專利名稱：從脂肪族α,ω－二腈中制備內(nèi)酰胺的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種通過(guò)生物學(xué)和化學(xué)的結(jié)合技術(shù)從脂肪族α,ω-二腈中制備五元或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法。更具體而言，使用一種具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性或者有腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的結(jié)合的催化劑在水溶液中首先把脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)變成ω-腈基羧酸的銨鹽。然后，不分離中間體ω-腈基羧酸或ω-氨基羧酸，直接在水溶液中通過(guò)氫化作用把ω-腈基羧酸轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺。當(dāng)脂肪族α,ω-二腈在α-碳原子位也被不對(duì)稱地取代時(shí)，由于ω-腈基的水解作用具有98％以上的區(qū)域選擇性，腈水解酶產(chǎn)生了ω-腈基羧酸銨鹽，因而在后續(xù)的氫化作用中僅產(chǎn)生了兩種可能的內(nèi)酰胺產(chǎn)物的一種。
2．相關(guān)領(lǐng)域描述通過(guò)各種化學(xué)方法，將腈容易地轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的羧酸，但這些方法一般需要強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的反應(yīng)條件及很高的反應(yīng)溫度，且通常產(chǎn)生非所需的副產(chǎn)物和/或大量的作為非所需副產(chǎn)物的無(wú)機(jī)鹽。酶催化的水解作用把腈底物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的羧酸的方法通常優(yōu)于化學(xué)法，這是因?yàn)檫@些方法經(jīng)常在環(huán)境溫度下進(jìn)行，不需要使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的反應(yīng)條件，以及不產(chǎn)生大量的非所需副產(chǎn)物。腈的酶催化水解作用優(yōu)于化學(xué)水解作用的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是對(duì)各種脂肪族二腈或芳香族二腈而言，酶催化的反應(yīng)可以是高度的區(qū)域選擇性的，其中僅兩個(gè)腈基之一個(gè)被水解成相應(yīng)的羧酸銨鹽。
在水溶液中，腈水解酶直接把腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的羧酸銨鹽而不形成酰胺中間體。用芳香族腈水解酶把芳香族腈水解成相應(yīng)的羧酸銨鹽的方法已使用了許多年，但僅是最近才報(bào)道使用脂肪族腈水解酶。Kobayashi等(《四面體》(1990)，第46卷，5587-5590；《細(xì)菌學(xué)雜志》，(1990)，第172卷，4807-4815)描述了一種分離自紫紅紅球菌K22株的脂肪族腈水解酶，該酶把脂肪族腈催化水解為相應(yīng)的羧酸銨鹽；幾種脂肪族α,ω-二腈也被水解，用靜止細(xì)胞作催化劑，以100％的摩爾轉(zhuǎn)化率將戊二腈轉(zhuǎn)變成4-氰基丁酸銨鹽。從睪丸酮叢毛單胞菌分離到一種腈水解酶，該酶能把一系列脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽或二羧酸二銨鹽(加拿大專利申請(qǐng)?zhí)朇A 2,103,616(1994/02/11)；S.Lévy-Schil等，《基因》，(1995)，第161卷，15-20)；水解己二腈在把5-氰基戊酸銨鹽完全轉(zhuǎn)變成己二酸二銨鹽前所獲得的5-氰基戊酸銨鹽的最大產(chǎn)量約為88％。
M.L.Gradley和C.J.Knowles(《生物技術(shù)通訊》，(1994)，第16卷，41-46)報(bào)道應(yīng)用具有脂肪族腈水解酶活性的紫紅紅球菌NCIMB 11216的懸浮液水解幾種2-甲基烷基腈。得到了把(+/-)-2-甲基丁基腈完全轉(zhuǎn)變成2-甲基丁酸銨鹽的結(jié)果，而(+/-)-2-甲基己烷腈的水解似乎是對(duì)(+)對(duì)映體的對(duì)映結(jié)構(gòu)特異性。C.Bengis-Garber和A.L.Gutman(《微生物學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用》，(1989)，第32卷，11-16)使用紫紅紅球菌NCIMB 11216作為催化劑水解幾種二腈。在該項(xiàng)工作中，將富馬腈和琥珀腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽，而將戊二腈、己二腈和庚二酰腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的二羧酸二銨鹽。
聯(lián)合使用腈水合酶(NHase)和酰胺酶這兩種酶也能在水溶液中把脂肪族腈轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的羧酸銨鹽。此反應(yīng)最初由腈水合酶把脂肪族腈轉(zhuǎn)化成酰胺，然后由酰胺酶接著把酰胺轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的羧酸銨鹽。已知大量的細(xì)菌種屬擁有不同的腈水合酶和酰胺酶活性譜，其中包括紅球菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬和微球菌屬。己將這些微生物的水懸液和所分離到的酶用于把腈轉(zhuǎn)化成酰胺和羧酸銨鹽。
P.Honicke-Schmidt和M.P.Schneider(化學(xué)協(xié)會(huì)雜志《化學(xué)通訊》(J.Chem.Soc.,Chem.Commun.)(1990),648-650)用固定化的紅球菌屬種CH 5株分別把腈和二腈轉(zhuǎn)化成羧酸銨鹽和ω-腈基羧酸銨鹽。這些細(xì)胞含有腈水合酶和酰胺酶活性，把戊二腈轉(zhuǎn)變成4-氰基丁酸銨鹽，以92％的底物轉(zhuǎn)化率為基礎(chǔ)則有79％的分離產(chǎn)量。A.J.Blakely等(《FEMS微生物學(xué)通訊》(1995)，第129卷，57-62)用紅球菌屬AJ 270懸液的腈水合酶和酰胺酶活性區(qū)域特異地水解丙二腈和己二腈，僅產(chǎn)生相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽。H.Yamada等(《發(fā)酵技術(shù)雜志》(1980)，第58卷，495-500)描述用含有腈水合酶和酰胺酶的假單胞菌屬種K9把戊二腈水解成4-氰基丁酰胺、4-氰基丁酸、戊二酸和氨的混合物。K.Yamamoto等(《發(fā)酵生物工程雜志》，1992，第73卷，125-129)描述使用含有腈水合酶和酰胺酶活性的棒狀桿菌屬種CH5細(xì)胞把反式1,4-二氰環(huán)己烷轉(zhuǎn)變成反式-4-氰基環(huán)己烷羧酸銨鹽，產(chǎn)量為99.4％。
J.L.Moreau等(《生物催化》，(1994)，第10卷，325-340)描述應(yīng)用短桿菌屬種R 312(腈水合酶和酰胺酶活性)、通過(guò)形成5-氰基戊酸中間體，把己二腈水解成己二酸、己二酰二胺和己二酰胺酸(adipamic acid)。A.Kerridge等(《生物區(qū)域選擇性藥物化學(xué)》(Biorg.Medicinal Chem)(1994)，第2卷，447-455)報(bào)道使用短桿菌屬種R 312(腈水合酶和酰胺酶活性)，把前手性-3-羥基戊二腈衍生物水解成相應(yīng)的(S)-氰酸銨鹽。歐洲專利178,106 B1(1993年3月31日)公開了如下方法使用來(lái)源于芽胞桿菌屬、桿菌屬、微球菌屬或短桿菌屬的單腈水解酶活性(定義為腈水解酶或腈水合酶/酰胺酶的組合)，把脂肪族二腈的氰基之一個(gè)選擇性地轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的羧酸、酰胺、酯或硫酯。除了具有腈水解酶活性或腈水合酶/酰胺酶活性的細(xì)菌催化劑的許多實(shí)施例外，Y.Asano等(《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》，(1980)，第44卷，2497-2498)闡述了真菌節(jié)狀鐮孢TG-1把戊二腈水解成4-氰基丁酸銨鹽以及把2-甲基戊二腈水解成4-氰基戊酸銨鹽。
沒(méi)有發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)描述在水溶液中脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的氫化作用直接產(chǎn)生相應(yīng)的內(nèi)酰胺。接近的相關(guān)技術(shù)是美國(guó)專利4,329,498描述用2號(hào)Raney鎳催化劑、在用氨飽和的無(wú)水乙醇溶液中粘康酸單腈的氫化形成6-氨基己酸(6-ACA)。除去氫化作用的催化劑后，把6-ACA乙醇溶液加熱到170℃-200℃可預(yù)期6-ACA環(huán)化形成己內(nèi)酰胺。已報(bào)道用Raney鎳作催化劑，在1N的氫氧化鈉溶液中，通過(guò)氫化作用把β-喹喔啉基丙酸(E.C.Taylor等，《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，(1965)，第87卷，1984-1990)或相關(guān)的2-(2-羧乙基)-3(4H)-喹喔酮(E.C.Taylor等，《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，(1965)，第87卷，1990-1995)還原性環(huán)化產(chǎn)生相應(yīng)的五元環(huán)內(nèi)酰胺，只不過(guò)從產(chǎn)物混合物中除去催化劑和酸化產(chǎn)生的濾液之后進(jìn)行。作者聲明對(duì)任何的這些還原作用，“內(nèi)酰胺的形成只能在酸性溶液中進(jìn)行”(1992頁(yè)，第二段)，可能需要質(zhì)子化的羧酸而不是羧酸鹽的存在。美國(guó)專利4,730,040公開了一種制備己內(nèi)酰胺的方法，該方法是在氫化作用催化劑存在下，把5-甲酰戊酸的水溶液和氨及氫反應(yīng)，然后把氨從產(chǎn)物混合物中分離，并把產(chǎn)生的6-ACA溶液加熱到300℃。
以前的工作已公開了已將含腈水合酶和酰胺酶活性的單細(xì)胞用于把腈和二腈轉(zhuǎn)化成不同的酸性銨鹽?？墒?，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)描述在本發(fā)明的氫化反應(yīng)條件下(即在加過(guò)量的氫氧化銨水溶液中)，把脂肪族ω-氨基羧酸銨鹽環(huán)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺。接近的相關(guān)技術(shù)已有報(bào)道，在各種反應(yīng)條件下，把脂肪族ω-氨基羧酸(但不是銨鹽)環(huán)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺。F.Mares和D.Sheehan(《化學(xué)工業(yè)工程學(xué)設(shè)計(jì)開發(fā)》(Ind.Eng.Chem.Process Des.Dev.)(1978)，第17卷，9-16)描述了用水或乙醇作溶劑，把6-氨基己酸(6-ACA)環(huán)化成己內(nèi)酰胺的方法。在水中，低于1mol/kg(約1M)的濃度下環(huán)化反應(yīng)是可逆的，且己內(nèi)酰胺的濃度隨著溫度的增加而增加；在0.85mol/kg(約0.85M)的6-ACA和己內(nèi)酰胺總濃度下，據(jù)報(bào)道己內(nèi)酰胺的百分率從在180℃下的38.7％增加到在250℃下的92.2％。在乙醇中，200℃時(shí)可獲得的己內(nèi)酰胺產(chǎn)量為98％，該報(bào)道認(rèn)為這是由于反應(yīng)移向有利于乙醇中6-ACA游離酸/游離胺形式的平衡，而不是在水中占優(yōu)勢(shì)的6-ACA分子內(nèi)烷基銨羧酸鹽的形式。從6-ACA中產(chǎn)生己內(nèi)酰胺的方法已在美國(guó)專利4,599,199中描述，其中將6-ACA在290℃～400℃的蒸汽存在下加到流化的氧化鋁床中。在甲苯中的氧化鋁或硅膠上通過(guò)脂肪族ω-氨基酸環(huán)化脫水合成五、六和七元環(huán)內(nèi)酰胺、同時(shí)不斷除去反應(yīng)中所產(chǎn)生的水的方法，己由A.Bladé-Font(《四面體通訊》，(1980)，第21卷，2443-2446)報(bào)道。據(jù)報(bào)道游離氨基(非質(zhì)子化的)對(duì)環(huán)化脫水的發(fā)生是必需的。
沒(méi)有發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)描述在含甲胺的水溶液中，脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的氫化作用直接產(chǎn)生相應(yīng)的N-甲基內(nèi)酰胺。接近的相關(guān)技術(shù)為用Raney鎳催化劑、在140℃，1000-2000 psig的氫氣下、在水中通過(guò)乙酰丙酸和甲胺水溶液的氫化作用制備1,5-二甲基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)(R.L.Frank等，《有機(jī)合成》，(1954),Coll.第3卷，328-329)。然后由過(guò)濾產(chǎn)物混合物和蒸餾濾液以除去水和甲胺而將所產(chǎn)生的4-N-甲基氨基戊酸甲銨鹽環(huán)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺。N-烷基內(nèi)酰胺也可通過(guò)含2-甲基戊二腈、伯烷基胺和氫化催化劑的水混合液的直接氫化作用產(chǎn)生，該方法產(chǎn)生1,3和1,5二烷基哌啶酮-2的混合物(美國(guó)專利5,449,780)。N-取代的2-吡咯烷酮(pyrrolidinones)可由如下方法制取把γ-戊內(nèi)脂和烷基胺在110～130℃反應(yīng)，然后加熱生成混合物至250～270℃，同時(shí)蒸餾去水(F.B.Zienty和G.W.Steahly，《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志》，(1947)，第69卷，715-716)。
產(chǎn)生內(nèi)酰胺或N-烷基內(nèi)酰胺的上述方法受如下一種或多種缺點(diǎn)所妨礙使用當(dāng)用水作溶劑時(shí)為獲得高產(chǎn)量的內(nèi)酰胺所用的溫度超過(guò)250℃；為推動(dòng)平衡移向內(nèi)酰胺形成，需從反應(yīng)混合物中除去水，調(diào)整反應(yīng)混合物的pH到酸性值，以利于內(nèi)酰胺的形成；或者使用有機(jī)溶劑，其中起始原料罕有可溶的。許多這些方法產(chǎn)生不需要的廢流，或產(chǎn)物混合物不易分離。有意義的進(jìn)展將是如下的方法在水溶液中把脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的內(nèi)酰胺或N-甲基內(nèi)酰胺，產(chǎn)量高，具有高度區(qū)域選擇性，幾乎不產(chǎn)生副產(chǎn)物或廢流，以及容易的回收產(chǎn)物的方法。
發(fā)明概述一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，具有如下步驟(a)把在水溶液反應(yīng)混合物中的脂肪族α,ω-二腈與一種酶催化劑接觸，該催化劑的特征為(1)脂肪族腈水解酶活性，或者(2)腈水合酶和酰胺酶活性的組合借此，脂肪族α,ω-二腈被轉(zhuǎn)化成α,ω-腈基羧酸銨鹽；(b)把從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；(c)從步驟(b)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
在步驟(b)前，可將氫氧化銨、氨氣或甲胺添加到步驟(a)的含水產(chǎn)物混合物中。該添加量是相應(yīng)于存在的ω-腈基羧酸銨鹽的量的0～4摩爾當(dāng)量。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例方案使用具有通式NCCXa(R)(CH2)nCN的脂肪族α,ω-二腈，其中a=0或1，當(dāng)a=1且R=H、非取代或取代的烷基、或非取代或取代的鏈烯基、或非取代或取代的亞烷基，且其中n=1或2時(shí)X=氫。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例方案是一種處理完整細(xì)胞催化劑從選擇區(qū)域選擇性的腈水解酶活性或腈水合酶活性，能催化脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的ω-氰基羧酸銨鹽的方法。所處理的完整細(xì)胞催化劑的特征為兩種類型的活性(1)合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶活性或區(qū)域選擇性的腈水合酶活性，和(2)不合乎需要的非區(qū)域選擇性的腈水解酶或腈水合酶活性。處理細(xì)胞的方法包括加熱完整細(xì)胞催化劑到約35℃～70℃的溫度，時(shí)間為10～120分鐘，其中將不合乎需要的非區(qū)域選擇性的腈水解酶活性或腈水合酶活性破壞，而將合乎需要的區(qū)域選擇性的腈水解酶或腈水合酶活性保留。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施例方案是使用酶催化劑，這些催化劑的形式為完整的微生物細(xì)胞、通透化的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物的一種或多種細(xì)胞組分、以及部分純化的酶或純化的酶。將這些酶催化劑固定在支持物上。具有脂肪族腈水解酶活性特征和用于本方法的微生物為敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72-PE-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和敏捷食酸菌72W(ATCC55746)。以腈水合酶和酰胺酶活性的組合為特征且能在本方法中應(yīng)用的微生物是睪丸酮叢毛單胞菌(Comomonas testosteroni)5-MGAM-4D(ATCC 55744)。
進(jìn)一步的實(shí)施例方案是一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)和如下通式Ⅰ或Ⅱ的脂肪族α,ω-二腈接觸
或
其中R1和R2是H，且R3、R4、R5和R6獨(dú)自選自H、非取代或取代的烷基，或非取代或取代的鏈烯基、在含水反應(yīng)混合液中含的酶催化劑選自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)，由此將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成ω-腈基羧酸銨鹽；b)把步驟(a)中生成的含水產(chǎn)物混合物和氫及氫化作用催化劑接觸，由此將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和c)從步驟(b)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
進(jìn)一步的實(shí)施例方案是一種從脂肪族α,ω-二腈制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把如下通式Ⅰ或Ⅱ的脂肪族α,ω-二腈在水反應(yīng)混合液中與睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)接觸；
或
