專利名稱：Brca1活性調(diào)節(jié)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣泛涉及人類疾病領(lǐng)域，更特別地涉及對基于具有BRCA1活性的調(diào)節(jié)子的疾病的治療和診斷方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌是美國死于癌癥的婦女的主要病因，每年有近170000名婦女罹患該病。報導病例的5％被認為起因于患者對該病有遺傳傾向。乳腺癌通?？煞譃樵缙诎l(fā)作和晚期發(fā)作型，后者定義為在50歲左右發(fā)病。診斷患有乳腺癌的40歲以下婦女的接近25％被認為是家族性的，因此是有遺傳因素的。晚期型乳腺癌也常是家族性的，雖然該病患者的家庭成員患此病的危險要少于早期型患者的家庭成員。
根據(jù)對遺傳性早期乳腺癌和卵巢癌家族的研究，據(jù)稱與這些疾病相關(guān)的一個基因已確定位于17號染色體的長臂，命名為BRCA1，或乳腺癌1基因(breast cancer one gene)。見Hitoyuki T.等，癌癥研究，552998-3002。對偶發(fā)乳腺癌的研究也表明該病與更精確地定位于染色體區(qū)17q21的BRCA1有遺傳聯(lián)系。見Hall J.M.等，科學，2501684-1689(1990)。
最近，BRCA1基因已被克隆，顯示出編碼一個有腫瘤抑制蛋白活性的蛋白質(zhì)。參見Miki Y.等，科學，26666-71；WO96/05306。一段時間以來，人們已經(jīng)知道許多癌癥至少部分起因于某些稱為“原癌基因”的正?；虻耐蛔??！霸┗颉眳⑴c調(diào)節(jié)正常細胞生長，其方式剛剛開始在分子水平進行探討。突變的“原癌基因”，或稱為“癌基因”的致癌基因破壞了正常細胞生長，如果癌癥不能及時發(fā)現(xiàn)和治療，這最終將導致生物的死亡。正?；虬┘毎L過程中，“原癌基因”或“癌基因”分別與調(diào)節(jié)或試圖調(diào)節(jié)正常細胞或癌細胞的生長調(diào)節(jié)子相抗衡。這種蛋白稱為腫瘤抑制蛋白，包括BRCA1、P53、成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(Rb)，多發(fā)性結(jié)腸腺癌蛋白(APC)、Wilm癌1型蛋白(WT1)、1型神經(jīng)纖維瘤蛋白(NF1)和2型神經(jīng)纖維瘤蛋白(NF2)。
BRCA1 cDNA編碼具1863個氨基酸的一個蛋白質(zhì)，理論分子量接近207000。參見Miki Y.等(1994)，科學，26666-71。BRCA1經(jīng)過克隆和鑒定表明是一個腫瘤抑制蛋白。例如幾位研究者最近的工作表明將BRCA1基因序列轉(zhuǎn)染到MCF-7腫瘤細胞中并表達時，抑制了體內(nèi)腫瘤生長，延長了患有腫瘤的動物的存活時間。參見Holt J.T.等，(1996)，國家遺傳學(Nat.Genet.)，12298-302。用表達抗已形成的MCF-7腹膜腫瘤的野生型BRCA1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體得到相似的結(jié)果。
已有大量工作致力于鑒定BRCA1中影響其腫瘤抑制活性的區(qū)域?？磥碓摲肿拥牟煌瑓^(qū)域?qū)ζ淠[瘤抑制活性影響不同。例如，近手全長的截短BRCA1蛋白不抑制乳腺癌細胞生長，但能抑制卵巢癌細胞生長。參見Holt J.T.等，(1996)，國家遺傳學，12298-302。這些現(xiàn)象有力地提示不同的宿主細胞因子，推測是一些蛋白質(zhì)，與BRCA1不同區(qū)域相互作用而影響細胞生長。
在過去幾年中已著手闡明某些腫瘤抑制蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用。參見Levin A.，生物化學年度綜述，1993，62卷623-651。鑒定參與這些相互作用的蛋白將有助于發(fā)展新的診斷方法，和新的確診、治療癌癥的療法。例如，成視網(wǎng)膜細胞瘤抑制蛋白鄰近脯氨酸的絲氨酸處于磷酸化狀態(tài)。細胞周期S、G2和M期磷酸化水平高，影響這個反應的激酶依次被調(diào)節(jié)細胞周期的一個細胞周期蛋白激活。隨后在有絲分裂晚期，磷酸酶移去該蛋白質(zhì)的磷酸基團，成視網(wǎng)膜細胞瘤抑制蛋白在G0-G1期恢復非磷酸化狀態(tài)。顯然，鑒定出能影響這些相互作用的藥物有望在調(diào)節(jié)細胞生長中發(fā)揮重要作用，因而能應用于癌癥治療。
然而，到目前為止，對與腫瘤抑制蛋白BRCA1的相互作用的研究很少。為了完善診斷和治療乳腺癌、卵巢癌的方法，關(guān)鍵在于鑒定和分離出這樣的蛋白質(zhì)。
發(fā)明概述本發(fā)明第一個目的是描述一族相關(guān)的分離核酸序列，它們編碼以下稱為調(diào)節(jié)子蛋白的能結(jié)合腫瘤抑制蛋白BRCA1的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第二個目的是描述一族相關(guān)的分離核酸序列，它們編碼分子量大約45-97Kdal的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述蛋白質(zhì)至少有一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，任選有一個鋅指結(jié)構(gòu)域，它們結(jié)合位于BRCA1前600個氨基酸內(nèi)用于調(diào)節(jié)子蛋白結(jié)合的不連續(xù)序列。
本發(fā)明第三個目的是描述有一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和一個鋅指結(jié)構(gòu)域的分子量約為53Kdal的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述兩個結(jié)構(gòu)域均靠近分子的氨基端，結(jié)合BRCAI上位于BRCA1前600個氨基酸內(nèi)調(diào)節(jié)子蛋白結(jié)合的共有序列。
本發(fā)明第四個目的是分別描述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離核酸或蛋白質(zhì)片段。
本發(fā)明第五個目的是描述用編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白或片段的分離的核酸序列轉(zhuǎn)化了的宿主細胞。
本發(fā)明第六個目的是描述含有編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白或片段的分離的核酸序列的載體。
本發(fā)明第七個目的是描述由BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的全長或片段組成的復合物。
本發(fā)明第八個目的是描述利用編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白全長或其片段的分離核酸序列或其片段診斷疾病，優(yōu)選涉及不希望的細胞生長的疾病(包括癌癥)的方法。
本發(fā)明第九個目的是描述一種檢驗方法，用于鑒定對涉及不希望的細胞生長的疾病(包括癌癥)有療效的化合物。
在閱讀了下述說明書中對本發(fā)明各個方面的描述后，本發(fā)明以上和其它目的對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。本發(fā)明上述和其它內(nèi)容在下面的附圖、發(fā)明詳述、實施例中將作更詳細解釋。
附圖概述

圖1顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和氨基酸序列，描述為1號序列，091-21A31。
圖2顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和氨基酸序列，描述為3號序列，091-1F84。
圖3顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和氨基酸序列，描述為5號序列，091-132Q20。
圖4顯示可提高細胞內(nèi)BRCA1含量的化合物的鑒定方法模式。
表1顯示BRCA1中與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白3號序列091-1F84，1號序列091-21A31，5號序列091-132Q20相互作用的區(qū)域。實驗中利用雙雜合檢測方法，參見美國專利5 283 173或Chien等，1991，美國國家科學院院報，889578-9582。編碼3號序列091-1F84，1號序列091-21A31和5號序列091-132Q20的cDNA與GAL4激活結(jié)構(gòu)域融合，表中顯示的BRCA1區(qū)域與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合?！?”號作為β-半乳糖苷酶活性指標。一個“+”號表示活性最低，三個表示活性最高。
表2顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白1號序列091-21A31中與BRCA1的區(qū)域相互作用的區(qū)域。
發(fā)明詳述說明書中提到的所有出版物和專利申請在此引入作為參考，它們在同一程度上被引用，似乎每篇出版物或?qū)＠暾埗际翘貏e地并單獨地引入作為參考。
定義首先需要指出，除非另有規(guī)定，此處所有科技名詞與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。一般所用的術(shù)語和下面描述的實驗操作是本領(lǐng)域內(nèi)公知和常用的。重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化(如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)均使用標準技術(shù)。通常，酶反應和提純步驟均參照生產(chǎn)商說明。技術(shù)和操作通常按照本領(lǐng)域常規(guī)方法和常用參考書進行(通常參考Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，在此引入作為參考)。此處所用的術(shù)語和下面描述的分析化學、有機合成化學及藥物配制實驗操作是本領(lǐng)域內(nèi)公知和常用的?；瘜W合成、化學分析、藥物配制和給藥、患者醫(yī)治均使用標準技術(shù)。
表示本發(fā)明BRCA1或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白選定的特定實施方案的分子式中，盡管常常未特別指出，但應理解氨基和羧基末端基團為處于生理pH值時的構(gòu)型，除非另有規(guī)定。因此，應理解在生理pH值時為N-端H2+和C-端O-狀態(tài)，在特定實施例或分子式中不特別說明。此處所用多肽符號與標準使用方法和傳統(tǒng)一致，即分子左手端是氨基末端，右手端是羧基末端。當然，酸和堿式鹽，包括在非生理pH值時形成的鹽，也包含在本發(fā)明化合物中。文中所述氨基酸殘基優(yōu)選為L異構(gòu)型。20個常見氨基酸、非天然氨基酸如a，a-分布的氨基酸(a，a-distributed amino acids)、N-烷基化氨基酸、乳酸及其它非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D型氨基酸)也適合作為本發(fā)明多肽的組分，只要該多肽仍保留了所需的功能性質(zhì)即可。對于圖示的多肽而言，每個編碼殘基適當時用三字母表示，與常見氨基酸的三字母名稱一致，這符合標準多肽命名法(描述于生物化學雜志，2433553-59(1969))，在37CFR§1.822(6)(2)中采用。
游離官能團，包括位于羧基和氨基末端的(稱為非干擾性取代基)，也可以是酰胺化、?；蚱渌淖兓衔锶芙舛榷挥绊懫浠钚缘娜〈?。這在已知BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白具有能結(jié)合BRCA1的某些區(qū)，并希望從這些區(qū)域制備可溶性多肽的情況中尤其有用。
本發(fā)明公開中使用的下列術(shù)語，除非另有說明，作如下理解“分離的蛋白質(zhì)”在本文中指一種來源于cDNA、重組RNA的蛋白質(zhì)，或者來源于合成的或某種組合的蛋白質(zhì)，由于其來源，所述“分離的蛋白質(zhì)”(1)基本上與自然界發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)無關(guān)，(2)基本不含相同來源的其它蛋白質(zhì)，如不含人蛋白質(zhì)，(3)可以用其它種的細胞表達，或(4)自然界中不存在。
此處用于描述物質(zhì)的“自然存在”是指該物質(zhì)能在自然界中找到。例如，存在于生物體(包括病毒)內(nèi)，能從自然界來源中分離得到，未被人有意在實驗室修飾過的多肽和多核苷酸序列是自然存在的。
術(shù)語“多核苷酸”在本文中指一個至少10個堿基長的多聚體形式的核苷酸，可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這兩種類型的修飾形式。該術(shù)語包括單鏈或雙鏈DNA。
本文所用術(shù)語“寡核苷酸”包括自然存在的、或通過自然存在或非自然存在的寡核苷酸鍵連接在一起的修飾核苷酸。寡核苷酸是具200個堿基或更短的多核苷酸子集合。優(yōu)選寡核苷酸長度為10到60個堿基，最優(yōu)選12、13、14、15、16、17、18、19或20到40個堿基。寡核苷酸通常是單鏈的，例如用作探針；雖然也可以是雙鏈的，例如用于構(gòu)建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。本文所用術(shù)語“自然存在的核苷酸”包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。本文所用術(shù)語“修飾的核苷酸”包括帶有修飾的或取代的糖基等的核苷酸。本文所用術(shù)語“寡核苷酸鍵”包括如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoroaniladate、氨基磷酸酯等寡核苷酸鍵。需要時寡核苷酸可帶有檢測標記。
本文所用術(shù)語“序列同源性”是描述兩個核酸序列之間堿基匹配的比例或兩個氨基酸序列之間氨基酸匹配的比例。若序列同源性表示為百分比，如50％，則該百分比表示與其它序列進行比較的BRCA1序列長度上的匹配比例?？梢栽试S存在缺口(在兩個序列中任一個)以達到最大匹配程度；一般所用缺口長度為15個堿基或更少，優(yōu)選6個堿基或更少，更優(yōu)選2個堿基或更少。寡核苷酸用作探針或處理時，目標核酸和寡核苷酸序列之間序列同源性一般在20個可能的寡核苷酸堿基對配對中有不少于17個目標堿基匹配(85％)；優(yōu)選10個可能的堿基對配對中有不少于9個目標堿基匹配(90％)；最優(yōu)選20個可能的堿基對配對中不少于19個目標堿基匹配(95％)。
如果兩個氨基酸序列部分或全部相同，則它們是同源的，例如，85％同源性意味著兩個序列排列比較達到最大匹配時有85％氨基酸是相同的?？梢栽试S存在缺口(在兩個序列任一個中)以達到最大匹配程度；缺口長度優(yōu)選5個堿基或更少，更優(yōu)選2個堿基或更少。可替代地并優(yōu)選地，如果兩個蛋白質(zhì)序列(或來源于它們的最少30個氨基酸的多肽序列)用具有突變數(shù)據(jù)矩陣和缺口罰分為6或更大的ALIGN程序得到的序列對比度大于5(標準偏差單位)，則它們是同源的。參見Dayhoff M.O.，蛋白序列與結(jié)構(gòu)圖譜，1972，第五卷，國家生物醫(yī)學研究基金會，101-110，和該卷的第2號增刊，1-10頁。更優(yōu)選地，若用ALIGN程序最佳排列使兩個序列或其部分的氨基酸有50％或以上相同時，則它們是同源的。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一個特點是有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。后者描述為富含亮氨酸殘基的一段氨基酸，通常為每第7個殘基，通過它，蛋白質(zhì)可二聚化形成同源或異源二聚體。有亮氨酸拉鏈的蛋白包括Jun和Fos。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一個任選的特點是有鋅指結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選類型是C3H2C3，C3HC4，或CX2CX11-27CXHX2H或CX2CX6-17CX2C；其中C、X和H分別代表半胱氨酸、一個氨基酸和組氨酸。這個結(jié)構(gòu)域結(jié)合鋅離子，經(jīng)常與結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)有關(guān)。用本領(lǐng)域人員知道的合適的數(shù)據(jù)庫，特別是Prosite Protein Database易于識別這樣的結(jié)構(gòu)域。
本文所用“基本純”意味著目的種類是優(yōu)勢種類(即組合物中，在摩爾水平上，它比其它種類大分子含量高)，優(yōu)選地，基本純的級分是目的種類至少占所有種類大分子的50％(摩爾基礎(chǔ)上)的一種組合物。通常，一種基本純的組合物是組合物中目的種類占所有種類大分子的80％以上，更優(yōu)選高于85％、90％、95％和99％。最優(yōu)選目的種類已純化至基本同質(zhì)(組合物中不能由常規(guī)檢測方法發(fā)現(xiàn)污染種類)，其中組合物基本由一種大分子組成。
“調(diào)節(jié)子蛋白”、“調(diào)節(jié)肽”或“調(diào)節(jié)多肽”指的是影響B(tài)RCA1基因的活性或該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)或肽。每個定義包括一個或更多這樣的實體。
化學術(shù)語的使用按照本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用方法，示例見此處引作參考的《McGraw-Hill化學名詞詞典》(Parker S.編，1985)，McGraw-Hil，San Francisco。
通過基因工程由克隆的基因制備蛋白質(zhì)是公知的技術(shù)。參見Bell等的美國專利4 761 371號第6列第3行到第9列第65行(所有引用的專利文獻的公開內(nèi)容均在此引入作為參考)。下面的討論意欲作為本領(lǐng)域概述，不求反映全貌。
功能相關(guān)的DNA區(qū)是可操縱地連接在一起的。例如啟動子與由它控制轉(zhuǎn)錄的編碼序列是可操縱地連接的；核糖體結(jié)合位點可操縱地連接到由它決定起始翻譯的編碼序列上。通?？刹倏v地連接意味著是鄰近的，在前導序列的情況中，是鄰近的且讀框一致的。
合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母細胞或高等真核細胞。原核細胞包括革蘭氏陰性和陽性生物體，如大腸桿菌或桿菌屬(Bacilli)。高等真核細胞包括下面描述的來源于哺乳動物的已建好的細胞系?？勺鳛槔拥乃拗骷毎荄H5α、E.coli W3110(ATCC27 325)、E.coli B、E.coli X1776(ATCC31 537)、E.coli294(ATCC31 446)。假單胞菌、芽孢桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesans)也是合適的宿主。
在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)可作為表達外源基因的載體。(參見Smith等，1983，病毒學雜志，46584；Smith，美國專利第4 215 051號)。在下面描述的一個特定實施方案中，用表達標記了glu-glu表位的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白構(gòu)建體的桿狀病毒載體感染Sf9昆蟲細胞。參見Rubinfeld等，生物化學雜志，270(10)5549-5555(1995)?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的其它表位標記，包括6x組氨酸標記、myc或EE-標記(即Glu-Glu標記)。E代表谷氨酸。
有多種合適的微生物載體可供選擇。通常，一種微生物載體包含能被目的宿主識別的復制起點、在宿主中能行使功能的啟動子和表型選擇基因如編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)需要的蛋白質(zhì)的基因?？蓸?gòu)建相似的構(gòu)建體以用于其它宿主。大腸桿菌通常使用pBR322轉(zhuǎn)化，參見Bolivar等，基因，2，95(1977)。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因此易于鑒定到轉(zhuǎn)化細胞。表達載體應含有能被宿主生物識別的啟動子。這通常意味著啟動子來源于目的宿主。最常用于重組微生物表達載體的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等，自然，275，615(1978)；Goeddel等，核酸研究，8，4057(1980)和歐洲專利申請36 776)，tac啟動子(H.De Boer等，美國國家科學院院報，80，21(1983))。這些是常用的，其它微生物啟動子也是適宜的。許多啟動子的核酸序列細節(jié)已公開，技術(shù)人員可以將它們可操縱地連接到質(zhì)?；虿《据d體上編碼BRCA1的DNA上(Siebenlist等，細胞，20，269，1980)。啟動子和Shine-Dalgarno(SD)序列(用于在原核宿主中表達的情況)被可操縱地連接到編碼BRCA1的DNA上，即它們的定位能促進從DNA到BRCA1信使RNA的轉(zhuǎn)錄。SD序列能通過它與大腸桿菌16S rRNA 3′末端的堿基配對促進mRNA與核糖體的結(jié)合(Steitz等(1979)，生物調(diào)節(jié)與發(fā)育基因表達(R.F.Goldberger編))。要表達具有弱核糖體結(jié)合位點的原核基因和真核基因參見Sambrook等，(1989)“大腸桿菌中克隆基因的表達”，《分子克隆實驗室指南》。此外，細菌啟動子可以包括自然存在的非細菌來源的啟動子，它具有結(jié)合細菌RNA聚合酶和起始轉(zhuǎn)錄的能力。自然存在的非細菌來源的啟動子也可以與適宜的RNA聚合酶相偶聯(lián)以在原核細胞中高產(chǎn)量表達某些基因。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)是偶聯(lián)啟動子系統(tǒng)的一個例子(Studier等，(1986)，分子生物學雜志，189113；Tabor等(1985)，美國國家科學院院報，821074)。另外，雜合啟動子也可以由噬菌體啟動子和大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(歐洲專利公開267 851號)。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白可以在細胞內(nèi)表達。啟動子序列可以直接連接BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因或它的一個片段，這種情況下N端第一個氨基酸總是由ATG起始密碼子編碼的甲硫氨酸。N端的甲硫氨酸可根據(jù)需要用溴化氰體外溫育或用細菌甲硫氨酸N端肽酶(歐洲專利公開219 237號)通過體內(nèi)或體外溫育的方法而從該蛋白質(zhì)中切去。
