專利名稱：血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的反義抑制物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考文獻(xiàn)本中請(qǐng)優(yōu)先權(quán)依據(jù)一項(xiàng)暫時(shí)共同未決的申請(qǐng)，其申請(qǐng)的序列號(hào)60/015,752/，提交日期1996年4月17日關(guān)于聯(lián)合研究或開發(fā)發(fā)起人的聲明不適用發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及利用寡核苷酸的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的細(xì)胞抑制。本發(fā)明的寡核苷酸可與目標(biāo)mRNA以序列特異性的方式結(jié)合，并阻礙其編碼的VEGF基因的表達(dá)。公開了為提高穩(wěn)定性和結(jié)合效率所作的寡核苷酸化學(xué)修飾。該寡核苷酸組合物可用于離體治療巨噬細(xì)胞，或者通過注射、吸入或局部治療或其它給藥途徑用于體內(nèi)治療。
相關(guān)技術(shù)的說明書血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)也稱為血管通透因子，包括一族同源雙螺旋的分泌糖蛋白，其分子量介于34-46Kda。它可由多種類型的細(xì)胞應(yīng)答缺氧和特定調(diào)控因子而分泌。目前已知有四種VEGF的同型體。它們是由同一基因編碼的mRNA通過不同的剪切方式形成的。(Keck等人，1989；Leung等人，1989；Connolly和Plander,1989；Tischer等人，1991)VEGF對(duì)于生長和發(fā)育過程中血管的形成和組織恢復(fù)是必需的(Ferrera，等人，1996；Carmeliet等人，1996；Thomas,1996；Dvorak等人，1995a,b；Folkman,1995；Ferrera等人,1992)。這種生長因子誘導(dǎo)血管的通透性，是單核細(xì)胞和成骨細(xì)胞的趨化因子，并且是內(nèi)皮細(xì)胞的一種選擇性促分裂原。VEGF的受體蛋白(在人中為KDR和Flt-1)屬于跨膜酪氨酸激酶家族(Terman等人，1992；de Vires等人，1992)。受體的激活可引發(fā)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞生長速度明顯地提高以及最終新血管生成的一系列的事件。VEGF比其它參與血管發(fā)生的蛋白質(zhì)因子在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長上更有選擇性。不幸的是，在特定情況下VEGF的存在可能會(huì)有有損于健康的效應(yīng)。
異常高濃度的VEGF常常與一些以高度的血管形成和血管通透性增加為特征的疾病有關(guān)。這些疾病包括糖尿病性視網(wǎng)膜病，侵襲性腫瘤，牛皮癬，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其它的一些炎癥情況(D′Amore,1994；Dvorak等人，1995a,b；Folkman,1995)。因此需要一些組合物和方法用于選擇性地降低不正常的高VEGF濃度以減少VEGF介導(dǎo)的新血管形成。這些方法和組合物可被用于減緩以新血管形成和血管通透性為特征的疾病進(jìn)程。
一種用于降低VEGF濃度的方法包括利用反義寡核苷酸(Wagner,1994)。這一技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于可以實(shí)現(xiàn)特異性的抑制。有效的寡核苷酸被認(rèn)為可以結(jié)合于mRNA特異的序列上，并干擾其編碼基因的表達(dá)。蛋白質(zhì)表達(dá)的減少可能是由于對(duì)核糖體功能的抑制，降低了可轉(zhuǎn)錄的底物mRNA的濃度或者其它的機(jī)制。此外，寡核苷酸可通過一種寡核苷酸介導(dǎo)的促進(jìn)mRNA分子降解速度的增加來降低mRNA的濃度。通常長約15個(gè)堿基的寡核苷酸就足夠提供與目標(biāo)RNA靶點(diǎn)的序列特異性的結(jié)合，雖然短一些的寡核苷酸有時(shí)也能結(jié)合(Uhlman和Peyman,1990)。然而，在體外實(shí)驗(yàn)中用于降低蛋白質(zhì)表達(dá)的反義寡核苷酸長度一般為11-30個(gè)堿基(綜述Uhlman和Peyman,1990)。
要將反義治療方案的潛在優(yōu)勢(shì)用于疾病的治療手段，還必須克服一系列障礙。例如，反義寡核苷酸是一些大的親水性化合物(大約3,000到10,000D)，而在它們結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的目標(biāo)之前，必須穿過疏水性細(xì)胞膜(Ulhmann和Peyman,1990；Miligan等人，1993)。因此，需要促進(jìn)VEGF反義寡核苷酸穿過細(xì)胞膜的運(yùn)輸方法。治療所用的寡核苷酸也必須是無毒的，且不能干擾正常的細(xì)胞代謝。為了減少這些非特異性效果，它們與其識(shí)別的序列結(jié)合必須要有高度的特異性和親和力。
具有天然磷酸二酯骨架的寡核苷酸對(duì)血清及細(xì)胞核酸酶高度敏感。隨機(jī)的17個(gè)堿基長的寡核苷酸在血清中的半衰期小于3分鐘(Bishop等人，1996)。在能用作治療新血管形成疾病的治療手段之前需要增加寡核苷酸的穩(wěn)定性。利用硫代磷酸酯替換磷酸二酯基團(tuán)能提高寡核苷酸的半衰期。它們應(yīng)為化學(xué)惰性的，且在多種化學(xué)環(huán)境下有核酸酶抗性。然而，這種寡核苷酸此前從未表明以選擇性方式抑制VEGF的表達(dá)。
以前已知的硫代磷酸酯寡核苷酸的一種缺陷是，為了降低VEGF的表達(dá)這種寡核苷酸的濃度要達(dá)到1μM(Nomura等人，1995；Robinson等人，1996)。在這種濃度下，這些寡核苷酸有毒性(Woolf等人，1992；Stein和Cheng,1993；Stein和Kreig,1994,Wagner,1994；Fennewald等人，1996)。且觀察到的效果可能是這種非特異性毒性造成的(Fennewald等人，1995)。需要一種新型寡核苷酸抑制物，通過在無毒的濃度下抑制VEGF的表達(dá)證明一種真正的反義效果。這些寡核苷酸可能有相對(duì)于現(xiàn)有的VEGF反義寡核苷酸來說有更高的結(jié)合常數(shù)和/或?qū)ζ淠繕?biāo)mRNA序列增加的特異性。
關(guān)于現(xiàn)有的VEGF反義寡核苷酸有限的效果有幾種可能的解釋。一種可能性是目標(biāo)RNA序列可被限制在一個(gè)大分子結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)從空間上阻礙了寡核苷酸的結(jié)合。例如，RNA結(jié)合蛋白和蛋白質(zhì)翻譯復(fù)合物可能會(huì)阻礙寡核苷酸的結(jié)合。此外，寡核苷酸可能無法與一種不利構(gòu)象的mRNA結(jié)合。另外，有效的目標(biāo)序列的位置是多變的。有效的目標(biāo)序列可能位于目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄本的任何位置上，且以翻譯起始密碼子或5’非翻譯區(qū)為靶的寡核苷酸就并不是總是有效的(Wanger等人，1993；Fenster等人，1994)。寡核苷酸與其它分子如蛋白質(zhì)之間的非特異性相互作用也同樣可以導(dǎo)致不同的生物學(xué)活性(Woolf等人，1992；Stein和Cheng,1993)。而且，寡核苷酸本身也許會(huì)采用一種意想不到的三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)在意料之外的位置上與DNA結(jié)合。這些不正常的結(jié)合可能會(huì)產(chǎn)生一些意外的生物學(xué)效果(Chaudhary等人，1995)。
在尋找有效的反義寡核苷酸的過程中還遇到過其它的困難。寡核苷酸與目標(biāo)RNA之間的親和力隨著片段長度和G-C含量的增加而增加。然而，較長的寡核苷酸易于與RNA或其它的寡核苷酸片段進(jìn)行非特異性的結(jié)合。而且，高G組份的寡核苷酸易形成G-四聚體，從而減少反義結(jié)合所必需的自由-螺旋狀態(tài)的寡核苷酸的數(shù)量(Bioshop等人，1996)。因此，寡核苷酸應(yīng)該是比較短且對(duì)于其目標(biāo)序列有較高的親和力，即使有較高的G含量也不會(huì)形成G-四聚體。
如前所述，寡核苷酸是一種大的親水性化合物，它必須穿過疏水性細(xì)胞膜才能同細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的目標(biāo)結(jié)合(Uhlmann和Peyman,1990；Milligan等人，1993)。但是由于它們比較大的尺寸、親水性本質(zhì)以及帶有負(fù)電荷，寡核苷酸不能有效地穿過細(xì)胞膜。在沒有細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑的存在下，寡核苷酸傾向于在受試細(xì)胞的前核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分中積累(Fisher等人，1993；Guy-Caffey等人，1995)。在這種情況下，寡核苷酸穿過質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的輸運(yùn)限制了其內(nèi)化的速度和其活性。因此，需要一種新的組合物和方法以促進(jìn)寡核苷酸穿過脂雙層的速度。
一類脂類吸收增強(qiáng)劑包括一個(gè)能與核酸結(jié)合的帶正電荷的頭部基團(tuán)，以及一個(gè)能夠與膜成分相互作用的膜相互作用性尾巴。這些組合物可以通過瞬時(shí)性擾動(dòng)細(xì)胞膜來促進(jìn)寡核苷酸穿過細(xì)胞膜。不幸的是，許多陽離子脂制劑，例如Lipofectin，一種陽離子脂DOTMA與融合脂質(zhì)二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(Life Technologies，公司，Gaithersburg,MD)按1∶1(質(zhì)量比)的混合物，對(duì)許多因素如核酸的組成和數(shù)量，靶細(xì)胞的類型，以及細(xì)胞培養(yǎng)基中血清的濃度等敏感。此外，一些制劑本身有細(xì)胞毒性。這些強(qiáng)制因素嚴(yán)重地限制了這些化合物在動(dòng)物體系中作為寡核苷酸輸運(yùn)劑用于治療用途。因此必須確立一種適應(yīng)于寡核苷酸的改進(jìn)的運(yùn)輸系統(tǒng)。
總之，許多疾病的過程與VEGF的過度表達(dá)所引起的血管生成和血管通透性增加有關(guān)。需要能特異性地降低VEGF表達(dá)的新組合物和方法以用于這些疾病的治療。反義寡核苷酸治療是一種有吸引力的途徑，因?yàn)樗哂袧撛诘倪x擇性。
不幸的是，許多已知的VEGF反義寡核苷酸只有在對(duì)細(xì)胞有毒的濃度下才有效，并且僅表現(xiàn)出非特異性的效果。而且，現(xiàn)有的反義寡核苷酸是化學(xué)和生物學(xué)不穩(wěn)定的，而那些更加穩(wěn)定的卻表現(xiàn)出對(duì)其目標(biāo)序列的低至不能接受的低親和力，且不易穿過細(xì)胞膜，因此很難到達(dá)其生物學(xué)目標(biāo)。最后，高G含量的寡核苷酸易形成G-四聚體。
需要一種無毒的、對(duì)其目標(biāo)mRNA序列有較高的親和力的新寡核苷酸組合物。這些組合物應(yīng)該有更高的生物學(xué)穩(wěn)定性，包括抵御核酸酶降解的能力的增加。此外，有用的寡核苷酸無論其序列如何均不應(yīng)聚合。還需要一種能幫助寡核苷酸穿過細(xì)胞膜的新組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于減緩與血管生成和血管通透性增加有關(guān)的疾病過程的組合物和方法。這種反義寡核苷酸組合物在選擇性抑制產(chǎn)生細(xì)胞的VEGF表達(dá)上優(yōu)于現(xiàn)有的反義寡核苷酸，且意在用于對(duì)此類疾病的治療。本發(fā)明的選擇性來自于可特異性地結(jié)合于VEGF mRNA分子上并阻礙VEGF表達(dá)的反義寡核苷酸。
本發(fā)明提供了這些寡核苷酸以及利用化學(xué)修飾來提高其對(duì)于目標(biāo)mRNA序列的親和力和特異性的制造和使用它們的方法。本發(fā)明的寡核苷酸均有較高的生物學(xué)穩(wěn)定性和對(duì)目標(biāo)序列的親和力。這些寡核苷酸無論是在疏水環(huán)境還是在親水環(huán)境下都對(duì)化學(xué)的和生物學(xué)的作用不敏感。并且不管其序列如何，不易形成聚合體。
本發(fā)明提供了有效且無毒的VEGF反義寡核苷酸。特別的，本發(fā)明用于一種新的寡核苷酸組合物，這種組合物以低于1μM的濃度處理細(xì)胞可導(dǎo)致VEGF的細(xì)胞產(chǎn)量降低。在這些濃度下本發(fā)明的反義寡核苷酸無毒且不會(huì)干擾細(xì)胞代謝。
本發(fā)明同時(shí)也提供了一種使寡核苷酸易于穿過細(xì)胞膜到達(dá)其生物學(xué)目標(biāo)的組合物及方法。這是通過在提供制備和使用反義寡核苷酸同時(shí)使用細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑的方法來實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑無毒，并且與VEGF反義寡核苷酸相容，能促進(jìn)寡核苷酸有效地穿過細(xì)胞膜。
用于本發(fā)明目的的“寡核苷酸”一詞包括核酸多聚體以及與核酸多聚體相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在寡核苷酸中核糖或脫氧核糖的等效物可被置換入其結(jié)構(gòu)中，只要結(jié)合的堿基的成分可維持其具有與目標(biāo)序列特異性結(jié)合所需的氫鍵。類似地，寡核苷酸中可含有磷酸二酯骨架的化學(xué)等效物如硫代磷酸酯鍵。此外，寡核苷酸中還可包括經(jīng)過化學(xué)修飾的堿基成分。特別的，寡核苷酸可包括但不局限于C5-(丙炔基或己炔基)尿苷或胞苷殘基，6-氮雜尿苷或胞苷殘基，以及經(jīng)C5或6-氮雜修飾的嘧啶。