其中R7、R8、R9、R10、R11和R12獨(dú)自選自H、非取代或取代的烷基，或非取代或取代的鏈烯基，其中任一個(gè)或二個(gè)R7或R8不是H；由此將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)變成ω-腈基羧酸銨鹽；(b)把在步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此將-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω～氨基羧酸銨鹽；和(c)從步驟(b)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
最后，提供新型的化合物如下通式Ⅲ的化合物
其中M+是H+或者是NH4+P通式Ⅳ的化合物
其中M+是H+或者是NH4+。
生物學(xué)保藏簡(jiǎn)述根據(jù)Budapest條約中的條款，申請(qǐng)者已進(jìn)行了如下的生物學(xué)保藏保藏者鑒定參考 國(guó)際保藏部保藏號(hào)保藏日期睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4DATCC 557441996年3月8日敏捷食酸菌72-PF-17 ATCC 557451996年3月8日敏捷食酸菌72WATCC 557461996年3月8日敏捷食酸菌72-PF-15 ATCC 557471996年3月8日在此所用的“ATCC”指的是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，國(guó)際保藏部，位于12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852，美國(guó)?！癆TCCNo.”是ATCC保藏培養(yǎng)物的登記號(hào)。
發(fā)明詳述開發(fā)了一種從脂肪族α,ω-二腈中高產(chǎn)量地制備內(nèi)酰胺的方法，該法利用酶和化學(xué)反應(yīng)的組合。假如α,ω-二腈被不對(duì)稱地取代，就能觀察到對(duì)兩種可能的內(nèi)酰胺產(chǎn)物(

圖1)之一種的高度區(qū)域選擇性。
圖1
其中a=0或1；X=氫，當(dāng)a=1時(shí)；n=1或2R=H，非取代或取代的烷基、或非取代或取代的鏈烯基、或非取代或取代的亞烷基；R1=H,-CH3本發(fā)明的產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)和藥物工業(yè)中能用作高價(jià)值的聚合物、溶劑和化學(xué)品的前體。當(dāng)用水作溶劑時(shí)，本方法使用低于250℃的溫度，獲得了高產(chǎn)量的內(nèi)酰胺。相應(yīng)于以前眾所周知的生產(chǎn)內(nèi)酰胺的化學(xué)法，要求權(quán)利保護(hù)的本發(fā)明幾乎不產(chǎn)生廢物，并允許用容易的方法回收產(chǎn)物。
在本申請(qǐng)中，除非在別處具體說(shuō)明，使用下列縮寫和定義“酶催化劑”指的是特征為腈水解酶活性或腈水合酶活性和酰胺酶活性組合的催化劑。該催化劑可能的形式為完整的微生物細(xì)胞、通透化的微生物細(xì)胞、一種或多種微生物細(xì)胞提取物的細(xì)胞組分、部分純化的酶或純化的酶。
“氫化作用催化劑”指的是能加速氫化作用而其本身不被消耗或不發(fā)生化學(xué)變化的物質(zhì)。
“含水產(chǎn)物混合物”被用于指含有從相應(yīng)的方法步驟所生成的含水產(chǎn)物混合物。
A．高產(chǎn)量及高度區(qū)域選擇性地把脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽。
本方法的第一步是用酶催化劑，把脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽。酶催化劑要么具有腈水解酶活性，要么具有兩種酶腈水合酶(NHase)和酰胺酶活性的組合，其中前者是腈水解酶把α,ω-二腈直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽(反應(yīng)式1)；而后者是由腈水合酶起始把脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)變成ω-腈烷基酰胺，然后由酰胺酶接著把ω-腈烷基酰胺轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽(反應(yīng)式2)
從暴露在脂肪族腈或脂肪族二腈的土壤樣品中分離得到新型的微生物敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，它能利用2-乙基琥珀腈作為氮源。當(dāng)使用微生物的完整細(xì)胞催化劑水解不對(duì)稱取代的2-烷基-α,ω-二腈、例如2-甲基戊二腈(2-MGN)或2-乙基琥珀腈時(shí)，得到產(chǎn)物混合物。在水解反應(yīng)整個(gè)過(guò)程中，除了所需的ω-腈基羧酸外，產(chǎn)生了相應(yīng)的二羧酸單酰胺和二羧酸。已發(fā)現(xiàn)在合適的緩沖液中，50℃下短時(shí)間加熱敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的懸液可失活完整細(xì)胞催化劑的不合乎需要的腈水合酶活性，該水合酶催化劑可催化產(chǎn)生不合乎需要的二羧酸單酰胺(進(jìn)一步由酰胺酶轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的二羧酸)。用這種方法，制備的完整細(xì)胞催化劑含有腈水解酶活性，由于ω-腈基的水解，腈水解酶把2-烷基-α,ω-二腈僅轉(zhuǎn)變成ω-腈基羧酸銨鹽。
熱處理敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的懸液50℃下1小時(shí)所產(chǎn)生的微生物完整細(xì)胞催化劑，能把2-甲基戊二腈(2-MGN)水解成4-氰基戊酸(4-CPA)銨鹽，把2-亞甲基戊二腈(2MEGN)水解成4-氰基-4-戊酸(4-CPEA)銨鹽，或者把2-乙基琥珀腈(2-ESN)水解成3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽，水解作用具有極為高度的區(qū)域選擇性，如在完全轉(zhuǎn)化二腈時(shí)，通過(guò)腈基的水解作用至少產(chǎn)生98％產(chǎn)量的ω-腈基羧酸銨鹽(表1)
表1α,ω-二腈ω-腈/酸銨鹽濃度(M)產(chǎn)量(％)2-MGN 4-CPA(NH4+)0.10 99.3″″ 0.40 99.4″″ 1.00 99.4″″ 1.85 98.8″″ 2.00 98.92-MEGN 4-CPEA(NH4+) 1.25 100″″ 2.00 1002-ESN 3-CPA(NH4+)0.10 100″″ 0.40 100″″ 1.00 100″″ 1.25 100目前還沒(méi)有非酶學(xué)方法能僅把脂肪族二腈的一個(gè)腈基選擇性地水解成酰胺基或羧酸基而完全轉(zhuǎn)化二腈。如果為了獲得對(duì)單酰胺或單酸水解產(chǎn)物的高度選擇性而上述的反應(yīng)以不完全轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)化率＜20％)的方式進(jìn)行，那么就需要分離步驟，把產(chǎn)物從未反應(yīng)的二腈中分離出來(lái)，在后續(xù)的反應(yīng)中重新循環(huán)二腈。典型的非酶促水解反應(yīng)包括在提高溫度下加熱腈或二腈溶液，常常需要存在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，而上述的酶催化反應(yīng)在環(huán)境溫度下的水溶液及中性pH中進(jìn)行，不用添加酸或堿。
已經(jīng)制備了兩種敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的突變株，它們僅產(chǎn)生非常低水平的不合需要的腈水合酶活性，該腈水合酶導(dǎo)致不合需要的副產(chǎn)物形成。這些突變株、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)在用作催化劑前不需要熱處理細(xì)胞就能把脂肪族α,ω-二腈水解成相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽。通過(guò)用未處理和熱處理的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)和未處理的敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)突變株水解2-MGN而產(chǎn)生4-CPA和2-甲基戊二酸(2-MGA)的產(chǎn)量比較，在表2中顯示
表2[2-MGN] 4-CPA 2-MGA催化劑 (M)(％產(chǎn)量)(％產(chǎn)量)敏捷食酸菌72W，未處理 0.1062.734.6敏捷食酸菌72W，熱處理 0.1099.30.7敏捷食酸菌72-PF-15，未處理 0.1096.83.6敏捷食酸菌72W，熱處理 0.4099.40.6敏捷食酸菌72-PF-15，未處理 0.4098.81.2敏捷食酸菌72W，熱處理 1.0098.71.3敏捷食酸菌72-PF-15，未處理 1.0099.20.8當(dāng)用熱處理過(guò)的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)作催化劑水解非取代的α,ω-二腈琥珀腈(SCN,1.25M)或戊二腈(GLN,1.5M)的水溶液時(shí)，產(chǎn)生了相應(yīng)的ω-腈基羧酸銨鹽3-氰基丙酸(3-CPRA)和4-氰基丁酸(4-CBA)，產(chǎn)量分別為99.7％和92.3％，相應(yīng)的二羧酸是唯一觀察到的副產(chǎn)物。當(dāng)將該相同的催化劑用于把己二腈(ADN)轉(zhuǎn)化成5-氰基戊酸(5-CPA)銨鹽時(shí)，己二酸(ADA)二銨鹽是主要產(chǎn)物(產(chǎn)量＞50％)。敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)及敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)均不適用于作高產(chǎn)量地制備5-CPA銨鹽的催化劑。
將從暴露于脂肪族腈或脂肪族二腈的土壤樣品中分離并能以不同的腈或酰胺作氮源生長(zhǎng)的30多種不同的微生物培養(yǎng)物用于高選擇性地產(chǎn)生5-CPA的篩選。分離到了第二種新型微生物睪丸酮絲毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)(用2-甲基戊二酰胺(methylglutaranide)作氮源)，該菌含有幾種腈水合酶和酰胺酶活性。當(dāng)用完整細(xì)胞催化劑水解ADN時(shí)，生成的產(chǎn)物混合物主要由ADA二銨鹽、己二酰二胺(ADAM)和己二酰胺酸(adipamic acid)(ADMA)組成，僅觀察到微量的5-CPA銨鹽。再次發(fā)現(xiàn)50℃下短時(shí)間加熱此種微生物可較大程度地失活不合需要的腈水合酶活性，使該微生物催化劑保留下把ADN轉(zhuǎn)化成5-氰基戊酰胺的腈水合酶活性和把5-氰基戊酰胺轉(zhuǎn)變成5-CPA銨鹽的酰胺酶活性。熱處理睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D 50℃1小時(shí)形成一種微生物細(xì)胞催化劑，該催化劑產(chǎn)生5-CPA，產(chǎn)量高達(dá)97％，完全轉(zhuǎn)化ADN。
通過(guò)熱處理消除不需要的腈水合酶而同時(shí)留下相對(duì)熱穩(wěn)定的腈水解酶活性或腈水合酶活性以把二腈轉(zhuǎn)變成氰酸，這種可能性以前未被人知曉，也不可能預(yù)測(cè)，因?yàn)殡嫠饷富螂嫠厦傅臏囟确€(wěn)定性是未知的?？梢灶A(yù)期在35℃～70℃溫度下熱處理10～120分鐘將產(chǎn)生所述的有用效應(yīng)。
B．五或六元環(huán)內(nèi)酰胺的制備已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種方法，可高產(chǎn)量地制備五元環(huán)或六元環(huán)內(nèi)酰胺，該法把在水溶液中酶催化水解脂肪族α,ω-二腈產(chǎn)生的ω-腈羧酸銨鹽產(chǎn)物混合物直接氫化而實(shí)現(xiàn)。在氫化作用步驟前，這種方法不需要從水解反應(yīng)的產(chǎn)物混合物中分離ω-腈羧酸銨鹽，也不需要在氫化作用前把ω-腈羧酸銨鹽轉(zhuǎn)變成游離酸(例如，4-CPA銨鹽轉(zhuǎn)變成4-CPA)，或者不需要從氫化作用產(chǎn)物混合物中分離生成的ω-氨基羧酸銨鹽和環(huán)化前把銨鹽轉(zhuǎn)化成游離羧酸。
用酶催化劑從脂肪族α,ω-二腈中生產(chǎn)含ω-腈基羧酸銨鹽的含水產(chǎn)物混合物后(反應(yīng)式3)，移去酶催化劑，在合適的氫化作用催化劑存在下把生成的水溶液和氫及加有化學(xué)計(jì)量學(xué)上過(guò)量的氨(如氫氧化銨)反應(yīng)，可預(yù)期產(chǎn)生含有脂肪族ω-氨基羧酸銨鹽的水溶液(反應(yīng)式4)
有必要在腈氫化成相應(yīng)的胺的過(guò)程中使用過(guò)量的氨，從而通過(guò)產(chǎn)物ω-氨基羧酸限制亞氨中間體(在腈基氫化成胺的過(guò)程中產(chǎn)生)的還原性烷基化，這種烷基化導(dǎo)致形成二聚體并喪失產(chǎn)量。這種技術(shù)已有文獻(xiàn)詳細(xì)描述(De Bellefon等，《英國(guó)科學(xué)回顧目錄》(Catal.Rev.Sci.Eng)(1994)，第36卷，459～506)并由腈氫化作用領(lǐng)域的技術(shù)人員普遍使用。
依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，可以預(yù)期必須將由ω-腈基羧酸銨鹽氫化作用產(chǎn)生的ω-氨基羧酸銨鹽在可進(jìn)行熱誘導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng)以產(chǎn)生所需的內(nèi)酰胺前(反應(yīng)式6)轉(zhuǎn)變成游離酸并加以分離(反應(yīng)式5)。根據(jù)Mares等的報(bào)道(同上)，在水中濃度低于1.0mol/kg(約1.0M)時(shí)，6-氨基己酸(6-ACA)(反應(yīng)式6,n=3,R=H)和己內(nèi)酰胺以可逆的平衡混合物存在，己內(nèi)酰胺的濃度隨著溫度的增加而增加。在0.85mol/kg(約0.85M)的6-ACA和己內(nèi)酰胺總濃度下，據(jù)Mares等報(bào)道己內(nèi)酰胺的百分比從180℃時(shí)的18.7％增加到250℃時(shí)的92.2％。
在這種情況下，盡管存在所加的過(guò)量的氨(如氫氧化銨)和反應(yīng)混合物的pH為9～10，但是不能認(rèn)為6-ACA銨鹽在氫化作用溫度低于200℃時(shí)會(huì)環(huán)化產(chǎn)生明顯數(shù)量的己內(nèi)酰胺。6-氨基己酸的羧酸基和質(zhì)子化的胺基的pKa′值分別為4.373和10.804(Lange′s化學(xué)手冊(cè)，J.A.Dean，主編，第14版，(1992),McGraw-Hill,NY.p8.22(如6-氨基己酸)),NH4+的pKa為9.25。在反應(yīng)混合物pH為9～10時(shí)，能計(jì)算出至少99.97％的6-ACA在溶液中以羧酸銨鹽存在，此外，大約一半的6-氨基己酸銨鹽的胺基也被質(zhì)子化。因此，不能認(rèn)為在本發(fā)明的氫化作用條件下，顯著量的6-ACA銨鹽會(huì)環(huán)化產(chǎn)生己內(nèi)酰胺，其中在反應(yīng)式(7)中表示的從環(huán)化反應(yīng)中間物中取代氫陰離子(-OH)是不利的
當(dāng)5-CPA銨鹽(通過(guò)酶水解ADN制備)水溶液的氫化作用在0M～2.0M NH4OH存在下、溫度70℃～160℃進(jìn)行時(shí)，可觀察到5-CPA完全轉(zhuǎn)變成6-ACA銨鹽，幾乎不形成副產(chǎn)物，正如預(yù)期的那樣，得到的己內(nèi)酰胺(生成七元環(huán)的內(nèi)酰胺)的產(chǎn)量小于3％(表3)表3溫度 5-CPA銨鹽 [NH4OH] 時(shí)間 5-CPA轉(zhuǎn)化 己內(nèi)酰胺(℃)(M) (M) (h)率(％) (％)70 1.002 100 0.770 1.0 1.0 2 100 0.770 1.0 1.5 2 94 0.870 1.0 2.0 2 84 0.81201.002 99 0.91201.0 1.0 2 100 0.91201.0 1.5 2 97 1.01201.0 2.0 2 97 1.11601.0 0 2 97 2.51601.0 1.0 2 84 2.31601.0 1.5 2 97 3.01601.0 2.0 2 95 2.7在與由酶水解ADN制備5-CPA銨鹽的氫化作用相同的氫化反應(yīng)條件下，當(dāng)處理通過(guò)混合真正的6-ACA和氫氧化銨制備的水溶液時(shí)，也可得到小于3％產(chǎn)量的己內(nèi)酰胺。在70℃下，5-CPA銨鹽的氫化作用制備的水溶液中，環(huán)化6-ACA銨鹽在高于200℃的溫度時(shí)可設(shè)法實(shí)現(xiàn)，該法首先除去氫化作用催化劑，然后在280℃時(shí)加熱約1.0M 6-ACA銨鹽產(chǎn)物混合物2小時(shí)即可。產(chǎn)生的己內(nèi)酰胺的量小于18％(表4)。這些結(jié)果說(shuō)明在過(guò)量的氨存在下，通過(guò)5-CPA銨鹽水溶液的直接氫化作用只能獲得非常低產(chǎn)量的己內(nèi)酰胺。根據(jù)6-ACA銨鹽進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)的不可預(yù)測(cè)性，尤其是存在過(guò)量的氫氧化銨時(shí)，這種結(jié)果是可預(yù)期的。
表4溫度 6-ACA銨鹽 [NH4OH] 時(shí)間 己內(nèi)酰胺(℃) (M) (M) (h)(％)2801.0 02 17.82801.0 1.0 2 17.22801.0 1.5 2 11.02801.0 2.0 2 9.02801.0 2.5 2 3.1也可預(yù)期當(dāng)3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽(由酶水解2-乙基琥珀腈(2 ESN)制備)或4-氰基戊酸(4-CPA)銨鹽(由酶水解2-甲基戊二腈(2-MGN)制備)在過(guò)量的氨存在下70℃～160℃氫化時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的ω-氨基羧酸銨鹽；在進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)成相應(yīng)的內(nèi)酰胺前(如5-CPA銨鹽的情況)，這些鹽類必須作游離酸予以分離。雖然羧酸的pKa值和產(chǎn)物4-氨基-3-乙基丁酸或5-氨基-4-甲基戊酸的質(zhì)子化胺的機(jī)能沒(méi)有報(bào)道，但是有充分理由設(shè)想這些pKa與6-ACA異構(gòu)體的pKa相似。
未曾預(yù)料到的是，在Raney鎳和過(guò)量的銨存在下，在pH9～10、溫度70℃～180℃時(shí)，把3-CPA銨鹽(由酶水解2-ESN產(chǎn)生)的水溶液氫化作用2小時(shí)，直接產(chǎn)生相應(yīng)的4-乙基吡咯烷-2-酮內(nèi)酰胺(4-EPRD)產(chǎn)量達(dá)91％(表5)。4-EPRD的產(chǎn)量也隨所添加的氫氧化銨(除了已經(jīng)作為羧酸銨鹽存在的銨離子濃度外添加)的濃度的增加而增加，這表明為了限制眾所周知的產(chǎn)生二聚體和聚合物的還原性烷基化反應(yīng)，需要添加氨進(jìn)行單腈酸銨鹽的水溶液的氫化作用(表6)。
表5溫度 3-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％ 時(shí)間3-CPA 4-EPRD(℃)(M) (M)Raney Ni (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)70 1.0 2.0 5 2 7 1.5120 1.0 2.0 5 2 5522.7140 1.0 2.0 5 2 7155.4140 1.0 2.0 10 2 100 89.9160 1.0 2.0 5 2 100 90.1160 1.0 2.0 10 2 100 91.3180 1.0 2.0 5 2 100 86.1180 1.0 2.0 10 2 100 90.0表6溫度 3-CPA銨鹽 [NH4OH] 重量％ 時(shí)間3-CPA4-EPRD(℃)(M)(M) Raney Ni (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)160 1.0 0 52 99 80.1160 1.01.0 52 99 87.6160 1.02.0 52 100 90.1160 1.03.0 52 100 85.4180 1.0 0 52 100 75.1180 1.01.0 52 100 85.8180 1.02.0 52 100 88.5180 1.03.0 52 100 90.0在Raney鎳和過(guò)量的氨存在下，在pH9～10、160℃時(shí)把4-CPA銨鹽(由酶水解2-MGN制備)的水溶液氫化作用2小時(shí)，直接產(chǎn)生相應(yīng)的5-甲基-2-哌啶酮內(nèi)酰胺(5-MPPD)，產(chǎn)量高達(dá)96％(表7)