真核微生物如酵母培養(yǎng)物可以用合適的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白載體轉(zhuǎn)化。參見美國專利4 745 057。釀酒酵母是低等真核宿主微生物中最常用的，雖然有許多其它菌株可選用。酵母載體可以含有酵母2μ質(zhì)粒的復制起點或自主復制序列(ARS)、啟動子、編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的DNA、多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列，及選擇基因。
適用于酵母載體的啟動子序列包括金屬硫蛋白啟動子、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，生物化學雜志，255，2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.，7，149(1968)；Holland等，生物化學，17，4900(1978))，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶等的啟動子。適用于酵母表達的載體和啟動子在R.Hitzman等，歐洲專利公開73 657號有進一步的詳述。
來源于多細胞生物的細胞培養(yǎng)物是我們希望的用于重組BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白合成的宿主。原則上，任何來源于脊椎或無脊椎動物的高等真核細胞都是可行的。但正如實施例中顯示，優(yōu)選的是哺乳動物細胞。在細胞培養(yǎng)體系中增殖這些細胞已是常規(guī)操作。參見組織培養(yǎng)，學術(shù)出版社，Kruse和Paterson主編(1973)。
用于轉(zhuǎn)化脊椎動物細胞的表達載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列經(jīng)常來源于病毒。例如，常用的一些啟動子來源于CMV、多瘤病毒、腺病毒2和猴病毒40(SV40)。參見美國專利4599308。
復制起點可通過構(gòu)建含有外源起點的載體提供，如來源于SV40或其它病毒(多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)或由宿主細胞染色體復制機制提供。如果載體能整合到宿主染色體中，則后者是一種有效的方法。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的鑒定BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的鑒定可以使用多種鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的不同檢測方法?？捎玫膫鹘y(tǒng)方法有將細胞裂解液或利用BRCA1從細胞裂解物中得到的蛋白質(zhì)通過梯度或?qū)游鲋M行共免疫沉淀、交聯(lián)和共提純，在細胞裂解液中鑒定出可與BRCA1相互作用的蛋白質(zhì)。這些方法中可以應用完整BRCA1或一個BRCA1肽。一旦分離后，這樣的胞內(nèi)蛋白可被鑒定，并可隨之與標準技術(shù)結(jié)合，從而鑒定與它相互作用的蛋白質(zhì)。例如，可以用本領(lǐng)域人員熟知技術(shù)如Edman降解技術(shù)確定與BRCA1相互作用的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的至少部分氨基酸序列。(參見如Creighton 1983，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理”，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，34-49)。得到的氨基酸序列可用來指導合成寡核苷酸混合物，用于篩選編碼這些胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因序列。篩選可用如標準的雜交或PCR技術(shù)實現(xiàn)。合成寡核苷酸混合物和篩選的技術(shù)是眾所周知的。(參見Ausubel，出處同前，PR教程方法和應用指南，1990，Innis，M.等編，學術(shù)出版社公司，紐約)。
另外，可以使用能同時鑒定到編碼與BRCA1相互作用的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因的方法。這些方法包括，例如用探針檢測表達文庫，其方式與熟知的抗體檢測λgt11文庫相似，其中使用標記的BRCA1蛋白或融合蛋白如BRCA1與標記蛋白(如酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光蛋白或染料)融合，或融合一個Ig-Fc結(jié)構(gòu)域。
作為體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)相互作用的一種方法-雙雜合系統(tǒng)，如下詳述，這種方法僅作例證而非限定。這個系統(tǒng)已有描述(美國專利5283173，Chien等，1991，美國國家科學院院報，889578-9582)，并且可從Clontech(Palo Alto，CA)購到。簡要步驟是，利用這個系統(tǒng)構(gòu)建編碼兩個雜合蛋白的質(zhì)粒一個質(zhì)粒由編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸與編碼BRCA1、BRCA1肽或融合蛋白的BRCA1核苷酸序列融合組成，另一個質(zhì)粒由編碼該轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活結(jié)構(gòu)域的核苷酸與編碼未知蛋白的cDNA融合組成，該cDNA已重組到這個質(zhì)粒中作為cDNA文庫的一部分。將所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合質(zhì)粒和該cDNA文庫轉(zhuǎn)化釀酒酵母的一個菌株，該菌株帶有一個報告基因(如HIS3或LacZ)，其調(diào)控區(qū)包含該轉(zhuǎn)錄激活蛋白的結(jié)合位點。單獨一個雜合蛋白不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜合蛋白不能激活是因為它無激活功能，激活結(jié)構(gòu)域雜合蛋白不能激活則是因為它不能定位到激活蛋白的結(jié)合位點。兩個雜合蛋白的相互作用重新組成了功能性的激活蛋白，導致報告基因的轉(zhuǎn)錄激活，這可以通過對報告基因產(chǎn)物的測定而檢測到。
雙雜合系統(tǒng)或相關(guān)方法可以用來從激活結(jié)構(gòu)域文庫篩選出與“誘餌”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。作為例證而非限制，優(yōu)選利用BRCA1肽或融合蛋白作為誘餌基因產(chǎn)物。單獨的全長BRCA1可以作為轉(zhuǎn)錄激活蛋白，因此不能作誘餌。將整個基因組或cDNA序列與編碼激活結(jié)構(gòu)域的DNA融合。將這個文庫與一個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到一種酵母報告菌株中，該質(zhì)粒編碼誘餌BRCA1基因產(chǎn)物和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合形成的雜合蛋白。從產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中篩選出報告基因轉(zhuǎn)錄被激活的那些轉(zhuǎn)化體。作為例證而非限制，可將誘餌BRCA1基因序列例如BRCA1的開放閱讀框(或BRCA1的一個結(jié)構(gòu)域)克隆到載體中以便該序列被可翻譯地融合到編碼GAL4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA上。純化菌落，分離出引起報告基因轉(zhuǎn)錄的文庫質(zhì)粒。利用DNA測序確定克隆的核苷酸序列，進而揭示由所述文庫質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)序列的性質(zhì)。
可用本領(lǐng)域常規(guī)方法，構(gòu)建細胞系的cDNA文庫，所述細胞系是欲從中檢測與誘餌BRCA1基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)的細胞系。根據(jù)此處敘述的特定體系，例如，可將cDNA片段可插入載體中以便與GAL4蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可翻譯地融合。該文庫與誘餌BRCA1基因-GAL4融合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到帶有LacZ基因的酵母菌株，其中LacZ基因由含有GAL4激活序列的啟動子所驅(qū)動。將cDNA編碼的與誘餌BRCA1基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)與GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，重新組成活性GAL4蛋白，由此啟動HIS3基因表達。表達HIS3的克隆在缺乏組氨酸的半固體瓊脂培養(yǎng)基平板能生長，據(jù)此可被檢出。從這些菌株提純cDNA，并用來通過本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備和分離與誘餌BRCA1基因相互作用的蛋白質(zhì)。
用上述雙雜合技術(shù)鑒定到了幾個BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，顯示具有包括亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的某些共同特征。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白cDNA三個代表性的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和推測的氨基酸序列見圖1-3。cDNA和它們編碼的蛋白質(zhì)定為1號序列，091-21A31；3號序列，091-1F84；5號序列，091-132Q20。這些cDNA編碼的蛋白質(zhì)分子量約為45-97kd。特別值得注意的是，其中至少有一個亮氨酸拉鏈基序，還任選存在一個鋅指結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的核苷酸序列包括(a)圖1-3所示或1996年8月14日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的保藏號為98141(3號序列，091-1F84)、98142(1號序列，091-21A31)、98143(5號序列，091-132Q20)的cDNA克隆中的DNA序列；(b)與圖1-3所示的或所述保藏于ATCC的cDNA克隆所含的DNA序列的互補序列在高度嚴緊條件下能雜交上且編碼功能相當?shù)幕虍a(chǎn)物的任何核苷酸序列，所述高度嚴緊條件例如是與結(jié)合于濾膜的DNA在0.5MNaHPO4，7％十二烷基磺酸鈉(SDS)，1mM EDTA，65℃下雜交，在0.1xSSC/0.1％SDS，于68℃下洗滌(Ausubel F.M.等編，1989，分子生物學最新方案，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，JohnWiley&sons，Inc.，New York，p2.10.3)；(c)與編碼圖1-3所示的氨基酸序列的DNA序列或包含于如上所述的保藏于ATCC的cDNA克隆中的DNA序列的互補序列在較弱嚴緊度的條件下能雜交上、但仍編碼與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白功能相當?shù)幕虍a(chǎn)物的任何核苷酸序列，所述較弱嚴緊條件例如是中度嚴緊條件下，舉例來說，用0.2xSSC/0.1％SDS在42℃洗滌(Ausubel等，1989，出處同前)。功能相當?shù)幕虍a(chǎn)物包括自然存在于其它種的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因，以及自然存在的或工程化的保持至少部分BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白活性(即結(jié)合BRCA1)的突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因。本發(fā)明也包括(a)到(c)的序列的簡并性變體。
本發(fā)明還包括與上段中(a)到(c)的核苷酸序列能雜交上，因此是相應核苷酸序列的互補體的核酸分子，優(yōu)選DNA分子。這樣的雜交條件可以是如上所述的高度或不太高的嚴緊條件。在所述核酸分子是脫氧寡核苷酸(寡核苷酸)情況下，高度嚴緊條件是指在如6xSSC/0.05％焦磷酸鈉中于37℃(對14個堿基的寡核苷酸)、48℃(對17個堿基的寡核苷酸)、55℃(對20個堿基的寡核苷酸)、60℃(對23個堿基的寡核苷酸)下洗滌。這些核酸分子可以編碼或作為BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的反義分子，可以用于例如基因調(diào)控(用于和/或作為BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因核酸序列的擴增反應的反義引物)。這樣的序列可以作為核酶和/或三股螺旋序列的一部分，也可以用于BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因調(diào)控。更進一步，這些分子可以作為診斷方法的組分，由此例如可檢測與失控細胞生長(即癌癥)相關(guān)的特定BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的存在。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，利用依據(jù)本發(fā)明公開的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列設計的兩組簡并寡核苷酸引物群，可以通過PCR從所需生物體的核酸中分離到BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的同系物。該反應的模板可以是從諸如已知或懷疑表達BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的人或非人細胞系或細胞型(如乳腺或卵巢細胞)的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。
可對該PCR產(chǎn)物進行亞克隆和測序，以確保擴增的序列代表BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的序列。隨后可利用該PCR片段通過多種方法分離全長cDNA克隆。例如，可標記所述擴增片段并用于篩選cDNA文庫，如噬菌體cDNA文庫?；蛘?，可利用該標記片段通過篩選基因組文庫而分離基因組克隆。
可以應用PCR技術(shù)分離全長cDNA序列。例如，按照標準步驟，可以從合適的細胞來源(即已知或懷疑表達BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的細胞例如乳腺或卵巢細胞)分離RNA。用一個特異于擴增片段5′最末端的寡核苷酸引物引發(fā)第一鏈的合成，從而進行逆轉(zhuǎn)錄反應。所得的RNA/DNA雜合體可通過標準的末端轉(zhuǎn)移酶反應加上鳥嘌呤尾巴，該雜合體經(jīng)RNAaseH消化，隨后用poly-C引物引發(fā)第二鏈的合成。這樣可容易地分離出所述擴增片段上游cDNA序列?？赡苡玫降目寺〔呗跃C述見如Sambrook等，1989，出處同前。
突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的cDNA也可以利用例如PCR進行分離。這種情況下，可以從推測帶有突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的個體的已知或懷疑表達該突變蛋白的細胞中分離mRNA，用oligo-dT寡核苷酸與之雜交，并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄延伸新鏈，從而合成第一鏈cDNA。然后利用與正?；?′端特異雜交的寡核苷酸合成第二鏈cDNA。用這兩個引物，經(jīng)PCR擴增出該產(chǎn)物，將其克隆至合適的載體中，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行DNA序列分析。通過比較突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因和正常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的DNA序列，可以確定導致突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物功能喪失或改變的突變。
可以利用從已知或懷疑帶有突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的個體得到的DNA構(gòu)建基因組文庫，或者利用從已知或懷疑表達突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的細胞型得到的RNA構(gòu)建cDNA文庫。然后可標記正常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因或其任何合適的片段，并用作探針從這些文庫中鑒定相應的突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因。然后可純化含有突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因序列的克隆，并按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行序列分析。
另外，可以利用從諸如已知或懷疑帶有突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的個體的已知或懷疑表達這種突變等位基因的細胞型中分離的RNA合成的cDNA構(gòu)建表達文庫。以這種方式，可以表達由所述推測的突變細胞型產(chǎn)生的基因產(chǎn)物，并利用標準抗體篩選技術(shù)和抗正常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物的抗體(如下述)進行篩選。(篩選技術(shù)，參見例如，HarlowE和Lane編，1988，《抗體實驗指南》，冷泉港出版社，冷泉港)，另外，可以用標記的融合蛋白實現(xiàn)篩選。在BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因突變導致表達了一個功能改變的基因產(chǎn)物(如由于錯義或移碼突變引起的)的情況下，BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一套多克隆抗體就可能與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白突變體發(fā)生交叉反應。通過它們與標記抗體的反應檢測到的這種BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白突變體可被純化，并按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行序列分析。
本發(fā)明也包括編碼BRCA1調(diào)節(jié)子肽段、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子、BRCA1調(diào)節(jié)子融合蛋白的核苷酸序列。核苷酸編碼的融合蛋白包括但不限于全長BRCA1調(diào)節(jié)子、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子或肽片段與不相關(guān)的蛋白質(zhì)或肽(如協(xié)助融合蛋白純化和檢測的標記表位或可以用作標記的酶、熒光蛋白、發(fā)光蛋白)等的融合體。優(yōu)選的表位標記是glu-glu，如Rubinfeld B.等，生物學和化學雜志，第270卷，105549-5555(1995)和Grussenmyer T等，美國國家科學院院報，827952-7954(1985)所述。
本發(fā)明也包括(a)含有任意上述BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列和/或它們的互補體(即反義序列)的DNA載體；(b)含有任意上述BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列的DNA表達載體，其中所述編碼序列可操縱性地連接了可指導其表達的調(diào)控元件；(c)含有任意上述BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列的基因工程宿主細胞，其中所述編碼序列可操縱性地連接了可指導其在宿主細胞的表達的調(diào)控元件。此處所用調(diào)控元件包括但不限于誘導型和非誘導型啟動子、增強子、操縱子和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的可啟動和調(diào)控表達的其它元件。這樣的調(diào)控元件包括但不限于桿狀病毒啟動子、巨細胞病毒hCMV即早期基因、SV40腺病毒早期或晚期啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、噬菌體A的主要操縱子和啟動區(qū)、fd衣殼蛋白控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶啟動子、酸性磷酸酶啟動子、酵母交配因子啟動子。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白如前所述，圖1-3顯示三個代表性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA序列和推測的氨基酸序列；1號序列，091-21A31；3號序列，091-1F84；5號序列，091-132Q20。5號序列，091-132Q20不是全長序列。已計算出諸蛋白質(zhì)的分子量約為45-97kd。特別值得注意的是其中存在至少一個亮氨酸拉鏈基序，任選一個鋅指結(jié)構(gòu)域。例如，3號序列，091-1F84有兩個亮氨酸拉鏈；5號序列，091-132Q20有一個亮氨酸拉鏈，而1號序列，091-21A31有一個亮氨酸拉鏈和一個鋅指結(jié)構(gòu)域。用Prosite蛋白數(shù)據(jù)庫很容易識別這些結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白、肽片段、它們的突變、截短或缺失形式及它們的融合蛋白質(zhì)可以應用于多種用途，包括但不限于抗體制備、作診斷檢測中的試劑、鑒定和/或與其它參與細胞生長的基因產(chǎn)物相互作用，在篩選可用于治療不期望的細胞生長紊亂(包括但不限于癌癥)的化合物的測定中用作試劑、作治療這些疾病的藥物。
