活性動(dòng)力學(xué)及其用于酶的抑制劑藥物篩選。
[0005] 具體方法是在這些酶的反應(yīng)體系中，先加入緩沖液，再加入酸性化合物試劑，然 后加入酶或者抑制劑，再還原后得到的有顏色的化合物，用比色法檢測(cè)其產(chǎn)生顏色化合物 的濃度，從而用于測(cè)算法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性動(dòng)力學(xué)及其用于酶的抑制劑藥物篩 選。這個(gè)方法沒(méi)有本底吸收，而反應(yīng)后的吸收峰很強(qiáng)，說(shuō)明這個(gè)方法精度和靈敏度高，外界 因素干擾少。此方法具體操作過(guò)程見(jiàn)圖1，反應(yīng)后吸收的圖譜見(jiàn)圖2。
[0006] 本發(fā)明的活性測(cè)定試劑盒包括緩沖液、穩(wěn)定劑、酸性化合物試劑、還原劑。其中酸 性化合物試劑指的是：鎢酸鈉鹽或者銨鹽，鑰酸鈉鹽或者銨鹽，砷酸鈉鹽或者銨鹽等之一或 其組合。還原所用的試劑指的是：孔雀綠，羅丹明，甲基紫，結(jié)晶紫，抗壞血酸，巰基乙醇，二 硫蘇糖醇，亞硫酸鈉，焦亞硫酸鈉，硫酸鐵，二氯化錫，硫酸亞鐵銨，果糖等之一或其組合。
[0007] 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解使用，或者配置液體試劑，直接使用， 本發(fā)明的試劑盒低溫長(zhǎng)期存放穩(wěn)定，重復(fù)性好，在酶的和底物的用量很少的條件下，可以快 速準(zhǔn)確地測(cè)定。
[0008] 該方法適用的酶主要是法呢基焦磷酸合酶（FPPS)，櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合酶 (GGPPS)，角鯊烯合成酶（SQS)，法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase)，櫳牛兒櫳牛兒轉(zhuǎn)移酶（GGTase)，甲 羥戊酸焦磷酸脫羧酶（MDD，以及其他涉及以磷酸或焦磷酸為產(chǎn)物或底物的酶或蛋白。

【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0010] 實(shí)施例一：
[0011] 在法呢基焦磷酸合酶（FPPS)反應(yīng)體系中，加入抑制劑條件下，混合10分鐘后，力口 入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變 化，從而測(cè)算出法呢基焦磷酸合酶的活性。
[0012] 實(shí)施例二：
[0013] 把法呢基焦磷酸合酶（FPPS)，反應(yīng)底物，緩沖液，穩(wěn)定劑，加入96板孔中，加入不 同濃度的抑制劑，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物 置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出系列的法呢基焦磷酸合酶的活性。
[0014] 實(shí)施例三：
[0015] 把櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合酶（GGPPS)，反應(yīng)底物，緩沖液，穩(wěn)定劑，加入96板孔中， 加入不同濃度的抑制劑，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將 反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出系列的櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合 酶（GGPPS)的活性。
[0016] 實(shí)施例四：
[0017] 把角鯊烯合成酶（SQS)，反應(yīng)底物，緩沖液，穩(wěn)定劑，加入96板孔中，加入不同濃度 的抑制劑，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物置于生 化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出系列的角鯊烯合成酶（SQS)的活性。
[0018] 實(shí)施例五：
[0019] 把法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase)，反應(yīng)底物，緩沖液，穩(wěn)定劑，加入96板孔中，加入不同濃 度的抑制劑，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物置于 生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出系列的法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase)的活性。
[0020] 實(shí)施例六：
[0021] 把櫳牛兒櫳牛兒轉(zhuǎn)移酶（GGTase)，反應(yīng)底物，緩沖液，穩(wěn)定劑，加入96板孔中， 加入不同濃度的抑制劑，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后， 將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出系列的櫳牛兒櫳牛兒轉(zhuǎn)移酶 (GGTase)的活性。
[0022] 實(shí)施例七：