表7溫度 4-CPA銨鹽 [NH4OH] 重量％ 時(shí)間 4-CPA 5-MPPD(℃)(M)(M) Raney Ni (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)1601.0 05 2100 85.61601.0 2.0 5 3100 96.41801.0 2.0 5 2100 91.41801.0 3.0 5 2100 89.53-氰基丙酸(3-CPRA)或4-氰基丁酸(4-CBA)銨鹽(由酶水解相應(yīng)的α,ω-二腈產(chǎn)生)的水溶液的氫化作用分別產(chǎn)生相應(yīng)的2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)內(nèi)酰胺和2-哌啶酮內(nèi)酰胺，產(chǎn)量分別為91.0％和93.5％。4-氰基-4-戊烯酸(4-CPEA)銨鹽(由酶水解2-亞甲基戊二腈產(chǎn)生)的水溶液的氫化作用產(chǎn)生腈和碳-碳雙鍵的氫化作用而產(chǎn)生5-甲基-2哌啶酮，產(chǎn)量達(dá)85％。
為限制腈氫化成胺過(guò)程中的還原性烷基化而加過(guò)量的氨(如氫氧化銨)到氫化反應(yīng)中，也能發(fā)生幾種形成副產(chǎn)物的另外反應(yīng)(De Bellefon等，《英國(guó)科學(xué)回顧目錄》(Catal.Rev.Sci.Eng.),(1994)，第36卷，459-506)。從腈制備酰胺或羧酸的普通方法是在酸或堿催化劑存在下加熱腈混合水溶液，該方法在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。因此，在本發(fā)明所用的氫化作用條件下，可預(yù)期的單腈羧酸銨鹽的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)會(huì)是腈基的堿催化水解，而產(chǎn)生二羧酸單酰胺銨鹽或二羧酸二銨鹽。在氫化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生了這些不需要的酰胺/酸和二羧酸銨鹽副產(chǎn)物，但是與內(nèi)酰胺的產(chǎn)量相比較，它們的產(chǎn)量非常低。
在存在的過(guò)量氨和產(chǎn)物內(nèi)酰胺之間的第二個(gè)形成副產(chǎn)物的反應(yīng)可能產(chǎn)生內(nèi)酰胺和預(yù)期的氨解產(chǎn)物即ω-氨基羧酰胺的平衡混合物。在本反應(yīng)條件下得到高產(chǎn)量的五元和六元環(huán)內(nèi)酰胺表明內(nèi)酰胺產(chǎn)物的氨解作用(或堿催化水解)不明顯。
除了從脂肪族α,ω-二腈中產(chǎn)生內(nèi)酰胺外，在4-CPA或3-CPA銨鹽水溶液的氫化作用中，通過(guò)甲胺對(duì)氨的取代反應(yīng)制備N-甲基-內(nèi)酰胺。將1～4當(dāng)量的甲胺(質(zhì)子化胺的pKa為10.62)加到含有1當(dāng)量銨離子(pKa 9.25)的4-CPA水溶液中預(yù)計(jì)產(chǎn)生明顯數(shù)量的游離氨(由于在水中質(zhì)子化甲胺和銨離子的pKa相對(duì)差異)。然后這種游離氨與參與在腈基的氫化作用過(guò)程中產(chǎn)生的中間體亞胺反應(yīng)的非質(zhì)子化甲胺競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致產(chǎn)生分別為5-氨基-4-甲基戊酸銨鹽和5-N-甲基氨基-4-甲基戊酸銨鹽的混合物，結(jié)果環(huán)化分別產(chǎn)生5-MPPD和1,5-二甲基-2-哌啶酮(1,5 DMPD)。
已發(fā)現(xiàn)由1.0M 4-CPA銨鹽水溶液氫化作用產(chǎn)生的5-MPPD和1,5-DMPD的相對(duì)產(chǎn)量依賴于所選用的催化劑。Raney鎳和氫化鋁上的釕分別產(chǎn)生作為主要的內(nèi)酰胺產(chǎn)物的5-MPPD，甚至在3.0M甲胺存在下也是如此，而在相同的甲胺濃度下用5％Pd/C或4.5％Pd/0.5％Pt/C作催化劑時(shí)，1,5-DMPD是主要的產(chǎn)物。當(dāng)用5％Pd/C作催化劑時(shí)，1,5-DMPD的產(chǎn)量隨著甲胺濃度的增加而增加(表8)。
用Pd/C催化劑在140℃下，在1.0M 3-CPA銨鹽水溶液氫化作用中，2.0M甲胺對(duì)氨的取代分別產(chǎn)生了4-乙基-1-甲基吡咯烷-2-酮(4-EMPRD)和4-EPRD，產(chǎn)量分別為69.8％和20.4％，轉(zhuǎn)化率為96％。
表8溫度 4-CPA(NH4+)CH3NH2催化劑 時(shí)間4-CPA 1,5-DMPD5-MPPD(℃) (M) (M) (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)1601.0 3.0 Ra-Ni2 10019.2 68.51601.0 3.0RuAl2O32 10019.0 63.51401.0 3.0 Pd/C 2 9983.4 01601.0 1.0 Pd/C 2 10053.5 01601.0 1.25Pd/C 2 10068.3 01601.0 1.5 Pd/C 2 10076.4 01601.0 2.0 Pd/C 2 10081.5 01601.0 3.0 Pd/C 2 10081.7 7.81601.0 4.0 Pd/C 2 10088.4 1.91801.0 3.0 Pd/C 2 9773.0 6.61601.4 2.3 Pd/Pt/C2 9994.0 3.1
優(yōu)選的實(shí)施例方案描述方法和材料用作制備ω-腈基羧酸的微生物催化劑分離到了兩種微生物用作微生物催化劑以把脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的ω-腈基羧酸，這些微生物是敏捷食酸菌72W(ATCC55746)和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)。
從在得克薩斯州Orange收集的土壤中分離到了敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)。標(biāo)準(zhǔn)的富集步驟用下列培養(yǎng)基進(jìn)行(E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH7.2)E2基本培養(yǎng)基 g/LKH2PO 1.4NaH2PO40.69檸檬酸鈉 0.1CaCl2·2H2O 0.025KCl 0.5NaCl 1.0MgSO4·7H2O 0.5FeSO4·7H2O 0.05CoCl2·6H2O 0.01MnCl2·4H2O 0.001ZnCl20.0005NaMoO4·2H2O 0.0025NiCl2·6H2O 0.01CuSO4·2H2O 0.005生物素 0.0002葉酸0.0002鹽酸吡哆醇 0.001核黃素 0.0005鹽酸硫胺素 0.00005煙酸0.0005泛酸0.0005維生素B120.00001對(duì)氨基苯甲酸0.0005
將下列補(bǔ)充物加到E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以進(jìn)行上述的富集過(guò)程菌株 富集的氮源 其它補(bǔ)充物敏捷食酸菌72W 0.2％(v/v)乙基琥珀腈 0.3％(v/v)甘油最初篩選菌株在加濃的腈培養(yǎng)基上根據(jù)生長(zhǎng)情況和產(chǎn)生的氨進(jìn)行。分離體通過(guò)重復(fù)過(guò)BactoBrain Heart Infusion Agar(Difco,Detroit,Michigan)、接著從富集的腈中篩選產(chǎn)生的氨而純化。純化的菌株用革蘭氏陰性測(cè)試板、在Biolog測(cè)試系統(tǒng)(Hayward,CA，美國(guó))上，根據(jù)它們的碳源利用特點(diǎn)加以鑒別。
為測(cè)定腈水解活性，將含10g/L葡萄糖的E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)敏捷食酸菌72W。給培養(yǎng)基補(bǔ)加25mM(±)-2-甲基戊二腈。給10ml體積的補(bǔ)充E2培養(yǎng)基接種0.1ml冷凍貯存培養(yǎng)物。在搖床上以250rpm、室溫(22-25℃)下生長(zhǎng)過(guò)夜后，將10ml接種物加到在2L培養(yǎng)瓶的990ml新鮮培養(yǎng)基中。以引起培養(yǎng)基中氣泡形成的足夠高的速度搖動(dòng)，室溫下培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。細(xì)胞通過(guò)離心收集，用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)/15％甘油洗滌一次，將濃縮的細(xì)胞糊狀物立即在于冰上冷凍并貯存在-65℃下。將10mM己二腈也用在1升發(fā)酵液中。經(jīng)16-20小時(shí)的生長(zhǎng)后停止發(fā)酵。細(xì)胞懸液冷卻到4℃，離心收獲細(xì)胞，用含15％甘油的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌一次后，將細(xì)胞在-60℃冷凍。將解凍的細(xì)胞糊狀物用于檢測(cè)腈水解活性。所需要的微生物特性是能區(qū)域特異地攻擊二腈化合物而不干擾酰胺酶活性的腈水解活性。微生物容易發(fā)生突變。某些突變可能對(duì)所需的腈基轉(zhuǎn)變是有利的。因此，甚至天然菌株的突變株可能用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
將標(biāo)準(zhǔn)富集程序步驟也用于睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D，該菌用E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH7.2，將該培養(yǎng)基由上述標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的維生素濃度的十分之一來(lái)修飾。下列補(bǔ)充物加到修飾過(guò)的E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以進(jìn)行富集過(guò)程菌株 富集氮源其它補(bǔ)充物睪丸酮叢毛單胞菌2-甲基戊二酰胺甘油(0.6％)5-MGAM-4D (MGAM；1.0％w/v)
最初篩選菌株在加濃的腈基酰胺培養(yǎng)基上根據(jù)生長(zhǎng)的情況進(jìn)行。用以上培養(yǎng)基、通過(guò)重復(fù)過(guò)瓊脂板而純化分離物。純化的菌株根據(jù)它們的碳源利用特點(diǎn)，用革蘭氏陰性測(cè)試板在Biolog測(cè)試系統(tǒng)(Hayward,CA，美國(guó))上進(jìn)行。
為測(cè)定腈水解活性，將含6.0g/L葡萄糖或甘油修飾過(guò)的E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞材料。給培養(yǎng)基添加1.0％MGAM。用一個(gè)250ml非隔板式搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，其中含50ml補(bǔ)充過(guò)的E2培養(yǎng)基，用0.2ml的冷凍貯存培養(yǎng)物接種，在搖床上以200rpm速度、在30℃下培養(yǎng)72小時(shí)。細(xì)胞通過(guò)離心收集，用10ml的20mM KH2PO4(pH 7.0)洗滌。在含20mMKH2PO4(pH7.0)和0.1M的甲基戊二腈或甲基戊二酰胺的10ml反應(yīng)液中，用HPLC技術(shù)從區(qū)域特異性水解作用方面篩選細(xì)胞。所需的微生物特性是能區(qū)域特異攻擊二腈化合物而不干擾酰胺酶活性的腈水解活性。微生物容易發(fā)生突變。某些突變可能對(duì)所需的腈基轉(zhuǎn)變是有利的。因此，甚至天然菌株的突變株可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
本發(fā)明不局限于上面提到的具體生物，而是包括應(yīng)用保留所需特性的變異株和其突變株。通過(guò)已知的各種方法如X-射線輻射、紫外線輻射和化學(xué)誘變劑，上述變異株和突變株能從親本菌株中產(chǎn)生。
為產(chǎn)生生物催化劑以闡明方法(實(shí)施例1-26)，可用下列培養(yǎng)基。菌株培養(yǎng)基72-PF-15Lauria-Bertani培養(yǎng)基(Bacto胰化白胨，10g/L+Bacto酵母提取物，5g/L+NaCl,10g/L)+0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉72W E2+1％(w/v)葡萄糖+0.4％(w/v)己二酰二胺5-MGAM-4D E2+1％(w/V)葡萄糖+0.2％(w/v)丙酰胺為啟動(dòng)生長(zhǎng)，給10ml合適的培養(yǎng)基用0.1ml冷凍貯存培養(yǎng)物進(jìn)行接種。在28℃、250rpm搖動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)夜后，將生長(zhǎng)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到在2L培養(yǎng)瓶中的1L的相同培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u動(dòng)繼續(xù)生長(zhǎng)。然后將1L生長(zhǎng)細(xì)胞懸液加到在10L發(fā)酵罐中的9L相同培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長(zhǎng)。發(fā)酵罐的參數(shù)條件是≥80％氧飽和度、25℃、pH7.2、300-1000rpm。20～91小時(shí)后，將發(fā)酵罐冷卻到8～12℃，加甘油至終濃度為10％。細(xì)胞材料通過(guò)離心收獲。將濃縮的糊狀細(xì)胞立即在干冰上冷凍，到使用前一直貯存在-70℃。在E2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中針對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，用作碳源和氮源的許多其它補(bǔ)充物在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知?？梢詫⑦@些以及復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基用于產(chǎn)生生物催化劑。不能認(rèn)為上面所述的具體培養(yǎng)基是限制性的。
缺乏腈水合酶活性的敏捷食酸菌72W突變株的篩選在2-MGN水解成4-CPA過(guò)程中，將具有減低產(chǎn)生不合需要的2-甲基戊二酸副產(chǎn)物能力的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)突變株以不能利用2-MGN作碳和能源的特點(diǎn)為依據(jù)篩選出來(lái)。具體而言，將生長(zhǎng)在LB/琥珀酸鹽培養(yǎng)基(1％(w/v)Bacto-胰化蛋白胨(Difco,Detroit,Michigan，美國(guó)),0.5％(w/v)Bacto-酵母提取物(Difco),1％(w/v)NaCl,0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉)中的敏捷食酸菌72W過(guò)夜培養(yǎng)物與100μg/ml誘變劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍接觸約30分鐘。這導(dǎo)致培養(yǎng)物中活細(xì)胞降低99.9％。將誘變過(guò)的細(xì)胞在無(wú)菌的1M磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.2)中離心而洗去誘變劑。將洗滌過(guò)的細(xì)胞重新懸浮在LB/琥珀酸鹽培養(yǎng)基中并在30℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。然后，將細(xì)胞在無(wú)菌的50mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.2)中離心洗滌，重新懸浮在含0.2％(v/v)2-甲基戊二腈和抗生素環(huán)絲氨酸(0.2mg/ml)哌拉西林(40μg/ml)的E2極限培養(yǎng)基(沒(méi)有葡萄糖)中。將細(xì)胞在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜并重新在無(wú)菌的50mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH7.2)中洗滌。將洗滌過(guò)的細(xì)胞鋪展在含非選擇培養(yǎng)基的瓊脂平板上，培養(yǎng)基即為E2極限培養(yǎng)基(沒(méi)有葡萄糖)，添加以0.2％(v/v)2-甲基戊二腈和0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉，鋪皿的濃度為每平板40-100個(gè)菌落形成單位。將平板在30℃下溫育約48h，以使菌落形成。將形成的菌落影印到含選擇培養(yǎng)基E2極限培養(yǎng)基(沒(méi)有葡萄糖)添加0.2％(v/v)2-MGN的瓊脂平板上。將平板在30℃下約溫育48h，以使菌落形成。具有所需特性的突變體不能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。因此，48h后比較影印過(guò)的平板，將顯示為僅在非選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株保存作進(jìn)一步測(cè)定。
從89個(gè)平板中檢查了共約5,120個(gè)菌落，鑒別出了19個(gè)具有所需特性的菌株。這些突變菌株在液體的E2極限培養(yǎng)基(沒(méi)有葡萄糖)添加0.2％(v/v)2-MGN中生長(zhǎng)以作進(jìn)-步測(cè)定。將顯示為在這種培養(yǎng)基中少量或沒(méi)有生長(zhǎng)的菌株在由E2極限培養(yǎng)基(沒(méi)有葡萄糖)添加0.2％(v/v)2-MGN和0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉組成的液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)過(guò)程中，篩選它們產(chǎn)生2-甲基戊二酸的能力。該方法的結(jié)果是，將兩種突變株、鑒定為敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)選為進(jìn)一步開發(fā)利用，因?yàn)樗鼈儤O大地減少了產(chǎn)生2-甲基戊二酸的能力。
脂肪族α,ω-二腈的水解反應(yīng)含脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的水溶液通過(guò)相應(yīng)的脂肪族α,ω-二腈與合適的酶催化劑(在上述A部分確認(rèn))水懸液混合而制備。不用任何預(yù)處理，可將完整的微生物細(xì)胞用作催化劑?？晒┻x擇的方法有，可將它們固定在聚合物基質(zhì)(如藻酸鹽珠或聚丙烯酰胺凝膠(PAG)顆粒)中或不溶性的固體支持物(如硅藻土)上，以便于回收和重新利用催化劑。把細(xì)胞固定在聚合物基質(zhì)中或不溶性固體支持物上的方法已廣泛報(bào)道且在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。也可將腈水解酶或者腈水合酶和酰胺酶從整個(gè)細(xì)胞中分離并直接用作催化劑，或把酶固定在聚合物基質(zhì)中或不溶性的支持物上。這些方法也已廣泛報(bào)道且在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中眾所周知。