舉例說明，BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白1號序列，091-21A31以甲硫氨酸開始，該甲硫氨酸的周圍DNA序列與翻譯起始位點一致。這個BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白預測分子量為53.3KD。
本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白氨基酸序列包括圖1所示的氨基酸序列或前述保藏于ATCC的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。另外，其它種的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。實際上，由上面描述的cDNA編碼的任何一種BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白都在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明還包括上面描述的核酸序列編碼的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的同功分子，判斷原則包括但不限于結(jié)合BRCA1的能力，與BRCA1結(jié)合的親和力，當BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的同功分子存在于適宜類型細胞(如卵巢或乳腺細胞)中時所導致的細胞代謝或表型的變化。這種BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的同功分子包括但不限于在由上述BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列編碼的氨基酸序列內(nèi)發(fā)生了氨基酸殘基的添加或取代，但產(chǎn)生的是沉默突變，由此得到的功能等同的基因產(chǎn)物。氨基酸殘基的取代建立在相關(guān)殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或兩親性方面的相似性。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；非極性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；帶正電荷的氨基酸(堿性)包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸；帶負電荷的氨基酸(酸性)包括天冬氨酸和谷氨酸。
雖然可以對BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白DNA進行隨機突變(利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的隨機誘變技術(shù))，并檢測產(chǎn)生的突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白活性，但定點突變BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列(利用本領(lǐng)域熟知的定點誘變技術(shù))，可以產(chǎn)生功能增強(如對BRCA1親和力改變)的突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
例如，可以改造突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白以使蛋白質(zhì)保留了種間特征區(qū)域，而可變殘基發(fā)生改變，這可通過諸如缺失或插入一個氨基酸殘基或者一或多個不同氨基酸殘基的取代。可以在可變位置上作保守性改變，以便產(chǎn)生的突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白仍保留原有功能。可在這些可變位置上作非保守性改變，以使突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白功能改變。或者，若需要改變功能，則可對保守區(qū)作缺失或非保守性改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用此處所述內(nèi)容可以很容易檢測出這種功能改變的突變或缺失的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
可以對BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列作其它突變，以產(chǎn)生更適于在所選定的宿主細胞中表達、表達量增加等的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。例如，每個氨基酸的三聯(lián)密碼子可被修飾以更接近宿主細胞翻譯機制偏好使用的密碼子。
對應于BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白一個或多個結(jié)構(gòu)域(或者結(jié)構(gòu)域的一部分)的肽(如亮氨酸拉鏈、鋅指)，截短的或缺失的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白(如缺失一個或多個上述結(jié)構(gòu)域的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白)，以及全長的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白、BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白與其它無關(guān)蛋白質(zhì)的融合蛋白也在本發(fā)明范圍內(nèi)，這可以根據(jù)這部分和上文公開的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白氨基酸序列設計。這種融合蛋白包括但不限于與表位標記的融合體(例如文中示例)；或與提供標記功能的酶、熒光蛋白或發(fā)光蛋白的融合體。
雖然BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白和肽可以化學合成(參見Creighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子原理，W.H.Freeman&Co.，N.Y.)，但BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白衍生的大的多肽和全長BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白本身可能最好是通過重組DNA技術(shù)，采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)表達含有BRCA1調(diào)節(jié)子基因序列和/或編碼序列的核酸而制備。這些方法可以用來構(gòu)建含有上述BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列和適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號的表達載體。這些方法包括諸如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、體內(nèi)遺傳重組等。實例參見Sambrook等，1989(出處同前)和Ausubel等，1989(出處同前)等內(nèi)敘述的技術(shù)?？晒┻x擇的，編碼BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的RNA可以用例如合成儀化學合成。實例參見《寡核酸合成》，1984，Gait，M.J.等編，IRL Press，Oxford中所述技術(shù)，該書全文引入本文作為參考。
可以利用多種宿主表達載體系統(tǒng)來表達本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列。BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽或多肽是可溶性分泌型衍生物時，則可從培養(yǎng)基中回收。如果該BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽或多肽不是分泌型的，則可以從宿主細胞中分離。但在不僅需要保持BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性，并能應用于估計生物活性(例如藥物篩選測定)的情況下，可以使用這種加工過的宿主細胞本身。
可用于本發(fā)明目的的表達系統(tǒng)包括但不限于微生物，例如轉(zhuǎn)化了含有BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體的細菌(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；轉(zhuǎn)化了含有BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的重組酵母表達載體的酵母菌(如酵母屬、畢赤酵母屬)；被含有BRCA1調(diào)節(jié)子序列的重組病毒表達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞體系；被含有BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的重組病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)感染的或者重組質(zhì)粒(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化了的植物細胞體系；引入了帶有來自哺乳動物細胞基因組的啟動子(如金屬硫蛋白啟動子)或哺乳動物病毒(如腺病毒晚期啟動子、牛痘病毒7.5K啟動子)的重組表達構(gòu)建體的哺乳動物細胞體系(如COS、CHO、BHK、293、3T3、U937)。
在細菌體系中，可以根據(jù)待表達的BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物的預定用途選擇較好的表達載體。例如，若要制備大量的這種蛋白質(zhì)以生產(chǎn)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的藥用組合物或產(chǎn)生抗BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗體，就選用能啟動高水平表達較容易純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體。這種載體包括但不限于大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO J，21791)，其中BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列可與Lac-Z編碼區(qū)讀框一致地單獨連接至載體中從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye，1985，核酸研究，133103-3109；Van Heeke&Schuster，1989，生物學與化學雜志，2645503-5509)等。也可以用pGEX載體來表達與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)形成融合蛋白的外源多肽。若插入片段編碼一個較小的多肽(小于25kD)，則融合蛋白通?？扇?，并可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖珠吸附細胞水解物后，再用游離谷胱甘肽洗脫的方法而很容易地純化。pGEX載體設計為包含凝血酶或凝血因子Xa蛋白酶切割位點，這樣克隆的目的基因產(chǎn)物就能從GST部分釋放出來。或者，若融合蛋白不可溶，并在宿主細胞內(nèi)形成包涵體，則可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)提純包涵體，溶解該重組蛋白質(zhì)。
在昆蟲細胞體系，可以用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)作載體來表達外源基因。(參見Smith等，1983，病毒學雜志，46584；Smith，美國專利4215051)。下面描述的一個特定實施方案中，用表達6xHIS標記的構(gòu)建體或表達EE標記的BRCA1調(diào)節(jié)子構(gòu)建體的桿狀病毒載體感染Sf9昆蟲細胞。
在哺乳動物宿主細胞中，可以使用多種基于病毒的表達系統(tǒng)。下面更詳細地描述的特定實施方案用CMV啟動子在U937細胞或Cos-7細胞瞬時表達標記的BRCA1調(diào)節(jié)子cDNA序列，以表達重組蛋白質(zhì)?；蛘?，可以利用本領(lǐng)域熟知的逆轉(zhuǎn)錄載體系統(tǒng)將該重組表達構(gòu)建體插入宿主細胞。例如，公開的PCT申請說明書WO96/09400和WO94/29438描述的用于轉(zhuǎn)導造血細胞的逆轉(zhuǎn)錄載體系統(tǒng)。
在用病毒作為表達載體的情況下，可將所需的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復合物上，如晚期啟動子和三聯(lián)前導序列。隨后可通過體內(nèi)或體外重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組。在病毒基因組非必要區(qū)域(例如E1或E3區(qū))插入一段序列將產(chǎn)生活性的、能在感染宿主中表達BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物的重組病毒(參見Logan&Shenk，1984，美國國家科學院院報，813655-3659)。還可能需要特異起始信號以有效翻譯插入的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。若將帶有自身起始密碼子和相鄰序列的完整BRCA1調(diào)節(jié)子基因或cDNA插入合適的表達載體，則不需要另外的翻譯調(diào)控信號。然而，若只插入部分BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列，則需要提供外源翻譯調(diào)控信號，可能包括ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須與目的編碼序列的閱讀框一致，以保證翻譯出完整的插入片段。外源翻譯調(diào)控信號和起始密碼子可以是自然或合成等多種來源。表達效率可以通過加入合適的轉(zhuǎn)錄增強元件、轉(zhuǎn)錄終止子等獲得提高(參見Bittner等，1987，酶學方法，153516-544)。
另外，可以選擇可調(diào)節(jié)插入序列的表達或按照預期方式修飾和加工該基因產(chǎn)物的宿主株?；虍a(chǎn)物的修飾(如糖基化)和加工(如切割)可能對蛋白質(zhì)的功能很重要。對于蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾，不同宿主細胞有特征性和特異的機制?？梢赃x擇合適的細胞系或宿主系統(tǒng)來保證所表達的外源蛋白正確修飾和加工。為了實現(xiàn)這個目的，可以用具有用于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適當加工的細胞機制的真核宿主細胞，這樣的哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38、U937細胞。
為了實現(xiàn)長期、高產(chǎn)地制備重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定表達體系。例如，可以加工能穩(wěn)定表達上述BRCA1調(diào)節(jié)子序列的細胞系。用含有病毒復制起點的表達載體，不如用轉(zhuǎn)化了在合適的表達調(diào)控元件(例如，啟動子、增強子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)調(diào)控下的DNA和一個選擇性標記的宿主細胞。導入外源DNA后，可以使工程化的細胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基中。該重組質(zhì)粒含有的選擇性標記使細胞能抗選擇壓，并允許質(zhì)粒穩(wěn)定整合到細胞的染色體內(nèi)，生長形成集落，這種集落又可以被克隆，發(fā)展為細胞系。這個方法可以用于構(gòu)建表達BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物的細胞系。這種工程化細胞系在篩選和評估影響B(tài)RCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物內(nèi)源活性的化合物時特別有用。
多種選擇系統(tǒng)可供利用，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等，1977，細胞，11223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Szybalska&Szybalski，1962，美國國家科學院院報，482026)、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy等，1980，細胞22817)，它們分別可以用于tk-、hgprt-、aprt-細胞。對抗代謝物的抗性也可以用作選擇下列基因的基礎(chǔ)dhfr，此基因賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，美國國家科學院院報，773567；Ohare，1981，美國國家科學院院報，781527)；gpt，此基因賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，美國國家科學院院報，782072)；neo，此基因賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物學雜志，1501)；hygro，此基因賦予對潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因，30147)。
BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物也可以在轉(zhuǎn)基因動物中進行表達。任何種類動物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬、羊、非人靈長類如狒狒、猴和黑猩猩可以用于制作BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因動物。
本領(lǐng)域熟知的任何技術(shù)可以用來將BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因?qū)雱游镏幸援a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的基礎(chǔ)品系。這樣的技術(shù)包括但不限于原核微量注射(HoppeP.C.和WagnerT.E.，1989，美國專利4873191)、對種系細胞進行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)移(Van der Putten等，1985，美國國家科學院院報，826148-6152)、對胚胎干細胞實施基因打靶(Thompson等，1989，細胞，56313-321)、胚胎電穿孔(Lo，1983，分子細胞生物學，31803-1814)、精子介導的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，1989，細胞，57717-723)等。這些技術(shù)的綜述參見此處全文引作參考文獻的Gordon，1989，轉(zhuǎn)基因動物，細胞學國際評論(Intl.Rev.Cytol.)，115171-229。
本發(fā)明提供了全部細胞帶有BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物，以及部分而非全部細胞帶有轉(zhuǎn)基因的動物即嵌合體動物。轉(zhuǎn)基因可以以單個轉(zhuǎn)基因或串聯(lián)體例如頭接頭或頭接尾串聯(lián)體形式整合。該轉(zhuǎn)基因可以選擇性地導入特定細胞類型中，并參照下列Lasko等的技術(shù)(Lasko，M.等，1992，美國國家科學院院報，896232-6236)進行激活。這種細胞類型特異性激活所需調(diào)控序列取決于感興趣的特定細胞類型，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很顯然的。如果需要將BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因整合到內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因的染色體位點，則優(yōu)選基因打靶。簡而言之，用這種技術(shù)時，設計含有與內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因同源的一些核苷酸序列的載體，以通過與染色體序列之間的同源重組，插入內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因的核苷酸序列中并破壞其功能。這樣，也可以通過在內(nèi)源基因中插入非功能性序列而使內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因的表達喪失。轉(zhuǎn)基因可以選擇性地導入特定細胞類型中，從而僅在這一細胞類型中失活內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因，參照下列Gu等的技術(shù)(Gu等，1994，科學，265103-106)。這種細胞類型特異性失活所需的調(diào)控序列取決于感興趣的細胞類型，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也是顯然的。