[0023] 把甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（MDD)，反應(yīng)底物，緩沖液，穩(wěn)定劑，加入96板孔中，加入 不同濃度的抑制劑，混合10分鐘后，加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng) 物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的變化，從而測(cè)算出系列的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（MDD) 的活性。
[0024] 實(shí)施例八：
[0025] 把法呢基焦磷酸合酶（FPPS)，反應(yīng)底物，緩沖液，加入96板孔中，混合10分鐘后， 加入酸性化合物試劑及還原劑，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光度的 變化，從而測(cè)算出法呢基焦磷酸合酶的活性。
[0026] 實(shí)施例九：
[0027] 把法呢基焦磷酸合酶（FPPS)，反應(yīng)底物，緩沖液，加入96板孔中，加入不同濃度的 抑制劑，混合10分鐘后，加入試劑盒，穩(wěn)定2分鐘后，將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)吸光 度的變化，從而測(cè)算出系列的法呢基焦磷酸合酶的活性。
[0028] 目前對(duì)于在紫外-可見(jiàn)沒(méi)有吸收的酶的底物，只能通過(guò)放射性同位素或者熒光基 團(tuán)標(biāo)記方法等測(cè)定酶的活性。這些檢測(cè)方法成本高，對(duì)環(huán)境不友好，且不易操作。本發(fā)明的 法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性測(cè)定方法特征是采用比色法檢測(cè)其中產(chǎn)生的產(chǎn)物焦磷酸 或者磷酸，再用特定試劑與其反應(yīng)，還原后形成有顏色的化合物，可定性或定量地分析。該 方法具有高效，敏感，經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。該方法具有廣譜性，除法呢基焦磷酸合成酶外，還可檢測(cè) 櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸合酶（GGPPS)，角鯊烯合成酶（SS)，法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase)，櫳牛兒櫳 牛兒轉(zhuǎn)移酶（GGTase)，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（MDD)等酶的活性，并且可高通量地用于這 些酶抑制劑的篩選和藥物的開(kāi)發(fā)。
【權(quán)利要求】
1. 一種法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性測(cè)定方法，其方法原理為通過(guò)檢測(cè)法呢基焦 磷酸合酶等類(lèi)酶在反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸或磷酸的量，得到酶的催化反應(yīng)活性。產(chǎn)生的焦磷 酸或者磷酸先與酸性化合物試劑反應(yīng)，再經(jīng)還原劑還原后得到的有顏色的化合物，比色法 檢測(cè)其濃度，從而測(cè)算法呢基焦磷酸合酶等類(lèi)酶的活性動(dòng)力學(xué)及其用于酶的抑制劑藥物篩 選。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的檢測(cè)方法，主要特征在于用比色法檢測(cè)法呢基焦磷酸合酶 等類(lèi)酶反應(yīng)后的一種產(chǎn)物，焦磷酸或者磷酸的量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的檢測(cè)方法，主要特征為與焦磷酸或者磷酸反應(yīng)的酸性化合 物試劑是：鎢酸鈉鹽或者銨鹽，鑰酸鈉鹽或者銨鹽，砷酸鈉鹽或者銨鹽等之一或其組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的檢測(cè)方法，主要特征為還原所用的試劑指的是：孔雀綠，羅 丹明，甲基紫，結(jié)晶紫，抗壞血酸，巰基乙醇，二硫蘇糖醇，亞硫酸鈉，焦亞硫酸鈉，硫酸鐵，二 氯化錫，硫酸亞鐵銨，果糖等之一或其組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的類(lèi)酶，除法呢基焦磷酸合酶（FPPS)外，還指櫳牛兒櫳牛 兒焦磷酸合酶（GGPPS)，角鯊烯合成酶（SQS)，法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase)，櫳牛兒櫳牛兒轉(zhuǎn)移酶 (GGTase)，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（MDD)。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104101595SQ201310132760
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月8日
【發(fā)明者】張巖, 陶柏秋, 高金波 申請(qǐng)人:張巖, 陶柏秋, 高金波