“VEGF”一詞包括已知屬于血管內(nèi)皮生長因子家族的所有蛋白質(zhì)。VEGF包括至少四種已知的人類VEGF的同源體，據(jù)認(rèn)為這四種分子來源于同一種mRNA的不同剪切產(chǎn)物，以及任何有相似生物學(xué)功能的同源蛋白質(zhì)。已知的蛋白質(zhì)包括那些編碼自mRNA剪切體的本領(lǐng)域已知的VEGF206、VEGF185、VEGF165和VEGF121。
本發(fā)明的反義寡核苷酸是用下面的方法制備的。長度大約為15-30個(gè)堿基的核苷酸序列，優(yōu)選的長度約19個(gè)堿基，其序列與編碼VEGF的mRNA一致。這些VEGF mRNA的序列為本領(lǐng)域已知。此RNA序列可以是編碼VEGF家族中蛋白質(zhì)的任意一種的mRNA上的任意一段序列。更優(yōu)選的應(yīng)是與編碼人VEGF206、VEGF185、VEGF165和VEGF121 mRNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸。最優(yōu)選的是可以與所有VEGFmRNA上均有的序列結(jié)合的寡核苷酸(見表1)?？?VEGF寡核苷酸 表1
+人VECF mRNA序列源自Leung等人．，science,246:1306,1989．起始密碼子位于57堿基。*硫代磷酸脂鍵。-磷酸二脂鍵。1C,U代表修飾過的堿基。
制備了一系列互補(bǔ)的或“反義”寡核苷酸。為了本發(fā)明的目的，“反義”是指具有序列與mRNA的序列互補(bǔ)的寡核苷酸，因此它們能與那些序列以一種特異性氫鍵結(jié)合方式結(jié)合。然而，只要寡核苷酸在濃度低于1μM時(shí)具有抗VEGF的活性，它就有可能有錯(cuò)配或者不完全正確的氫鍵方式結(jié)合。
本發(fā)明的反義寡核苷酸包括一些提高其生物學(xué)穩(wěn)定性的修飾。其生物學(xué)穩(wěn)定性的提高是通過在不同的或所有的核苷酸殘基中摻入核酸酶抗性鍵如硫代磷酸酯鍵。本發(fā)明的寡核苷酸還包括在不同的或所有的嘧啶位置上的化學(xué)修飾。這些修飾過的堿基包括5-丙炔基嘧啶、C5-己炔基嘧啶或6-氮雜嘧啶或結(jié)合C5和6-氮雜嘧啶的衍生物，這些修飾可進(jìn)一步穩(wěn)定本發(fā)明的寡核苷酸。
在本發(fā)明的反義寡核苷酸包括可增加其對(duì)于目的序列結(jié)合親和力的修飾。通過在嘧啶堿基中摻入不同的化學(xué)成分提高結(jié)合親和力。這些寡核苷酸包括在不同的或所有嘧啶位置上的化學(xué)修飾的堿基。這些經(jīng)修飾的堿基包括C5-丙炔基嘧啶，C5-己炔基嘧啶或既有C5又有6-氮雜的嘧啶衍生物。
反義寡核苷酸可與天然的mRNA相結(jié)合也可與化學(xué)合成的與VEGFmRNA上的序列相同的RNA序列結(jié)合。這種結(jié)合可以通過多種方法證實(shí)。其中一種觀察結(jié)合的方法如實(shí)施例Ⅲ中描述。這種方法包括將反義寡核苷酸同一些化學(xué)合成的等長的mRNA分子相互混合，使該寡核苷酸在最初的加熱和冷卻步驟中退火，觀察混合物加熱時(shí)在260nm處吸光值的變化。還可以利用其它的方法對(duì)結(jié)合進(jìn)行檢測，例如核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)，寡核苷酸延伸實(shí)驗(yàn)，NMR，凝膠電泳或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一些技術(shù)。
為了本發(fā)明的目的“改善的結(jié)合親和力”或“穩(wěn)定性”是指該寡核苷酸與其目標(biāo)序列結(jié)合時(shí)的解鏈溫度(Tm)比一種沒有經(jīng)過修飾的寡核苷酸要高。如實(shí)施例Ⅲ中所描述的解鏈溫度的檢測方法用于此項(xiàng)檢測。本發(fā)明采用了那些可以提高反義寡核苷酸/mRNA目標(biāo)序列雙螺旋的結(jié)合親和力的化學(xué)修飾。一般地，在所述的方法中反義寡核苷酸的Tm高于45℃。更優(yōu)選的寡核苷酸Tm＞50℃。
本發(fā)明的特定寡核苷酸包括經(jīng)過化學(xué)修飾的活性高于那些已知VEGF反義寡核苷酸?；钚蕴岣咭馕吨w內(nèi)抑制VEGF表達(dá)所需的寡核苷酸濃度較低。雖然本發(fā)明并不局限于這些修飾作用的模式，目前所關(guān)注的寡核苷酸增加的活性至少有一部分原因是由于增加的結(jié)合親和力和生物學(xué)穩(wěn)定性。如前所述，這些特異性的化學(xué)修飾可用于提高此寡核苷酸的活性。
本發(fā)明所關(guān)注的反義寡核苷酸在濃度低于大約1μM時(shí)無毒。參照實(shí)施例V所述方法測定毒性。
本發(fā)明的反義寡核苷酸降低處理的細(xì)胞中的VEGF產(chǎn)量。在一種方法中，將細(xì)胞與寡核苷酸組合物直接接觸，使寡核苷酸能夠被內(nèi)化入細(xì)胞并且到達(dá)其目標(biāo)mRNA序列。在處理之前，此寡核苷酸先在一種液體中溶解或懸浮，或使之摻入一種固體。合適的液體或固體的制劑為本領(lǐng)域已知，且可用周知的方法選擇。配制成的寡核苷酸直接與細(xì)胞接觸。在其它方法中，將按配方制成的寡核苷酸定位使該寡核苷酸可通過擴(kuò)散、分散或類似方式到達(dá)其靶細(xì)胞。本發(fā)明不要求寡核苷酸制劑直接接觸目標(biāo)細(xì)胞。發(fā)明僅要求此核苷酸到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞。例如，可將一種寡核苷酸導(dǎo)入血液中，但是它可能在到達(dá)目標(biāo)腫瘤細(xì)胞，關(guān)節(jié)炎細(xì)胞等等之前已從血液中擴(kuò)散出去了。另外，寡核苷酸可被混入一種粉末直接用于皮膚且擴(kuò)散到下面的細(xì)胞中。
用本發(fā)明的反義寡核苷酸處理過細(xì)胞在同樣條件下最多大約可以產(chǎn)生相對(duì)于未經(jīng)處理過的細(xì)胞的90％的VEGF。且在寡核苷酸溶液濃度低于約1μM時(shí)即可觀察到該效果。
一種測定VEGF產(chǎn)量降低的方法如實(shí)施例Ⅵ中所述。但是，也可以用其它的方法測定VEGF產(chǎn)量的下降，只要它們和實(shí)施例V中所述方法一樣敏感。通過測量經(jīng)過處理和未經(jīng)過處理的細(xì)胞產(chǎn)生VEGF的量確定由經(jīng)過處理的細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF的百分比。用處理過的細(xì)胞的產(chǎn)量除以未經(jīng)處理的細(xì)胞的產(chǎn)量再乘以100即為相對(duì)于處理過的細(xì)胞的產(chǎn)量百分比。其中處理過的細(xì)胞與未處理過的細(xì)胞除了在培養(yǎng)基中是否存在寡核苷酸制劑的方面之外在各方面都是相同的。因此檢測中所用的細(xì)胞應(yīng)該有相同的類型、傳代數(shù)、表型以及處在細(xì)胞生長的同一時(shí)期。細(xì)胞在相同的條件下生長，包括培養(yǎng)基(除了是否加入了寡核苷酸制劑本身的變化)，溫度和相同的氣體條件。在這些條件下，經(jīng)本發(fā)明的寡核苷酸處理過的細(xì)胞的VEGF的產(chǎn)量最多可以達(dá)到未經(jīng)處理過的細(xì)胞的產(chǎn)量的約90％。當(dāng)反義寡核苷酸溶液中的濃度高達(dá)1μM時(shí)，如果是用固體制劑也要達(dá)到相似的摩爾百分?jǐn)?shù)。
優(yōu)選的寡核苷酸摻入能夠提高其核酸酶降解抗性的一些化學(xué)修飾。在這些實(shí)施方案中化學(xué)修飾的設(shè)計(jì)是指對(duì)在寡核苷酸中常見的天然存在的化學(xué)物的修飾。本發(fā)明的特定化學(xué)成分包括硫代磷酸酯鍵。這些修飾可位于一些或全部核苷酸殘基之間。最優(yōu)選的寡核苷酸含有10個(gè)硫代磷酸酯和8個(gè)磷酸二酯鍵。除了核苷酸鍵之外，對(duì)堿基組分的化學(xué)修飾能提高對(duì)核酸酶的降解抗性。更特別的，對(duì)吡啶環(huán)的修飾包括C5-丙炔基和己炔基基團(tuán)和/或6-氮雜吡啶的修飾。
測定核酸酶抗性的一種方法是通過檢測寡核苷酸在血清中的半衰期。這是采用本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)方法完成的。為本發(fā)明的目的，可以采用一種降低反義寡核苷酸的核酸酶降解速率的化學(xué)成分，如果帶有該組分的寡核苷酸比無此組分的有更長的血清半衰期。含有硫代磷酸酯的寡核苷酸血清半衰期大大超過24小時(shí)。而與其相對(duì)應(yīng)的僅含有磷酸二酯鍵的寡核苷酸的半衰期不超過3小時(shí)。
所設(shè)計(jì)的寡核苷酸在其嘧啶環(huán)上帶有化學(xué)修飾。最優(yōu)選的寡核苷酸包括有C5-丙炔基嘧啶、C5-己炔基嘧啶和/或6-氮雜嘧啶。這些修飾提高了它們的Tm值，生物學(xué)穩(wěn)定性和活性。帶有修飾的寡核苷酸前體的合成如實(shí)施例Ⅰ所述。從這些或其它受保護(hù)的核苷酸合成寡核苷酸采用本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)方法。
本發(fā)明中特定的實(shí)施方案是指能提高寡核苷酸活性的細(xì)胞吸收增強(qiáng)組合物。一般地，這些組合物可促進(jìn)一種液體穿過液體雙層的運(yùn)輸。在一些實(shí)施方案中，將寡聚物與一種親脂的分子共價(jià)連接。這可改善寡核苷酸與膜的結(jié)合和穿透性質(zhì)，如膽固醇、脂肪酸或其它親脂性鏈。這些分子可以通過本領(lǐng)域周知的標(biāo)準(zhǔn)方法與寡核苷酸化學(xué)性連接。
在另一些實(shí)施方案中，可利用陽離子脂質(zhì)體或脂質(zhì)體制劑作為吸收的增強(qiáng)劑。這些試劑因?yàn)槠溥m應(yīng)性所以有吸引力。這些實(shí)施方案的優(yōu)勢(shì)在于同一個(gè)運(yùn)輸載體可用于寡核苷酸混合物的導(dǎo)入。一種實(shí)施方案中特別選用了脂質(zhì)體制劑Cellfectin。其它的實(shí)施方案中包括一類多氨基脂吸收增強(qiáng)劑，包括亞精胺-膽固醇(SpdC)。后一種化合物具有在血清存在下同樣有效地發(fā)揮作用的優(yōu)勢(shì)。帶有細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑的反義寡核苷酸的制備方法及組合物如實(shí)施例Ⅳ,Ⅵ和Ⅶ中所述。
本發(fā)明的特定寡核苷酸是鹽的形式。此鹽形式是一種寡核苷酸與帶有正電荷(陽離子)的原子或分子結(jié)合的形式。合適的陽離子包括但不局限于鈉離子，鉀離子，銨根離子，亞精胺或多氨基脂，如亞精胺-膽固醇等等。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案還包括一種脂質(zhì)體。適宜的脂質(zhì)體為本領(lǐng)域周知。本發(fā)明特定的脂質(zhì)體特別包括Cellfectin。其它的組合物包括混有DOPE的亞精胺-膽固醇。采用本領(lǐng)域已知方法制備脂質(zhì)體制劑。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案通過持續(xù)釋放系統(tǒng)運(yùn)輸其寡核苷酸組合物，包括但不局限于一些寡聚體釋放載體，例如聚己酸內(nèi)酯或聚己酸內(nèi)酯與甲氧基聚乙二醇的混合物。用于本發(fā)明的反義寡核苷酸摻入到持續(xù)釋放系統(tǒng)中的方法和組合物為本領(lǐng)域周知。
附圖的簡要說明

圖1．表示本發(fā)明中反義寡核苷酸合成中用以替換天然堿基的本發(fā)明的修飾的堿基。
圖2．制備5-(1-己炔基或丙炔基)-6-氮雜-2’脫氧尿苷亞磷酰胺(參見圖1)圖3．反義寡核苷酸對(duì)培養(yǎng)的正常人角質(zhì)細(xì)胞VEGF產(chǎn)生的影響。
圖4．施用帶有或沒有Cellfectin的反義寡核苷酸(序列編號(hào)NO.2)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。
圖5．施用帶有或沒有Cellfectin的反義寡核苷酸(序列編號(hào)No.27)對(duì)角質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。
圖6．不同的細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑對(duì)T30639(序列編號(hào)NO.2)的角質(zhì)細(xì)胞活性的影響。
圖7．細(xì)胞短期暴露于本發(fā)明寡核苷酸制劑以及VEGF表達(dá)的長期抑制。
圖8．細(xì)胞短期暴露于本發(fā)明寡核苷酸制劑以及VEGF表達(dá)的長期抑制。
圖9．細(xì)胞短期暴露于本發(fā)明寡核苷酸制劑以及VEGF表達(dá)的長期抑制。
圖10．帶有末端修飾的、VEGF反義寡核苷酸嵌合體在有無吸收增強(qiáng)劑的存在下對(duì)VEGF表達(dá)的影響優(yōu)選的實(shí)施方案的說明優(yōu)選的實(shí)施方案包括一種反義寡核苷酸，其能與一種編碼mRNA分子的多種VEGF的共同序列結(jié)合并且能夠在體內(nèi)抑制VEGF的表達(dá)。優(yōu)選的寡核苷酸含有在幾個(gè)磷酸二酯鍵位置上的硫代磷酸酯鍵，以及其它用以提高寡核苷酸與其目標(biāo)mRNA序列親和力的化學(xué)修飾。在優(yōu)選的組合物中寡核苷酸與能夠提高它們穿過細(xì)胞膜的能力的細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑一起做成制劑。
本發(fā)明的寡核苷酸的長度范圍從約17-30個(gè)堿基。優(yōu)選的寡核苷酸長度為19個(gè)核苷酸。其序列的選定是基于與編碼VEGF基因的mRNA分子互補(bǔ)的原則。mRNA分子上與寡核苷酸互補(bǔ)的區(qū)域稱為目標(biāo)序列。優(yōu)選的反義寡核苷酸能夠與四種已知的VEGF mRNA分子包括VEGF206,VEGF185,VEGF165和VEGF121上共有目標(biāo)序列互補(bǔ)。
設(shè)計(jì)的寡核苷酸帶有一些提高它們與目標(biāo)mRNA結(jié)合親和力的化學(xué)修飾。優(yōu)選的寡核苷酸帶有C5-丙炔基嘧啶，C5-己炔基嘧啶和/或6-氮雜嘧啶。優(yōu)選的修飾提高寡核苷酸與其目標(biāo)序列解離時(shí)的溫度。帶有這些修飾的核苷酸前體的合成如實(shí)施例Ⅰ中所述。按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法從被保護(hù)的核苷酸合成寡核苷酸。
優(yōu)選的寡核苷酸摻入一些增加其核酸酶降解抗性的化學(xué)修飾。雖然本發(fā)明并不局限于這種抗性機(jī)制，經(jīng)過化學(xué)修飾的核苷酸認(rèn)為可以通過在核酸酶的底物結(jié)合口袋處干擾與寡核苷酸的結(jié)合來抵抗核酸酶的降解。這些優(yōu)選的核酸酶抗性的寡核苷酸在至少一些核苷酸殘基之間含有硫代磷酸酯鍵。最優(yōu)選的寡核苷酸包括10個(gè)硫代磷酸酯和8個(gè)磷酸二酯鍵。