轉(zhuǎn)基因動物建成后，就可以用標準技術(shù)檢測重組BRCA1調(diào)節(jié)子基因的表達。初步篩選可以用Southern印跡分析或PCR技術(shù)分析動物組織，檢測所述轉(zhuǎn)基因是否已整合。轉(zhuǎn)基因動物組織中轉(zhuǎn)基因的mRNA表達水平可以利用下述技術(shù)估計，這些技術(shù)包括但不限于對得自動物的特定細胞類型樣品進行Northern印跡分析，原位雜交分析，RT-PCR。也可以利用下述的特異于BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗體對表達BRCA1調(diào)節(jié)子基因的組織樣品進行免疫化學定量。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗體特異識別BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一個或多個表位，或其保守變體、肽片段的一個或多個表位的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。這樣的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化的或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、由Fab表達文庫產(chǎn)生的片段、抗獨特型(anti-Id)抗體、以及上述任一形式的表位結(jié)合片段。
本發(fā)明的抗體可以用于例如，檢測生物樣品中的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所以可以作為該蛋白質(zhì)含量異常的患者的診斷和治療手段。這樣的抗體也可以與例如化合物篩選方案結(jié)合應用，如本文所述用于評價待測化合物對BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白表達和/或活性的影響。另外，這樣的抗體也可以與基因治療技術(shù)結(jié)合應用，以在導入患者體內(nèi)前評價正常和/或工程化的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白表達細胞。這樣的抗體還可以作為抑制異常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白活性的方法。
為制備抗體，可通過注射BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白、BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白多肽、BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白同功分子、或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的突變體而對各種宿主動物進行免疫。這樣的宿主動物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等等。可以利用多種佐劑來增強免疫應答，這取決于宿主種類，包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)，礦物膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂、普盧龍尼克多元醇類、聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔血藍蛋白、二硝基苯酚、和可能有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和小型棒狀桿菌。多克隆抗體是來源于免疫動物血清的異種抗體分子群。
單克隆抗體是特異抗原的同種抗體群，可以用通過連續(xù)培養(yǎng)細胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，自然，256495-497；美國專利4376110)、人類B細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，今日免疫學，472；Cole等，1983，美國國家科學院院報，802026-2030)、EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp77-96)。這樣的抗體可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD的任何免疫球蛋白型及其亞型。本發(fā)明產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以體內(nèi)或體外培養(yǎng)。在體內(nèi)能高滴度產(chǎn)生單克隆抗體使得這一方法成為目前優(yōu)選的方法。
另外，可以利用將合適抗原特異性的小鼠抗體分子基因連接合適生物活性的人抗體分子基因產(chǎn)生嵌合抗體的技術(shù)(Morrison等，1984， 美國國家科學院院報816851-6855；Neuberger等，1984，自然，312604-608；Takeda等，1985，自然，314452-454)。嵌合抗體是各部分來源于不同動物種類的分子，如具有來源于單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。
或者，用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4946778；Bird，1988，科學，242423-426；Huston等，1988，美國國家科學院院報，855879-5883；Ward等，1989，自然，334544-546)可用來生產(chǎn)抗BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物的單鏈抗體。單鏈抗體是通過一個氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段而產(chǎn)生的單鏈多肽。
識別特異表位的抗體片段可由已知技術(shù)制備。例如，這種片段包括但不限于可通過胃蛋白酶水解抗體產(chǎn)生的F(ab’)2和還原F(ab’)2的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段?；蛘?，可以構(gòu)建Fab表達文庫(Huse等，1989，科學，2461275-1281)從而快速、簡單地鑒定到所需特異性的單克隆Fab片段。
反過來，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，可以利用BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗體產(chǎn)生能“模擬”BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗獨特型抗體(參見Greenspan&Bona，1993，F(xiàn)ASEB J.，7(5)437-444；Nissinoff，1991，免疫學雜志，147(8)2429-2438)。
用BRCA1調(diào)節(jié)子鑒定可提高BRCA1水平的化合物BRCA1基因編碼有腫瘤抑制活性的一種蛋白質(zhì)。參見Holt J.T.等，(1996)國家遺傳學，12卷，298-302。研究表明某些癌癥細胞中BRCA1水平低，提高BRCA1水平能恢復正常細胞表型。因此，可提高BRCA1水平的化合物在癌癥治療中有重要的治療用途。
本發(fā)明一個方面是描述協(xié)助鑒定可提高BRCA1胞內(nèi)水平的化合物的分析方法，其中使用BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子。圖4以簡圖形式給出該方法的一個模式。概括地說，這一方法是基于以下兩點首先，已知BRCA1是通用的轉(zhuǎn)錄激活子；第二，BRCA1調(diào)節(jié)子結(jié)合BRCA1。該方法利用了上述雙雜合技術(shù)的某些特性。構(gòu)建兩個質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染合適的細胞系，優(yōu)選乳腺或卵巢細胞系。優(yōu)選的一個乳腺細胞系是MCF-7。一個質(zhì)粒含有由GAL4識別的核苷酸序列，其操縱性連接了激活子序列，還含有位于這一序列下游的報告基因。優(yōu)選的報告基因的一個例子是熒光素酶的編碼基因。第二個質(zhì)粒編碼表達GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與BRCA1調(diào)節(jié)子的融合蛋白。優(yōu)選的調(diào)節(jié)子是1號序列，091-21A31。
GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-BRCA1調(diào)節(jié)子融合蛋白結(jié)合第一個質(zhì)粒的GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，隨后與存在的任何BRCA1形成GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-BRCA1調(diào)節(jié)子融合蛋白和BRCA1的復合物。復合物中的BRCA1靠近激活子序列，從而啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄。因此，可以檢測出化合物刺激BRCA1產(chǎn)生的能力。能刺激BRCA1產(chǎn)生的化合物會使報告基因產(chǎn)物增加。上述方法見圖4。
鑒定改變BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子相互作用的化合物如上所述，BRCA1是已知的腫瘤抑制蛋白。參見Holt J.T.等，(1996)國家遺傳學，12卷，298-302。因此，影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間正常的相互作用的化合物可能會影響B(tài)RCA1腫瘤抑制活性。影響程度主要取決于受測化合物的化學性質(zhì)。有些可能強烈破壞BRCA1與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間的相互作用，有些僅有小的影響。前者用分析致瘤性改變的生物學檢測方法可以反映，后者則不行。反之亦然，某些化合物能增進BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的相互作用，出現(xiàn)相反的生物學影響。因此迫切需要鑒定出影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的化合物。
用于鑒定影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的化合物的體系，其基本原理包括制備含有上述BRCA1蛋白、多肽、肽、融合蛋白以及BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的反應混合物，條件適宜、兩者充分相互作用并結(jié)合，因而形成復合物。為了檢測化合物的抑制活性，分別制備含有和不含待測化合物的反應混合物。待測化合物可以開始就包含在反應混合物中，或者在加入BRCA1部分和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白后的某時刻加入。對照反應混合物溫育，其中不含化合物或加安慰劑。檢測BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白形成的任何復合物。對照反應體系中形成復合物，而含有受測化合物的反應混合物中不產(chǎn)生，表明該化合物干擾BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間的相互作用。另外，含有待測化合物和正常BRCA1蛋白的反應混合物中復合物的形成情況可以與含有待測化合物和突變體BRCA1蛋白的反應混合物中復合物的形成情況進行比較。在需要鑒定破壞突變體BRCA1的相互作用，而不破壞正常BRCA1的相互作用的化合物時這種比較可能很重要。
干擾BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的化合物的分析方法可以異種或同種形式進行。異種分析包括將BRCA1部分或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白固定在固相上，反應結(jié)束時檢測錨定在固相上的復合物。同種分析中整個反應在液相進行。兩種方法加入反應物的順序可以改變以得到待測化合物的不同信息。例如，以競爭機制干擾相互作用的待測化合物可以在存在待測物質(zhì)的反應中鑒定到，即在BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之前或同時將待測物質(zhì)加入反應體系。或者，破壞復合物形成的受測化合物，例如有更高的結(jié)合常數(shù)而取代復合物中的一個組分的化合物，通過在復合物形成后加入待測化合物可以鑒定到。下面有簡要敘述。
在異種分析體系中，BRCA1部分或反應性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白錨定在固相表面，而未錨定的那一種被直接或間接標記。實際操作中，可以方便地利用微量滴定板。錨定的那一種可以是通過非共價或共價連接而固定。簡單地將固相表面涂覆BRCA1或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白溶液并干燥即可實現(xiàn)非共價連接。或者，可以用特異于待錨定的那一種物質(zhì)的固定化抗體將該物質(zhì)錨定于固相表面。固相表面可以預先制備并存放。
為了進行檢測，將有或沒有待測化合物的涂覆表面與固定物質(zhì)的對應反應物接觸。反應完全后，除去未反應的組分(如沖洗)，任何已形成的復合物均保留在固相表面。固相表面錨定的復合物的檢測方法有多種。若未固定的那一種物質(zhì)已預先標記，則在固相表面檢測到固定的標記物表明形成了復合物。若未固定的那一種物質(zhì)沒有預先標記，則可以用間接標記檢測錨定于表面的復合物；例如，用特異于起初未固定的物質(zhì)的標記抗體(抗體可以直接標記或用標記的抗免疫球蛋白抗體間接標記)。根據(jù)反應組分加入的順序可以檢測待測化合物是抑制復合物的形成或破壞已形成的復合物。
或者，反應可以在有或沒有待測化合物的液相中進行，從未反應組分中分離出反應產(chǎn)物，檢測復合物；例如，用特異于結(jié)合組分之一的固定化抗體將溶液中形成的任何復合物錨定，用特異于另一反應物的標記抗體檢測錨定的復合物。同樣，根據(jù)反應組分加入液相的順序可以鑒定出待測化合物是抑制復合物的形成還是破壞已形成的復合物。
在本發(fā)明一個候選實施方案中，可以使用同種分析。這個方法中，提前制備BRCA1部分和相互作用性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白形成的復合物，其中BRCA1或其BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白已被標記，但標記產(chǎn)生的信號將因為復合物的形成而猝滅(參見Rubenstein的美國專利4109496，其中用這種方法進行免疫測定)。加入與已形成的復合物的一種組分競爭并發(fā)生取代的測試物質(zhì)將產(chǎn)生高于本底的信號。這樣就可以鑒定出破壞BRCA1/胞內(nèi)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的待測物質(zhì)。
本發(fā)明一個特定實施方案中，可以制備BRCA1融合蛋白以用于固定化。例如，可以用融合載體如pGEX-5X-1等將BRCA1或肽片段與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合，融合方式保證在所產(chǎn)生的融合蛋白中能維持它的結(jié)合活性。純化相互作用性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，按照本領(lǐng)域常規(guī)和上述方法制備單克隆抗體。該抗體用例如放射性同位素125I通過常規(guī)方法標記。在異種測定中，例如可以將GST-BRCA1融合蛋白錨定于谷胱甘肽-瓊脂糖珠上。隨后在有或沒有待測化合物的情況下加入與之作用的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，保證發(fā)生相互作用和結(jié)合。反應結(jié)束后洗去未結(jié)合的物質(zhì)，將標記單克隆抗體加入體系，使其結(jié)合到復合物組分中。測定谷胱甘肽-瓊脂糖珠存留的放射強度可以檢測到BRCA1蛋白和相互作用性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間的相互作用。待測化合物成功抑制相互作用會使測得的放射強度下降。
或者，可以在沒有谷胱甘肽-瓊脂糖珠的液相中混合GST-BRCA1融合蛋白和與之相互作用的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。待測化合物在兩種物質(zhì)結(jié)合過程中或之后加入。然后將混合液加入谷胱甘肽-瓊脂糖珠中，洗去未結(jié)合物質(zhì)。同樣通過加入標記抗體并測定瓊脂糖珠中存留的放射強度可以檢測到BRCA1/BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用被抑制的程度。
在本發(fā)明另一個實施方案中，同樣的技術(shù)可以用于BRCA1和/或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域所對應的肽片段，而代替兩種全長蛋白質(zhì)之一或二者?？梢杂帽绢I(lǐng)域多種常規(guī)方法鑒定和分離結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域在實施例中有更詳細討論。這些方法包括但不限于誘變編碼兩種蛋白質(zhì)之一的基因和用共免疫沉淀測定篩選結(jié)合被破壞的一些方法。然后可選擇出編碼復合物中另一種物質(zhì)的基因中發(fā)生的補償性突變。對編碼相應蛋白質(zhì)的基因的序列分析將揭示與蛋白質(zhì)中參與相互結(jié)合的區(qū)域?qū)耐蛔?。也可以使用雙雜合分析，實施例中有更詳細討論。舉例說明，如果得到胞內(nèi)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的編碼基因，可以構(gòu)建短基因片段表達該蛋白質(zhì)的肽片段，隨后可檢測其結(jié)合活性并純化或合成。
有效劑量上述鑒定到的影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的相互作用、從而影響細胞生長的化合物，其毒性和藥效可以按照標準過程在細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏写_定。例如，可以確定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體治療有效劑量)。多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的模型體系可以用來檢測化合物的細胞生長性質(zhì)，包括細胞在軟瓊脂中的生長和在體內(nèi)對腫瘤的作用。這些實驗可以在用BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子共轉(zhuǎn)染的細胞中進行。
毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)，可以表達為LD50/ED50。優(yōu)選治療指數(shù)大的化合物。因為可能用到有毒副作用的化合物，應仔細設計給藥體系，將化合物定位到目的組織位點，以使對未感染細胞的潛在損傷減至最小，從而減少副作用。
可以利用細胞培養(yǎng)測定和動物研究中得到的數(shù)據(jù)制定出適合人類使用的劑量范圍。優(yōu)選化合物劑量在包括ED50且僅有弱的或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可在該范圍內(nèi)根據(jù)采用的劑量形式和給藥途徑而變化。本發(fā)明方法中所用的任何一種化合物的治療有效劑量均可由細胞培養(yǎng)測定初步估計?？梢栽趧游锬Ｐ椭写_定劑量，得到一個血循環(huán)濃度范圍，其中包括在細胞培養(yǎng)物中測得的IC50(即待測化合物取得對癥狀二分之一最大抑制效果的濃度)。這種信息可以用來更精確地確定人類的有效劑量。血漿中的含量可以用例如高效液相層析測定。
下面的實施例舉例說明了本發(fā)明的特定實施方案及各種應用。這些實施例僅供解釋之用而非對本發(fā)明的限定。
實施例1編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA的鑒定用美國專利5283173或Chien等，1991，美國國家科學院院報889578-9582描述的酵母雙雜合檢測系統(tǒng)初步鑒定BRCA1調(diào)節(jié)子。檢測組分可以購自Clontech(Palo Alto CA)。