在本發(fā)明中用作起始原料的某些脂肪族α,ω-二腈僅是中度水溶性的。它們的溶解度也依賴于水相中溶液的溫度和鹽濃度(緩沖液和/或ω-腈基羧酸銨鹽)。例如，將己二腈確定為溶解度的極限約為0.60M(25℃,20mM磷酸鹽緩沖液，pH7)，在相同的條件下，將2-甲基戊二腈確定為溶解度的極限約為0.52M。在這種情況下，產(chǎn)生比起始的α,ω-二腈溶解度極限更大濃度的ω-腈基羧酸銨鹽的水溶液是使用開始時(shí)包括兩相的反應(yīng)混合物實(shí)現(xiàn)的，兩相是指含酶催化劑和溶解的α,ω-二腈的水相和有機(jī)相(不溶解的α,ω-二腈)。隨著反應(yīng)進(jìn)行，二腈溶于水相中，最后得到了單一相的產(chǎn)物混合物。
在反應(yīng)混合液中，酶催化劑的濃度依賴于酶催化劑的特殊性催化活性和選擇獲得所需的反應(yīng)速率。用作水解反應(yīng)催化劑的微生物細(xì)胞的濕細(xì)胞重量一般范圍為每ml總反應(yīng)體積0.001克～0.100克濕細(xì)胞，優(yōu)選的范圍是每ml 0.002克～0.050克濕細(xì)胞。用已知重量的微生物細(xì)胞催化劑、通過(guò)測(cè)定25℃下把0.10M二腈底物溶液轉(zhuǎn)變成所需的ω-腈基羧酸產(chǎn)物的速率來(lái)確定微生物細(xì)胞的比活性(IU/克濕細(xì)胞wt.)。將酶活性的一個(gè)IU(國(guó)際單位)定義為每分鐘把1微摩爾底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶活性的量。
選定的水解反應(yīng)溫度使反應(yīng)速度和酶催化劑活性穩(wěn)定性最優(yōu)化。反應(yīng)溫度的范圍可恰在懸液冷凍點(diǎn)(約0℃)以上至60℃，優(yōu)選的反應(yīng)溫度范圍為5℃～35℃。微生物細(xì)胞催化劑懸液可通過(guò)把細(xì)胞懸浮在蒸餾水中來(lái)制備，或者通過(guò)懸浮在維持反應(yīng)起始pH5.0～10.0，優(yōu)選的為6.0～8.0的緩沖水溶液中來(lái)制備。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，由于從二腈的相應(yīng)腈基功能形成羧酸銨鹽，所以反應(yīng)混合液的pH可能會(huì)變化。不用控制pH，反應(yīng)能進(jìn)行到完全轉(zhuǎn)變二腈，或者在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中加合適的酸或堿而維持所需的pH。
在α,ω-二腈完全轉(zhuǎn)變的產(chǎn)物混合物中，脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的最終濃度可從0.001M到脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的溶解度極限。從代表性而言，ω-腈基羧酸銨鹽的濃度范圍為0.10M～2.0M。酶催化劑通過(guò)離心和/或過(guò)濾回收后，可將水解反應(yīng)的產(chǎn)物混合物直接用于后續(xù)的氫化反應(yīng)中。通過(guò)用濃鹽酸調(diào)整反應(yīng)混合液的pH為2.0～2.5，用氯化鈉飽和生成溶液以及用合適的有機(jī)溶劑、如乙酸乙酯、乙醚、或二氯甲烷提取ω-腈基羧酸的方法，也可將ω-腈基羧酸從產(chǎn)物混合物中(除去催化劑后)分離出來(lái)。然后，將有機(jī)提取物合并，用合適的干燥劑(如硫酸鎂)攪拌，過(guò)濾，除去溶劑(如，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)，以高產(chǎn)量和高純度(代表性純度為98-99％)地產(chǎn)生所需的產(chǎn)物。如果需要，可將產(chǎn)物進(jìn)一步通過(guò)重結(jié)晶法或蒸餾法純化。
ω-腈基羧酸銨鹽的氫化作用/環(huán)化作用催化氫化作用是從脂肪族腈制備脂肪族胺的優(yōu)選方法。在本發(fā)明中，將在氫化作用過(guò)程中產(chǎn)生的ω-氨基羧酸環(huán)化成相應(yīng)的五元或六元環(huán)內(nèi)酰胺。ω-腈基羧酸銨鹽的水溶液(通過(guò)對(duì)酶水解相應(yīng)的脂肪族α,ω-二腈而產(chǎn)生的含水產(chǎn)物混合物的離心和過(guò)濾制備)首先和濃縮的氫氧化銨及水混合，以產(chǎn)生含1～4個(gè)化學(xué)計(jì)量當(dāng)量的所加氫氧化銨的溶液。加氫氧化銨是限制在氫化作用過(guò)程中由產(chǎn)物ω-氨基羧酸引起的ω-腈基羧酸的還原性烷基化作用。相對(duì)于在反應(yīng)混合液中存在的ω-腈基羧酸的數(shù)量，2～3倍化學(xué)計(jì)量上過(guò)量的氫氧化銨是優(yōu)選的用量，可獲得所需內(nèi)酰胺的最適產(chǎn)量?？蛇x擇的是，氨氣也能替代加到反應(yīng)混合液中的氫氧化銨。在氫化作用反應(yīng)混合液中，ω-腈基羧酸銨鹽的初始濃度范圍可以為5～20溶液重量百分比，優(yōu)選的范圍為7.5～12.5重量百分比。
為制備N-甲基內(nèi)酰胺，用甲胺替代氫氧化銨或氨，相對(duì)于在反應(yīng)混合液中存在的ω-腈基羧酸的數(shù)量，使用濃度為1～4個(gè)化學(xué)計(jì)量當(dāng)量。為獲得所需的N-甲基內(nèi)酰胺的最適產(chǎn)量，相對(duì)于在反應(yīng)混合液中存在的ω-腈基羧酸的數(shù)量，3～4倍化學(xué)計(jì)量上過(guò)量的甲胺是優(yōu)選的用量。
然后，向上述的氫化作用反應(yīng)混合液中加以合適的氫化反應(yīng)催化劑，將生成的混合物在壓力下和氫氣一起加熱而把ω-腈基羧酸銨鹽轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的五元或六元環(huán)內(nèi)酰胺。適用于本目的的氫化作用催化劑包括(但不局限于)各種鉑類金屬，如依、鋨、銠、釕、鉑和鈀，還有各種其它的過(guò)渡金屬如鈷、銅、鎳和鋅。催化劑可能沒(méi)有支持物(例如Raney鎳或氧化鉑)，或者可能是有支持物的(例如，在碳上的鈀，在氧化鋁上的鉑，或在硅藻土上的鎳)。
所用的氫化作用催化劑為在所選擇的反應(yīng)條件下足以得到所需的反應(yīng)速度和起始原料的總轉(zhuǎn)化率的最低濃度。這種濃度容易由試驗(yàn)確定。所用的催化劑的量，以催化劑的重量份表示為每100份用于反應(yīng)的ω-腈基羧酸中占0.001～20或更多份。代表性而言，上樣到反應(yīng)混合液中的催化劑為1％～10％(催化劑重量/ω-腈基羧酸重量)，上樣催化劑3％～5％為優(yōu)選的用量。在加有氨以產(chǎn)生內(nèi)酰胺所進(jìn)行的反應(yīng)中，Raney鎳(例如，促Cr-Raney鎳催化劑(Grace Davison Raney 2400活性金屬催化劑))是一種優(yōu)選的催化劑，而加有甲胺以產(chǎn)生N-甲基內(nèi)酰胺所進(jìn)行的反應(yīng)中，在碳上的5％或10％的鈀或在碳上的4.5％鈀/0.5％鉑是優(yōu)選的催化劑。
氫化反應(yīng)溫度和壓力變化很大。一般來(lái)說(shuō)，溫度范圍可為45℃～200℃，優(yōu)選的為70℃～180℃。一般來(lái)說(shuō)，氫氣壓力范圍從約大氣壓～100個(gè)大氣壓，優(yōu)選的為30～60個(gè)大氣壓。氫化作用在不調(diào)整反應(yīng)混合液pH的情況下進(jìn)行，一般來(lái)說(shuō)，加了過(guò)量的氫氧化銨、氨或甲胺后，pH為9～12。在這種pH范圍內(nèi)，準(zhǔn)確的pH值可通過(guò)加任一種合適的、非干擾的堿或酸來(lái)調(diào)整到所需的pH。合適的堿包括(但不局限于)氫氧化堿金屬、碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽，而合適的酸包括(但不局限于)鹽酸、硫酸或磷酸。
在水解反應(yīng)中微生物細(xì)胞催化劑的裂解或來(lái)自催化劑制備時(shí)存在的沾染物可能把抑制催化劑活性的化合物導(dǎo)入到氫化作用反應(yīng)混合液中(如硫醇類)。當(dāng)把經(jīng)微生物水解產(chǎn)生的ω-腈基羧酸銨鹽混合液的氫化作用與氫化作用前從水解產(chǎn)物混合物中分離和純化的相同的ω-腈基羧酸水溶液的氫化作用相比較時(shí)，未觀察到抑制或失活氫化作用催化劑的現(xiàn)象。
由先過(guò)濾混合液回收氫化作用催化劑的方法，可將內(nèi)酰胺或N-甲基內(nèi)酰胺容易地從氫化作用產(chǎn)物混合物中分離，然后將產(chǎn)物直接從生成的水濾液中蒸餾。在環(huán)化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的或加到反應(yīng)混合物中的氨也能用這種蒸餾法回收，循環(huán)使用，避免了作為廢產(chǎn)物的不合需要的無(wú)機(jī)鹽出現(xiàn)。內(nèi)酰胺或N-甲基內(nèi)酰胺也可通過(guò)下列方法回收過(guò)濾氫化作用混合液，用濃鹽酸調(diào)濾液的pH約為7并用氯化鈉飽和，用有機(jī)溶劑如乙酸乙酯、二氯甲烷或乙醚提取內(nèi)酰胺或N-甲基內(nèi)酰胺(水浴或連續(xù)提取)，然后通過(guò)蒸餾法或結(jié)晶法從有機(jī)提取液中回收。在所附的實(shí)施例中，報(bào)道用這種方法所分離的產(chǎn)量是非優(yōu)化的，該方法僅用于得到純化產(chǎn)物，以分析和確認(rèn)化學(xué)同一性。
在下列用作進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明但不局限于此的實(shí)施例中，脂肪族α,ω-二腈的％重獲率或在微生物水解反應(yīng)中形成的水解產(chǎn)物的％產(chǎn)量是根據(jù)在反應(yīng)混合液中存在的α,ω-二腈的初始數(shù)量得到(除非別處注明)并用折射率檢測(cè)儀和Supelcosil LC-18-DB柱(25cm×4.6mm直徑)或Bio-Rad HPX-87H柱(30cm×7.8mm直徑)的高壓液相色譜法測(cè)定。由ω-腈基羧酸銨鹽水溶液的氫化作用產(chǎn)生的內(nèi)酰胺和N-甲基內(nèi)酰胺的產(chǎn)量是依據(jù)在反應(yīng)混合液中存在的ω-腈基羧酸銨鹽的初始濃度得到(除非別處注明)并用DB-1701毛細(xì)管柱(30m×0.53mm ID,1微米膜厚)的氣相色譜法測(cè)定。
實(shí)施例14-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞(冷凍前預(yù)先50℃熱處理1h)0.60克(濕細(xì)胞重量)放入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加12ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。將細(xì)胞融化和懸浮后，將生成的懸液離心并丟棄上清液。將生成的細(xì)胞沉淀重懸浮在總體積12ml的相同磷酸鹽緩沖液中。將重0.1081g(0.114ml,1.00mmol,0.100M)的2-甲基戊二腈加入到第二支15ml的聚丙烯離心管中，然后加9.89ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的細(xì)胞懸液(0.494g細(xì)胞溫重量)，將生成的懸液在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上27℃時(shí)混合。吸取樣品(0.300ml)并離心，然后把0.180ml的上清液放入MilliporeUltrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750MN-甲基丙酰胺水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。加足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約2.5，過(guò)濾生成的溶液，用HPLC分析。1.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為99.3％和0.7％，沒(méi)有剩余2-甲基戊二腈。
實(shí)施例2(比較性的)4-氰基戊酸(銨鹽)用在冷凍前沒(méi)有在50℃被熱處理1h的敏捷食酸菌72W(ATCC55746)細(xì)胞重復(fù)在實(shí)施例1中描述的步驟。1.0b后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為62.7％和34.6％，沒(méi)有剩余2-甲基戊二腈。
實(shí)施例34-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞(在冷凍前預(yù)先在50℃熱處理1h)1.136克(細(xì)胞濕重量)放入一支50ml的聚丙烯離心管中，接著加21.6ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。將細(xì)胞融化懸浮后，離心生成的懸液并丟棄上清液。將生成的細(xì)胞沉淀重懸浮于總體積22.7ml的相同磷酸鹽緩沖液中。將重0.4355g(0.458ml,4.00mmol,0.403M)的2-甲基-戊二腈加入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加9.54ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞懸液(0.477g細(xì)胞濕重量)，將生成的懸液在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上27℃時(shí)混合。用蒸餾水按1∶4稀釋樣品(0.300ml)，然后離心，將0.180ml上清液放入MilliporeUltrafree MC濾膜裝置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750MN-甲基丙酰胺水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。加足量的1.0MHCl，把樣品的pH降低到約2.5，過(guò)濾生成的溶液并用HPLC分析。4.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為99.4％和0.6％，沒(méi)有剩余2-甲基戊二腈。
實(shí)施例44-氰基戊酸(銨鹽)除了在一支15ml的聚丙烯離心管中將1.086g(1.143ml,10.04mmol，兩相反應(yīng)，1.00M產(chǎn)物)的2-甲基戊二腈和8.86ml的熱處理敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞懸液(0.443g細(xì)胞濕重量)在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上27℃時(shí)混合外，重復(fù)實(shí)施例3中所描述的步驟。用蒸餾水按1∶10稀釋樣品(0.300ml)，然后離心，將0.180ml的上清液放入MilliporeUltrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750MN-甲基丙酰胺(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。加足量的1.0M HCl，把樣品的pH降低到約2.5，過(guò)濾生成的溶液并用HPLC分析。15.25h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為98.7％和1.3％，沒(méi)有剩余2甲基戊二腈。
實(shí)施例54-氰基戊酸(銨鹽)用沒(méi)有在50℃熱處理1h的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸液重復(fù)在實(shí)施例1中描述的步驟。3.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為96.8％和3.6％，沒(méi)有剩余2-甲基戊二腈。
實(shí)施例64-氰基戊酸(銨鹽)用沒(méi)有在50℃熱處理1h的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸液重復(fù)在實(shí)施例3中所描述的步驟。將0.4355g(0.458ml,4.00mmol,0.403M)的2-甲基戊二腈和9.54ml的敏捷食酸菌突變株72-PF-15細(xì)胞懸液(0.477g細(xì)胞濕重量)的混合液在一支15ml聚丙烯離心管中于旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上27℃時(shí)混合。6.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為98.8％和1.2％，沒(méi)有剩余2-甲基戊二腈。
實(shí)施例74-氰基戊酸(銨鹽)用沒(méi)有在50℃熱處理1h的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸液重復(fù)實(shí)施例4中所描述的步驟。將1.086g(1.143ml,10.04mmol,1.00M)的2-甲基戊二腈和8.86ml的敏捷食酸菌突變株72 PF-15(ATCC 55747)細(xì)胞懸液(0.443g細(xì)胞濕重量)的混合液在一支15ml的聚丙烯離心管中在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上于27℃時(shí)混合。15.25h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為99.2％和0.8％，沒(méi)有剩余2-甲基戊二腈。
實(shí)施例84-氰基戊酸的分離將重150g(細(xì)胞濕重量)的冷凍敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞(冷凍前未預(yù)先在50℃熱處理1h)加入到一個(gè)裝備有磁攪拌棒的2L的三角燒瓶中。然后加磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)至總體積1.50L。細(xì)胞被融化和懸浮后，將生成的懸液在水浴中加熱至50℃1h，然后在冰/水浴中冷卻到10℃，離心，丟棄上清液。形成的細(xì)胞沉淀通過(guò)重懸浮在1.50L同樣的磷酸鹽緩沖液中、接著離心的方法洗滌一次。將洗滌過(guò)的細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝備有磁攪拌棒的4L的三角燒瓶中，然后懸浮在總體積2.5L的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中。隨著攪拌的同時(shí)，加129.6g(136.4ml,1.20mol,0.400M)的2-甲基戊二腈，用同樣的磷酸鹽緩沖液把終體積調(diào)整到3.00L。在25℃下攪拌混合液，在一定的時(shí)間間隔吸取樣品并用HPLC分析。21.5h后，4-氰基戊酸(4-CPA)和2-甲基戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為99.5％和0.5％，沒(méi)有剩余的2-甲基戊二腈。
離心反應(yīng)混合液，回收細(xì)胞沉淀以作重新使用，將形成的上清液傾析并用Amicon 2.5L備有YM-10濾膜(10K MWCO)的濾膜裝置過(guò)濾。將濾液放入4.0L的燒瓶中，用6N HCl調(diào)溶液的pH至2.5。然后在溶液中一邊攪拌一邊加入氯化鈉，直到飽和為止，將1.0L部分的生成溶液用4×500ml乙醚提取。將合并的乙醚提取液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器把溶液濃縮到1.0L。然后，在溶液中加入1.2L己烷和0.200ml乙醚，將產(chǎn)生的溶液冷卻到-78℃。將生成的白色結(jié)晶固體通過(guò)快速真空過(guò)濾并用300ml冷(5℃)己烷洗滌而分離出來(lái)。在高真空下(150毫托)移去殘留的溶劑，產(chǎn)生了120.3g(分離產(chǎn)量79％)的4-氰基戊酸(熔點(diǎn)31.9-32.6℃)。