在優(yōu)選的組合物中，本發(fā)明的寡核苷酸是與能提高其穿過細(xì)胞膜的能力的細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑一起配制或混合的。本發(fā)明所使用的細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑包括二油酰磷酯酰乙醇胺，Cellfectin，亞精胺-膽固醇等。最優(yōu)選的組合物是按質(zhì)量比1∶1混合的亞精胺-膽固醇和二油酰磷酯酰乙醇胺。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法將此制劑與10nM-1μM濃度的寡核苷酸混合。
本發(fā)明的寡核苷酸組合物是根據(jù)它們體內(nèi)的活性選擇的。優(yōu)選的組合物在寡核苷酸濃度高達(dá)1μM時(shí)基本上無細(xì)胞毒性。用于此檢測的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性檢測的方法如實(shí)施例Ⅰ所述。還要證明這種組合物在濃度低于1μM時(shí)有降低細(xì)胞VEGF產(chǎn)量的能力。
本發(fā)明在已建立的意在包括用于實(shí)踐本發(fā)明優(yōu)選模式的具體實(shí)施方案中加以闡述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，按照本公開的精神，可以在不超出本發(fā)明的范圍的情況下對(duì)具體的實(shí)施方案進(jìn)行多種修飾和變化。所有這些修飾均認(rèn)為落在后附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例Ⅰ制備用于摻入合成寡核苷酸的修飾過的堿基的方法這些用于提高合成的寡核苷酸的結(jié)合親和力和/或特異性的修飾過的堿基如圖1所示。圖2給出的是制備5-(1-己炔基或丙炔基)-6-氮雜-2’脫氧尿苷亞磷酰胺的合成示意圖。此合成為制備含有6-氮雜尿苷的反義寡核苷酸提供了構(gòu)件塊。6-氮雜胞苷的合成也采用相似的示意圖。制備5-(1-己炔基)-6-氮雜-2’-脫氧尿苷亞磷酰胺詳細(xì)的合成方法如下所述。用同樣的方法可從5’-碘代衍生物7制備5’-丙炔基衍生物。
3’-5’-雙-氧-對(duì)-甲苯基-5-碘代-6-氮雜-2’-脫氧尿苷(7a)將0.5ml的氯三甲基硅烷加入到5-碘代-6-氮雜尿嘧啶(5.8g,33.47mmol)的1,1,1,3,3,3-六甲基二硅烷胺(HMDS,80ml)溶液中，回流加熱6小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫，真空中使HMDS蒸發(fā)。殘余物在高度真空下抽干4小時(shí)。將干燥好的甲硅烷基衍生物溶解在二氯甲烷(60ml)中。在此溶液中加入1-氯-2-脫氧-3,5-雙-氧-對(duì)-甲苯基-b-D-赤-呋喃戊糖(6,16.3g,42mmol)和氯化鋅(0.46g,3.35mmol)在氬氣中攪拌混合24小時(shí)。用二氯甲烷(250ml)稀釋該反應(yīng)混合物，并用水飽和的NaHCO3溶液(100ml)洗滌二氯甲烷溶液。用二氯甲烷(4×100ml)抽提水相，合并的有機(jī)相用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。殘余物用硅膠柱(4×15cm)層析純化。產(chǎn)物用含有0-5％甲醇的二氯甲烷洗脫。經(jīng)干燥的異頭體產(chǎn)物重15g。純的b異頭體可以通過與二氯甲烷和甲醇(4∶1,200ml)的混合物研制而獲得。通過過濾和蒸發(fā)收集固體。重復(fù)此研制過程可得10.5g純的b異頭體。熔點(diǎn)204-205℃。1H NMR(DMSO-d6):d2.35,2.37(2s,6H,2CH3),2.80(m,2H,C2’H和C2”H),4.43(s,3H,C4’H,C5’H2),5.55(brs,1H,C3H),6.39(t,J=6.0Hz,1H,C1’H),7.28(t,4H,Tol),7.85(t,4H,Tol),12.42(brs,1H,NH)C24H24IN3O7的元素分析計(jì)算值為C,48.58；H,4.08；N,7.08，實(shí)驗(yàn)值C,48.85；H,3.80；N,6.92。
3’,5’-雙-氧-對(duì)-甲苯基-5-(1-己炔基)-6-氮雜-2’脫氧尿苷(8a):
3’,5’-雙-甲苯基-5-碘代-6-氮雜-2’-脫氧尿苷(7,3.84克，6.5毫摩爾)與干DMF(25ml)共蒸發(fā)干燥后溶解在DMF(30ml)中并在氬氣條件下加入CuI(0.25g,1.3mmol)，三乙胺(1.82ml,13mmol),1-己炔(2.23ml,19.5mmol)以及四(三苯基膦)鈀(0.75g,0.65mmol)。該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)并加入0.5g四(三苯基膦)鈀。48小時(shí)后蒸發(fā)溶劑，殘留物與甲苯共蒸發(fā)。用硅膠層析柱純化殘留物，產(chǎn)物用含有0-5％乙酸乙酯的二氯甲烷洗脫得到0.9g的標(biāo)題化合物。熔點(diǎn)198-200℃。1H NMR(DMSO-d6):d 0.87(t,3H,CH3),1.45(m,4H,2,CH2),2.37,2.39(2s,6H,2CH3),2.45(m,3H,CH2和C2”H),2.84(m,1H,C2’H),4.45(s,3H,C4’H,C5’H2),5.59(brs,1H,C3’H),6.49(t,J=6.3Hz,1H,C1’H),7.31(dd,4H,Tol),7.88(dd,4H,Tol),12.40(br s,1H,NH)。C30H33N3O7的元素分析計(jì)算值C,65.80；H,6.07；N,7.68，實(shí)驗(yàn)值C,65.61；H,5.73；H,7.29。
6-氮雜-5-(1-己炔基)-2’脫氧尿苷(9a):
3’,5’-雙-氧-對(duì)-甲苯基-5-(1-己炔基)-2’-脫氧尿苷(8a,0.8g,1.47mmol)和甲醇(55ml)及甲醇鈉(25％的甲醇溶液，1.28ml)的混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，加入Dowex 50X8(H+)樹脂終止反應(yīng)。該樹脂通過過濾除去，蒸發(fā)濾液。殘留物可用硅膠柱層析純化，用含有0-4％甲醇的二氯甲烷洗脫產(chǎn)生0.38g(84％)的高度吸水的標(biāo)題化合物。
1HNMR(DMSO-d6):d0.88(t,3H,CH3),1.47(m,4H,2,CH2),2.02(m,1H,C2″H),2.33(m,1H,C2′H),2.46(m,2H,CH2),3.40(m.2H.C5′H2),3.68(m,1H,C4′H,),4.21(br s,1H,C3′H),4.61(t,1H,C5′OH),5.17(d,1H,C3′OH),6.49(dd,1H,C1′H),12.27(br s,1H,NH).
5’-氧-(4,4’-雙甲氧三?；?-6-氮雜-5-(1-己炔基)-2’脫氧尿苷(10a):
4,4’-雙甲氧三酰氯(0.51g,1.5mmol)加入5-(1-己炔基)-6-氮雜-2’脫氧尿苷(0.38g,1.24mmol)的干吡啶(10毫升)溶液中。攪拌6小時(shí)后，加入0.5g DMT-Cl，該反應(yīng)混合物攪拌過夜。該反應(yīng)混合物用二氯甲烷(100毫升)稀釋，用水(20毫升)洗該有機(jī)溶液。水相用二氯甲烷抽提，合并有機(jī)相用Na2SO4干燥并蒸發(fā)。殘留物與甲苯(10毫升)共蒸發(fā)，用硅膠層析柱(2×10cm)純化殘留物。產(chǎn)物用含有0-1.5％甲醇的二氯甲烷洗脫，得到0.45g。
1H NMR(DMSO-d6):d0.85(t,3H,CH3),1.37(m,4H,2,CH2),2.08(m,1H,C2″H),2.37(m,3H,CH2and C2′H),3.06(m,2H,C5′H2),3.72(s,6H,2OMe),3.87(m,1H,C4′H,),4.20(m,1H,C3′H),5.23(d,1H,C3′OH),6.35(dd,1H,C1′H),6.83(m,4H,DMT),7.16-7.25(m,9H,DMT),12.30(br s,1H,NH).
5’-氧-(4,4’-雙甲氧三?；?-6-氮雜-5-(1-己炔基)-2’脫氧尿苷-3’-氧-(2-氰乙基)-N,N-二異丙基亞磷酰胺(11a):
5’-氧-(4,4’-雙甲氧三?；?-6-氮雜-5-(1-己炔基)-2’脫氧尿苷(10a)在二氯甲烷中在N,N-二異丙基乙胺以周知的方法提供亞磷酰胺11a時(shí)與2-氰乙基-N,N-二異丙基亞磷酰胺反應(yīng)。
實(shí)施例Ⅱ寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成選擇能夠與所有VEGF mRNA的剪切變體共同的mRNA目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合的反義寡核苷酸序列。表1給出了一些合成的寡核苷酸的序列的例子。為了提高它們對(duì)于mRNA目標(biāo)的結(jié)合親和力，這些寡核苷酸用帶有C5-丙炔基或C5-己炔基基團(tuán)的嘧啶合成，如圖1所示(Wagner等人，1993)。還考慮包括6-氮雜脫氧尿苷和6-氮雜脫氧胞苷等其它修飾過的堿基(圖2)，也考慮這些修飾的組合。寡核苷酸T30691(序列編號(hào)NO.27)與反義寡核苷酸T30639(序列編號(hào)No.2)互補(bǔ)，在下面的實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照。其與T30639(序列編號(hào)No.2)的大小相同，含有相同的骨架以及堿基的修飾。
實(shí)施例Ⅲ反義寡核苷酸-RNA異源雙螺旋相互作用的Tm值檢測反義寡核苷酸RNA雙螺旋的溫度(Tm)可用來評(píng)估結(jié)合親和力。Tm值用一個(gè)裝有溫度控制的二極管陣列分光光度計(jì)測定(HewlettPackard Model 8452)。反義寡核苷酸與合成的同等大小的RNA目標(biāo)(每一種1μM)，在含2mM的磷酸鈉pH7.0,18mM NaCl和1mM EDTA溶液中混合。該溶液在分光光度計(jì)的小室中加熱到90℃,10分鐘，并用多于10分鐘時(shí)間冷卻到20℃。然后平衡10分鐘使雙螺旋形成。為了檢測雙螺旋的解鏈溫度(Tm)，小室的溫度以1℃/min的速度慢慢地從20℃加熱到80℃，測定在260nm處的吸光值作為溫度的函數(shù)。吸光值信號(hào)的升高意味著雙螺旋的解鏈或打開成單鏈寡聚體?？衫萌鐦?biāo)準(zhǔn)方法所述的方程從熔解曲線上求出雙螺旋形成的Tm值(Puglisi和Tinoco,1989)。Tm值如表2所示。摻入C5-丙炔基或C5-己炔基修飾堿基的硫代磷酸酯寡核苷酸導(dǎo)致Tm值比未經(jīng)修飾的寡核苷酸明顯升高。這顯示了反義寡核苷酸對(duì)其目標(biāo)序列的親和力顯著增加。
表2T30807(反義DNA
<p>實(shí)施例Ⅳ吸收增強(qiáng)劑的制備無協(xié)助的反義寡核苷酸的細(xì)胞吸收很低低(Ficher等人，1993；Guy-caffey等人，1995)。為了提高進(jìn)入細(xì)胞的能力采用了多種商品化的吸收增強(qiáng)劑以及由本發(fā)明人合成的新型多氨基脂制劑。
實(shí)施例Ⅴ細(xì)胞毒性的檢測細(xì)胞以500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。接種一天后，用一系列稀釋的寡核苷酸制劑處理細(xì)胞(每個(gè)稀釋度作四個(gè)平行孔)。處理1天后或4天后用一種非放射性檢測系統(tǒng)測定細(xì)胞存活力的影響(Cell Titer96 Aqueous cell proliferation assay,Promega公司)。本發(fā)明的寡核苷酸濃度在低于1μM時(shí)未觀察到毒性。
實(shí)施例Ⅵ寡核苷酸的細(xì)胞學(xué)檢測用培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞來評(píng)價(jià)反義寡核苷酸、其修飾過的對(duì)應(yīng)物和不同制劑的活性。角質(zhì)細(xì)胞是一種初級(jí)細(xì)胞系，它可在正常的培養(yǎng)條件下分泌VEGF(Bauaun等人，1995；Frank等人，1995)。細(xì)胞按50-100,000個(gè)細(xì)胞/孔/0.5mlKGM培養(yǎng)基(Clonetics)的密度接種到48孔板上。用一種靈敏的、以ELISA檢測為基礎(chǔ)的蛋白檢測系統(tǒng)(R&amp;D Systerm)來測定細(xì)胞上清中的VEGF蛋白質(zhì)水平。初步的檢測表明當(dāng)NHEK細(xì)胞在建議的培養(yǎng)基中生長時(shí)，0.5ml培養(yǎng)基中的50,000個(gè)細(xì)胞在15個(gè)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生大約150-200pg VEGF(即未經(jīng)處理的細(xì)胞上清中大約300-400pg/ml)。細(xì)胞和寡核苷酸制劑一起培養(yǎng)15個(gè)小時(shí)。四種抗VEGF寡核苷酸中有三種在0.2μM的濃度范圍內(nèi)有活性(在有10μg/mlCellfectin存在的情況下)。而對(duì)照的有義(sense)寡核苷酸對(duì)細(xì)胞沒有影響(結(jié)果沒有給出)，結(jié)果如圖3所示。
為了評(píng)價(jià)反義的效果，在加入或不加入細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑的情況下向細(xì)胞施用寡核苷酸。在最初的實(shí)驗(yàn)中，不帶有堿基修飾的硫代磷酸酯寡核苷酸在濃度低于1μM時(shí)有效，并且無載體對(duì)其活性沒有明顯的影響(結(jié)果未給出)。當(dāng)濃度大于1μM時(shí)寡核苷酸易于非特異性抑制VEGF的表達(dá)(結(jié)果未給出)。這些非特異性的效果為本領(lǐng)域已知(Stein等人，1993；Wagner,1994)。為了避免這些非特異性的效果，將吸收增強(qiáng)劑與寡核苷酸混合。Cellfectin是一種用四棕櫚酰亞精胺(Tm-TPS)與二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)(Tm-TPS/DOPE，按質(zhì)量比1∶1.5 LifeTechnologies公司)的一種脂質(zhì)體制劑，它比經(jīng)檢測的其它一些商品化運(yùn)輸介質(zhì)的活性更高，毒性更低。與多氨基脂SpdC的脂質(zhì)體制劑配制的寡核苷酸更有效(Guy-Caffey等人，1995；SpdC/DOPE,1∶1質(zhì)量比)。在典型的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，寡核苷酸(10nM-1μM)在室溫下溶解在大約20-40μl吸收增強(qiáng)劑的水溶液中，并孵育約10分鐘。將上述溶液與0.5ml的溫?zé)徇^的培養(yǎng)基混合并加入到細(xì)胞中。細(xì)胞在寡核苷酸存在下培養(yǎng)15小時(shí)。培養(yǎng)之后收集細(xì)胞上清，立即用于ELISA檢測或于-80℃儲(chǔ)存以用于將來的檢測(未發(fā)現(xiàn)未經(jīng)冷凍的樣品與經(jīng)過凍融的樣品中VEGF水平的明顯差別)。如圖4所示，在Cellfectin存在下反義寡核苷酸T30639(序列編號(hào)No.2)活性更強(qiáng)，而對(duì)照的“有義”寡核苷酸T30691(序列編號(hào)NO.27)在所用的最高濃度下也沒有什么效果。如圖5所示。