編碼人BRCA1的cDNA(參見Miki Y.等，科學，26666-71；PCT/US95/10202)用MvnI-Nhel消化，將代表BRCA1第8-1293位氨基酸的片段與pGBT8質(zhì)粒的SmaI-Nhel位點的GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，該質(zhì)粒是Chien等，美國國家科學院院報，889578-9582(1991)中描述的質(zhì)粒pMA424在EcoR1和Sal1單切位點間插入序列5’-CCGGGGATCCCCATGGCTAGCCATATG-3’進行改造而得到的。將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株YGH1，評估攜有質(zhì)粒GAL4-BRCA1(8-1293)的YGH1株激活兩個報告性狀的能力在無組氨酸培養(yǎng)基上的生長和β-半乳糖苷酶活性。帶有質(zhì)粒GAL4-BRCA1(8-1293)的YGH1菌株能在無組氨酸的平板上生長但在無組氨酸的平板中加入7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑(3AT)會受到調(diào)控，該菌株無可檢測到的β-半乳糖苷酶活性。帶有質(zhì)粒GAL4-BRCA1(8-1293)的YGH1菌株隨后被融合于質(zhì)粒pGAD中GAL4激活結(jié)構(gòu)域的Hela細胞cDNA文庫轉(zhuǎn)化(Chien等，1991，美國國家科學院院報，889578-9582)。若cDNA編碼的蛋白質(zhì)可與BRCA1蛋白(氨基酸8-1293)相互作用，則該YGH1菌株應能在補充了7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑的無組氨酸平板中生長，并產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。
2.5×106個轉(zhuǎn)化子中篩選到4株能在補充了7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑的無組氨酸平板中生長，并有β-半乳糖苷酶活性。用從這4株酵母菌株回收的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化初始YGH1 GAL4-BRCA1(8-1293)菌株。所有質(zhì)粒都賦予菌株在補充了7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑的無組氨酸平板中生長的能力，并能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。在隨后的篩選中，發(fā)現(xiàn)4株菌中的3株含有編碼與BRCA1有明確結(jié)合能力的調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA。一個質(zhì)粒含有編碼被命名為1號序列，091-21A31的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的新cDNA。其核苷酸和氨基酸序列見圖1。計算分子量約53kd，pI估計為9.05。特別值得注意的是它有一個鋅指結(jié)構(gòu)域和一個亮氨酸拉鏈基序。
第二個cDNA的核苷酸序列和它編碼的氨基酸序列(此后命名為3號序列，091-1F84)見圖2。它有兩個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)分子量計算為96443.3，pI估計為4.95。
第三個cDNA的核苷酸序列和它編碼的氨基酸序列(此后命名為5號序列，091-132Q20)見圖3。該克隆有一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)分子量計算為45904.9，pI估計為6.73。
實施例2BRCA1結(jié)構(gòu)域與BRCA1調(diào)節(jié)子的結(jié)合進行實驗確定BRCA1哪些區(qū)域與實施例1所述三個BRCA1調(diào)節(jié)子相互作用。采用美國專利5 283 173或Chien等，1991，美國國家科學院院報，889578-9582描述的酵母雙雜合測定進行實驗。將編碼3號序列，091-1F84；1號序列，091-21A31；5號序列，091-132Q20的cDNA與GAL4激活結(jié)構(gòu)域融合，將表1所示的BRCA1的各個區(qū)域和含有BRCA1氨基酸1-300、1-600或8-1293的區(qū)域與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。對照包括載體或與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的bcl-2(參見美國專利5539 085)。
表1BRCA1與雙雜合系統(tǒng)(091-)的相互作用用于上述研究的BRCA1構(gòu)建體由BRCA1限制酶切片段克隆至質(zhì)粒pGBT8中而產(chǎn)生，該質(zhì)粒是質(zhì)粒pMA424在EcoRI和SalI單切位點間插入序列5’-CCGGGGATCCCCATGGCTAGCCATATG-3’而改造得到的(如Chien等，美國國家科學院院報，88卷，9578-9582(1991)所述)。簡言之，含有BRCA1前300個氨基酸的構(gòu)建體是將Nco1-EcoR1消化產(chǎn)生的BRCA1鈍末端片段亞克隆至pGBT8的EcoR1酶切位點鈍末端而產(chǎn)生的。含有8-1293位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體如上述構(gòu)建。最后，含有1-600位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體是將BRCA1的Nco1-Spe1片段亞克隆至pGBT8的Nco1-Nhe1位點而產(chǎn)生的。
表1顯示BRCA1中與3號序列，091-1F84；1號序列，091-21A31；5號序列，091-132Q20編碼的蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域。用“+”主觀反映測定的β-半乳糖苷酶活性。一個“+”表示最低，三個“+”表示活性最高。從表1明顯可見BRCA1前300個氨基酸不結(jié)合三個BRCA1調(diào)節(jié)子中的任一個，但三個BRCA1調(diào)節(jié)子都與含有BRCA1前600個氨基酸的BRCA1構(gòu)建體結(jié)合。BRCA1調(diào)節(jié)子都不結(jié)合載體或bcl-2對照，卻都與近似全長的含有8-1293位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體結(jié)合。
這些結(jié)果顯示三個BRCA1調(diào)節(jié)子優(yōu)先結(jié)合BRCA1前600個氨基酸。
實施例31號序列，091-21A31與BRCA1相互作用的結(jié)構(gòu)域的鑒定進行雙雜合實驗來確定BRCA1調(diào)節(jié)子091-21A31，1號序列與BRCA1相互作用的區(qū)域。方法基本如實施例1所述。酵母培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化和生長基本按照美國專利5283173；Chien等，1991，美國國家科學院院報，889578-9582；Spaargaren M等，(1994)生物化學雜志，300303-307描述的方法進行。
簡言之，將YGH1酵母菌株用編碼1號序列，091-21A31的cDNA，或編碼融合了GAL4激活結(jié)構(gòu)域、含有1號序列091-21A31的氨基酸78-469、1-300、300-469的片段的cDNA共轉(zhuǎn)化。將bcl-2 cDNA(參見美國專利5539085)與GAL4激活結(jié)構(gòu)域融合作為對照。將編碼具有氨基酸1-300、1-600、8-1293的BRCA1片段的cDNA如實施例2所述與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。
1號序列，091-21A31構(gòu)建體用質(zhì)粒pGADGH或pGAD424制備；兩者可購自Clontech。
含有氨基酸78-469的1號序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號序列，091-21A31的EcoR1-Xhol片段亞克隆至pGAD424的EcoR1-Sal1位點而產(chǎn)生的。
含有氨基酸1-300的1號序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號序列，091-21A31的BamH1-Sal1片段亞克隆至pGADGH的BamH1-Sal1位點而產(chǎn)生的。
含有氨基酸300-469的1號序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號序列，091-21A31的BamH1鈍末端-Sal1片段亞克隆至pGADGH的Sal1鈍末端-Xhol位點而產(chǎn)生的。
表2顯示共轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果。顯然BRCA1的前300個氨基酸不結(jié)合三個1號序列(091-21A31)的片段構(gòu)建體中的任何一個，也不結(jié)合1號序列(091-21A31)。含有1-600位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體確實結(jié)合1號序列，091-21A31和含有該序列氨基酸78-469的構(gòu)建體，但不結(jié)合含有該序列氨基酸1-300、300-469的構(gòu)建體。同樣，含有氨基酸8-1293的BRCA1構(gòu)建體也與1號序列(091-21A31)的氨基酸78-469、1-300的構(gòu)建體結(jié)合，而不結(jié)合具有該序列的氨基酸300-469的構(gòu)建體。
表2BRCA1與091-21的相互作用實施例4BRCA1調(diào)節(jié)子的表達和提純在桿狀病毒感染的SF9細胞中表達并提純BRCA1調(diào)節(jié)子。產(chǎn)生桿狀病毒及培養(yǎng)SF9細胞的方法為本領(lǐng)域公知技術(shù)，詳細操作可見于M.Summers和G.Smith“桿狀病毒載體與昆蟲培養(yǎng)操作指南”一文，Texas Agricultural Experiment Station，Bulletin NO.1555(1987年5月或G.E.Smith和M.D.Summers的EPO127839)。
以下構(gòu)建體用pAcC 13(Rubinfeld B.等，細胞，651033-1042(1991))或pAcC 13衍生的pAcOG制備。后一個質(zhì)粒中用加工成編碼起始甲硫氨酸、Glu-Glu表位標記(Grussenmyer T.等，美國國家科學院院報827952(1985))和含有數(shù)個終止子的多克隆位點(Rubinfeld B.等，生物學和化學雜志，2705549-5555(1995))的合成接頭取代了原質(zhì)粒的多接頭。
含有1號序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號序列，091-21A31的Kpn1-Xbal片段亞克隆至pAcC 13的Kpn1-Xbal位點制備的。
含有3號序列，091-1F84的構(gòu)建體是將3號序列，091-1F84的Nco1-Xbal片段亞克隆至pAcOG 1的Nco1-Xbal位點制備的。
含有5號序列，091-132Q20的構(gòu)建體是將5號序列，091-132Q20的Kpn1-Xbal片段亞克隆至pAcC 13的Kpn1-Xbal位點制備的。
含有適當BRCA1調(diào)節(jié)子的桿狀病毒是用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SF9細胞，并基本按照Pharmingen′s cat.no.21100D，BaculoGoldtm/BaculovirusDNA的方法分離相應桿狀病毒而產(chǎn)生的。從單個噬斑分離病毒，并用來感染SF9細胞。細胞生長4天，離心分離，將細胞團溶解制備細胞提取物。簡要步驟是，重組SF9細胞離心成團，在5倍體積的[20mMTris(pH8.0)，1mM EDTA，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]溶液中裂解，冰浴10分鐘。然后加入NaCl至終濃度為150mM，在室溫保持10分鐘，離心。將所得上清液上樣到含有共價交聯(lián)到蛋白G-瓊脂糖的小鼠Glu-Glu單克隆抗體的1ml親和柱上。參見Grussenmyer T.等，美國國家科學院院報，827952(1985)。將柱子用10-15ml裂解緩沖液洗滌，用每ml同一緩沖液含100μg Glu-Glu肽(EYMPME)的溶液洗脫。收集各級分，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，匯集峰級分，根據(jù)純度進一步在HPLC柱上純化，這些柱包括Resource Q、ResourceS、Resource Eth(Pharmacia)。若純化不可溶蛋白質(zhì)，特別是1號序列，091-21A31，則將重組SF9細胞離心沉淀，在5倍體積的[20mMTris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，2％SDS，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]中裂解，室溫保持20-30分鐘，超速離心。取出上層液相，調(diào)節(jié)NaCl至400mM，再離心。上清液用1×TG緩沖液[20mMTris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，1％TritonX 100，10％甘油，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]1∶10稀釋，經(jīng)3μm GelmanVersapore濾器過濾，上樣到1ml抗Glu-Glu的親和柱上。參見RubinfeldB.等，分子細胞生物學，124634-4642(1992)。親和柱用10-15ml含400mM NaCl的1×TG緩沖液洗滌，用含1％SDS和100ug/mlGlu-Glu肽的1×TG緩沖液洗脫。各級分經(jīng)SDS-PAGE分析。
實施例5確證BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白與BRCA1的結(jié)合為了確證實施例1中所述的雙雜合檢測結(jié)果及進一步實現(xiàn)每個BRCA1調(diào)節(jié)子與BRCA1結(jié)合，制備兩個BRCA1構(gòu)建體并檢測它們與BRCA1調(diào)節(jié)子的結(jié)合能力。兩個BRCA1構(gòu)建體是Glu-Glu標記的BRCA1 5’(1-1293)和BRCA1 3’(1293-1863)。如以上實施例所述，Glu-Glu表位標記能協(xié)助免疫親和純化。對照構(gòu)建體包括rapGAP。該構(gòu)建體制備如Rubinfeld B.和Polakis P.，“桿狀病毒產(chǎn)生的Rap1 GTPase-激活蛋白的純化”，酶學方法，W.E.Balch，Channing J.Der和Alan Hall編，CaliforniaAcademic Press，Inc.，25531-38中所述。BRCA1構(gòu)建體的制備如下將BRCA1 Nco1-Nhel片段亞克隆至pAcOG1S的Nco1-Nhel位點得到pAcO BRCA1 5’(1-1293)。將BRCA1的Nhel鈍末端-Not1片段亞克隆至pAcO G2 Stu1-Not1l位點得到pAcO BRCA1 3’(1293-1863)。按照標準方法，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到SF9細胞中。基本按上述實施例中所述的免疫親和純化方法提純BRCA1構(gòu)建體。
為了體外轉(zhuǎn)錄和翻譯BRCA1調(diào)節(jié)子，將下列構(gòu)建體亞克隆至PCANmyc中，它是pCDNA3(Invitrogen)用加工成編碼起始甲硫氨酸、Myc表位標記(參見Evan G.等，分子細胞生物學，53610(1985))和一個多克隆位點(Rubinfeld B.等，科學，2721023-1026(1996))的合成接頭取代多接頭而衍生得到的。
含有BRCA1調(diào)節(jié)子3號序列，091-1F84的質(zhì)粒PCANmyc091-1F84是將3號序列，091-1F84的Spel鈍末端-Xhol片段亞克隆至PCANmyc3的EcoRV-Xhol位點制備的。含有BRCA1調(diào)節(jié)子1號序列，091-21A31的質(zhì)粒PCANmyc091-21A31是將1號序列，091-21A31的BamH1-Xhol片段亞克隆至PCANmyc3的BamH1-Xhol位點制備的。最后，含有BRCA1調(diào)節(jié)子5號序列，091-132Q20的質(zhì)粒PCANmyc091-132Q20是將5號序列，091-132Q20的EcoR1-Xhol片段亞克隆至PCANmyc3的EcoR1-Xhol位點制備的。
為了進行體外結(jié)合分析，BRCA1調(diào)節(jié)子cDNA(3號序列，091-1F84；1號序列，091-21A31；5號序列，091-132Q20)用TNT偶聯(lián)的小麥胚細胞裂解體系(Promega)在[35S]甲硫氨酸存在下進行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。然后，將1-2ug純化的重組BRCA1蛋白(Glu-Glu標記的BRCA1 5’(1-1293)或BRCA1 3’(1293-1863))與10μl抗Glu-Glu偶聯(lián)的G蛋白-瓊脂糖珠一起加入25μl預先澄清的裂解物中。4℃振蕩溫育2小時后，瓊脂糖珠用1ml冰冷的B緩沖液(20mMTris(pH7.5)，150mM NaCl，0.5％Nonidet P-40)洗3次，用20μlSDS-PAGE樣品緩沖液洗脫，進行SDS-PAGE和熒光顯影。
SDS-PAGE熒光顯影顯示三個BRCA1調(diào)節(jié)子都與BRCA1 5’(1-1293)構(gòu)建體發(fā)生親和沉淀，而不與BRCA1 3’(1293-1863)形成沉淀。
rapGAP對照不與任何一種BRCA1調(diào)節(jié)子發(fā)生親和沉淀。綜合上述結(jié)果證實并擴展了雙雜合檢測的結(jié)果，證實了BRCA1調(diào)節(jié)子與BRCA1的結(jié)合。
實施例6制備BRCA1調(diào)節(jié)子的抗體為了制備抗體，利用特異識別重組可溶蛋白中表達的Glu-Glu表位的固定化抗Glu-Glu抗體從桿狀病毒感染的SF9昆蟲細胞中免疫親和純化BRCA1調(diào)節(jié)子(參見Rubinfeld B.等，分子細胞生物學，124634-4642(1992))。簡言之，將重組SF9細胞離心沉淀，在5倍體積的[20mMTris(pH8.0)，1mM EDTA，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]溶液中裂解，冰浴10分鐘。加入NaCl至終濃度150mM，室溫保持10分鐘，離心。然后將所得上清液上樣到含有共價交聯(lián)到蛋白G-瓊脂糖的小鼠Glu-Glu抗體的1ml親和柱上。將柱子用10-15ml裂解緩沖液洗滌，用每毫升同一緩沖液含100ugGlu-Glu肽(EYMPME)的溶液洗脫。收集各級分，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，匯集峰級分，根據(jù)純度進一步在HPLC柱中純化，該柱包括Resource Q、Resource S、ResourceEth(Pharmacia)。若純化不可溶蛋白，特別是1號序列，091-21A31，則離心沉淀重組SF9細胞，在5倍體積的溶液[20mM Tris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，2％SDS，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]中裂解，室溫保持20-30分鐘，超速離心。取出上層液相，調(diào)節(jié)NaCl至400mM，再離心。然后將澄清的上清液用1×TG緩沖液[20mMTris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，1％TritonX 100，10％甘油，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]1∶10稀釋，經(jīng)3μm GelmanVersapore濾器過濾，上樣到1ml抗Glu-Glu的親和柱上。親和柱用10-15ml含400mM NaCl的1×TG緩沖液洗滌，用含1％SDS和100ug/ml Glu-Glu肽的1×TG緩沖液洗脫。各級分進行SDS-PAGE分析，匯集，用于免疫兔子。
要制備含抗BRCA1調(diào)節(jié)子的抗體的抗血清，則用BRCA1調(diào)節(jié)子如下免疫兔子。對BRCA1調(diào)節(jié)子1號序列，091-21A31，通常要進行兩次免疫；第一次皮下注射含在CFA中的0.500mg，四個星期后第二次肌內(nèi)注射含在ICFA中的0.250mg。取兔血，收集抗血清，如下純化抗體。
用偶聯(lián)于載體基質(zhì)上的BRCA1調(diào)節(jié)子免疫原親和純化BRCA1調(diào)節(jié)子抗體。簡要步驟為，將BRCA1調(diào)節(jié)子1號序列，091-21A31按如下偶聯(lián)到CNBr活化的Sepharose 6MB(Pharmacia)上。1ml基質(zhì)按照廠商說明進行活化(即重懸于1mM HCl，在1mM HCl中用燒結(jié)玻璃濾器洗15分鐘)。將1mg 1號序列，091-21A31對偶聯(lián)緩沖液
在4℃透析過夜，換兩次緩沖液。將透析得到的蛋白質(zhì)與CNBr活化的Sepharose 6MB溫育，于4℃振蕩過夜。過量的配體用偶聯(lián)緩沖液洗去，殘留的任何活性基團用1M乙醇胺室溫封閉反應兩小時。用不同pH值的緩沖液交替洗三輪，每輪包括用0.1M醋酸緩沖液(pH4.0)，0.5M NaCl洗一次，隨后用0.1M Tris(pH8.0)，0.5M NaCl洗一次。將偶聯(lián)了蛋白質(zhì)的凝膠基質(zhì)重新懸浮于PBS，與5ml抗體血清在4℃振蕩溫育過夜。將混合液注入柱子，使其逐滴流出，每次用15ml PBS洗滌，共洗三次。用800μl 0.2M甘氨酸(pH2.5)洗脫，收集七次的洗脫液，每次洗脫液立即用200μl 1M K2HPO4中和。合并峰級分，透析到PBS疊氮化物中保存。
美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏物編碼3號序列，091-1F84；1號序列，091-21A31；5號序列，091-132Q20的cDNA克隆于1996年8月14日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號分別為98141(3號序列，091-1F84)、98142(1號序列，091-21A31)、98143(5號序列，091-132Q20)。這些保藏物是依據(jù)Budapest條約保藏的，保藏日之后至少保留30年，最近一次要求之后至少保留5年。
如上已詳盡描述了本發(fā)明，有許多本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的變化和修改不背離附加權(quán)利要求的精神和范圍。
序列表(1)基本信息(i)申請人Rubinfeld，BonneePolakis，Paul G.