實(shí)施例94-氰基戊酸(銨鹽)將從實(shí)施例8回收的細(xì)胞沉淀重新用在幾個(gè)連續(xù)的3.0L批反應(yīng)中，以把2-甲基戊二腈水解成4-氰基戊酸銨鹽。在2-甲基戊二腈的濃度大于0.400M、超過(guò)了二腈在細(xì)胞水懸液中的溶解度時(shí)，這些反應(yīng)作為兩相的水/有機(jī)混合物進(jìn)行，直到剩余的2-甲基戊二腈能溶在反應(yīng)混合液中為止。下表列出了產(chǎn)生的4-CPA銨鹽的最終濃度和4-CPA及2-甲基戊二酸的產(chǎn)量百分比。根據(jù)細(xì)胞催化劑的干重(1克濕重=0.20克干重)計(jì)，每克干重的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)產(chǎn)生了86g 4-CPA。
時(shí)間 [4-CPA(NH4)] 4-CPA 2-MGArxn#(h) (M) (％產(chǎn)量)(％產(chǎn)量)1 23 0.40 99.50.52 22 0.40 99.10.93 46 1.00 99.20.84 50 1.00 99.40.65 99 1.85 98.81.26 261 2.00 98.91.1實(shí)施例103-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷凍前預(yù)先在50℃下熱處理1h)0.60克(細(xì)胞濕重)放入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加入10ml磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。將細(xì)胞融化且懸浮后，離心形成的懸液，丟棄上清液。將產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀重新懸浮在總體積10ml的相同磷酸鹽緩沖液中。將重0.1080g(0.112ml,1.00mmol,0.100M)的2-乙基琥珀腈加入到第二支15ml聚丙烯離心管中，加8.00ml的敏捷食酸菌72W細(xì)胞懸液(0.5g細(xì)胞濕重)，用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整總體積至10.0ml，將生成的懸液在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上27℃時(shí)混合。吸取樣品(0.300ml)并離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml、0.750M的N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾生成的溶液并用HPLC分析。1.0h后，3-氰基戊酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例113-氰基戊酸(銨鹽)用0.4337g(0.449ml,4.01mmol,0.401M)的2-乙基琥珀腈和8.00ml的熱處理過(guò)的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞懸液(0.5g細(xì)胞濕重)，在總體積10.0ml溶液中(用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整)重復(fù)實(shí)施例10中所描述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶4稀釋并離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。8.0h后，3-氰基戊酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例123-氰基戊酸(銨鹽)用1.087g(1.13ml,10.1mmol，兩相反應(yīng)，1.01M產(chǎn)物)的2-乙基琥珀腈和8.00ml的熱處理過(guò)的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞懸液(0.5g細(xì)胞濕重)，在總體積10.0ml的溶液(用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整)中重復(fù)在實(shí)施例10中所描述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋并離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。71h后，3-氰基戊酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例133-氰基戊酸的分離在裝備有磁攪拌棒的4.0L三角燒瓶中，放入161g冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞(冷凍前預(yù)先在50℃下熱處理1h)和27℃的1.60L磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。隨著攪拌，將細(xì)胞融化并懸浮，然后，一邊攪拌，一邊加325g(336.0ml,3.00mole)的2-乙基琥珀腈，將混合液的總體積用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整到2.40L。形成的混合液在27℃攪拌，吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。183h后，3-氰基戊酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。離心反應(yīng)混合液，回收細(xì)胞沉淀，可重復(fù)使用，將產(chǎn)生的2.3L的上清液傾析并用裝備有YM-10濾膜(10KMWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過(guò)濾。在濾液中3-氰基戊酸銨鹽的濃度為1.26M。
將上述含1.26M 3-氰基戊酸銨鹽的300ml部分濾液用約60ml的6N HCl調(diào)pH至2.5，然后用氯化鈉飽和，用4×200ml的乙醚提取。將合并的有機(jī)提取液在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，通過(guò)在28℃、減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。將生成的略帶黃色的粘油物28℃下在高度真空(50毫托)下攪拌，以移去殘余的溶劑，然后冷卻到-20℃2-3h，而產(chǎn)生成為白色結(jié)晶固體的3-氰基戊酸(45.9g，產(chǎn)量96％)；熔點(diǎn)33.0～34.0℃。
實(shí)施例143-氰基戊酸(銨鹽)用沒(méi)有在50℃熱處理過(guò)的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC55747)的懸液，重復(fù)在實(shí)施例10中所述的步驟。1.0h后，3-氰基戊酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例153-氰基戊酸(銨鹽)用0.4325g(0.455ml,4.00mmol,6.400M)的2-乙基琥珀腈和8.00ml(0.5g細(xì)胞濕重)的沒(méi)有在50℃熱處理過(guò)的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸浮液，在總體積10.0ml溶液(用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整)中重復(fù)在實(shí)施例14中所描述的步驟。25h后，3-氰基戊酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例163-氰基戊酸(銨鹽)用1.087g(1.14ml,10.1mmol，兩相反應(yīng)，1.01M產(chǎn)物)的2-乙基琥珀腈和8.00ml(0.5g細(xì)胞濕重)的沒(méi)有在50℃熱處理過(guò)的敏捷食酸菌突變株72-PF 15(ATCC 55747)的懸液，在總體積10.0ml溶液(用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整)中重復(fù)實(shí)施例14中所描述的步驟。71h后，3-氰基戊酸的HPLC產(chǎn)量為76.6％，有25.1％剩余的2-乙基琥珀腈，未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例174-氰基-4戊烯酸的分離在裝備有磁攪拌棒的500ml的三角燒瓶中，放入50.0g冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞(冷凍前預(yù)先在50℃熱處理1h)和在27℃、450ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。隨著攪拌，將細(xì)胞融化并懸浮、然后離心、丟棄上清液。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在1.0L燒瓶中的總體積863ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中，然后在27℃下一邊攪拌一邊加133g(137.0ml,1.25mole)的2-亞甲基戊二腈。在2-亞甲基戊二腈的濃度大于0.400M、超過(guò)了二腈在細(xì)胞水懸液中的溶解度時(shí)，這些反應(yīng)以兩相水/有機(jī)混合液的方式進(jìn)行，一直進(jìn)行到剩余的2-亞甲基戊二腈可溶于反應(yīng)混合液中為止。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10比例稀釋，離心，然后將0.150ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)，和0.150ml的0.150M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。26h后，4-氰基-4-戊烯酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余的2-亞甲基戊二腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。離心反應(yīng)混合液，回收細(xì)胞沉淀以重新使用，將上清液用裝備有YM-10濾膜(10K MWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過(guò)濾。在濾液中4-氰基-4-戊烯酸銨鹽的最終濃度為1.298M。
將上述含有4-氰基-4-戊烯酸銨鹽產(chǎn)物混合物的100ml部分濾液用6N HCl調(diào)整到pH2.7，用氯化鈉飽和，用4×100ml乙醚提取。將合并的有機(jī)提取液在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，通過(guò)28℃減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器把合并提取液的體積降低到100ml。在乙醚溶液中加入200ml己烷，將生成的溶液冷卻到-78℃。生成的白色結(jié)晶固體由快速真空過(guò)濾法分離并用100ml冷(5℃)己烷洗滌。將殘留的溶劑在高真空(150毫托)下除去而產(chǎn)生9.80g(60％分離產(chǎn)量)的4-氰基-4-戊烯酸(熔點(diǎn)26.5-27.0℃，貯存在-20℃)。
實(shí)施例184-氰基-4-戊烯酸(銨鹽)從實(shí)施例17(敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞)回收的細(xì)胞沉淀在把2-亞甲基戊二腈水解成4-氰基-4-戊烯酸銨鹽的第二次連續(xù)的1.0L批反應(yīng)中重新使用。在2-亞甲基戊二腈的濃度大于0.400M、超過(guò)了二腈在細(xì)胞水懸液中的溶解度時(shí)，這些反應(yīng)以兩相水/有機(jī)相混合液的方式進(jìn)行，一直進(jìn)行到剩余的2-亞甲基戊二腈可溶在反應(yīng)混合液中為止。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在1.0L燒瓶中的總體積781ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中，然后在27℃下，一邊攪拌一邊加212g(219.0ml,2.00mole)的2-亞甲基戊二腈。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶20稀釋，離心，然后將0.150ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并與0.150ml的0.150M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾生成的溶液并用HPLC分析。53h后，4-氰基4-戊烯酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余2-亞甲基戊二腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例193-氰基丙酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷凍前預(yù)先在50℃熱處理1h)細(xì)胞0.50克(細(xì)胞濕重)放入一支15ml聚丙烯離心管中，接著加10ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。將細(xì)胞融化和懸浮后，離心形成的懸液，丟棄上清液。將產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀重新懸浮在總體積10ml的同樣磷酸鹽緩沖液中。在第二支15ml的聚丙烯離心管中放入溶在總體積8.0ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中的0.3236g(4.00mmol,0.400M)的琥珀腈，然后加2.00ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞懸液(0.10g細(xì)胞濕重)，將產(chǎn)生的懸液在27℃下、旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上混合。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶4比例稀釋，離心，然后將0.150ml的上清液被放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中，與0.015ml的0.1M HCl及0.150ml的0.100M丙酸的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾生成的溶液并用HPLC分析。3.0h后，3-氰基丙酸的HPLC產(chǎn)量為100％，沒(méi)有剩余的琥珀腈，也未觀察到其它副產(chǎn)物。
實(shí)施例203-氰基丙酸的分離在裝備有磁攪拌棒的500ml三角燒瓶中放入20.0g的冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞(冷凍前在50℃熱處理1h)和27℃下、200ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。隨著攪拌的同時(shí)，將細(xì)胞融化、懸浮、然后離心，丟棄上清液。重復(fù)該洗滌步驟。將生成的細(xì)胞沉淀重新懸浮在含101.1g(1.25mole,1.25M)的琥珀腈的總體積1.00L的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中，將產(chǎn)生的混合液在27℃下放在水浴中的1L燒瓶中攪拌。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，然后將0.150ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.015ml 0.1M HCl及0.150ml的0.100M丙酸水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。1.0h后，3-氰基丙酸和琥珀酸的HPLC產(chǎn)量分別為99.7％和0.3％，沒(méi)有剩余琥珀腈。離心產(chǎn)生的混合液，用裝備有YM-10濾膜(10KMWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過(guò)濾。在濾液中3-氰基丙酸的終濃度為1.31M。
將含有上述的3-氰基丙酸銨鹽產(chǎn)物混合物的200ml部分濾液用6NHCl調(diào)整至pH2.5，然后用氯化鈉飽和，用4×200ml乙醚提取。將合并的有機(jī)提取液在硫酸鎂上干燥、過(guò)濾，在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。將生成的無(wú)色油狀物溶于150ml乙醚中，然后加100ml己烷，把產(chǎn)生的溶液冷卻到-78℃。生成的白色結(jié)晶固體通過(guò)真空過(guò)濾法分離，在高真空下(150毫托)移去殘留的溶劑，可產(chǎn)生14.32g(55％分離產(chǎn)量)的3-氰基丙酸(熔點(diǎn)，49.5-51.0℃)。
實(shí)施例214-氰基丁酸(銨鹽)首先，冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷凍前預(yù)先在50℃熱處理1h)0.50克(細(xì)胞濕重)放入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加10ml磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。將細(xì)胞融化和懸浮后，離心產(chǎn)生的懸液，丟棄上清液。將產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀重新懸浮在總體積10ml的相同磷酸鹽緩沖液中。在第二支15ml的聚丙烯離心管中放入溶在總體積6.0ml磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中的0.3830g(4.03mmol,0.400M)戊二腈，然后加4.00ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞懸液(0.20g細(xì)胞濕重)，將產(chǎn)生的懸浮液在27℃、旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上混合。吸取樣品(0.100ml)，用水按1∶4稀釋，然后將0.150ml的上清液被放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中，與0.015ml 0.1M HCl及0.150ml的0.150M乙酸鉀水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液，用HPLC分析。4.0h后，4-氰基丁酸和戊二酸的HPLC產(chǎn)量分別為85.1％和8.2％，仍剩有5.7％戊二腈。
實(shí)施例224-氰基丁酸的分離在備有磁攪拌棒的250ml三角燒杯中放入15.0g冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細(xì)胞(冷凍前50℃熱處理1h)和27℃的135ml磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。隨著攪拌的同時(shí)，將細(xì)胞融化并懸浮，然后離心，丟棄上清液。重復(fù)該洗滌步驟。將產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀重新懸浮在總體積100ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中，將這種細(xì)胞懸液加入含有磁攪拌棒、42.78g(0.450mole)的戊二腈及157.2ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)的500ml燒瓶中。將產(chǎn)生的含有1.5M戊二腈的混合液在27℃下攪拌。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，離心。然后，將0.200ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中，與0.020ml的0.1M HCl及0.200ml的0.150M乙酸鉀水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。4.0h后，4-氰基丁酸銨鹽和戊二酸二銨鹽的HPLC產(chǎn)量分別為92.3％和7.7％，沒(méi)有剩余戊二腈。