圖6給出了利用多種陽離子脂質(zhì)體制劑SpdC，亞精胺-膽固醇(Guy-Caffey等人，1995)；DC-Chol(Gao和Huang,1991)；CS，膽酸酯-亞精胺；DCS，脫氧膽酸酯-亞精胺；cF,Cellfectin施用0.1μM或0.2μM寡核苷酸(序列編號(hào)No.2)的效果。每種陽離子脂質(zhì)體制劑是將其與融合脂質(zhì)DOPE(質(zhì)量比1∶1)混合制得，凍干后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂们跋葘⒅|(zhì)體重懸在5％葡萄糖(1mg/ml的濃度)中，4℃貯存2周內(nèi)使用。按上所述的方法，進(jìn)行細(xì)胞處理之前將寡核苷酸與陽離子脂質(zhì)體制劑混合。
圖7-9給出了用不同濃度的反義寡核苷酸T30639(序列編號(hào)No.2)，以及其磷酸二酯-硫代磷酸酯嵌合體T30848(序列編號(hào)No.6)的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果(見表1)。圖7給出的是0.1μM寡核苷酸的效果，圖8給出的是0.2μM寡核苷酸的作用效果，圖9給出的是0.4μM寡核苷酸作用效果。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞用補(bǔ)加同SpdC/DOPE預(yù)混的反義寡核苷酸的培養(yǎng)基處理4小時(shí)。然后將培養(yǎng)基換成新鮮的未補(bǔ)加的培養(yǎng)基。圖(graph)1給出的是寡核苷酸組合物被洗掉16小時(shí)后VEGF的表達(dá)被抑制的百分?jǐn)?shù)。圖(graph)2是洗掉寡核苷酸40小時(shí)后的結(jié)果。圖(graph)3是寡核苷酸洗掉64小時(shí)后的結(jié)果。然后檢測收集的培養(yǎng)基中VEGF水平的量。在約3天的培養(yǎng)期結(jié)束后細(xì)胞的形態(tài)正常，圖7-9給出了寡核苷酸對(duì)VEGF表達(dá)的長效影響。在這些圖(graph)中符號(hào)(Δ)表示的是0.1μM的T30848(序列編號(hào)NO.6)；符號(hào)()表示的是0.1μM T30639(序列編號(hào)NO.2)。
圖10給出的是用帶有親脂性基團(tuán)的寡核苷酸衍生物所作的類似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。S96-5296(序列編號(hào)NO.20)其分子的3’末端用一個(gè)C-16脂基修飾且其含有8個(gè)磷酸二酯和11個(gè)硫代磷酸酯鍵。S96-5297(序列編號(hào)NO.21)有相同的骨架且3’末端的修飾是3’芘成分。這些疏水性成分可以提高與Cellfectin混合時(shí)寡核苷酸被吸收的程度及活性，且這些磷酸二酯鍵可以提高這些寡核苷酸的活性。符號(hào)()表示S96-5296(序列編號(hào)NO.20)，符號(hào)()表示S96-5296(序列編號(hào)NO.20)與10μg/mlCellfectin，符號(hào)(o)表示S96-5297(序列編號(hào)NO.21)，符號(hào)(·)表示S96-5297(序列編號(hào)NO.21)與10μg/ml Cellfectin，符號(hào)(□)表示0.2μM T30639(序列編號(hào)No.2)與10μg/ml的Cellfectin。
實(shí)施例Ⅶ反義寡核苷酸的抗VEGF活性含有不帶堿基修飾的硫代磷酸酯反義寡核苷酸對(duì)細(xì)胞VEGF的產(chǎn)生無明顯的影響，除了濃度超過1μM時(shí)一些序列不依賴性特異性抑制(數(shù)據(jù)未給出)。這些結(jié)果同其它研究相符，表明低的亞微摩劑量的單純硫代磷酸酯寡核苷酸不是有效的抑制物，在高濃度下這種寡核苷酸表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞代謝的非特異性效果(綜述Stein和Cheng,1993；Wagner,1994)。但是，含有C5-丙炔基修飾嘧啶(Wagner等人，1993)硫代磷酸酯的寡核苷酸特異性抑制細(xì)胞產(chǎn)生VEGF。見圖3。
這些經(jīng)過修飾的寡核苷酸的解鏈溫度比其它未修飾的寡核苷酸的解鏈溫度高出約15℃。見表2。這表明經(jīng)修飾的寡核苷酸與其目標(biāo)的親和力要高于那些未經(jīng)修飾的形式。
最適的寡核苷酸與Cellfectin的比例細(xì)胞對(duì)于寡核苷酸-陽離子脂質(zhì)體混合物的吸收部分取決于制劑中各個(gè)成分的化學(xué)性質(zhì)，部分取決于其濃度及其相對(duì)的質(zhì)量比，另一部分取決于目標(biāo)細(xì)胞的內(nèi)吞能力。將寡核苷酸T30639(序列編號(hào)NO.2)與Cellfectin共同施于NHEK細(xì)胞，寡核苷酸與TMTPS的比例為1∶3(質(zhì)量比)，可達(dá)到最佳的活性。在一個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，改變寡核苷酸的濃度但保持寡核苷酸與陽離子脂質(zhì)的比例，測定相對(duì)于“有義”對(duì)照物T30691(序列編號(hào)NO.27)對(duì)VEGF表達(dá)的影響。寡核苷酸T30639(序列編號(hào)NO.2)表現(xiàn)出特異的抗VEGF活性而對(duì)照寡核苷酸則沒有效果(見圖4和圖5)。
亞精胺-膽固醇+DOPE或DC-Chol+DOPE(脂質(zhì)體制劑，重量比1∶1)制劑對(duì)于寡核苷酸功效的影響有多種吸收增強(qiáng)劑被用于核酸治療中(Behr,1994；Guy-Caffey等人，1995,Lewis等人，1996)。其中的一種化合物是亞精胺-膽固醇偶聯(lián)物(SpdC)(Guy-Caffey等人，1995)。這種化合物在遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本發(fā)明所需要的濃度下對(duì)細(xì)胞無毒，并且連續(xù)處理嚙齒動(dòng)物1周以上也無毒性。另一種陽離子脂質(zhì)體DC-Chol(Gao和Huang,1991)被證明能用于基因治療，并且在細(xì)胞體系中也相對(duì)無毒。將脂質(zhì)體制劑SpdC/DOPE和DC-Chol/DOPE(SpdC或DC-Chol與二油酰磷酯酰膽堿)的質(zhì)量比范圍為1∶0.5,1∶1,1∶1.5和1∶2，其中1∶1的比例在與NHEK細(xì)胞的抗VEGF的檢測中最有效。見圖5。帶陽離子試劑的組合物效果比帶Cellfectin的活性要高20％-40％(圖6。)。
寡核苷酸制劑對(duì)細(xì)胞的短期處理就足以產(chǎn)生對(duì)VEGF產(chǎn)生的長期抑制效果。經(jīng)較短暫暴露于本發(fā)明所公開的組合物后VEGF的表達(dá)下降。例如，4小時(shí)孵育所表現(xiàn)出的抗VEGF的活性要超過過夜暴露于寡核苷酸的效果。見圖7-9。令人驚訝地，在全部實(shí)驗(yàn)過程中該效果至少持續(xù)3天。圖7-9。
其它的實(shí)驗(yàn)表明含有硫代磷酸酯和磷酸二酯嵌合骨架的反義寡核苷酸是一種有效的VEGF表達(dá)抑制物。特別的，含有10個(gè)硫代磷酸酯和8個(gè)磷酸二酯鍵T30639的嵌合變體(序列編號(hào)NO.2)以及脂質(zhì)末端修飾的S96-5296(序列編號(hào)NO.20)和S96-5297(序列編號(hào)NO.21)在有SpdC/DOPE的存在下表現(xiàn)出極佳的活性(圖7)。在僅4小時(shí)培養(yǎng)后VEGF的抑制長于3天(圖7)。在沒有SpdC存在時(shí)，這種嵌合寡核苷酸骨架不能影響VEGF表達(dá)。因此減少寡核苷酸的硫代磷酸酯鍵可以提高功效，并減少非特異性影響。吸收對(duì)寡核苷酸的功效至關(guān)重要。實(shí)施例Ⅷ體內(nèi)VEGF的抑制。
A．特定的目的。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)升高常參與與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病，新生血管性青光眼及許多其它致盲性條件相關(guān)的眼血管新生的過程。視網(wǎng)膜的局部缺血導(dǎo)致血管生成蛋白質(zhì)VEGF合成的增加，這就引發(fā)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，并導(dǎo)致了視網(wǎng)膜、視神經(jīng)和虹膜中血管的大量不正常形成。然而至今對(duì)這種情況尚未有一種可以被接受的治療手段。我們的總體目標(biāo)是通過合理的設(shè)計(jì)和檢測手段建立一種新的、有潛在治療性的反義寡核苷酸VEGF表達(dá)抑制物，其目的在于治療人的與視網(wǎng)膜局部缺血相關(guān)的新血管增生。我們最新的在人細(xì)胞培養(yǎng)體系上的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們能夠制備特異性的寡核苷酸制劑，其在亞微摩濃度范圍內(nèi)即可抑制超過50％的VEGF細(xì)胞表達(dá)，我們?yōu)榇四康牡哪繕?biāo)是將我們的體外發(fā)現(xiàn)推廣到VEGF相關(guān)的新血管增生大鼠模型中。我們特殊的目的是1．合成一個(gè)直接拮抗大鼠VEGF mRNA的反義寡核苷酸“庫”。有三種主要的和一種次要的VEGF剪接體。十種寡核苷酸將以這些RNA序列的共同區(qū)域?yàn)榘?。它們將也含有核酸酶抗性骨架以及能夠提高其與目標(biāo)mRNA結(jié)合親和力的修飾過的堿基。
2．建立大鼠細(xì)胞單層和球狀體模型以檢測這些反義寡核苷酸及其制劑的活性和毒性。在此采用了C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，因?yàn)槠湟驯粡V泛地用于研究VEGF的功能。球狀體(細(xì)胞團(tuán))將用于評(píng)價(jià)我們的寡核苷酸是否能夠穿過細(xì)胞層。
3．用各種細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑評(píng)價(jià)寡核苷酸的效率。在Aronex所開發(fā)的各種化合物與許多商品化的試劑加以比較。
4．建立一種經(jīng)得起檢驗(yàn)的檢測方法以獲得支持反義機(jī)制的數(shù)據(jù)。設(shè)計(jì)這一體外實(shí)驗(yàn)是為驗(yàn)證我們是否能夠特異性地?fù)糁袃H僅一種VEGF同型體，以便回答我們的寡核苷酸是否是通過預(yù)想的模式起作用的。這將有助于將來對(duì)反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)。
5．用大鼠的體內(nèi)虹膜血管增生模型來檢測最有希望的反義寡核苷酸。這些研究將與在Harvard的Dr.Anthony Adamis共同完成。
在完成有目的的研究之后，我們希望獲得關(guān)于1-2種寡核苷酸體內(nèi)功效的大量信息。也可獲得一些關(guān)于劑量、可能的作用機(jī)理、細(xì)胞有效性以及潛在的毒性等信息。如任何一種寡核苷酸能夠在體內(nèi)降低血管的形成和/或VEGF表達(dá)的20％，我們就認(rèn)為是一種陽性進(jìn)展且在Ⅱ期研究過程中在動(dòng)物模型中作更詳細(xì)的研究。
選擇寡核苷酸，非特異性地與其它RNA結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)非常高，而高G含量序列的選擇可導(dǎo)致不期望的G-四聚體的形成，這將導(dǎo)致結(jié)合中所需的游離螺旋形式的減少(Bishop等人，1996)。有意采用的另一種方法是用含有C5-丙炔基嘧啶的選擇性修飾過的寡核苷酸，其修飾可以導(dǎo)致無明顯毒性的十分有效的結(jié)合(Wagner等人，1993；Fenster等人，1994)。我們最近已發(fā)現(xiàn)丙炔基修飾的效果相當(dāng)好(見最初的結(jié)果)。
提高寡核苷酸核酸酶抗性的方法含有天然的磷酸二酯骨架的寡核苷酸對(duì)血清和細(xì)胞核酸酶高度敏感。我們已確定一種隨機(jī)序列17堿基長的寡核苷酸在血清中的半衰期小于3分鐘(Bishop等人，1996)。另一種方法是采用帶有硫代磷酸酯骨架的寡聚體(Stein等人，1991)，這種修飾可將寡核苷酸的血清半衰期顯著地提高到1天或更長。硫代磷酸酯鍵的使用認(rèn)為在高水平下會(huì)導(dǎo)致一些非特異性的效果，但是正如以下的討論所說，我們希望合成一種經(jīng)過特異性修飾的寡核苷酸，其在一個(gè)很低的濃度下就可產(chǎn)生效果，因此減少了非特異性相互作用的風(fēng)險(xiǎn)。也測試過其它骨架的寡核苷酸，但是都有比硫代磷酸酯寡核苷酸有更大的非特異性效果。