Ligenfelter，CarolVuong，Terilyn T.
(ii)發(fā)明名稱BRCA1活性調(diào)節(jié)子(iii)序列數(shù)目6(iv)聯(lián)系地址(A)地址Onyx Pharmaceuticals，Inc.
(B)街道3031 Rsearch Drive(C)城市Richmond(D)州名CA(E)國家USA(F)郵政編碼94806(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)柮绹粗?B)遞交日(C)分類實用新型(viii)律師/代理人信息(A)名稱Giotta，Gregory(B)登記號32,028(C)參考/著錄號ONYX1024 GG
(ix)電信信息(A)電話(510)262-8710(B)傳真(510)222-9758(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度2065個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置103..1512(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGGATCCCC CGGGCTGCAG GAATTCGGCA CGAGCGGCAC GAGTACGAAG CCGGACCTGT60AGCAGTTTCT TTGGCTGCCT GGGCCCCTTG AGTCCAGCCA TC ATG CCT ATC CGT 114Met Pro Ile Arg1GCT CTG TGC ACT ATC TGC TCC GAC TTC TTC GAT CAC TCC CGC GAC GTG 162Ala Leu Cys Thr Ile Cys Ser Asp Phe Phe Asp His Ser Arg Asp Val5 10 15 20GCC GCC ATC CAC TGC GGC CAC ACC TTC CAC TTG CAG TGC CTA ATT CAG 210Ala Ala Ile His Cys Gly His Thr Phe His Leu Gln Cys Leu Ile Gln25 30 35TGG TTT GAG ACA GCA CCA AGT CGG ACC TGC CCA CAG TGC CGA ATC CAG 258Trp Phe Glu Thr Ala Pro Ser Arg Thr Cys Pro Gln Cys Arg Ile Gln40 45 50GTT GGC AAA AGA ACC ATT ATC AAT AAG CTC TTC TTT GAT CTT GCC CAG 306Val Gly Lys Arg Thr Ile Ile Asn Lys Leu Phe Phe Asp Leu Ala Gln55 60 65GAG GAG GAG AAT GTC TTG GAT GCA GAA TTC TTA AAG AAT GAA CTG GAC 354Glu Glu Glu Asn Val Leu Asp Ala Glu Phe Leu Lys Asn Glu Leu Asp70 75 80AAT GTC AGA GCC CAG CTT TCC CAG AAA GAC AAG GAG AAA CGA GAC AGC 402Asn Val Arg Ala Gln Leu Ser Gln Lys Asp Lys Glu Lys Arg Asp Ser85 90 95 100CAG GTC ATC ATC GAC ACT CTG CGG GAT ACG CTG GAA GAA CGC AAT GCT 450Gln Val Ile Ile Asp Thr Leu Arg Asp Thr Leu Glu Glu Arg Asn Ala105 110 115ACT GTG GTA TCT CTG CAG CAG GCC TTG GGC AAG GCC GAG ATG CTG TGC 498Thr Val Val Ser Leu Gln Gln Ala Leu Gly Lys Ala Glu Met Leu Cys120 125 130TCC ACA CTG AAA AAG CAG ATG AAG TAC TTA GAG CAG CAG CAG GAT GAG 546Ser Thr Leu Lys Lys Gln Met Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Gln Asp Glu135 140 145ACC AAA CAA GCA CAA GAG GAG GCC CGC CGG CTC AGG AGC AAG ATG AAG 594Thr Lys Gln Ala Gln Glu Glu Ala Arg Arg Leu Arg Ser Lys Met Lys150 155 160ACC ATG GAG CAG ATT GAG CTT CTA CTC CAG AGC CAG CGC CCT GAG GTG 642Thr Met Glu Gln Ile Glu Leu Leu Leu Gln Ser Gln Arg Pro Glu Val165 170 175 180GAG GAG ATG ATC CGA GAC ATG GGT GTG GGA CAG TCA GCG GTG GAA CAG 690Glu Glu Met Ile Arg Asp Met Gly Val Gly Gln Ser Ala Val Glu Gln185 190 195CTG GCT GTG TAC TGT GTG TCT CTC AAG AAA GAG TAC GAG AAT CTA AAA 738Leu Ala Val Tyr Cys Val Ser Leu Lys Lys Glu Tyr Glu Asn Leu Lys200 205 210GAG GCA CGG AAG GCC TCA GGG GAG GTG GCT GAC AAG CTG AGG AAG GAT 786Glu Ala Arg Lys Ala Ser Gly Glu Val Ala Asp Lys Leu Arg Lys Asp215 220 225TTG TTT TCC TCC AGA AGC AAG TTG CAG ACA GTC TAC TCT GAA TTG GAT 834Leu Phe Ser Ser Arg Ser Lys Leu Gln Thr Val Tyr Ser Glu Leu Asp230 235 240CAG GCC AAG TTA GAA CTG AAG TCA GCC CAG AAG GAC TTA CAG AGT GCT 882Gln Ala Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ala Gln Lys Asp Leu Gln Ser Ala245 250 255 260GAC AAG GAA ATC ATG AGC CTG AAA AAG AAG CTA ACG ATG CTG CAG GAA 930Asp Lys Glu Ile Met Ser Leu Lys Lys Lys Leu Thr Met Leu Gln Glu265 270 275ACC TTG AAC CTG CCA CCA GTG GCC AGT GAG ACT GTC GAC CGC CTG GTT 978Thr Leu Asn Leu Pro Pro Val Ala Ser Glu Thr Val Asp Arg Leu Val280 285 290TTA GAG AGC CCA GCC CCT GTG GAG GTG AAT CTG AAG CTC CGC CGG CCA1026Leu Glu Ser Pro Ala Pro Val Glu Val Asn Leu Lys Leu Arg Arg Pro295 300 305TCC TTC CGT GAT GAT ATT GAT CTC AAT GCT ACC TTT GAT GTG GAT ACT1074Ser Phe Arg Asp Asp Ile Asp Leu Asn Ala Thr Phe Asp Val Asp Thr310 315 320CCC CCA GCC CGG CCC TCC AGC TCC CAG CAT GGT TAC TAC GAA AAA CTT1122Pro Pro Ala Arg Pro Ser Ser Ser Gln His Gly Tyr Tyr Glu Lys Leu325 330 335 340TGC CTA GAG AAG TCA CAC TCC CCA ATT CAG GAT GTC CCC AAG AAG ATA1170Cys Leu Glu Lys Ser His Ser Pro Ile Gln Asp Val Pro Lys Lys Ile345 350 355TGC AAA GGC CCC AGG AAG GAG TCC CAG CTC TCA CTG GGT GGC CAG AGC1218Cys Lys Gly Pro Arg Lys Glu Ser Gln Leu Ser Leu Gly Gly Gln Ser360 365 370TGT GCA GGA GAG CCA GAT GAG GAA CTG GTT GGT GCC TTC CCT ATT TTT1266Cys Ala Gly Glu Pro Asp Glu Glu Leu Val Gly Ala Phe Pro Ile Phe375 380 385GTC CGG AAT GCC ATC CTA GGC CAG AAA CAG CCC AAG AGG CCC AGG TCA1314Val Arg Asn Ala Ile Leu Gly Gln Lys Gln Pro Lys Arg Pro Arg Ser390 395 400GAG TCC TCT TGC AGC AAA GAT GTG GTA AGG ACA GGC TTC GAT GGG CTC1362Glu Ser Ser Cys Ser Lys Asp Val Val Arg Thr Gly Phe Asp Gly 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TGGAAGATTT 1982TCATGTAAAA TAAAATTAAA AAAAAAAAAA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2042AAAAAAAAAA AAAAAAACTC GAG 2065(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度470個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Pro Ile Arg Ala Leu Cys Thr Ile Cys Ser Asp Phe Phe Asp His1 5 10 15Ser Arg Asp Val Ala Ala Ile His Cys Gly His Thr Phe His Leu Gln20 25 30Cys Leu Ile Gln Trp Phe Glu Thr Ala Pro Ser Arg Thr Cys Pro Gln35 40 45Cys Arg Ile Gln Val Gly Lys Arg Thr Ile Ile Asn Lys Leu Phe Phe50 55 60Asp Leu Ala Gln Glu Glu Glu Asn Val Leu Asp Ala Glu Phe Leu Lys65 70 75 80Asn Glu Leu Asp Asn Val Arg Ala Gln Leu Ser Gln Lys Asp Lys Glu85 90 95Lys Arg Asp Ser Gln Val Ile Ile Asp Thr Leu Arg Asp Thr Leu Glu100 105 110Glu Arg Asn Ala Thr Val Val Ser Leu Gln Gln Ala Leu Gly Lys Ala115 120 125Glu Met Leu Cys Ser Thr Leu Lys Lys Gln Met Lys Tyr Leu Glu Gln130 135 140Gln Gln Asp Glu Thr Lys Gln Ala Gln Glu Glu Ala Arg Arg Leu Arg145 150 155 160Ser Lys Met Lys Thr Met Glu Gln Ile Glu Leu Leu Leu Gln Ser Gln165 170 175Arg Pro Glu Val Glu Glu Met Ile Arg Asp Met Gly Val Gly Gln Ser180 185 190Ala Val Glu Gln Leu Ala Val Tyr Cys Val Ser Leu Lys Lys Glu Tyr195 200 205Glu Asn Leu Lys Glu Ala Arg Lys Ala Ser Gly Glu Val Ala Asp Lys210 215 220Leu Arg Lys Asp Leu Phe Ser Ser Arg Ser Lys Leu Gln Thr Val Tyr225 230 235 240Ser Glu Leu Asp Gln Ala Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ala Gln Lys Asp245 250 255Leu Gln Ser Ala Asp Lys Glu Ile Met Ser Leu Lys Lys Lys Leu Thr260 265 270Met Leu Gln Glu Thr Leu Asn Leu Pro Pro Val Ala Ser Glu Thr Val275 280 285Asp Arg Leu Val Leu Glu Ser Pro Ala Pro Val Glu Val Asn Leu Lys290 295 300Leu Arg Arg Pro Ser Phe Arg Asp Asp Ile Asp Leu Asn Ala Thr Phe305 310 315 320Asp Val Asp Thr Pro Pro Ala Arg Pro Ser Ser Ser Gln His Gly Tyr325 330 335Tyr Glu Lys Leu Cys Leu Glu Lys Ser His Ser Pro Ile Gln Asp Val340 345 350Pro Lys Lys Ile Cys Lys Gly Pro Arg Lys Glu Ser Gln Leu Ser Leu355 360 365Gly Gly Gln Ser Cys Ala Gly Glu Pro Asp Glu Glu Leu Val Gly Ala370 375 380Phe Pro Ile Phe Val Arg Asn Ala Ile Leu Gly Gln Lys Gln Pro Lys385 390 395 400Arg Pro Arg Ser Glu Ser Ser Cys Ser Lys Asp Val Val Arg Thr Gly405 410 415Phe Asp Gly Leu Gly Gly Arg Thr Lys Phe Ile Gln Pro Thr Asp Thr420 425 430Val Met Ile Arg Pro Leu Pro Val Lys Pro Lys Thr Lys Val Lys Gln435 440 445Arg Val Arg Val Lys Thr Val Pro Ser Leu Phe Gln Ala Lys Leu Asp45C 455 460Thr Phe Leu Trp Ser*465470(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度3256個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置34.，2541(xi)序列描述SEQ ID NO3GAACTAGTGG ATCCCCCGGG CTGCAGGAAT TCG GCA CGA GAA AGC TTA TCC CTT 54Ala Arg Glu Ser Leu Ser Leu1 5CCC TCG ATG CTT CGG GAT GCT GCA ATT GGC ACT ACC CCT TTC TCT ACT 102Pro Ser Met Leu Arg Asp Ala Ala Ile Gly Thr Thr Pro Phe Ser Thr10 15 20TGC TCG GTG GGG ACT TGG TTT ACT CCT TCA GCA CCA CAG GAA AAG AGT 150Cys Ser Val Gly Thr Trp Phe Thr Pro Ser Ala Pro Gln Glu Lys Ser25 30 35ACA AAC ACA TCC CAG ACA GGC CTG GTT GGC ACC AAG CAC AGT ACT TCT 198Thr Asn Thr Ser Gln Thr Gly Leu Val Gly Thr Lys His Ser Thr Ser40 45 50 55GAG ACA GAG CAG CTC CTG TGT GGC CGG CCT CCA GAT CTG ACT GCC TTG 246Glu Thr Glu Gln Leu Leu Cys Gly Arg Pro Pro Asp Leu Thr Ala Leu60 65 70TCT CGA CAT GAC TTG GAA GAT AAC CTG CTG AGC TCT CTT GTC ATT CTG 294Ser Arg His Asp Leu Glu Asp Asn Leu Leu Ser Ser Leu Val Ile Leu75 80 85GAG GTT CTC TCC CGC CAG CTT CGG GAC TGG AAG AGC CAG CTG GCT GTC 342Glu Val Leu Ser Arg Gln Leu Arg Asp Trp Lys Ser Gln Leu Ala Val90 95 100CCT CAC CCA GAA ACC CAG GAC AGT AGC ACA CAG ACT GAC ACA TCT CAC 390Pro His Pro Glu Thr Gln Asp Ser Ser Thr Gln Thr Asp Thr Ser His105 110 115AGT GGG ATA ACT AAT AAA CTT CAG CAT CTT AAG GAG AGC CAT GAG ATG 438Ser Gly Ile Thr Asn Lys Leu Gln His Leu Lys Glu Ser His Glu Met120 125 130 135GGA CAG GCC CTA CAG CAG GCC AGA AAT GTC ATG CAA TCA TGG GTG CTT 486Gly Gln Ala Leu Gln Gln Ala Arg Asn Val Met Gln Ser Trp Val Leu140 145 150ATC TCT AAA GAG CTG ATA TCC TTG CTT CAC CTA TCC CTG TTG CAT TTA 534Ile Ser Lys Glu Leu Ile Ser Leu Leu His Leu Ser Leu Leu His Leu155 160 165GAA GAA GAT AAG ACT ACT GTG AGT CAG GAG TCT CGG CGT GCA GAA ACA 582Glu Glu Asp Lys Thr Thr Val Ser Gln Glu Ser Arg Arg Ala Glu Thr170 175 180TTG GTC TGT TGC TGT TTT GAT TTG CTG AAG AAA TTG AGG GCA AAG CTC 630Leu Val Cys Cys Cys Phe Asp Leu Leu Lys Lys Leu Arg Ala Lys Leu185 190 195CAG AGC CTC AAA GCA GAA AGG GAG GAG GCA AGG CAC AGA GAG GAA ATG 678Gln Ser Leu Lys Ala Glu Arg Glu Glu Ala Arg His Arg Glu Glu Met200 205 210 215GCT CTC AGA GGC AAG GAT GCG GCA GAG ATA GTG TTG GAG GCT TTC TGT 726Ala Leu Arg Gly Lys Asp Ala Ala Glu Ile Val Leu Glu Ala Phe Cys220 225 230GCA