離心反應(yīng)混合液，用備有YM-10濾膜(10K MWCO)的Amicon2.5L濾膜裝置過(guò)濾上清液。將含有上面所述的4-氰基丁酸銨鹽產(chǎn)物混合物的濾液用6N HCl調(diào)整至pH3.5，然后用氯化鈉飽和，用4×300ml乙醚提取。將合并的有機(jī)提取液在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，接著在真空下(100毫托)攪拌產(chǎn)生35.3g(62％產(chǎn)量)的以停止結(jié)晶的白黃色油狀物的4-氰基丁酸。固體在1∶1乙酸乙酯/己烷5℃下重新結(jié)晶(熔點(diǎn)，39.6-40.2℃)。
實(shí)施例235-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC55744)細(xì)胞(冷凍前預(yù)先在50℃熱處理1h)2.0克(細(xì)胞濕重)放入一支50ml的聚丙烯離心管中，接著加30ml磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)。將細(xì)胞融化和懸浮后，離心產(chǎn)生的懸液，丟棄上清液。將產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀重新懸浮在總體積30ml同樣的磷酸鹽緩沖液中。在第二支15ml的聚丙烯離心管中放入重0.1085g(0.114ml,1.00mmol,0.100M)的己二腈，然后加9.29ml的磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)和0.60ml的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)細(xì)胞懸液(0.040g細(xì)胞濕重)，將產(chǎn)生的懸液在27℃下、旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上混合。吸取樣品(0.300m1)，離心，然后將0.180ml的上清液被放入MilliporeUltrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，和0.020ml的0.750MN-乙基乙酰胺的水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合，足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約pH2.5。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。5.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰二胺、己二酸的HPLC產(chǎn)量為96.6％、1.7％、1.4％和0.3％，沒(méi)有剩余己二腈。
實(shí)施例245-氰基戊酸(銨鹽)用0.4338g(0.457ml,4.01mmol,0.401M)的己二腈和3.0ml熱處理過(guò)的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)細(xì)胞懸液(0.20g細(xì)胞濕重)，在總體積10.0ml的溶液中(用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整)重復(fù)實(shí)施例23中所描述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶4稀釋，離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，和0.020ml的0.750M N-乙基乙酰胺水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合，足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約pH2.5。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。5.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC產(chǎn)量為94.0％、4.0％、0.6％和1.4％，沒(méi)有剩余己二腈。
實(shí)施例255-氰基戊酸(銨鹽)用1.084g(1.14ml,10.0mmol，兩相反應(yīng)，1.00M產(chǎn)物)的己二腈和7.5ml熱處理過(guò)的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC55744)細(xì)胞懸液(0.50g細(xì)胞濕重)，在總體積10.0ml溶液中(用磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)調(diào)整)重復(fù)實(shí)施例23中所述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，和0.020ml的0.750M N-乙基乙酰胺水溶液(HPLC外標(biāo)準(zhǔn)溶液)混合，足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約2.5。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。24.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamicacid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC產(chǎn)量為90.0％、4.2％、0.0％和5.7％，沒(méi)有剩余的己二腈。
實(shí)施例265－氰基戊酸的分離在備有磁攪拌棒的2L三角燒瓶中放入在27℃1.72L磷酸鉀緩沖液(20mM,pH7.0)中的4.0g睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)細(xì)胞(預(yù)先在50℃熱處理1h)的懸液。然后，一邊攪拌，一邊往懸液中加入270.4g(284.3ml,2.5mole，約1.25M最終產(chǎn)物濃度)的己二腈，在27℃下攪拌產(chǎn)生的混合液。吸取樣品(0.200ml)，用水以1∶5稀釋，離心，然后將0.200ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，加足量的1.0M HCl，把樣品的pH降低到約pH2.5。過(guò)濾產(chǎn)生的溶液并用HPLC分析。63h后，水解反應(yīng)相當(dāng)緩慢，因此加另外的10.0g相同的微生物細(xì)胞催化劑到混合液中。86h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamicacid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC產(chǎn)量為88.2％、4.7％、6.6％和0.0％，沒(méi)有剩余己二腈。離心反應(yīng)混合物，用備有YM-10濾膜(10KMWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過(guò)濾上清液。
將上面所述的含有5-氰基戊酸銨鹽(1.13M)的200ml部分產(chǎn)物混合物濾液用6N HCl調(diào)整到pH2.5，然后用氯化鈉飽和，用4×200ml乙醚提取。將合并的乙醚提取液在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑.將殘留的乙醚通過(guò)室溫下高真空(60毫托)中攪拌無(wú)色的液體5h除去，而產(chǎn)生27.32g(95％分離產(chǎn)量)的5-氰基戊酸。然后，將5-氰基戊酸在110-112℃、真空下(75毫托)蒸餾而毫無(wú)分解。
實(shí)施例27來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的5-甲基-2-哌啶酮在100ml刻度量筒中放入54.4ml含有1.85M 4-氰基戊酸銨鹽(0.1摩爾濃度的4-氰基戊酸銨鹽，通過(guò)酶水解2-甲基戊二腈產(chǎn)生；實(shí)施例9，從反應(yīng)#5過(guò)濾產(chǎn)物混合液)的反應(yīng)混合物水溶液，然后加12.9ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3,0.2mole NH3)，將最終體積用蒸餾水調(diào)整至100ml。4-氰基戊酸銨鹽和加入的氫氧化銨的最終濃度分別為1.0M和2.0M。在產(chǎn)生的溶液中加入0.631g(5重量％/重量的4-氰基戊酸)的鉻促Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)，產(chǎn)生的混合液轉(zhuǎn)移到裝備有Dispersimax渦輪型推進(jìn)器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應(yīng)器充氮?dú)夂螅瑢⒎磻?yīng)器中的內(nèi)含物在500psig氫氣中以1000rpm攪拌并在160℃加熱3h。冷卻至室溫后，通過(guò)氣相色譜分析，最終反應(yīng)混合液顯示5-甲基-2-哌啶酮的產(chǎn)量為96.4％，沒(méi)有剩余4-氰基戊酸銨鹽。
過(guò)濾產(chǎn)物混合液以除去催化劑，然后用6N HCl調(diào)pH至6.0，用氯化鈉飽和。用100ml二氯甲烷提取產(chǎn)生的溶液5次，將合并的有機(jī)提取液在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，而產(chǎn)生無(wú)色的油狀物。在真空(0.1mmHg)中除去殘留的溶劑后，油狀物結(jié)晶形成白色固體，在-78℃下從150ml乙醚中重新結(jié)晶而產(chǎn)生6.69g(59％分離產(chǎn)量)的5-甲基2-哌啶酮(熔點(diǎn)55.5-56.2℃)。
實(shí)施例28來(lái)自4-氰基戊酸的5-甲基-2-哌啶酮用12.71g(0.100mole)的結(jié)晶4-氰基戊酸(來(lái)自實(shí)施例8描述的分離物)和19.34ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3,0.3mole NH3)，在總體積100ml溶液中重復(fù)實(shí)施例27所描述的反應(yīng)。4-氰基戊酸銨鹽和氨的最終濃度分別為1.0M和2.0M。用氣相色譜分析最終的反應(yīng)混合液顯示5-甲基-2-哌啶酮的產(chǎn)量為91.1％，沒(méi)有剩余4-氰基戊酸。
實(shí)施例29來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的5-甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來(lái)自實(shí)施例9、反應(yīng)#5的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、0～3.0M氫氧化銨和5重量％或10重量％(相對(duì)于4-氰基戊酸的重量)選自促Cr Raney鎳催化劑(Raney 2400)、5％在碳上的鈀、10％在碳上的鈀、5％在氧化鋁上的釕或10％在氧化鋁上的釕的氫化作用催化劑的5ml反應(yīng)混合物水溶液，其氫化作用在500psig氫氣、160或180℃下、在玻璃振搖器試管中進(jìn)行，測(cè)定了產(chǎn)生的相應(yīng)的5甲基-2-哌啶酮內(nèi)酰胺(5-MPPD)溫度 [NH4OH] 重量％ 時(shí)間 ％4-CPA 5-MPPD(℃) 催化劑(M)催化劑 (h) 轉(zhuǎn)化率(％)160 Raney 2400 0 5 2100 85.6160 Raney 2400 2.05 2100 96.4160 Raney 2400 3.05 2100 86.5160 5％Pd/C 2.05 210 0160 10％Pc/C 2.05 214 0160 5％Ru/Al2O32.0 5 215 0160 10％Ru/Al2O32.0 5 220 0180 Raney 24002.05 2100 91.4180 Raney 24003.05 2100 89.5實(shí)施例30來(lái)自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2酮在100ml刻度量筒中放入含1.26M 3-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的3-氰基戊酸銨鹽，由酶水解2-乙基琥珀腈產(chǎn)生；實(shí)施例13的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)的79.4ml反應(yīng)混合物水溶液，然后加12.9ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3,0.2mole NH3)，用蒸餾水調(diào)整最終體積至100ml。3-氰基戊酸銨鹽和加入的氫氧化銨的終濃度分別為1.0M和2.0M。在產(chǎn)生的溶液中加入0.631g(5重量％/重量的3-氰基戊酸)的促鉻Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)，將產(chǎn)生的混合液轉(zhuǎn)移到裝備有Disperimax渦輪型推進(jìn)器的300ml 314SS AutoclaveEngineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應(yīng)器充氮?dú)夂?，將反?yīng)器中的內(nèi)含物在500psig氮?dú)庀乱?000rpm攪拌并在160℃加熱4h。冷卻到室溫后，由氣相色譜分析最終反應(yīng)混合液顯示4-乙基吡咯烷-2-酮的產(chǎn)量為90.7％，沒(méi)有剩余3-氰基戊酸銨鹽。
實(shí)施例31來(lái)自3-氰基戊酸的4-乙基吡咯烷-2-酮用12.71g(0.100mole)的結(jié)晶3-氰基戊酸(來(lái)自實(shí)施例13所述的分離物)和19.34ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3,0.3mole NH3)，在總體積100ml的溶液中重復(fù)實(shí)施例30所述的反應(yīng)。3-氰基戊酸銨鹽和所加的氫氧化銨的最終濃度分別為1.0M和2.0M。用氣相色譜分析最終的反應(yīng)混合液(反應(yīng)時(shí)間2h)顯示4-乙基吡咯烷-2-酮的產(chǎn)量為92.1％，沒(méi)有剩余3-氰基戊酸。
過(guò)濾產(chǎn)物混合液以除去催化劑，然后用6N HCl調(diào)整pH到7.0，用氯化鈉飽和。用100ml二氯甲烷提取產(chǎn)生的溶液4次，將合并的有機(jī)提取液在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑，而產(chǎn)生無(wú)色的油狀物。在真空中(0.1mmHg)移去殘留的溶劑后，將油狀物溶在150ml的乙醚中，然后冷卻到-78℃。1h后，通過(guò)真空過(guò)濾法收集白色的已結(jié)晶的固體，而總共產(chǎn)生8.96g(79％分離產(chǎn)量)的4-乙基吡咯烷-2-酮(熔點(diǎn)40.5～41.5℃)。
實(shí)施例32除了用于氫化作用的溫度是140℃外，如上所述完全重復(fù)實(shí)施例30中所述的反應(yīng)。通過(guò)氣相色譜法分析的最終反應(yīng)混合物(4h反應(yīng)時(shí)間)顯示4-乙基吡咯烷-2酮的產(chǎn)量為87.2％，沒(méi)有剩余3-氰基戊酸。
實(shí)施例33來(lái)自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮除了應(yīng)用1.262g(10重量％/重量的3-氰基戊酸)的促鉻Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)外，準(zhǔn)確按照實(shí)施例30所描述的反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行。用氣相色譜分析最終的反應(yīng)混合液(反應(yīng)時(shí)間1.5h)顯示4-乙基吡咯烷-2-酮的產(chǎn)量為91.0％，沒(méi)有剩余3-氰基戊酸。
實(shí)施例34來(lái)自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮(溫度依賴性)含有1.0M 3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽(從實(shí)施例13來(lái)的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、2.0M氫氧化銨和5重量％或10重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)(相對(duì)于3-氰基戊酸的重量)的5ml反應(yīng)混合物水溶液的氫化作用在500psig氫氣和溫度從70℃-180℃下在玻璃振搖器試管中進(jìn)行2h，然后，用高壓液相色譜分析3-CPA的轉(zhuǎn)化率，用氣相色譜分析產(chǎn)生的4-乙基吡咯烷-2-酮溫度 3-CPA銨鹽 [NH4OH] 重量％ 時(shí)間3-CPA4-EPRD(℃)(M) (M)Raney Ni (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)70 1.0 2.0 52 7 1.5120 1.0 2.0 52 5522.7140 1.0 2.0 52 7155.4140 l.0 2.0 10 2 100 89.9160 1.0 2.0 52 100 90.1160 1.0 2.0 10 2 100 91.3180 1.0 2.0 52 100 86.1180 1.0 2.0 10 2 100 90.0實(shí)施例35來(lái)自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮(NH4OH濃度依賴性)含有1.0M 3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽(來(lái)自實(shí)施例13的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、0～3.0M氫氧化銨和5重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)(相對(duì)于3-氰基戊酸的重量)的5ml反應(yīng)混合物水溶液的氫化作用在500psig氫氣和160℃或180℃溫度下在玻璃振搖器試管中進(jìn)行2h，然后用高壓液相色譜分析3-CPA的轉(zhuǎn)化率，用氣相色譜分析產(chǎn)生的4-乙基吡咯烷-2-酮溫度 3-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％ 時(shí)間 3-CPA4-EPRD(℃) (M) (M) Raney Ni (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)1601.0 0 52 99 80.11601.0 1.0 52 99 87.61601.0 2.0 52 100 90.11601.0 3.0 52 100 85.41801.0 0 52 100 75.11801.0 1.0 52 100 85.81801.0 2.0 52 100 88.51801.0 3.0 52 100 90.0實(shí)施例36來(lái)自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮(3-CPA濃度依賴性)將分別含有1.0M、1.5M或2.0M的3-氰基戊酸(3-CPA)(從實(shí)施例13過(guò)濾產(chǎn)物混合液中分離)和2.0M、3.0M或4.0M氫氧化銨的5ml反應(yīng)混合物水溶液的氫化作用，用如5重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)(相對(duì)于3-氰基戊酸的重量)在500psig氫氣和160℃或180℃溫度下在玻璃振搖器試管中進(jìn)行2h，然后用高壓液相色譜分析3-CPA的轉(zhuǎn)化率，用氣相色譜分析產(chǎn)生的4-乙基吡咯烷-2-酮溫度 3-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％時(shí)間3-CPA4-EPRD(℃) (M) (M) Raney Ni(h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)1601.0 2.0 5 2 10090.11601.5 3.0 5 2 99 76.11602.0 4.0 5 2 99 80.01801.0 2.0 5 2 10088.51801.5 3.0 5 2 99 77.31802.0 4.0 5 2 99 84.1