一種提高寡核苷酸細(xì)胞吸收的方法亞細(xì)胞性分布研究表明，經(jīng)熒光寡核苷酸處理的細(xì)胞中，其大多聚集在核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(Guy-Caffey等人，1995)。內(nèi)化過程中的限速步驟似乎是寡核苷酸穿過質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的運(yùn)輸。有兩種可能的途徑可以促進(jìn)寡核苷酸穿過膜脂雙層的運(yùn)輸。在第一個(gè)途徑中，可將寡聚體與一種可以改善其與細(xì)胞膜親和及通透性質(zhì)的化合物共價(jià)偶聯(lián)，例如與膽固醇偶聯(lián)(Letsinger等人，1989)。我們最近提出了一種新型的適當(dāng)修飾，一種親脂的二茂鐵鏈(見實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))，這種物質(zhì)明顯地提高了反義寡核苷酸的功效。此外，也可采用其它的吸收增強(qiáng)劑如陽離子脂質(zhì)或脂質(zhì)體制劑等。這些試劑有吸引力是因?yàn)樗鼈兪嵌喙δ艿?，即用同一個(gè)運(yùn)輸載體可以同時(shí)導(dǎo)入多種寡核苷酸。這些陽離子脂質(zhì)的設(shè)計(jì)摻入一個(gè)帶正電荷的與核酸結(jié)合的頭部基團(tuán)，以及一個(gè)能與膜相互作用的尾巴，這一部分意在與融合脂質(zhì)相互作用且/或?qū)е录?xì)胞膜的不穩(wěn)定。許多陽離子脂質(zhì)制劑(如Lipofectin)的活性受多種因素例如核酸的組成和質(zhì)量、細(xì)胞類型以及細(xì)胞生長培養(yǎng)基中血清的濃度等的影響。此外有些制劑是有細(xì)胞毒性的。這些缺陷嚴(yán)重地限制了這些的化合物用作治療性寡核苷酸的運(yùn)輸劑在動(dòng)物體系中的應(yīng)用，而且迫切需要有效的吸收增強(qiáng)劑。我們合成了一種新的運(yùn)輸載體，亞精胺-膽固醇(SpdC)，即使在有血清的情況下，也可提高寡核苷酸細(xì)胞吸收以及穿過細(xì)胞膜的能力(Guy-Caffey等人，1995)。對(duì)使用這種化合物的制劑將作為目的研究的一部分進(jìn)行評(píng)價(jià)。
我們的目的是確立一種能夠抑制眼球細(xì)胞VEGF表達(dá)并同時(shí)降低與疾病相關(guān)的血管增生的反義寡核苷酸制劑。這些研究受到我們最近的一個(gè)發(fā)現(xiàn)的鼓舞，那就是，經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸在亞微摩的劑量下有很強(qiáng)的抑制活性。此外，利用Dr.Adamis所建立的VEGF相關(guān)血管增生的動(dòng)物模型，我們將能夠在體內(nèi)檢測其中最有效的化合物。初步的結(jié)果總結(jié)我們最初一系列的連續(xù)的實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)和/或驗(yàn)證一些細(xì)胞基礎(chǔ)的VEGF表達(dá)模型中提高反義寡核苷酸活性的普遍原理和方法。初步的，我們的目標(biāo)是·建立一種定量的細(xì)胞水平的篩選檢測反義寡核苷酸對(duì)VEGF蛋白質(zhì)水平的效果的方法?！ず铣梢恍в薪Y(jié)構(gòu)性修飾使其提高對(duì)目標(biāo)mRNA的結(jié)合親和力、核酸酶抗性以及特異性的寡核苷酸?！z測用新的吸收增強(qiáng)劑(有些在Aronex合成)促進(jìn)施用的寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)化和膜穿透的制劑。
寡核苷酸的設(shè)計(jì)由于我們期望我們的化合物中的一種最終能在人體中測試，本發(fā)明一開始就使用直接針對(duì)人VEGF mRNA的反義寡核苷酸。為了達(dá)到最大抑制表達(dá)的效果，我們選擇了能與四種VEGF mRNA的共同序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸(表3)。
反義寡核苷酸(起始密碼子AUG在mRNA序列．57)T30638:mRNA seq.87-105 5’-a*g*a*g*C*a*g*C*a*a*g*g*C*g*a*g*g*C*t-3T30639:mRNA seq.185-023 5’-g*C*g*C*U*g*a*U*a*g*a*C*a*U*C*C*a*U*g-3T30640:mRNA seq.204-222 5’-C*g*a*U*U*g*g*a*U*g*g*C*a*g*U*a*g*C*t-3T30641:mRNA seq.232-250 5’-U*a*C*U*C*C*U*g*g*a*a*g*a*U*g*U*C*C*a-3全部的硫代磷酸酯(*)骨架具有核酸酶抗性。
C5-丙炔基嘧啶以提高對(duì)目標(biāo)RNA的結(jié)合親和力。
表3．直接針對(duì)人VEGF的反義寡核苷酸與初始報(bào)告一致(Wagner等人，1993)，我們發(fā)現(xiàn)C5-丙炔基嘧啶堿基替換提高了指示鏈間親和力的雙螺旋形成的Tm值，可以從未經(jīng)修飾的寡核苷酸的-60℃升高到超過80℃。作為一種對(duì)照，我們同時(shí)還合成了一個(gè)大小相同及相同的修飾的“有義”寡核苷酸T30691。
寡核苷酸的細(xì)胞檢測采用培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞，一種分泌VEGF的初級(jí)細(xì)胞系評(píng)價(jià)反義寡核苷酸、其修飾過的對(duì)應(yīng)物及不同的制劑的活性。細(xì)胞按50,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到0.5ml的KGM培養(yǎng)基的46孔板上(Clonetics)。用酶聯(lián)免疫吸附鑒定(ELISA)方法測定分泌到生長培養(yǎng)基中的VEGF的水平(R&amp;D Systems)。這種檢測在5-1000pg/ml范圍內(nèi)呈線性。我們的檢測表明NHEK細(xì)胞在推薦的培養(yǎng)基中生長時(shí)，接種在0.5ml培養(yǎng)基中100,000個(gè)細(xì)胞15個(gè)小時(shí)內(nèi)能產(chǎn)生大約150pgVEGF(在未經(jīng)處理的對(duì)照上清中大約300pg/ml)。
大多數(shù)的細(xì)胞水平的檢測采用一種商品化的陽離子脂質(zhì)體制劑，作為一種向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸基因的一種轉(zhuǎn)染劑來完成。(Cellfectin，購自LifeTechnologies)。發(fā)現(xiàn)其它商品化的轉(zhuǎn)染試劑或有毒或效果相對(duì)較差(7次檢測)。一種Cellfectin的難以理解的效果是當(dāng)單獨(dú)施于細(xì)胞時(shí)，作為對(duì)照，它實(shí)際上促進(jìn)VEGF產(chǎn)生。其中的原因未知。最近我們開始采用亞精胺-膽固醇制劑(Guy-Caffey等人，1995)。
在最早的實(shí)驗(yàn)中，使用了不帶有C5-丙炔基修飾的硫代磷酸酯反義寡核苷酸，我們發(fā)現(xiàn)其對(duì)VEGF水平無影響(甚至在高達(dá)5μM的胞外濃度下，無論是否加入了吸收增強(qiáng)劑)。在更高水平上，有很少的似乎為非特異性抑制(數(shù)據(jù)未給出)。當(dāng)用含有C5-丙炔基嘧啶(Wagner等人，1993)來替換胞嘧啶和胸腺嘧啶核苷后，在體內(nèi)測得的Tm值提高20℃，這表明寡核苷酸與其合成的目標(biāo)RNA的親和力大大高于未經(jīng)修飾的變體(數(shù)據(jù)未給出)。我們?cè)谟袩o吸收增強(qiáng)劑的情況下檢測這些寡核苷酸的效果，并改變吸收增強(qiáng)劑與寡核苷酸的比例以期獲得一個(gè)最佳的配方。我們發(fā)現(xiàn)不同的寡核苷酸對(duì)VEGF水平有不同的影響。
圖3．四種寡核苷酸中的三種在有10μg/ml Cellfectin時(shí)在0.2μM的范圍內(nèi)有活性。對(duì)照有義寡核苷酸沒有效果(沒有給出)。其中最有效的所測寡核苷酸，T30639，已用于后面的優(yōu)化研究。
最適的寡核苷酸和吸收增強(qiáng)劑的比例在下面的實(shí)驗(yàn)中，我們將寡核苷酸(反義的T30639和有義的T30691對(duì)照)與陽離子脂質(zhì)體成分cF的質(zhì)量比維持在1∶3，并檢測對(duì)VEGF產(chǎn)生的影響。T30639+cF又一次表明了有特異性抗VEGF活性，而對(duì)照寡核苷酸則沒有效果。圖11．
圖11．寡核苷酸Cellfectin(1∶3)制劑對(duì)VEGF表達(dá)的影響。
在高濃度下，表現(xiàn)出非特異性的效果(未給出)。需要注意的是我們并沒有試圖將游離的吸收增強(qiáng)劑與綁縛材料分開。當(dāng)我們改變一種與另一種的相對(duì)比例時(shí)這肯定會(huì)有影響。
寡核苷酸大小的影響在下一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們探尋是否可以在減少寡核苷酸大小的情況下維持其特異性抗VEGF活性。短寡聚體的合成也較便宜。但是，用同樣的NHEK檢測，我們發(fā)現(xiàn)19個(gè)堿基的寡核苷酸要比16個(gè)或14個(gè)堿基的衍生物更有效，所有寡核苷酸都與10μg/mlCellfectin一起施用。改變Cellfetin與寡核苷酸的比例并不會(huì)改變其相對(duì)活性(未給出)。
亞精胺-膽固醇+DOPE或DC-chol+DOPE(脂質(zhì)體制劑，重量比1∶1)的制劑對(duì)寡核苷酸功效的影響最近，我們已開始開發(fā)一種Cellfetin的替代物，因?yàn)殚L期使用Cellfetin會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生某些毒性。已發(fā)現(xiàn)一種吸收增強(qiáng)劑亞精胺-膽固醇偶聯(lián)物(SpdC)(Guy-Catfey等人，1995)在所使用的水平上對(duì)細(xì)胞無毒，且在所處理的嚙齒動(dòng)物身上使用長達(dá)1周也無可測出的毒性。陽離子脂質(zhì)DC-Chol(Gao等人，1991)已被批準(zhǔn)用于基因治療的臨床試驗(yàn)，且其在細(xì)胞體系中有很低的毒性。最初的數(shù)據(jù)表明這種新型的脂質(zhì)體制劑比在平行實(shí)驗(yàn)中Cellfetin的效率高20％-40％。
寡核苷酸制劑對(duì)細(xì)胞的短期處理就足以獲得對(duì)VEGF產(chǎn)生的長期抑制效果在所有以上實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)?jīng)將細(xì)胞與寡核苷酸及吸收增強(qiáng)劑共同孵育過夜。隨后我們探尋，用寡核苷酸對(duì)細(xì)胞處理較短的時(shí)間是否也能達(dá)到相同的抗VEGF活性水平。我們發(fā)現(xiàn)確實(shí)是這樣的處理4小時(shí)之后洗去，更換成新鮮的未補(bǔ)加的培養(yǎng)基，并不會(huì)降低抗VEGF活性(圖12)。而且，此效果可持續(xù)長達(dá)3天(實(shí)驗(yàn)的時(shí)間)。
圖12．用四種寡核苷酸+cF處理，然后換成純的培養(yǎng)基。這種抑制幾乎可以持續(xù)3天。而對(duì)照有義寡核苷酸無明顯的抑制(結(jié)果未給出)。
實(shí)際上，相對(duì)于對(duì)照(無寡核苷酸)來說，抑制效果比以前所觀察到的要好。其中一個(gè)原因可能是，在一次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，VEGF質(zhì)蛋白可通過原先已存在的mRNA不斷地被合成(如果仍未被反義寡聚物所阻斷)，并在培養(yǎng)基中積累。通過在4小時(shí)后更換培養(yǎng)基，可以消除“背景”VEGF的來源。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)體系很重要，因?yàn)檫@種長效反義效果表明并不需要經(jīng)常施用藥物。這一點(diǎn)還需經(jīng)特意的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。
二茂鐵偶聯(lián)的寡核苷酸我們最近發(fā)現(xiàn)一種經(jīng)金屬茂修飾的寡核苷酸與吸收增強(qiáng)劑的制劑在我們的體外實(shí)驗(yàn)中是最有效的VEGF抑制物，并且在使用濃度范圍內(nèi)幾乎無毒性(圖13)。這種與Cellfetin一起配成的寡核苷酸制劑在20μM濃度時(shí)有特異性抗VEGF活性。這種二茂鐵鏈已被設(shè)計(jì)用于提高寡核苷酸對(duì)膜的結(jié)合力(D.Mulvet,Aronex，個(gè)人通訊)。此外，我們推測這種親脂的鐵成分可能通過利用細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸系統(tǒng)幫助寡核苷酸的細(xì)胞定位和穿膜運(yùn)動(dòng)。對(duì)于修飾機(jī)制的進(jìn)一步研究已超過了本專利的范圍，且可作為另一研究的目的。但是，我們已發(fā)現(xiàn)這種經(jīng)二茂鐵修飾的寡核苷酸的高活性，提示當(dāng)我們?cè)隗w內(nèi)模型中檢測寡核苷酸時(shí)也應(yīng)探索這一途徑。
圖13.T0639(反義)經(jīng)二茂鐵偶聯(lián)的變體的強(qiáng)烈反義抑制效果。
如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一節(jié)中的詳細(xì)描述，成年大鼠虹膜血管增生模型為定量檢測反義寡核苷酸的活性提供了一個(gè)方法。在這一檢測中，將大鼠置于低氧艙中1-21天，用數(shù)字成像定量測定虹膜中增生的血管數(shù)量。如數(shù)據(jù)所示(圖14.)，隨著孵育時(shí)間的延長，有清晰的血管增生的過程。視網(wǎng)膜RNA水平也增高但未達(dá)到相同的程度(圖15)。受到初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及大鼠模型數(shù)據(jù)的鼓舞后，我們現(xiàn)在意在體內(nèi)的血管增生模型中獲取相似的概念性證明。
C.相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。
主要研究者Nilabh Chaudhary，理學(xué)博士，在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域有著豐富的經(jīng)驗(yàn)。他于1984年在加拿大的倫敦市WesternOntario大學(xué)獲得了生物化學(xué)的博士學(xué)位。隨后他又獲得了DamonRunyon-Walter Winchell癌癥基金會(huì)的一項(xiàng)資助，以在Rockefeller大學(xué)Dr.Gunter Blobel的實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)進(jìn)行他的博士后研究。在1986年他被任命為Howard Hughes醫(yī)學(xué)研究所的同一實(shí)驗(yàn)室的助理。Chaudhary博士于1992年作為研究科學(xué)家加入了Triplex(最近改名為Aronex)以開始一項(xiàng)細(xì)胞生物學(xué)的研究計(jì)劃，其目標(biāo)是開發(fā)一種能提高細(xì)胞和細(xì)胞核對(duì)核酸治療的吸收能力的技術(shù)。他與一支有機(jī)化學(xué)家隊(duì)伍緊密合作，共同設(shè)計(jì)、合成并測試新的寡核苷酸修飾和吸收增強(qiáng)劑。Chauahary博士是關(guān)于有治療潛力的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)-功能相互關(guān)系等科學(xué)論文的共同作者并設(shè)計(jì)了改善其細(xì)胞內(nèi)化和功效的途徑。他在設(shè)計(jì)基于細(xì)胞的檢測體系，免疫化學(xué)技術(shù)，蛋白質(zhì)的微量定量技術(shù)，核酸純化以及分子克隆技術(shù)，亞細(xì)胞器分離，膜蛋白質(zhì)與脂的分離以及熒光顯微鏡技術(shù)等方面有豐富的經(jīng)驗(yàn)。