CAC GCC AGC CAG CGC ATC AGC CAG CTG GAA CAG GAC CTA GCA TCC 774Ala His Ala Ser Gln Arg Ile Ser Gln Leu Glu Gln Asp Leu Ala Ser235 240 245ATG CGG GAA TTC AGA GGC CTT CTG AAG GAT GCC CAG ACC CAA CTG GTA 822Met Arg Glu Phe Arg Gly Leu Leu Lys Asp Ala Gln Thr Gln Leu Val250 255 260GGG CTT CAT GCC AAG CAA GAA GAG CTG GTT CAG CAG ACA GTG AGT CTT 870Gly Leu His Ala Lys Gln Glu Glu Leu Val Gln Gln Thr Val Ser Leu265 270 275ACT TCT ACC TTG CAA CAA GAC TGG AGG TCC ATG CAA CTG GAT TAT ACA 918Thr Ser Thr Leu Gln Gln Asp Trp Arg Ser Met Gln Leu Asp Tyr Thr280 285 290 295ACA TGG ACA GCT TTG CTG AGT CGG TCC CGA CAA CTC ACA GAG AAA CTC 966Thr Trp Thr Ala Leu Leu Ser Arg Ser Arg Gln Leu Thr Glu Lys Leu300 305 310ACA GTC AAG AGC CAG CAA GCC CTG CAG GAA CGT GAT GTG GCA ATT GAG1014Thr Val Lys Ser Gln Gln Ala Leu Gln Glu Arg Asp Val Ala Ile Glu315 320 325GAA AAG CAG GAG GTT TCT AGG GTG CTG GAA CAA GTC TCT GCC CAG TTA1062Glu Lys Gln Glu Val Ser Arg Val Leu Glu Gln Val Ser Ala Gln Leu330 335 340GAG GAG TGC AAA GGC CAA ACA GAA CAA CTG GAG TTG GAA AAC AGT CGT1110Glu Glu Cys Lys Gly Gln Thr Glu Gln Leu Glu Leu Glu Asn Ser Arg345 350 355CTA GCA ACA GAT CTC CGG GCT CAG TTG CAG ATT CTG GCC AAC ATG GAC1158Leu Ala Thr Asp Leu Arg Ala Gln Leu Gln Ile Leu Ala Asn Met Asp360 365 370 375AGC CAG CTA AAA GAG CTA CAG AGT CAG CAT ACC CAT TGT GCC CAG GAC1206Ser Gln Leu Lys Glu Leu Gln Ser Gln His Thr His Cys Ala Gln Asp380 385 390CTG GCT ATG AAG GAT GAG TTA TTC TGC CAG CTT ACC CAG AGC AAT GAG1254Leu Ala Met Lys Asp Glu Leu Phe Cys Gln Leu Thr Gln Ser Asn Glu395 400 405GAG CAG GCT GCT CAA TGG CAA AAG GAA GAG ATG GCA CTA AAA CAC ATG1302Glu Gln Ala Ala Gln Trp Gln Lys Glu Glu Met Ala Leu Lys His Met410 415 420CAG GCA GAA CTG CAG CAG CAA CAA GCT GTC CTG GCC AAA GAG GTG CGG1350Gln Ala Glu Leu Gln Gln Gln Gln Ala Val Leu Ala Lys Glu Val Arg425 430 435GAC CTG AAA GAG ACC TTG GAG TTT GCA GAC CAG GAG AAT CAG GTT GCT1398Asp Leu Lys Glu Thr Leu Glu Phe Ala Asp Gln Glu Asn Gln Val Ala440 445 450 455CAC CTG GAG CTG GGT CAG GTT GAG TGT CAA TTG AAA ACC ACA CTG GAA1446His Leu Glu Leu Gly Gln Val Glu Cys Gln Leu Lys Thr Thr Leu Glu460 465 470GTG CTC CGG GAG CGC AGC TTG CAG TGT GAG AAC CTC AAG GAC ACT GTA1494Val Leu Arg Glu Arg Ser Leu Gln Cys Glu Asn Leu Lys Asp Thr Val475 480 485GAG AAC CTA ACG GCT AAA CTG GCC AGC ACC ATA GCA GAT AAC CAG GAG1542Glu Asn Leu Thr Ala Lys Leu Ala Ser Thr Ile Ala Asp Asn Gln Glu490 495 500CAA GAT CTG GAG AAA ACA CGG CAG TAC TCT CAA AAG CTA AGG CTG CTG1590Gln Asp Leu Glu Lys Thr Arg Gln Tyr Ser Gln Lys Leu Arg Leu Leu505 510 515ACT GAG CAA CTA CAG AGC CTG ACT CTC TTT CTA CAG ACA AAA CTA AAG1638Thr Glu Gln Leu Gln Ser Leu Thr Leu Phe Leu Gln Thr Lys Leu Lys520 525 530 535GAG AAG ACT GAA CAA GAG ACC CTT CTG CTG AGT ACA GCC TGT CCT CCC1686Glu Lys Thr Glu Gln Glu Thr Leu Leu Leu Ser Thr Ala Cys Pro Pro540 545 550ACC CAG GAA CAC CCT CTG CCT AAT GAC AGG ACC TTC CTG GGA AGC ATC1734Thr Gln Glu His Pro Leu Pro Asn Asp Arg Thr Phe Leu Gly Ser Ile555 560 565TTG ACA GCA GTG GCA GAT GAA GAG CCA GAA TCA ACT CCT GTG CCC TTG1782Leu Thr Ala Val Ala Asp Glu Glu Pro Glu Ser Thr Pro Val Pro Leu570 575 580CTT GGA AGT GAC AAG AGT GCT TTC ACC CGA GTA GCA TCA ATG GTT TCC1830Leu Gly Ser Asp Lys Ser Ala Phe Thr Arg Val Ala Ser Met Val Ser585 590 595CTT CAG CCC GCA GAG ACC CCA GGC ATG GAG GAG AGC CTG GCA GAA ATG1878Leu Gln Pro Ala Glu Thr Pro Gly Met Glu Glu Ser Leu Ala Glu Met600 605 610 615AGT ATT ATG ACT ACT GAG CTT CAG AGT CTT TGT TCC CTG CTA CAA GAG1926Ser Ile Met Thr Thr Glu Leu Gln Ser Leu Cys Ser Leu Leu Gln Glu620 625 630TCT AAA GAA GAA GCC ATC AGG ACT CTG CAG CGA AAA ATT TGT GAG CTG1974Ser Lys Glu Glu Ala Ile Arg Thr Leu Gln Arg Lys Ile Cys Glu Leu635 640 645CAA GTT AGG CTG CAG GCC CAG GAA GAA CAG CAT CAG GAA GTC CAG AAG2022Gln Val Arg Leu Gln Ala Gln Glu Glu Gln His Gln Glu Val Gln Lys650 655 660GCA AAA GAA GCA GAC ATA GAG AAG CTG AAC CAG GCC TTG TGC TTG CGC2070Ala Lys Glu Ala Asp Ile Glu Lys Leu Asn Gln Ala Leu Cys Leu Arg665 670 675TAC AAG AAT GAA AAG GAG CTC CAG GAA GTG ATA CAG CAG CAG AAT GAG2118Tyr Lys Asn Glu Lys Glu Leu Gln Glu Val Ile Gln Gln Gln Asn Glu680 685 690 695AAG ATC CTA GAA CAG ATA GAC AAG AGT GGC GAG CTC ATA AGC CTT AGA2166Lys Ile Leu Glu Gln Ile Asp Lys Ser Gly Glu Leu Ile Ser Leu Arg700 705 710GAG GAG GTG ACC CAC CTT ACC CGC TCA CTT CGG CGT GCG GAG ACA GAG2214Glu Glu Val Thr His Leu Thr Arg Ser Leu Arg Arg Ala Glu Thr Glu715 720 725ACC AAA GTG CTC CAG GAG GCC CTG GCA GGC CAG CTG GAC TCC AAC TGC2262Thr Lys Val Leu Gln Glu Ala Leu Ala Gly Gln Leu Asp Ser Asn Cys730 735 740CAG CCT ATG GCC ACC AAT TGG ATC CAG GAG AAA GTG TGG CTC TCT CAG2310Gln Pro Met Ala Thr Asn Trp Ile Gln Glu Lys Val Trp Leu Ser Gln745 750 755GAG GTG GAC AAA CTG AGA GTG ATG TTC CTG GAG ATG AAA AAT GAG AAG2358Glu Val Asp Lys Leu Arg Val Met Phe Leu Glu Met Lys Asn Glu Lys760 765 770 775GAA AAA CTC ATG ATC AAG TTC CAG AGC CAT AGA AAT ATC CTA GAG GAG2406Glu Lys Leu Met Ile Lys Phe Gln Ser His Arg Asn Ile Leu Glu Glu780 785 790AAC CTT CGG CGC TCT GAC AAG GAG TTA GAA AAA CTA GAT GAC ATT GTT2454Asn Leu Arg Arg Ser Asp Lys Glu Leu Glu Lys Leu Asp Asp Ile Val795 800 805CAG CAT ATT TAT AAG ACC CTG CTC TCT ATT CCA GAG GTG GTG AGG GGA2502Gln His Ile Tyr Lys Thr Leu Leu Ser Ile Pro Glu Val Val Arg Gly810 815 820TGC AGA GAA CTA CAG GGA TTG CTG GAA TTT CTG AGC TAA GAAACTGAAA 2551Cys Arg Glu Leu Gln Gly Leu Leu Glu Phe Leu Ser825 830 835GCCAGAATCT GCTTCACCTC TTTTTACCTG CAATACCCCC TTACCCCAAT ACCAAGACCA2611ACTGGCATAG AGCCAACTGA GATAAATGCT ATTTAAATAA AGTGTATTTA ATGAAAACTC2671GTGCCGAATT CGGCACGAGC GGCACGAGCG GCACGAGCTG CAGCCATGTC TCTAGTGATC2731CCTGAAAAGT TCCAGCATAT TTTGCGAGTA CTCAACACCA ACATCGATGG GCGGCGGAAA2791ATAGCCTTTG CCATCACTGC CATTAAGGGT GTGGGCCGAA GATATGCTCA TGTGGTGTTG2851AGGAAAGCAG ACATTGACCT CACCAAGAGG GCGGGAGAAC TCACTGAGGA TGAGGTGGAA2911CGTGTGATCA CCATTATGCA GAATCCACGC CAGTACAAGA TCCCAGACTG GTTCTTGAAC2971AGACAGAAGG ATGTAAAGGA TGGAAAATAC AGCCAGGTCC TAGCCAATGG TCTGGACAAC3031AAGCTCCGTG AAGACCTGGA GCGACTGAAG AAGATTCGGG CCCATAGAGG GCTGCGTCAC3091TTCTGGGGCC TTCGTGTCCG AGGCCAGCAC ACCAAGACCA CTGGCCGCCG TGGCCGCACC3151GTGGGTGTGT CCAAGAAGAA ATAAGTCTGT AGGCCTTGTC TGTTAATAAA TAGTTTATAT3211ACCAAAAAAA AAAAAAAAAA ACTCGAGCAT GCATCTAGAG GGCCC3256(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度836個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Arg Glu Ser Leu Ser Leu Pro Ser Met Leu Arg Asp Ala Ala Ile1 5 10 15Gly Thr Thr Pro Phe Ser Thr Cys Ser Val Gly Thr Trp Phe Thr Pro20 25 30Ser Ala Pro Gln Glu Lys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Thr Gly Leu Val35 40 45Gly Thr Lys His Ser Thr Ser Glu Thr Glu Gln Leu Leu Cys Gly Arg50 55 60Pro Pro Asp Leu Thr Ala Leu Ser Arg His Asp Leu Glu Asp Asn Leu65 70 75 80Leu Ser Ser Leu Val Ile Leu Glu Val Leu Ser Arg Gln Leu Arg Asp85 90 95Trp Lys Ser Gln Leu Ala Val Pro His Pro Glu Thr Gln Asp Ser Ser100 105 110Thr Gln Thr Asp Thr Ser His Ser Gly Ile Thr Asn Lys Leu Gln His115 120 125Leu Lys Glu Ser His Glu Met Gly Gln Ala Leu Gln Gln Ala Arg Asn130 135 140Val Met Gln Ser Trp Val Leu Ile Ser Lys Glu Leu Ile Ser Leu Leu145 150 155 160His Leu Ser Leu Leu His Leu Glu Glu Asp Lys Thr Thr Val Ser Gln165 170 175Glu Ser Arg Arg Ala Glu Thr Leu Val Cys Cys Cys Phe Asp Leu Leu180 185 190Lys Lys Leu Arg Ala Lys Leu Gln Ser Leu Lys Ala Glu Arg Glu Glu195 200 205Ala Arg His Arg Glu Glu Met Ala Leu Arg Gly Lys Asp Ala Ala Glu210 215 220Ile Val Leu Glu Ala Phe Cys Ala His Ala Ser Gln Arg Ile Ser Gln225 230 235 240Leu Glu Gln Asp Leu Ala Ser Met Arg Glu Phe Arg Gly Leu Leu Lys245 250 255Asp Ala Gln Thr Gln Leu Val Gly Leu His Ala Lys Gln Glu Glu Leu260 265 270Val Gln Gln Thr Val Ser Leu Thr Ser Thr Leu Gln Gln Asp Trp Arg275 280 285Ser Met Gln Leu Asp Tyr Thr Thr Trp Thr Ala Leu Leu Ser Arg Ser290 295 300Arg Gln Leu Thr Glu Lys Leu Thr Val Lys Ser Gln Gln Ala Leu Gln305310 315 320Glu Arg Asp Val Ala Ile Glu Glu Lys Gln Glu Val Ser Arg Val Leu325 330 335Glu Gln Val Ser Ala Gln Leu Glu Glu Cys Lys Gly Gln Thr Glu Gln340 345 350Leu Glu Leu Glu Asn Ser Arg Leu Ala Thr Asp Leu Arg Ala Gln Leu355 360 365Gln Ile Leu Ala Asn Met Asp Ser Gln Leu Lys Glu Leu Gln Ser Gln370 375 380His Thr His Cys Ala Gln Asp Leu Ala Met Lys Asp Glu Leu Phe Cys385 390 395 400Gln Leu Thr Gln Ser Asn Glu Glu Gln Ala Ala Gln Trp Gln Lys Glu405 410 415Glu Met Ala Leu Lys His Met Gln Ala Glu Leu Gln Gln Gln Gln Ala420 425 430Val Leu Ala Lys Glu Val Arg Asp Leu Lys Glu Thr Leu Glu Phe Ala435 440 445Asp Gln Glu Asn Gln Val Ala His Leu Glu Leu Gly Gln Val Glu Cys450 455 460Gln Leu Lys Thr Thr Leu Glu Val Leu Arg Glu Arg Ser Leu Gln Cys465 470 475 480Glu Asn Leu Lys Asp Thr Val Glu Asn Leu Thr Ala Lys Leu Ala Ser485 490 495Thr Ile Ala Asp Asn Gln Glu Gln Asp Leu Glu Lys Thr Arg Gln Tyr500 505 510Ser Gln Lys Leu Arg Leu Leu Thr Glu Gln Leu Gln Ser Leu Thr Leu515 520 525Phs Leu Gln Thr Lys Leu Lys Glu Lys Thr Glu Gln Glu Thr Leu Leu530 535 540Leu Ser Thr Ala Cys Pro Pro Thr Gln Glu His Pro Leu Pro Asn Asp545 550 555 560Arg Thr Phe Leu Gly Ser Ile Leu Thr Ala Val Ala Asp Glu Glu Pro565 570 575Glu Ser Thr Pro Val Pro Leu Leu Gly Ser Asp Lys Ser Ala Phe Thr580 585 590Arg Val Ala Ser Met Val Ser Leu Gln Pro Ala Glu Thr Pro Gly Met595 600 605Glu Glu Ser Leu Ala Glu Met Ser Ile Met Thr Thr Glu Leu Gln Ser610 615 620Leu Cys Ser Leu Leu Gln Glu Ser Lys Glu Glu Ala Ile Arg Thr Leu625 630 635 640Gln Arg Lys Ile Cys Glu Leu Gln Val Arg Leu Gln Ala Gln Glu Glu645 650 655Gln His Gln Glu Val Gln Lys Ala Lys Glu Ala Asp Ile Glu Lys Leu660665 670Asn Gln Ala Leu Cys Leu Arg Tyr Lys Asn Glu Lys Glu Leu Gln Glu675 680 685Val Ile Gln Gln Gln Asn Glu Lys Ile Leu Glu Gln Ile Asp Lys Ser690 695 700Gly Glu Leu Ile Ser Leu Arg Glu Glu Val Thr His Leu Thr Arg Ser705 710 715 720Leu Arg Arg Ala Glu Thr Glu Thr Lys Val Leu Gln Glu Ala Leu Ala725 730 735Gly Gln Leu Asp Ser Asn Cys Gln Pro Met Ala Thr Asn Trp Ile Gln740 745 750Glu Lys Val Trp Leu Ser Gln Glu Val Asp Lys Leu Arg Val Met Phe755 760 765Leu Glu Met Lys Asn Glu Lys Glu Lys Leu Met Ile Lys Phe Gln Ser770 775 780His Arg Asn Ile Leu Glu Glu Asn Leu Arg Arg Ser Asp Lys Glu Leu785 790 795 800Glu Lys Leu Asp Asp Ile Val Gln His Ile Tyr Lys Thr Leu Leu Ser805 810 815Ile Pro Glu Val Val Arg Gly Cys Arg Glu Leu Gln Gly Leu Leu Glu820 825 830Phe Leu Ser *835(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度1191個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置34.