實(shí)施例37來(lái)自5-氰基戊酸銨鹽的己內(nèi)酰胺將含有1.0M 5-氰基戊酸(5-CPA)銨鹽(從酶水解己二腈制備，來(lái)自實(shí)施例26的過(guò)濾產(chǎn)物混合液),0-2.5M氫氧化銨和5重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)(相對(duì)于5-氰基戊酸的重量)的5ml反應(yīng)混合物水溶液的氫化作用在500psig氫氣和70℃～160℃溫度下在玻璃振搖器試管中進(jìn)行2h，然后用高壓液相色譜分析5-CPA的轉(zhuǎn)化率，用氣相色譜分析產(chǎn)生的己內(nèi)酰胺溫度 5-CPA銨鹽 [NH4OH]時(shí)間 5-CPA 己內(nèi)酰胺(℃) (M) (M)(h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量)701.0 0 2 1000.7701.0 1.0 2 1000.7701.0 1.5 2940.8701.0 2.0 2840.8701.0 2.5 2990.8120 1.0 0 2990.9120 1.0 1.0 2 1000.9120 1.0 1.5 2971.01201.0 2.0 2971.11601.0 0 2972.51601.0 1.0 2842.31601.0 1.5 2973.01601.0 2.0 2952.7通過(guò)在70℃下5-CPA銨鹽的氫化作用而制備的含水產(chǎn)物混合物中(如上所述)6-氨基己二酸(6-ACA)銨鹽的環(huán)化由下列方法在較高溫度下設(shè)法實(shí)現(xiàn)首先用過(guò)濾法除去氫化作用催化劑，然后在280℃下，加熱約1.0M 6-ACA銨鹽反應(yīng)混合液2h溫度 6-ACA銨鹽(M) [NH4OH]時(shí)間 己內(nèi)酰胺(℃)(按上述方法制備) (M)(h) (％產(chǎn)量)2801.0 0 217.82801.0 1.0 217.22801.0 1.5 211.02801.0 2.0 2 9.02801.0 2.5 2 3.1實(shí)施例38來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的1,5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來(lái)自實(shí)施例9、反應(yīng)#5的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、3.0M甲胺和5重量％或10重量％(相對(duì)于4-氰基戊酸的重量)選自促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)、5％在碳上的鈀、5％在氧化鋁上的鈀、5％在氧化鋁上的釕、或在碳上的4.5％鈀/0.5％鉑的氫化作用催化劑的5ml反應(yīng)混合物水溶液，其氫化作用在500psig氫氣和160℃下，在玻璃振搖器試管中進(jìn)行2h，然后分析產(chǎn)生的1,5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)和5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)溫度 重量％ 時(shí)間 4-CPA 5-DMPD 5-MPPD(℃)催化劑 催化劑 (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量)160Raney 2400 5 2 10019.2 68.5160Raney 2400 10 2 10021.7 69.11605％Ru/Al2O35 2 10019.0 63.51605％Pd/C 5 2 99 81.7 7.81605％Pd/Al2O35 2 93 77.2 4.6160 4.5％Pd/0.5％Pt/C 5 2 97 77.8 6.2實(shí)施例39來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的1,5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來(lái)自實(shí)施例9、反應(yīng)#5的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、1.0M～3.0M甲胺和5重量％(相對(duì)于4-氰基戊酸的重量)的5％在碳上的鈀的5ml反應(yīng)混合物水溶液，其氫化作用在500psig氫氣和140℃下，在玻璃振搖器試管中進(jìn)行2h，然后分析產(chǎn)生的1,5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊二酸(2-MGA)溫度 時(shí)間 [CH3NH2]4-CPA 5-DMPD 5-MPPD2-MGA(℃) 催化劑 (h) (M)(％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量)140 5％Pd/C 21.0 100 53.3 00.7140 5％Pd/C 21.25 100 65.8 00.7140 5％Pd/C 21.599 74.5 00.8140 5％Pd/C 22.098 80.2 01.0140 5％Pd/C 23.099 83.4 01.1實(shí)施例40來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的1,5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來(lái)自實(shí)施例9、反應(yīng)#5的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、1.0M～4.0M甲胺和5重量％(相對(duì)于4-氰基戊酸的重量)的5％在碳上的鈀的5ml反應(yīng)混合物水溶液，其氫化作用在500psig氫氣和160℃下，在玻璃振搖器試管中進(jìn)行，然后分析產(chǎn)生的1,5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊二酸(2-MGA)溫度時(shí)間 [CH3NH2]4-CPA5-DMPD 5-MPPD2-MGA(℃) 催化劑 (h)(M) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量)160 5％Pd/C 2 1.0 100 53.5 00.7160 5％Pd/C 2 1.25100 68.3 00.8160 5％Pd/C 2 1.5 100 76.4 00.9160 5％Pd/C 2 2.0 100 81.5 01.8160 5％Pd/C 2 3.0 99 81.7 7.8 3.3160 5％Pd/C 2 4.0 99 88.4 1.9 2.6
實(shí)施例41來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的1,5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來(lái)自實(shí)施例9、反應(yīng)#5的過(guò)濾產(chǎn)物混合液),3.0M～4.0M甲胺和5重量％(相對(duì)于4-氰基戊酸的重量)的5％在碳上的鈀或在碳上的4.5％鈀/0.5％鉑的5ml反應(yīng)混合物水溶液，其氫化作用在500psig氫氣和180℃下，在玻璃振搖器試管中進(jìn)行2h，然后分析產(chǎn)生的1,5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊二酸(2-MGA)溫度 [CH3NH2] 4-CPA 5-DMPD5-MPPD2-MGA(℃)催化劑 (M)(％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量)1805％Pd/C 3.097 73.0 6.6 -180 4.5％Pd/0.5％Pt/C 3.096 69.0 1.9 23.91805％Pd/C 4.095 66.6 2.6 33.5實(shí)施例42來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的1,5-二甲基-2-哌啶酮在100ml刻度量筒中放入54.4ml的含有1.84M 4-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的4-氰基戊酸銨鹽，通過(guò)酶水解2-甲基戊二腈產(chǎn)生；實(shí)施例9，來(lái)自反應(yīng)#5過(guò)濾產(chǎn)物混合液)的反應(yīng)混合物水溶液，然后加25.8ml的40重量％甲胺(9.31g甲胺，0.3mole)，用蒸餾水調(diào)整最終體積至100ml。4-氰基戊酸銨鹽和甲胺的最終濃度分別為1.0M和3.0M。往產(chǎn)生的溶液中加入0.636g(5重量％重量的4-氰基戊酸)在碳粉末上的5％Pd，把產(chǎn)生的混合液轉(zhuǎn)移到裝備有Dispersimax渦輪型推進(jìn)器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。在反應(yīng)器中通入氮?dú)夂?，將反?yīng)器的內(nèi)含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌并在160℃加熱4h。經(jīng)取樣管移取樣品(約1.5ml)以分析整個(gè)反應(yīng)過(guò)程。冷卻到室溫后，通過(guò)氣相色譜分析最終反應(yīng)混合液顯示1,5-二甲基-2-哌啶酮的產(chǎn)量為72.8％,5-甲基-2-哌啶酮的產(chǎn)量為3.5％,2-甲基戊二酸的產(chǎn)量為19.9％，沒(méi)有剩余4-氰基戊酸銨鹽。
過(guò)濾產(chǎn)物混合液(取樣后61ml)而除去催化劑，然后用6N HCl調(diào)pH至7.0并用氯化鈉飽和。用100ml乙醚提取產(chǎn)生的溶液4次，將合并的有機(jī)相提取物在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，并在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑而產(chǎn)生無(wú)色的液體。將該液體在3.5 Torr下蒸餾，并收集在70.0-71.5℃沸騰的級(jí)分，而產(chǎn)生4.65g(60％分離產(chǎn)量)的1,5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)。
實(shí)施例43來(lái)自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基-1-甲基吡咯烷-2-酮在100ml刻度量筒中放入79.4ml含有1.26M 3-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的3-氰基戊酸銨鹽，通過(guò)酶水解2-乙基琥珀腈產(chǎn)生；實(shí)施例13過(guò)濾產(chǎn)物混合液)的反應(yīng)混合物水溶液，然后加17.2ml的40重量％甲胺(6.21g甲胺，0.2mole)，用蒸餾水調(diào)整最終體積到100ml。3-氰基戊酸銨鹽和甲胺的最終濃度分別為1.0M和2.0M。往產(chǎn)生的溶液中加入0.636g(5重量％/重量的3-氰基戊酸)在碳粉末上的5％Pd，把產(chǎn)生的混合液轉(zhuǎn)移到裝備有Dispersimax渦輪型推進(jìn)器的300ml314SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。在反應(yīng)器中通入氮?dú)夂?，將反?yīng)器中的內(nèi)含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌并在140℃加熱4h。經(jīng)取樣管移取樣品(約1.5ml)以分析整個(gè)反應(yīng)過(guò)程。冷卻到室溫后，通過(guò)氣相色譜分析最終反應(yīng)混合液顯示4-乙基-1-甲基吡咯烷-2-酮的產(chǎn)量為69.8％,4-乙基吡咯烷-2-酮的產(chǎn)量為20.4％，沒(méi)有剩余3-氰基戊酸銨鹽。
過(guò)濾產(chǎn)物混合液(取樣后80ml)以除去催化劑，然后用6N HCl調(diào)整到pH7.0并用氯化鈉飽和。用100ml二氯甲烷提取產(chǎn)生的溶液4次，將合并的有機(jī)提取液在硫酸鎂上干燥，過(guò)濾，在減壓下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑而產(chǎn)生無(wú)色的液體。將該液體在16 Torr下分餾，收集在100℃沸騰的級(jí)分(5.15g,51％產(chǎn)量)。產(chǎn)生的4-乙基-1-甲基-吡咯烷酮-2-酮含有＜5％的4-乙基吡咯烷-2-酮不純物，所以將該液體在40 Torr下重蒸餾，并收集在128℃沸騰的級(jí)分而產(chǎn)生3.71g(37％分離產(chǎn)量)的4-乙基-甲基吡咯烷-2-酮(4-EMPRD)。
實(shí)施例44來(lái)自4-氰基-4-戊烯酸銨鹽的5-甲基-2-哌啶酮在100ml刻度量筒中放入77.0ml含有1.30M 4-氰基-4-戊烯酸銨鹽(0.1mole的4-氰基戊烯酸銨鹽，通過(guò)酶水解2-亞甲基戊二腈產(chǎn)生；實(shí)施例17)的反應(yīng)混合物水溶液，然后加12.9ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3,0.2mole NH3)，用蒸餾水調(diào)整最終體積到100ml。4-氰基-4-戊烯酸銨鹽和所加的氫氧化銨最終濃度分別為1.0M和2.0M。往產(chǎn)生的溶液中加入0.626g(5重量％/重量的4-氰基-4-戊烯酸)的鉻促Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)，把產(chǎn)生的混合液轉(zhuǎn)移到裝備有Dispersimax渦輪型推進(jìn)器的300ml314SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。在反應(yīng)器中通入氮?dú)夂?，將反?yīng)器中的內(nèi)含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌，并在50℃加熱5h，然后在160℃再加熱3h。冷卻到室溫后，通過(guò)氣相色譜分析最終反應(yīng)混合液顯示5-甲基-2-哌啶酮的產(chǎn)量為85.0％，沒(méi)有剩余4-氰基-4-戊烯酸銨鹽。
實(shí)施例45來(lái)自3-氰基丙酸銨鹽的2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)在100ml的刻度量筒中放入78.5ml含有1.31M 3-氰基丙酸銨鹽(0.1mole的3-氰基丙酸銨鹽，通過(guò)酶水解琥珀腈產(chǎn)生；實(shí)施例20)的反應(yīng)混合物水溶液，然后加19.4ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3，0.3mole NH3)，用蒸餾水把最終體積調(diào)整到100ml。3-氰基丙酸銨鹽和所加的氫氧化銨的最終濃度分別為1.0M和3.0M。往產(chǎn)生的溶液中加入0.99g(10重量％/重量的3-氰基丙酸)的促鉻Raney鎳(GraceDavison Raney2400活潑金屬催化劑)，把產(chǎn)生的溶液轉(zhuǎn)移到裝備有Dispersimax渦輪型推進(jìn)器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應(yīng)器通入氮?dú)夂螅瑢⒎磻?yīng)器中的內(nèi)含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌，并在70℃加熱4.5h，然后180℃再加熱5h。用氣相色譜分析顯示2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)的產(chǎn)量為91.0％，沒(méi)有剩余3-氰基丙酸銨鹽。
實(shí)施例46來(lái)自4-氰基丁酸銨鹽的2-哌啶酮重復(fù)實(shí)施例22中所述的步驟。4.0h后，4-氰基丁酸銨鹽和戊二酸二銨鹽的HPLC產(chǎn)量分別為91.7％和7.5％，沒(méi)有剩余戊二腈。4-氰基丁酸銨鹽在離心和過(guò)濾過(guò)的反應(yīng)混合液中的最終濃度為1.42M。在100ml刻度量筒中放入70.6ml(0.100mole的4-氰基丁酸銨鹽)的過(guò)濾含水產(chǎn)物混合物，然后加19.4ml的濃縮的氫氧化銨(29.2％NH3，0.3mole NH3)，用蒸餾水把最終體積調(diào)整到100ml。4-氰基丙酸銨鹽和所加的氫氧化銨最終濃度分別為1.0M和3.0M。往產(chǎn)生的溶液中加入1.13g(10重量％/重量的4-氰基丁酸)的促鉻Raney鎳(GraceDavison Raney2400活潑金屬催化劑)，把產(chǎn)生的溶液轉(zhuǎn)移到裝備有Dispersimax渦輪型推進(jìn)器的300ml 314SS Autoclave EngineersEZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應(yīng)器通入氮?dú)夂螅瑢⒎磻?yīng)器中的內(nèi)含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌，并在70℃加熱3.5h。用氣相色譜分析顯示2-哌啶酮的產(chǎn)量為29.7％，沒(méi)有剩余4-氰基丁酸銨鹽。把溫度提高到180℃，再加熱2h，接著用氣相色譜分析樣品顯示2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)的產(chǎn)量為93.5％。
實(shí)施例47來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的5-甲基2-哌啶酮將含有1.85M 4-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的4-氰基戊酸銨鹽，通過(guò)酶水解2-甲基戊二腈產(chǎn)生；實(shí)施例9，來(lái)自反應(yīng)#5的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、5.6g的29％氫氧化銨水溶液和44ml D.I.水的50毫升混合水溶液轉(zhuǎn)移到300ml高壓鍋中。往該溶液中加入0.73g(3重量％，以4-氰基戊酸為主)在碳上的4.5％Pd/0.5％Pt催化劑。密封高壓鍋，用氮?dú)馇逑慈?，接著?00psig氫氣和緩慢攪拌下加熱至160℃。160℃時(shí)，把壓力提高到800psig，開始最大速度的攪拌。3小時(shí)后，冷卻反應(yīng)器，排氣，用氮?dú)馇逑础．a(chǎn)物混合液氣相色譜分析顯示4-氰基戊酸的轉(zhuǎn)化率為96％且5-甲基-2-哌啶酮的產(chǎn)量為95.5％(99.5％選擇性)。