Anthony P.Adamis，醫(yī)學(xué)博士，是這一課題的合作者和顧問。它是Harvard醫(yī)學(xué)院眼科系的助教授以及波士頓兒童醫(yī)院外科系的研究助理。Adamis博士和他的同事于1994年首次證實(shí)了眼VEGF水平的增加、血管增生以及導(dǎo)致失明的主要原因之一的增生性糖尿病視網(wǎng)膜病過程之間的相關(guān)性。在由那時(shí)起進(jìn)行的研究中，他證實(shí)了在刺激VEGF表達(dá)導(dǎo)致眼中血管增生中缺氧的生理作用。他廣泛的研究經(jīng)驗(yàn)包括病人的臨床研究，設(shè)計(jì)基于細(xì)胞的概念性證明的嚙齒動(dòng)物疾病模型的開發(fā)以及分子生物學(xué)和克隆技術(shù)的應(yīng)用。他已經(jīng)發(fā)表了20多篇文章，其中10篇關(guān)于血管增生的領(lǐng)域。
D．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法。
方法概述這一設(shè)計(jì)的目標(biāo)是證實(shí)抗VEGF反義化合物在血管增生動(dòng)物模型中的功效。為此，我們準(zhǔn)備進(jìn)行一系列的體外實(shí)驗(yàn)，以便找到最有希望用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的反義制劑。我們將以大鼠VEGF mRNA為目標(biāo)的10種候選的反義寡核苷酸(19個(gè)堿基)“文庫”中開始篩選。這些寡核苷酸含有C5-丙炔基嘧啶，以提高其與目標(biāo)mRNA的結(jié)合親和力，且硫代磷酸酯核苷酸間鍵會(huì)賦予核酸酶抗性。
為了進(jìn)行細(xì)胞檢測，我們計(jì)劃使用大鼠C6(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)細(xì)胞，其在低氧條件下產(chǎn)生豐富的VEGF mRNA和蛋白質(zhì)。在96孔板上進(jìn)行檢測，其格式用于篩選各種反義或?qū)φ展押塑账嶂苿┑幕钚浴Ｋ鼈儗?duì)于細(xì)胞外培養(yǎng)基中分泌的VEGF水平的影響的時(shí)間過程用ELISA方法監(jiān)測。為了提高細(xì)胞的吸收，將寡核苷酸與新型的吸收增強(qiáng)劑一同施用。測定核酸與脂質(zhì)體之間的不同比率。此外，從中選出兩種“最佳的”反義序列用于與3’親脂的二茂鐵偶聯(lián)，這種修飾可促進(jìn)反義寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞。還用Northern雜交來確定這兩種最佳的寡核苷酸(或其制劑)對(duì)VEGF mRNA水平的影響(與恰當(dāng)對(duì)照的效果比較)。
在試圖提供反義機(jī)制的證據(jù)時(shí)，設(shè)計(jì)了一系列的相對(duì)獨(dú)立的體外實(shí)驗(yàn)。分別用特異設(shè)計(jì)的VEGF同型體特異性反義寡核苷酸即其以一種或兩種VEGFmRNA(大鼠中3種主要的和一種次要的)為目標(biāo)處理C6細(xì)胞。用RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)用于測定每種VEGF mRNA的相對(duì)水平。原則上，如果這種反義效果確有序列特異性，只有目標(biāo)同型體的表達(dá)被下調(diào)。不同序列的寡核苷酸無效。
最有效的反義化合物的細(xì)胞毒性在兩種不同細(xì)胞系中檢測，其中毒性最小的制劑將用于C6細(xì)胞球狀體模型中，此模型用于確定這些寡核苷酸是否能通過細(xì)胞層。球狀體中連續(xù)的細(xì)胞層中VEGF mRNA的水平用原位雜交方法測定。吸收增強(qiáng)劑和鏈的使用也將在此模型中進(jìn)行檢測。具有最強(qiáng)抗VEGF寡核苷酸的抗血管增生活性將用大鼠眼球的虹膜血管增生模型在動(dòng)物中進(jìn)行檢測。將白化病大鼠放入低氧艙中(長達(dá)兩周)，并用一種非侵害性定量數(shù)字成像系統(tǒng)監(jiān)測虹膜中血管的增生。在此模型中缺氧條件下僅1-2天后可觀察到血管生成的增加。將被檢測的寡核苷酸(或其制劑)直接引入大鼠的一只眼睛中，另一只眼睛作為未經(jīng)處理的對(duì)照。處理長達(dá)l周后，測定對(duì)血管生成的任何影響。視網(wǎng)膜中(玻璃體，如果可能的話)VEGF蛋白質(zhì)和mRNA水平的改變分別用ELISA和Northern雜交方法檢測。注意觀測出現(xiàn)的任何副作用。根據(jù)最初的結(jié)果，可以采用多劑量實(shí)驗(yàn)。也檢測對(duì)照寡核苷酸的效果。然后將毒性最低最有效的制劑(抑制＞20％新血管形成)用于擴(kuò)展的一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，作為這些研究第Ⅱ期的一部分。
反義和對(duì)照寡核苷酸的選擇為了達(dá)到VEGF表達(dá)的最大抑制，我們將合成能結(jié)合到大鼠中所有VEGF同型體的10個(gè)共同區(qū)上的反義寡核苷酸(Conn等人，1990)。合成10種基本上隨機(jī)選擇的寡核苷酸(其中沒有明顯的發(fā)卡結(jié)構(gòu)或G-富集區(qū))，以用于第一輪的篩選。其中有5種是大鼠特異性的，另外5種選擇也可與人mRNA結(jié)合的。并不清楚進(jìn)化上保守的位點(diǎn)作為反義的靶點(diǎn)是好還是不好，雖然大多數(shù)最近的證據(jù)表明對(duì)于反義結(jié)合優(yōu)選的靶點(diǎn)不能預(yù)測。所有合成的寡核苷酸都含有C5-丙炔基嘧啶(以提高其對(duì)目標(biāo)的結(jié)合親和力)以及硫代磷酸酯鍵(核酸酶抗性)(Wagner等人，1993,Fenster等人，1994)。我們已經(jīng)有幾種“不相關(guān)”的寡核苷酸用作對(duì)照，但是如果需要，我們將合成一種與反義序列有相同的大小以及堿基組成的對(duì)照寡核苷酸。這些寡核苷酸將由在Aronex的寡核苷酸合成小組完成合成、純化(＞95％，用HPLC)和鑒定工作。
用于作用機(jī)制研究的寡核苷酸為了獲得支持反義作用機(jī)制的數(shù)據(jù)，將制備幾種(大約4種根據(jù)其效果)20個(gè)堿基的同型體-特異性寡核苷酸。一種寡核苷酸是直接針對(duì)VEGF-165mRNA上的一種序列的就不應(yīng)與VEGF-120的mRNA結(jié)合。類似地，一個(gè)20堿基的寡核苷酸與VEGF-120的剪切連接體互補(bǔ)(即每個(gè)外顯子中10個(gè)堿基)，就不該也與VEGF-165結(jié)合。合成帶有重復(fù)序列的寡核苷酸(兩部分序列反向重復(fù))用作對(duì)照。這些寡核苷酸對(duì)VEGF表達(dá)的影響將通過比較不同的mRNA的相對(duì)水平加以確定。用RNA酶保護(hù)性實(shí)驗(yàn)測定每種mRNA的相對(duì)水平(Ambiou,Austin,TX)。此中的探針(長度大約為150-250堿基)已用大鼠mRNA序列特異性引物和RT-PCR技術(shù)(Perkin Elmer)制備。
細(xì)胞培養(yǎng)生物學(xué)篩選將在從大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤中衍生的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中進(jìn)行。在此細(xì)胞系中主要的VEGF同型體是VEGF-165(氨基酸)和VEGF-120(各個(gè)46％)，而VEGF-188只占大約8％(Bacic等人，1995)。這種細(xì)胞系已被廣泛地用于研究VEGF的結(jié)構(gòu)和功能。為了通過低氧條件刺激誘導(dǎo)VEGF的合成，將細(xì)胞置于一個(gè)低氧艙中(GasPakPlus厭氧培養(yǎng)箱)(BBL.Micobilology System)，用氫和鈀催化劑去掉所有的氧分子。(Stein等人，1995)。典型的孵育時(shí)間范圍為6-8小時(shí)。或者用100-300μM的氯化鈷處理培養(yǎng)物，氯化鈷干擾血紅素依賴性低氧反應(yīng)系統(tǒng)并激活一種誘導(dǎo)VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄的低氧反應(yīng)因子。
反義寡核苷酸活性的體外評(píng)價(jià)生長成單層的C6細(xì)胞用含5％胎牛血清和抗生素的Dulbecco培養(yǎng)基維持。為了初步測定抗VEGF的寡核苷酸，將細(xì)胞按10,000或20,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔平板上。恢復(fù)1天后，用寡核苷酸處理細(xì)胞(在0.25ml培養(yǎng)基中)。測試2種類型的培養(yǎng)基常規(guī)的含血清的C6培養(yǎng)基或Optimen(Life Technologies)，這是一種血清少的培養(yǎng)基，通過減少血清成分中的干擾經(jīng)常用于提高轉(zhuǎn)染的效率。經(jīng)在低氧艙中不同的培養(yǎng)時(shí)間之后，將上清轉(zhuǎn)移到用于ELISA檢測一個(gè)新的平板。作為一條原則，檢測一種新的制劑時(shí)我們都利用顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)以找出異常的改變或任何明顯的毒性信號(hào)。
為了RNA分析，用一定量的制劑處理大量的細(xì)胞(＞2×106-107，在T75搖瓶中)。寡核苷酸處理之后(且經(jīng)低氧處理，等等)，再次收集上清以備ELSA檢測，并分離RNA用下面的方法進(jìn)行分析。
VEGF ELISA檢測尚未有一種適用于嚙齒動(dòng)物系統(tǒng)的商品化檢測試劑盒，因此我們用已知能夠與大鼠VEGF(RDI-1020或RDI-4046購自Research Diagnostics公司，其它則購自R&amp;D Systerms)充分反應(yīng)的抗體設(shè)計(jì)了一個(gè)。其它針對(duì)VEGF的抗血清也能用，因此我們選擇了最佳的組合。ELISA試劑(酶聯(lián)二抗，底物)購自Pierce。
RNA提取、Northern雜交、RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)以及雜交探針VEGF mRNA的大小在3.8-4千堿基范圍內(nèi)，主要是由于長的非翻譯區(qū)。為作RNA分析，用RNAzol方法(Tel-Test公司，F(xiàn)riendswood,TX)從處理過或未處理過的細(xì)胞中分離總RNA。為用作探針，采用C6 RNA和VEGF特異性引物通過聯(lián)合反轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR試劑盒，PerkinElmer)，然后根據(jù)來源于不同的mRNA的cDNA的大小篩選，再用同型體特異性引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，最后獲得了相應(yīng)于共同區(qū)域和同型體特異性探針的VEGF特異性片段。將這些探針克隆到PCRⅡ質(zhì)?？寺≥d體中(Invitrogen)，通過測序確證這些序列(測序酶，USB)。這種PCRⅡ載體允許放射性標(biāo)記的RNA探針的RNA聚合酶不依賴性產(chǎn)生用于RNA酶保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，(試劑盒購自Ambion,Austin,TX)。用β-肌動(dòng)蛋白探針標(biāo)定RNA的量。為了Northern雜交，將RNA(多達(dá)20μg)在甲酰胺凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，再利用放射性標(biāo)記探針按照標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行檢測，用β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)定RNA的量。在所有的RNA分析中，光學(xué)成像儀(富士，光學(xué)成像儀)用于放射性相對(duì)水平的定量。
支持反義作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)本研究的反義寡核苷酸與編碼VEGFmRNA的mRNA序列互補(bǔ)。然而，它們?cè)谏矬w系中的抑制效果不一定證明反義作用機(jī)制。事實(shí)上，最近的分析表明許多寡核苷酸可非特異性干擾細(xì)胞代謝，尤其是當(dāng)濃度超過1μM時(shí)(綜述見Stein和Cheng,1993)。關(guān)于反義作用機(jī)制的證據(jù)似乎很難找到，而且目前只有一些間接的證據(jù)。我們目前已設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)，(雖然是間接的)意在獲得可能反義機(jī)制的證據(jù)。簡單地說，我們已合成用于大鼠基于細(xì)胞的檢測，以選擇性抑制單一VEGF變體表達(dá)的“同型體特異性”反義寡核苷酸。大鼠C6細(xì)胞(來源于神經(jīng)膠質(zhì)瘤)可產(chǎn)生三種主要類型VEGF同型體。RNA酶保護(hù)性實(shí)驗(yàn)已表明C6細(xì)胞中約45％的VEGF是120個(gè)氨基酸的變體，45％是165個(gè)氨基酸的變體，其余的是188個(gè)氨基酸的變體(Bacic等人，1995)。用針對(duì)一種或多種VEGF同型體的反義寡核苷酸處理細(xì)胞，再用低氧或加入可模擬低氧的200μM的氯化鈷刺激mRNA的轉(zhuǎn)錄。處理9小時(shí)以后，VEGF mRNA的細(xì)胞水平用RNA酶保護(hù)性實(shí)驗(yàn)加以監(jiān)測(Ambion,Austin,TX.)。重要的是，用我們通過RT-PCR技術(shù)獲得的同型體特異性探針(長度大約為100-200個(gè)堿基)來確定每一種VEGF mRNA的水平，并且用相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白的水平進(jìn)行標(biāo)定。如果反義作用機(jī)制成立，且用單一同型體特異性寡核苷酸，則只有一種VEGF的表達(dá)相對(duì)于其它種類而言降低。另一方面，一種與所有VEGF共同區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸應(yīng)可以減少每一種VEGF的表達(dá)。