，1191(xi)序列描述SEQ ID NO5GAACTAGTGG ATCCCCCGGG CTGCAGGAAT TCG GCA CGA GGC GGC GCC GAA GAG 54Ala Arg Gly Gly Ala Glu Glu1 5GCG ACT GAG GCC GGA CGG GGC GGA CGG CGA CGC AGC CCG CGG CAG AAG 102Ala Thr Glu Ala Gly Arg Gly Gly Arg Arg Arg Ser Pro Arg Gln Lys10 15 20TTT GAA ATT GGC ACA ATG GAA GAA GCT GGA ATT TGT GGG CTA GGG GTG 150Phe Glu Ile Gly Thr Met Glu Glu Ala Gly Ile Cys Gly Leu Gly Val25 30 35AAA GCA GAT ATG TTG TGT AAC TCT CAA TCA AAT GAT ATT CTT CAA CAT 198Lys Ala Asp Met Leu Cys Asn Ser Gln Ser Asn Asp Ile Leu Gln His40 45 50 55CAA GGC TCA AAT TGT GGT GGC ACA AGT AAC AAG CAT TCA TTG GAA GAG 246Gln Gly Ser Asn Cys Gly Gly Thr Ser Asn Lys His Ser Leu Glu Glu60 65 70GAT GAA GGC AGT GAC TTT ATA ACA GAG AAC AGG AAT TTG GTG AGC CCA 294Asp Glu Gly Ser Asp Phe Ile Thr Glu Asn Arg Asn Leu Val Ser Pro75 80 85GCA TAC TGC ACG CAA GAA TCA AGA GAG GAA ATC CCT GGG GGA GAA GCT 342Ala Tyr Cys Thr Gln Glu Ser Arg Glu Glu Ile Pro Gly Gly Glu Ala90 95 100CGA ACA GAT CCC CCT GAT GGT CAG CAA GAT TCA GAG TGC AAC AGG AAC 390Arg Thr Asp Pro Pro Asp Gly Gln Gln Asp Ser Glu Cys Asn Arg Asn105 110 115AAA GAA AAA ACT TTA GGA AAA GAA GTT TTA TTA CTG ATG CAA GCC CTA 438Lys Glu Lys Thr Leu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Met Gln Ala Leu120 125 130 135AAC ACC CTT TCA ACC CCA GAG GAG AAG CTG GCA GCT CTC TGT AAG AAA 486Asn Thr Leu Ser Thr Pro Glu Glu Lys Leu Ala Ala Leu Cys Lys LysTAT GCT GAT CTT CTG GAG GAG AGC AGG AGT GTT CAG AAG CAA ATG AAG 534Tyr Ala Asp Leu Leu Glu Glu Ser Arg Ser Val Gln Lys Gln Met Lys155 160 165ATC CTG CAG AAG AAG CAA GCC CAG ATT GTG AAA GAG AAA GTT CAC TTG 582Ile Leu Gln Lys Lys Gln Ala Gln Ile Val Lys Glu Lys Val His Leu170 175 180CAG AGT GAA CAT AGC AAG GCT ATC TTG GCA AGA AGC AAG CTA GAA TCT 630Gln Ser Glu His Ser Lys Ala Ile Leu Ala Arg Ser Lys Leu Glu Ser185190 195CTT TGC AGA GAA CTT CAG CGT CAC AAT AAG ACG TTA AAG GAG GAA AAT 678Leu Cys Arg Glu Leu Gln Arg His Asn Lys Thr Leu Lys Glu Glu Asn200 205 210 215ATG CAG CAG GCA CGA GAG GAA GAA GAA CGA CGT ATA GAA GCA ACT GCA 726Met Gln Gln Ala Arg Glu Glu Glu Glu Arg Arg Ile Glu Ala Thr Ala220 225 230CAT TTC CAG ATT ACC TTA AAT GAA ATT CAA GCC CAG CTG GAG CAG CAT 774His Phe Gln Ile Thr Leu Asn Glu Ile Gln Ala Gln Leu Glu Gln His235 240 245GAC ATC CAC AAC GCC AAA CTC CGA CAG GAA AAC ATT GAG CTG GGG GAG 822Asp Ile His Asn Ala Lys Leu Arg Gln Glu Asn Ile Glu Leu Gly Glu250 255 260AAG CTA AAG AAG CTC ATC GAA CAG TAC GCA CTG AGG GAA GAG CAC ATT 870Lys Leu Lys Lys Leu Ile Glu Gln Tyr Ala Leu Arg Glu Glu His Ile265 270 275GAT AAG GTG TTC AAA CAT AAG GAA CTG CAA CAG CAG CTC GTG GAT GCC 918Asp Lys Val Phe Lys His Lys Glu Leu Gln Gln Gln Leu Val Asp Ala280 285 290 295AAA CTG CAG CAA ACG ACA CAA CTG ATA AAA GAA GCT GAT GAA AAA CAT 966Lys Leu Gln Gln Thr Thr Gln Leu Ile Lys Glu Ala Asp Glu Lys His300 305 310CAG AGA GAG AGA GAG TTT TTA TTA AAA GAA GCG ACA GAA TCG AGG CAC1014Gln Arg Glu Arg Glu Phe Leu Leu Lys Glu Ala Thr Glu Ser Arg His315 320 325AAA TAC GAA CAA ATG AAA CAG CAA GAA GTA CAA CTA AAA CAG CAG CTT1062Lys Tyr Glu Gln Met Lys Gln Gln Glu Val Gln Leu Lys Gln Gln Leu330 335 340TCT CTT TAT ATG GAT AAG TTT GAA GAA TTC CAG ACT ACC ATG GCA AAA1110Ser Leu Tyr Met Asp Lys Phe Glu Glu Phe Gln Thr Thr Met Ala Lys345 350 355AGC AAT GAA CTG TTT ACA ACC TTC AGA CAG GAA ATG GAA AAG ATG ACA1158Ser Asn Glu Leu Phe Thr Thr Phe Arg Gln Glu Met Glu Lys Met Thr360 365 370 375AAG AAA ATT AAA AAA AAA AAA AAA AAA CTC GAG 1191Lys Lys Ile Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu380 385(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度386個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Arg Gly Gly Ala Glu Glu Ala Thr Glu Ala Gly Arg Gly Gly Arg1 5 10 15Arg Arg Ser Pro Arg Gln Lys Phe Glu Ile Gly Thr Met Glu Glu Ala20 25 30Gly Ile Cys Gly Leu Gly Val Lys Ala Asp Met Leu Cys Asn Ser Gln35 40 45Ser Asn Asp Ile Leu Gln His Gln Gly Ser Asn Cys Gly Gly Thr Ser50 55 60Asn Lys His Ser Leu Glu Glu Asp Glu Gly Ser Asp Phe Ile Thr Glu65 70 75 80Asn Arg Asn Leu Val Ser Pro Ala Tyr Cys Thr Gln Glu Ser Arg Glu85 90 95Glu Ile Pro Gly Gly Glu Ala Arg Thr Asp Pro Pro Asp Gly Gln Gln100 105 110Asp Ser Glu Cys Asn Arg Asn Lys Glu Lys Thr Leu Gly Lys Glu Val115 120 125Leu Leu Leu Met Gln Ala Leu Asn Thr Leu Ser Thr Pro Glu Glu Lys130 135 140Leu Ala Ala Leu Cys Lys Lys Tyr Ala Asp Leu Leu Glu Glu Ser Arg145 150 155 160Ser Val Gln Lys Gln Met Lys Ile Leu Gln Lys Lys Gln Ala Gln Ile165 170 175Val Lys Glu Lys Val His Leu Gln Ser Glu His Ser Lys Ala Ile Leu180 185 190Ala Arg Ser Lys Leu Glu Ser Leu Cys Arg Glu Leu Gln Arg His Asn195 200 205Lys Thr Leu Lys Glu Glu Asn Met Gln Gln Ala Arg Glu Glu Glu Glu210 215 220Arg Arg Ile Glu Ala Thr Ala His Phe Gln Ile Thr Leu Asn Glu Ile225 230 235 240Gln Ala Gln Leu Glu Gln His Asp Ile His Asn Ala Lys Leu Arg Gln245 250 255Glu Asn Ile Glu Leu Gly Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ile Glu Gln Tyr260 265 270Ala Leu Arg Glu Glu His Ile Asp Lys Val Phe Lys His Lys Glu Leu275 280 285Gln Gln Gln Leu Val Asp Ala Lys Leu Gln Gln Thr Thr Gln Leu Ile290 295 300Lys Glu Ala Asp Glu Lys His Gln Arg Glu Arg Glu Phe Leu Leu Lys305 310 315 320Glu Ala Thr Glu Ser Arg His Lys Tyr Glu Gln Met Lys Gln Gln Glu325 330 335Val Gln Leu Lys Gln Gln Leu Ser Leu Tyr Met Asp Lys Phe Glu Glu340 345 350Phe Gln Thr Thr Met Ala Lys Ser Asn Glu Leu Phe Thr Thr Phe Arg355 360 365Gln Glu Met Glu Lys Met Thr Lys Lys Ile Lys Lys Lys Lys Lys Lys370 375 380Leu Glu38權(quán)利要求
1.一種組合物，它包含編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分離的核酸序列編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述調(diào)節(jié)子蛋白包含至少一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和一個鋅指結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述分離的核酸序列編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白分子量約為45-97kd。
4.權(quán)利要求3的包含一種分離的核酸序列的組合物，其中所述核酸序列為cDNA序列。
5.權(quán)利要求4的包含分離核酸序列的組合物，其中所述cDNA序列選自下列成員3號序列，091-1F84；1號序列，091-21A31；5號序列，091-132Q20。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中編碼所述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的所述分離的核酸序列含有所述核酸序列的一個分離的核酸片段。
7.一種核酸序列，它與權(quán)利要求1所述BRCA1調(diào)節(jié)子核酸序列在高度嚴緊條件下能雜交。
8.權(quán)利要求7的核酸序列，其中所述核酸序列與所述BRCA1調(diào)節(jié)子序列有大約95％同源。
9.一種包含BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的組合物。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分子量約為45-97kd。
11.包含編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離的核酸序列的分離的宿主細胞。
12.包含編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離的核酸序列的載體。
13.一種復合物，其包含基本純的BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
14.含有權(quán)利要求13的復合物的宿主細胞。
15.一種形成基本純的BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的復合物的方法，包括將基本純的BRCA1和基本純的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白在溶液中相互接觸，給予足夠時間以形成所述復合物，并除去未復合的BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
16.與BRCA1調(diào)節(jié)子結(jié)合的分離的抗體。
17.包含BRCA1調(diào)節(jié)子的藥用組合物。
18.權(quán)利要求15的藥用組合物，其中所述BRCA1調(diào)節(jié)子選自下列成員1號序列，091-21A31；3號序列，091-1F84；5號序列，091-132Q20。
19.一種核酸序列，其編碼由保藏在ATCC的編號為98141的保藏物中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)(3號序列，091-1F84)。
20.一種核酸序列，其編碼由保藏在ATCC的編號為98142的保藏物中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)(1號序列，091-21A31)。
21.一種核酸序列，其編碼由保藏在ATCC的編號為98143的保藏物中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)(5號序列，091-132Q20)。
22.一種生產(chǎn)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求11所述細胞，并從所述細胞或所述培養(yǎng)基中分離所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
由編碼名為BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的蛋白質(zhì)的一族相關(guān)核苷酸序列組成的組合物,該調(diào)節(jié)子蛋白能結(jié)合腫瘤抑制基因產(chǎn)物BRCA1;以及用所述核苷酸序列和它們編碼的蛋白質(zhì)進行診斷和/或治療疾病的方法,該BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的表觀分子量為45—97千道爾頓,其特征在于具有至少一個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,任選地含有鋅指結(jié)構(gòu)域。
文檔編號C07K14/435GK1228811SQ97197589
公開日1999年9月15日 申請日期1997年8月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月4日
發(fā)明者B·魯賓菲爾德, P·泊拉基斯, C·利根菲爾特, T·T·翁 申請人:昂尼克斯藥物公司