實(shí)施例48來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的1,5-二甲基-2-哌啶酮將含有1.85M 4-氰基戊酸銨鹽(0.2mole的4-氰基戊酸銨鹽，通過(guò)酶水解2-甲基戊二腈產(chǎn)生；實(shí)施例9，來(lái)自反應(yīng)#5過(guò)濾產(chǎn)物混合液)，和14g(0.2mole)的40％甲胺水溶液的100毫升混合水溶液轉(zhuǎn)移到300ml高壓鍋中。往該溶液中加入在碳上的4.5％Pd/0.5％Pt催化劑。密封高壓鍋，用氫氣清洗3次，在100psig氫氣和緩慢攪拌下加熱反應(yīng)液。在反應(yīng)溫度下，提高壓力，開始最大速度的攪拌。一定的反應(yīng)時(shí)間后，冷卻反應(yīng)器，排氣，用氮?dú)馇逑?。將氣相色譜分析在不同的反應(yīng)條件下幾種操作的產(chǎn)物混合液的結(jié)果總結(jié)如下溫度 H2裝入的催化劑 時(shí)間 4-CPA 5-DMPD 5-MPPD(℃) (psig) (wt％) (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量)1753007.4 3 9967.8 28.216050010 2 9968.6 28.114550010 2 9365.2 26.4實(shí)施例49來(lái)自4-氰基戊酸銨鹽的1,5-二甲基-2-哌啶酮用不同的在碳上的Pd催化劑，4-氰基戊酸銨鹽的氫化作用在5ml玻璃振搖器試管中在800psig下進(jìn)行。將1.85M(7mmoles)5-氰基戊酸水溶液(來(lái)自實(shí)施例9、反應(yīng)#5的過(guò)濾產(chǎn)物混合液)、0.88g(11.4mmoles)40％甲胺和選自5％Pd/C及4.5％Pd/0.5％Pt/C的催化劑共4毫升轉(zhuǎn)移到試管中并進(jìn)行反應(yīng)3小時(shí)。冷卻到25℃后，將氣相色譜分析在不同反應(yīng)條件下產(chǎn)生的產(chǎn)物混合液的結(jié)果總結(jié)如下溫度裝入的催化 時(shí)間 4-CPA 5-DMPD 5-MPPD(℃)催化劑 劑(wt％) (h) (％轉(zhuǎn)化率) (％產(chǎn)量) (％產(chǎn)量)1605％Pd/C 1.2 2 99 91.8 5.0160 4.5％Pd/0.5％Pt/C 0.7 2 99 94.0 3.11505％Pd/C 0.7 2 99 92.5 2.2
條款19下的聲明申請(qǐng)者已經(jīng)修改了權(quán)利要求2、13和14，對(duì)脂肪族α,ω-二腈的通式范圍妥善描述為包括亞烷基和取代的亞烷基。關(guān)于該修改的支持材料可在實(shí)施例18中找到，其中
將含有CH2分枝(在權(quán)利要求2中定義為亞烷基)的2-亞甲基戊二腈變成4-氰基-4-戊烯酸。相同的反應(yīng)在說(shuō)明書第9頁(yè)具體描述并被列為表1的部分。對(duì)整個(gè)公開內(nèi)容而言，應(yīng)注意如下事實(shí)，在本發(fā)明中，未找到取代的亞烷基操作實(shí)施例。不過(guò)，包括取代基團(tuán)和取代的亞烷基的原范圍為本發(fā)明主題的一部分，這是合理的。
另外，權(quán)利要求2、13和14已做了修改，用普遍接受的名稱“烷基或取代的烷基”取代原來(lái)的短語(yǔ)“非取代或取代的烷基”。這種方式也適用于鏈烯基和亞烷基。
權(quán)利要求書(國(guó)際局于1997年12月4日收到(04.12.97)；修改了原始提交的2,13,14，其余權(quán)利要求未改動(dòng))。
1．一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把在反應(yīng)混合物水溶液中的脂肪族α,ω-二腈與具有如下特征的酶催化劑之一種接觸1)脂肪族腈水解酶活性，或者2)腈水合酶和酰胺酶活性的組合，由此，將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成ω-腈基羧酸銨鹽；(b)把從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺、而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和(c)從步驟(b)中生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
2．權(quán)利要求1的方法，其中脂肪族α,ω-二腈具有下列通式NCCXa(R)(CH2)nCN其中，a=0或1，當(dāng)a=1且R=H、烷基或取代的烷基、或鏈烯基或取代的鏈烯基、或者亞烷基或取代的亞烷基，且其中n=1或2時(shí)X=氫。
3．權(quán)利要求1的方法，其中酶催化劑的形式為完整的微生物細(xì)胞、通透化的微生物細(xì)胞、一或多種微生物細(xì)胞提取物的細(xì)胞組分、部分純化的酶或者純化的酶。
4．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑的特征為具有脂肪族腈水解酶活性且其形式為敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)或敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)完整的微生物細(xì)胞。
5．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑的特征為腈水合酶和酰胺酶活性的組合且其形式為睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC55744)完整的微生物細(xì)胞。
6．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑的形式為固定在不溶性支持物之中或其上的完整的微生物細(xì)胞。
7．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑是固定在可溶或不溶性支持物上的部分純化的酶或純化的酶。
8．權(quán)利要求1的方法，其中脂肪族α,ω-二腈在α-碳原子位不對(duì)稱地被取代，且酶催化劑的特征為由于區(qū)域選擇性地水解ω-腈基而產(chǎn)生ω-腈基羧酸銨鹽的脂肪族腈水解酶活性，由此在后續(xù)的氫化反應(yīng)中，僅產(chǎn)生兩種可能的內(nèi)酰胺產(chǎn)物之一種。
9．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(b)的氫化反應(yīng)前，把氫氧化銨、氨氣或甲胺加到含有ω-腈基羧酸銨鹽的含水產(chǎn)物混合物中。
10．權(quán)利要求9的方法，其中加到含水產(chǎn)物混合物中的氫氧化銨、氨氣或甲胺的量為相對(duì)于存在的ω-腈基羧酸銨鹽的0～4摩爾當(dāng)量。
11．權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(b)氫化反應(yīng)前，將甲胺加入到含ω-腈基羧酸銨鹽的含水產(chǎn)物混合物中，且氫化反應(yīng)的產(chǎn)物是N-甲基內(nèi)酰胺。
12．權(quán)利要求1的方法，其中氫化反應(yīng)的溫度為45～200℃。
13．一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把在反應(yīng)混合物水溶液中具下列任一通式脂肪族α,ω-二腈與選自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)，敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)，和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的酶催化劑接觸，脂肪族α,ω-二腈的通式為
或
其中R1和R2均為H，且R3、R4、R5和R6每一個(gè)獨(dú)自選自H、烷基或取代的烷基，或鏈烯基或取代的鏈烯基，或者R3和R4一起為亞烷基或取代的亞烷基，或獨(dú)立地R5和R6一起為亞烷基或取代的亞烷基；
由此，將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成ω-腈基羧酸銨鹽；b)把從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此，將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和c)從步驟(b)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
14．一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把在反應(yīng)混合物水溶液中具有下列任一通式的脂肪族α,ω-二腈與睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)接觸，脂肪族α,ω-二腈的通式為
或
其中R7、R8、R9、R10、R11和R12每一個(gè)獨(dú)自選自H、烷基或取代的烷基，或鏈烯基或取代的鏈烯基，或R3和R4一起為亞烷基或取代的亞烷基，或獨(dú)立地，R5和R6一起為亞烷基或取代的亞烷基；且其中任一個(gè)或兩個(gè)R7或R8不是H；由此，將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成ω-腈基羧酸銨鹽；b)把從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此，將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和c)從步驟(b)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
15．權(quán)利要求13的方法，其中酶催化劑的形式是來(lái)源于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的完整微生物細(xì)胞、通透化的微生物細(xì)胞、一種或多種微生物細(xì)胞提取物的細(xì)胞組分、以及部分純化的酶或純化的酶。
權(quán)利要求
1．一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把在反應(yīng)混合物水溶液中的脂肪族α,ω-二腈與具有如下特征的酶催化劑之一種接觸1)脂肪族腈水解酶活性，或者2)腈水合酶和酰胺酶活性的組合，由此，將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成ω-腈基羧酸銨鹽；(b)把從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺、而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和(c)從步驟(b)中生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
2．權(quán)利要求1的方法，其中脂肪族α,ω-二腈具有下列通式NCCXa(R)(CH2)nCN其中，a=0或1，當(dāng)a=1且R=H、非取代或取代的烷基、或非取代或取代的鏈烯基、或者非取代或取代的亞烷基，且其中n=1或2時(shí)X=氫。
3．權(quán)利要求1的方法，其中酶催化劑的形式為完整的微生物細(xì)胞、通透化的微生物細(xì)胞、一或多種微生物細(xì)胞提取物的細(xì)胞組分、部分純化的酶或者純化的酶。
4．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑的特征為具有脂肪族腈水解酶活性且其形式為敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)或敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)完整的微生物細(xì)胞。
5．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑的特征為腈水合酶和酰胺酶活性的組合且其形式為睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC55744)完整的微生物細(xì)胞。
6．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑的形式為固定在不溶性支持物之中或其上的完整的微生物細(xì)胞。
7．權(quán)利要求3的方法，其中酶催化劑是固定在可溶或不溶性支持物上的部分純化的酶或純化的酶。
8．權(quán)利要求1的方法，其中脂肪族α,ω-二腈在α-碳原子位不對(duì)稱地被取代，且酶催化劑的特征為由于區(qū)域選擇性地水解ω-腈基而產(chǎn)生ω-腈基羧酸銨鹽的脂肪族腈水解酶活性，由此在后續(xù)的氫化反應(yīng)中，僅產(chǎn)生兩種可能的內(nèi)酰胺產(chǎn)物之一種。
9．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在步驟(b)的氫化反應(yīng)前，把氫氧化銨、氨氣或甲胺加到含有ω-腈基羧酸銨鹽的含水產(chǎn)物混合物中。
10．權(quán)利要求9的方法，其中加到含水產(chǎn)物混合物中的氫氧化銨、氨氣或甲胺的量為相對(duì)于存在的ω-腈基羧酸銨鹽相的0～4摩爾當(dāng)量。
11．權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(b)氫化反應(yīng)前，將甲胺加入到含ω-腈基羧酸銨鹽的含水產(chǎn)物混合物中，且氫化反應(yīng)的產(chǎn)物是N甲基內(nèi)酰胺。
12．權(quán)利要求1的方法，其中氫化反應(yīng)的溫度為45～200℃。
13．一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把在反應(yīng)混合物水溶液中具下列任一通式脂肪族α,ω-二腈與選自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)，敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)，和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的酶催化劑接觸，脂肪族α,ω-二腈的通式為
或
其中R1和R2均為H，且R3、R4、R5和R6每一個(gè)獨(dú)自選自H、非取代或取代的烷基，或非取代或取代的鏈烯基；由此，將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成ω-腈基羧酸銨鹽；b)把從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此，將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和c)從步驟(b)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
14．一種從脂肪族α,ω-二腈中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把在反應(yīng)混合物水溶液中具有從下列任一通式的脂肪族α,ω-二腈與睪丸叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)接觸，脂肪族α,ω-二腈的通式為
或
其中R7、R8、R9、R10、R11和R12每一個(gè)獨(dú)自選自H、非取代或取代的烷基，或非取代或取代的鏈烯基，且其中任一個(gè)或兩個(gè)R7或R8不是H；由此，將脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成ω-腈基羧酸銨鹽；b)把從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此，將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和c)從步驟(b)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
15．權(quán)利要求13的方法，其中酶催化劑的形式是來(lái)源于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的完整微生物細(xì)胞、通透化的微生物細(xì)胞、一種或多種微生物細(xì)胞提取物的細(xì)胞組分、以及部分純化的酶或純化的酶。
16．權(quán)利要求14的方法，其中酶催化劑的形式是來(lái)源于睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)的完整的微生物細(xì)胞、通透化的微生物細(xì)胞、一種或多種微生物細(xì)胞提取物的細(xì)胞組分、以及部分純化的酶或純化的酶。
17．權(quán)利要求15或16的方法，其中酶催化劑的形式是固定在不溶性支持物上的完整的微生物細(xì)胞。
18．權(quán)利要求15或16的方法，其中酶催化劑是固定在可溶或不溶性支持物上的部分純化或純化的酶。
19．權(quán)利要求13或14的方法，其中脂肪族α,ω-二腈在α-碳原子位不對(duì)稱地被取代，且酶催化劑的特征為由于區(qū)域選擇性地水解ω-腈基而產(chǎn)生ω-腈基羧酸銨鹽的脂肪族水解酶活性，因此，在后續(xù)的氫化反應(yīng)中，僅產(chǎn)生兩種可能的內(nèi)酰胺產(chǎn)物之一種。
20．分離的微生物，其特征為具有脂肪族腈水解酶活性且選自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)。
21．分離的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)，其特征為具有腈水合酶和酰胺酶活性的組合。
22．一種從含有ω-腈基羧酸銨鹽的反應(yīng)混合物水溶液中制備五元環(huán)內(nèi)酰胺或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法，包括(a)把含有ω-腈基羧酸銨鹽的含水產(chǎn)物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此，將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和(b)從步驟(a)生成的含水產(chǎn)物混合物中回收內(nèi)酰胺。
23．通式Ⅲ的化合物
其中M+是H+或NH4+。
24．通式Ⅳ的化合物
其中M+是H+或NH4+。
25．權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)的反應(yīng)混合物水溶液包括(ⅰ)含有下列物質(zhì)的水相(a)酶催化劑，其特征為脂肪族腈水解酶活性或者腈水合酶和酰胺酶活性的組合；和(b)溶解的α,ω-二腈；和(ⅱ)包括非溶解的α,ω-二腈的有機(jī)相。
26．一種處理完整的細(xì)胞催化劑的方法，該方法用于選擇區(qū)域選擇性水解酶活性或腈水合酶活性，這些酶活性能催化脂肪族α,ω-二腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的ω-氰基羧酸銨鹽，完整的細(xì)胞催化劑的特征為合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶活性或腈水合酶活性，以及不合需要的非區(qū)域選擇性腈水解酶或腈水合酶活性，該方法包括把完整的細(xì)胞催化劑加熱到約35℃～70℃的溫度，持續(xù)10～120分鐘，其中將不合需要的非區(qū)域選擇性的腈水解酶活性或腈水合酶活性破壞，而將合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶或腈水合酶活性保留。
全文摘要
本發(fā)明開發(fā)了一種從脂肪族α,ω－二腈中制備五元環(huán)或六元環(huán)內(nèi)酰胺的方法。在該方法中,首先使用一種具有脂肪族腈水解酶(EC3.5.5.7)活性或腈水合酶(EC4.2.1.84)與酰胺酶(EC3.5.1.4)活性組合的催化劑將脂肪族α,ω－二腈轉(zhuǎn)化成ω－腈基羧酸銨鹽的水溶液。然后,不分離中間體ω－腈基羧酸或ω－氨基羧酸,直接通過(guò)水溶液中的氫化作用將這種ω－腈基羧酸銨鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的內(nèi)酰胺。當(dāng)脂肪族α,ω－二腈在α－碳原子位也被不對(duì)稱地取代時(shí),由于ω－腈基的水解作用具有98%以上的區(qū)域選擇性,腈水解酶產(chǎn)生了ω－腈基羧酸銨鹽,因而在后續(xù)的氫化作用過(guò)程中僅產(chǎn)生兩種可能的內(nèi)酰胺產(chǎn)物中的一種。本發(fā)明還提供了一種用于選擇合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶或腈水合酶活性而破壞不合乎需要的活性的熱處理方法。
文檔編號(hào)C07D211/76GK1219167SQ97194702
公開日1999年6月9日 申請(qǐng)日期1997年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月17日
發(fā)明者R·迪科斯莫, R·D·法爾隆, J·E·加瓦甘, F·E·赫爾克斯 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司