二茂鐵偶聯(lián)的寡核苷酸的合成經(jīng)過前幾輪的篩選之后，活性最高且副作用最小的寡核苷酸通過3′端加上一個(gè)二茂鐵鏈，以期進(jìn)一步提高寡核苷酸的吸收和特異性活性(見初步結(jié)果，T30781(+二茂鐵)對(duì)T30639(未經(jīng)修飾))。如果有效，比較這種寡核苷酸與一種隨機(jī)序列的且含有同樣鏈的對(duì)照的活性。我們假設(shè)這種二茂鐵成分可使寡核苷酸通過利用細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸或通透系統(tǒng)(鐵離子？)，但是這種機(jī)制尚未進(jìn)行研究。
吸收增強(qiáng)劑的使用在大多數(shù)情況下，為了便于進(jìn)入細(xì)胞，常在有陽離子脂質(zhì)體試劑存在的情況下將寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。作為基因運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)染劑，現(xiàn)已有許多商品化的陽離子脂質(zhì)體，然而在我們的檢測中(已實(shí)驗(yàn)的7種主要的脂質(zhì)體)，只有Cellfectin(Life Technologies)表現(xiàn)出一致的效果。Cellfectin是一種多氨基脂四棕櫚酰亞精胺和二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)按1∶1.5(wt/wt)的脂質(zhì)混合物。我們還使用了另一種脂質(zhì)體DC-chol，這是由Leaf Huang(Gao和Huang,1991)所研制的，并且已批準(zhǔn)用于基因治療的臨床試驗(yàn)(Rgene Therapeutics,The Woodlands,TX)。此外，我們還設(shè)計(jì)并合成了(Guy-Caffey等人，1995)一系列能夠明顯提高寡核苷酸的細(xì)胞吸收，不受血清影響的且沒有明顯相關(guān)毒性的新型多氨基脂吸收增強(qiáng)劑。其中最有效的一種是SpdC(亞精胺-膽固醇)。當(dāng)靜脈注射入小鼠時(shí)，SpdC可促進(jìn)寡核苷酸對(duì)許多組織的運(yùn)輸，且當(dāng)向小鼠以SpdC的濃度高達(dá)100/mg/kg/天，連續(xù)注射1周以上時(shí)未見毒性(數(shù)據(jù)未給出)。
我們已制備了脂質(zhì)體制劑SpdC/DOPE和DC-chol/DOPE(SpdC或DC-chol與二油酰磷酯酰膽堿)質(zhì)量比范圍從1∶0.5,1∶1,1∶1.5到1∶2。在我們較早的NHEK細(xì)胞的抗VEGF檢測中對(duì)于兩種陽離子脂質(zhì)體最有效的比率為1∶1。我們正意在研究這些制劑在C6細(xì)胞系、C6球狀體以及最終在眼球模型中對(duì)于抗VEGF寡核苷酸活性的增強(qiáng)作用。
關(guān)于這些吸收方式的確切的作用機(jī)制依然存在著爭論。將陽離子脂質(zhì)體與核酸混合幾乎總會(huì)產(chǎn)生一些微小的沉淀，這些沉淀能有效地進(jìn)入細(xì)胞。為了保持一致性，以及為了找到一個(gè)潛在的原理，我們用一種Coulter顆粒大小儀器來監(jiān)視這些顆粒的大小。
用于體內(nèi)注射的制劑我們使用一個(gè)不很嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拿~“制劑”是為了說明在給藥過程中所使用的多成分混合物。但是，當(dāng)我們進(jìn)行體內(nèi)測試階段時(shí)，設(shè)計(jì)用于注射入眼球內(nèi)的最佳制劑是慎重的，尤其是包括吸收增強(qiáng)劑時(shí)。另一些需要考慮的參數(shù)是反義的數(shù)量和濃度、鹽、顆粒大小、pH值和載體。Dr.Joe Wyse幫助我們選擇和制備最佳的制劑。
細(xì)胞毒性檢測將細(xì)胞按500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板上。接種一天后，用系列稀釋的寡核苷酸制劑處理細(xì)胞(每個(gè)稀釋度4個(gè)孔)。處理1天或4天后，用一種非放射性檢測系統(tǒng)監(jiān)測對(duì)細(xì)胞的存活的影響(CellTiter96 Aqueous細(xì)胞增殖檢測，Promega公司)。對(duì)最有效的寡核苷酸，在三種不同的細(xì)胞系上進(jìn)行此檢測(包括C6,NHEK及成纖維細(xì)胞系)。
在球狀體中反義活性的評(píng)價(jià)C6細(xì)胞通常生長成單層(4.5g葡萄糖/L,DMEM,5％FCS加抗生素)，可以被誘導(dǎo)長成約0.4-0.8mm細(xì)胞球狀體或聚集體。了解我們的反義寡核苷酸，與脂制成制劑的或其它的反義寡核苷酸能否穿過球狀體的細(xì)胞層并且仍有生物活性很有意義。利用Stein等人(1995)所述的方法制備球狀體。將C6細(xì)胞從匯合生長的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到非貼壁性的細(xì)菌培養(yǎng)皿，生長48小時(shí)。將出現(xiàn)的球狀體轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)搖瓶中，繼續(xù)生長10天(80轉(zhuǎn)/分)，經(jīng)過一個(gè)10ml的取液器吸頭沉淀分選得大小一致的球狀體。繼續(xù)生長6周，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。每天往搖瓶中充入95％的空氣和5％的CO2，以保證有足夠的氧氣和pH。
用反義制劑或合適的對(duì)照處理球狀體，然后置于低氧中長達(dá)1天以誘導(dǎo)VEGF合成，隨后用原位雜交檢測球狀體中VEGF mRNA的水平。為此，用4％的多聚甲醛固定球狀體，冷凍，切成10μm厚的片，用前述的方法以35S標(biāo)記的DNA或RNA探針作原位雜交檢測產(chǎn)生的VEGF。
這些加工過的切片用蘇木精和cosin染料進(jìn)行復(fù)染，經(jīng)過幾天的放射自顯影(Guy-Caffey，等人)將這些切片通過亮視野和暗視野照明檢測。
VEGF RNA的分布將反映出反義寡核苷酸所達(dá)到的抑制程度。理想的，在所有層中VEGF mRNA的水平都很低。最可能的，在表層的VEGF較低，這或是因?yàn)樗幬镂赐溉爰?xì)胞層，或是因?yàn)樵谥醒氲募?xì)胞更加缺氧，因而產(chǎn)生更多的VEGF。如果運(yùn)輸只能進(jìn)入表層，我們將試圖設(shè)計(jì)新的給藥途徑。
VEGF反義寡核苷酸抗血管增生的體內(nèi)活性評(píng)價(jià)成年嚙齒動(dòng)物VEGF-相關(guān)虹膜血管增生模型成年大鼠在低氧環(huán)境中刺激新血管在虹膜中生成。血管的增生在時(shí)間上與視網(wǎng)膜中VEGF mRNA水平的上調(diào)相關(guān)聯(lián)。這種眼球事件的順序在猴虹膜潮紅模型和人的虹膜新生血管增生中同樣可見，其中已知局部缺血的VEGF視網(wǎng)膜是虹膜血管增生的原因。我們意在利用這一模型檢測可降低血管增生的反義化合物的活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，包括動(dòng)物的處理、外科手術(shù)、照相、計(jì)算機(jī)定量分析以及VEGF mRNA的Northern分析將在Adamis實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
350-400g成年Kingston群體白化病Sprague-Dawley大鼠(雌性)置于低氧艙中(1％的氧氣)1-21天。在培養(yǎng)前后進(jìn)行生物顯微檢查和常規(guī)的裂隙照相機(jī)成像。記錄下在低氧環(huán)境中虹膜血管擴(kuò)張、扭曲、以及血管密度增加的過程。在這些白化病動(dòng)物中可以很清楚地看到虹膜的血管。將虹膜的標(biāo)準(zhǔn)照片掃描輸入計(jì)算機(jī)程序(NIH圖像，1.54D軟件)并用象素分析以模糊方式定量新生血管的面積。虹膜血管在14天中表現(xiàn)出漸進(jìn)式增加。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和第Ⅷ因子的免疫染色也證明內(nèi)皮細(xì)胞增生始于第2天；證明增加血管代表血管增生。分離的用于Northern雜交的視網(wǎng)膜證實(shí)缺氧條件動(dòng)物的視網(wǎng)膜中穩(wěn)態(tài)的VEGF mRNA水平升高?？傊?，成年大鼠在低氧環(huán)境中刺激虹膜中新血管的生長。我們的目的是利用這一模型檢測候選的抗VEGF制劑的效果。
確定中斷的低氧條件對(duì)新血管形成的效果的實(shí)驗(yàn)上述大鼠模型僅用于連續(xù)的低氧處理。因?yàn)槿绻脱跆幚砜梢员恢袛嗟脑掃@種模型會(huì)更加實(shí)用，例如，為了反復(fù)給藥，我們希望確定這些動(dòng)物每天脫離低氧的條件一小段時(shí)間后虹膜血管增生的程度。我們預(yù)計(jì)這種短暫的移出會(huì)增加新血管增生，因?yàn)槿绻眠@種方法處理新生大鼠將比在恒定氧壓下的動(dòng)物有更強(qiáng)的血管增生反應(yīng)(Reynaud和Dorey,1994)。缺氧的視網(wǎng)膜再給氧后會(huì)產(chǎn)生活性氧中間物，已知這種中間物將增加視網(wǎng)膜VEGF mRNA蛋白質(zhì)(Kuroki等人，1995)。
將大鼠置于低氧艙中(10％的氧氣)1,3,5,7,14和21天(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只動(dòng)物，一共18只)。將它們每天移出1小時(shí)，并置于正常室內(nèi)氧中(含氧量21％)。培養(yǎng)結(jié)束后，拍攝標(biāo)準(zhǔn)的虹膜照片。處死動(dòng)物并將眼球的前半部分用于PCNA染色和光學(xué)顯微鏡檢查。分離視網(wǎng)膜用于32p標(biāo)記的558bp VEGF cDNA隨機(jī)引物標(biāo)記探針進(jìn)行Northern雜交。
在21天的過程中，視網(wǎng)膜VEGF mRNA的上調(diào)與虹膜新血管生成的照片以及免疫組化的數(shù)據(jù)相關(guān)。血管的面積可以從標(biāo)準(zhǔn)照片定量，并可與處于連續(xù)低氧條件下的動(dòng)物比較。從這個(gè)實(shí)驗(yàn)，我們可以預(yù)期在不影響低氧效果的前提下，可以從低氧艙中取出動(dòng)物的最大允許的次數(shù)及每一次的時(shí)間長度。
體內(nèi)反義作用效果的評(píng)價(jià)在第0天拍攝基線的照片。隨機(jī)的選擇麻醉動(dòng)物的一只眼睛，向其注射VEGF反義化合物。另一只眼睛不作處理。給藥劑量要參照體外研究的結(jié)果，但是給藥不超過20μl。動(dòng)物置于不中斷的低氧環(huán)境中7天。在首次實(shí)驗(yàn)時(shí)，每種制劑處理6只動(dòng)物(4種制劑只加寡核苷酸；寡核苷酸+鏈，以及以上兩種分別再加入吸收增強(qiáng)劑)。目的是確定這些化合物是否確實(shí)有效。如果血管增生有明顯的降低，就用更多的動(dòng)物。下表總結(jié)了所需動(dòng)物的統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)?？傊糠N處理方式要用大約20只大鼠。
表1．所需大鼠的數(shù)量在此模型中90％的大鼠有新生血管增生。假定有顯著意義的水平為0.05(α=0.05)，權(quán)為0.8(1-β=0.80)，則每一實(shí)驗(yàn)組眼睛的數(shù)量可根據(jù)不同的血管增生抑制劑的效率來確定。
對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組 所需眼睛數(shù)量904038905024906017907012這些實(shí)驗(yàn)中新血管的增生抑制定義為與對(duì)照的眼睛相比實(shí)驗(yàn)組眼睛中血管形成的面積減少20％。假設(shè)某一試劑的效果很好，則實(shí)驗(yàn)組發(fā)生虹膜血管增生的眼球比率就低，那么用以獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的眼睛的數(shù)量就可大大的降低。
在第7天，照相并處死動(dòng)物。收集視網(wǎng)膜用作Northern雜交(單獨(dú)的)。用光學(xué)成像儀(Moleular Dyamics)對(duì)VEGF恒定態(tài)mRNA進(jìn)行定量并用28S核糖體RNA信號(hào)標(biāo)定。虹膜血管進(jìn)行定量并比較經(jīng)過處理的和對(duì)照的眼球。
F．脊椎動(dòng)物處理程序所有動(dòng)物過程將在Harvard醫(yī)學(xué)院的兒童醫(yī)院進(jìn)行，并嚴(yán)格遵守視覺和眼科研究協(xié)會(huì)所制定的使用動(dòng)物進(jìn)行研究的規(guī)章，以及Massachusattes眼睛和耳朵醫(yī)學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)建立的規(guī)章?？偣矊⑹褂?20只白化病的雌性Kingston群體Sprague-Dawley大鼠。它們將被麻醉且用30號(hào)的針頭向玻璃體內(nèi)注射20μl的寡核苷酸或?qū)φ罩苿?。注射之后將施以硫酸慶大霉素。將動(dòng)物在10％氧環(huán)境下維持長達(dá)3周。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后它們吸入CO2處死。所有的實(shí)驗(yàn)都將符合OPRR的規(guī)章。
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序列表(1)基本信息(ⅰ)申請(qǐng)人Chaudhary,NilabhRao,T.SudhakarRevankar,Ganapathi R.
Cossum,Paul A.
Rando,Robert F.
Peyman,AnuschUhlman,Eugen(ⅱ)發(fā)明題目血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的反義抑制物(ⅲ)序列數(shù)目21(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Conley,Rose&amp;Tayon,P.C.
(B)街道600 Travis,Suite 1850(C)城市Houston(D)州Texas(E)國家美國(F)郵政編碼77002-2912(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)Windows 95(D)軟件Microsoft Word 7.0a(ⅵ)最近的申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)數(shù)量(B)提交日期(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)日期
(A)申請(qǐng)數(shù)量(B)提交日期(ⅷ)代理人/代理信息(A)姓名McDaniel,C.Steven(B)登記號(hào)33,962(C)文獻(xiàn)/卷號(hào)碼1472-07200(ⅸ)電信信息(A)電話713/238-8010(B)電傳713/238-8008(2)SEQ ID NO.1序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型合成核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(E)反義是(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(C)其它信息/注釋=“每個(gè)殘基之間的硫代磷酸酯鍵”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.1:GCGCTGATAG ACATCCATG19(2)SEQ ID NO.2的序列信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“每個(gè)殘基之間的硫代磷酸酯鍵,C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.2:
GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.3序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“每個(gè)殘基之間的硫代磷酸酯鍵,C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.3CGAUUGGAUG GCAGUAGCCT19(2)SEQ ID NO.4序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“每個(gè)殘基之間的硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.4:UACUCCUGGA AGAUGUCCA19(2)SEQ ID NO.5序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置6-7；9-10；10-11；13-14(D)其它信息/注釋=“所指殘基之間的硫代磷酸酯鍵”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.5:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.6序列的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置3-4；5-6；6-7；9-10；10-11；13-14(D)其它信息/注釋=“除去所指殘基之間的硫代磷酸酯鍵”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.6:GCGCUGAUAG ACAUCCAUUG19(2)SEQ ID NO.7序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置6-7；10-11；(D)其它信息/注釋=“除去所指殘基之間的硫代磷酸酯鍵”
(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.7:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.8序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“所有殘基之間的硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.8:GAAGAUGUCC ACCAGGGUC19(2)SEQ ID NO.9序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19
(D)其它信息/注釋=“所指殘基之間的硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.9:AGGAAGCUCA UCUCUCCUA19(2)SEQ ID NO.10序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D) 拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.10:UACACGUCUG CGGAUCUUG19(2)SEQ ID NO.11序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶定”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.11:UAACUCAAGC UGCCUCGCC19(2)SEQ ID NO.12序列的信息(ⅱ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.12:CCAUGAACUU CACCACUUC19(2)SEQ ID NO.13序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.13:GACAUCCAUG AACUUCACC19(2)SEQ ID NO.14序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.14:GGCUGGCAGU AGCUGCGCU19(2)SEQ ID NO.15序列的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.15:GGAUGGCAGU AGCUGCGCU19(2)SEQ ID NO.16序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基胞嘧啶殘基”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.16:GCGCTGATAG ACATCCATG19(2)SEQ ID NO.17序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基尿嘧啶殘基”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.17:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.18序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，在殘基8，12,14和15處的C5-丙炔基嘧啶”
(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.18:GCGCTGAUAG ACAUCCATG19(2)SEQ ID NO.19序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，在殘基2,5,8,12,15和18處的C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.19:GCGCUGAUAG ACATCCAUG19(2)SEQ ID NO.20序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature
(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶，3’末端連接于脂質(zhì)鏈”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.20:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.21序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，除去殘基1-5,8-9,12-13,14-15和16-19之間；3’末端芘；C5-丙炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.21:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.22序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性
(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-己炔基嘧啶”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.22:GCGCUGAUAG ACAUCCAUG19(2)SEQ ID NO.23序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基嘧啶”ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.23:GCGCUGACAG ACAUUCAUG19(2)SEQ ID NO.24序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義否(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.24:CATGGATGTC TATCAGCGC19(2)SEQ ID NO.25序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義否(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.25:CATGGATGTC TATCAGCGC19(2)SEQ ID NO.26序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature
(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基胞嘧啶殘基”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.26:AGAGCAGCAA GGCGAGGCT19(2)SEQ ID NO.27序列的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ⅳ)反義是(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-featute(B)位置1-19(D)其它信息/注釋=“硫代磷酸酯鍵，C5-丙炔基胞嘧啶殘基”(ⅹ)序列描述序列編號(hào)NO.27:CAUGGAUGUC UAUCAGCGC19
權(quán)利要求
1．一種減少所處理的細(xì)胞中細(xì)胞VEGF產(chǎn)生的反義寡核苷酸，用該反義寡核苷酸在低于大約1μM的濃度下處理；處理過的細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF不超過未經(jīng)過處理的細(xì)胞產(chǎn)生的約90％。
2．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的反義寡核苷酸能與編碼VEGF的mRNA上的RNA序列結(jié)合。
3．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的反義寡核苷酸能與至少兩種編碼VEGF的mRNA上的RNA序列結(jié)合。
4．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的反義寡核苷酸能與VEGF206的mRNA上的RNA序列結(jié)合。
5．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的反義寡核苷酸能與VEGF185的mRNA上的RNA序列結(jié)合。
6．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的反義寡核苷酸能與VEGF165的mRNA上的RNA序列結(jié)合。
7．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的反義寡核苷酸能與VEGF121的mRNA上的RNA序列結(jié)合。
8．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含降低該反義寡核苷酸被核酸酶降解的速率的化學(xué)成分。
9．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含硫代磷酸酯基團(tuán)和磷酸二酯基團(tuán)。
10．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含一對(duì)與抗核酸酶降解的化學(xué)部分相連的相鄰殘基。
11．權(quán)利要求8的反義寡核苷酸，其中所述的降低該反義寡核苷酸被核酸酶降解的速率的成分是硫代磷酸酯基團(tuán)。
12．權(quán)利要求8的反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸的每個(gè)殘基是以硫代磷酸酯基團(tuán)相連。
13．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸包含選自C5-丙炔基尿苷，C5-丙炔基胞苷，C5-己炔基尿苷，C5-己炔基胞苷，6-氮雜尿苷和6-氮雜胞苷中選取的核苷酸殘基。
14．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸含有硫代磷酸酯基團(tuán)和選自C5-丙炔基尿苷，C5-丙炔基胞苷，C5-己炔基尿苷，C5-己炔基胞苷，6-氮雜尿苷和6-氮雜-胞苷中的核苷酸殘基。
15．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含C5-丙炔基尿苷殘基。
16．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含C5-丙炔基尿苷殘基和硫代磷酸酯基團(tuán)。
17．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含C5-丙炔基胞苷殘基。
18．權(quán)利要求1中的反義寡核苷酸，其包含C5-丙炔基胞苷殘基和硫代磷酸酯基團(tuán)。
19．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含C5-己炔基尿苷殘基和硫代磷酸酯基團(tuán)。
20．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含C5-己炔基胞苷殘基。
21．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含C5-己炔基胞苷殘基和硫代磷酸酯基團(tuán)。
22．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含6-氮雜脫氧尿苷殘基。
23．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含6-氮雜脫氧尿苷殘基和硫代磷酸酯基團(tuán)。
24．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含6-氮雜脫氧胞苷殘基。
25．權(quán)利要求1的反義寡核苷酸，其包含6-氮雜脫氧胞苷殘基和硫代磷酸酯基團(tuán)。
26．一種含有一種反義寡核苷酸的組合物，用該寡核苷酸在濃度低于約1μM時(shí)處理細(xì)胞，所處理的細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF減少，該經(jīng)過處理的細(xì)胞最多產(chǎn)生由未經(jīng)處理的細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF的約90％，該組合物還含有一種細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑。
27．權(quán)利要求26的組合物，其中所述的細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑是一種親脂成分。
28．權(quán)利要求27的組合物，其中的親脂成分含有膽固醇。
29．權(quán)利要求1的組合物，其中所述的寡核苷酸還包含與陽離子形成一種鹽的離子鍵。
30．權(quán)利要求29的組合物，其中所述的陽離子是陽離子脂。
31．權(quán)利要求30的組合物，其中所述的陽離子脂是一種多氨基脂。
32．權(quán)利要求31的組合物，其中所述的多氨基脂是亞精胺-膽固醇。
33．權(quán)利要求26的組合物，其中所述的細(xì)胞吸收增強(qiáng)劑含有一種脂質(zhì)體。
34．權(quán)利要求33的組合物，其中所述的脂質(zhì)體含有Cellfectin。
35．權(quán)利要求33的組合物，其中所述的脂質(zhì)體含有與DOPE混合的亞精胺-膽固醇。
36．一種能與VEGF mRNA結(jié)合并含有硫代磷酸酯基團(tuán)以及選自C5-丙炔基尿苷，C5-丙炔基胞苷，C5-己炔基尿苷，C5-己炔基胞苷，6-氮雜脫氧尿苷和6-氮雜-脫氧胞苷的核苷酸殘基的反義寡核苷酸，其中所述的反義寡核苷酸的雙螺旋解鏈溫度比相同的但無化學(xué)修飾的嘧啶殘基的反義寡核苷酸至少要高約5℃；該反義寡核苷酸減少了在用濃度低于約1μM的該寡核苷酸處理過的細(xì)胞中細(xì)胞的VEGF的生產(chǎn)；該處理過的細(xì)胞產(chǎn)生不超過由未處理過的細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF的約90％。
37．一種含有一種能與VEGF mRNA結(jié)合且?guī)в辛虼姿狨セ鶊F(tuán)以及選自C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-己炔基尿苷、C5-己炔基胞苷、6-氮雜脫氧尿苷和6-氮雜脫氧胞苷中的核苷酸殘基的反義寡核苷酸的組合物，其中該反義寡核苷酸的雙螺旋解鏈溫度比相同的但無化學(xué)修飾的嘧啶殘基的反義寡核苷酸至少高約5℃；該反義寡核苷酸減少了在用濃度低于約1μM時(shí)的該寡核苷酸處理過的細(xì)胞中細(xì)胞的VEGF的生產(chǎn)，該處理過的細(xì)胞產(chǎn)生不超過由未處理過的細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF的約90％；該組合物也含有聚合的持續(xù)釋放的化合物。
38．在含有硫代磷酸酯鍵以及能與編碼VEGF的mRNA結(jié)合的一種反義寡核苷酸的改進(jìn)體中包含在反義寡核苷酸中含有選自C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-己炔基尿苷、C5-己炔基胞苷、6-氮雜脫氧尿苷和6-氮雜脫氧胞苷中的核苷酸殘基；其中該改進(jìn)體增加了一種反義寡核苷酸的雙螺旋解鏈溫度至少約5℃。
39．一種減少在細(xì)胞中細(xì)胞VEGF產(chǎn)生的方法，其包含用權(quán)利要求1的反義寡核苷酸接觸一種細(xì)胞，該細(xì)胞產(chǎn)生最多不超過由來處理過的細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF的約90％，該寡核苷酸濃度不超過1μM。
40．一種選自序列編號(hào)No.2-22的反義寡核苷酸。
41．一種包含具有序列編號(hào)No.2的反義寡核苷酸的組合物。
42．一種包含具有序列編號(hào)No.3的反義寡核苷酸的組合物。
43．一種包含具有序列編號(hào)No.4的反義寡核苷酸的組合物。
44．一種包含具有序列編號(hào)No.6的反義寡核苷酸的組合物。
45．一種包含具有序列編號(hào)No.10的反義寡核苷酸的組合物。
46．一種包含具有序列編號(hào)No.20的反義寡核苷酸的組合物。
47．一種包含具有序列編號(hào)No.21的反義寡核苷酸的組合物。
48．一種包含具有序列編號(hào)No.22的反義寡核苷酸的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用寡核苷酸抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)。本發(fā)明的寡核苷酸可與目標(biāo)mRNA以序列特異性的方式結(jié)合,并阻礙其編碼的基因表達(dá)。公開了為提高其穩(wěn)定性和結(jié)合效率的寡核苷酸化學(xué)修飾。這些修飾的方法可以提高本發(fā)明所設(shè)計(jì)的寡核苷酸的穩(wěn)定性和功效。該寡核苷酸組合物可用于離體療法治療巨噬細(xì)胞,或者通過注射、吸入或局部治療或其它給藥途徑用于體內(nèi)治療。
文檔編號(hào)C07H19/173GK1222192SQ97194721
公開日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月17日
發(fā)明者N·考德哈里, T·S·勞, G·R·雷范卡, P·A·柯薩姆, R·F·蘭多, A·佩曼, E·尤爾曼 申請(qǐng)人:德國赫徹斯特馬里奧羅塞爾有限公司, 阿羅尼克斯藥物公司