国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      促進(jìn)休眠型TGF-β活化的肽以及調(diào)節(jié)TGF-β活性的化合物的篩選方法

      文檔序號:3550525閱讀:441來源:國知局
      專利名稱:促進(jìn)休眠型TGF-β活化的肽以及調(diào)節(jié)TGF-β活性的化合物的篩選方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種新型肽,其能促進(jìn)休眠型TGF-β(TGF-β普通分泌型)轉(zhuǎn)化為活性型轉(zhuǎn)化生長因子-β(以下簡稱為活性型TGF-β或者TGF-β),活性型TGF-β具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化、免疫抑制、刺激成纖維細(xì)胞的趨化性等多種生理活性,此肽還可以作為與缺乏TGF-β活性相關(guān)的疾病以及認(rèn)為施用外源TGF-β可有效治療的疾病如癌、骨折、心肌梗塞、缺血再灌注后心肌紊亂、腦梗塞和視網(wǎng)膜脫落等疾病的治療劑。
      另外,本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)休眠型轉(zhuǎn)化生長因子-β(此后縮寫為LTGF-β)與細(xì)胞結(jié)合的化合物的篩選方法或者調(diào)節(jié)自休眠型TGF-β釋放出活性型TGF-β的化合物的篩選方法,以及用于治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的根據(jù)上述方法篩選得到的化合物。
      背景技術(shù)
      包括人在內(nèi)的哺乳類中都存在諸如TGF-β1、β2和β3的TGF-β,且都分泌為無活性的LTGF-β[Robert,A.B.和Sporn,M.B.,肽生長因子和它們的受體(Peptide Growth Factors and Thir Receptors),藥學(xué)實驗手冊,第一部(Handbook of Experimental Pharmacology,Part 1),SPRINGER-VERLAG,柏林,419~472頁(1990)],需要在分泌后被活化以呈現(xiàn)其活性。LTGF-β可被分為兩種類型小分子量休眠型TGF-β(以下簡稱為SLTGF-β),其中休眠相關(guān)肽(以下簡稱為LAP)以非共價鍵與TGF-β結(jié)合;以及大分子量休眠型TGF-β(以下簡稱LLTGF-β),其中休眠型TGF-β結(jié)合蛋白質(zhì)以下簡稱為LTBP)通過二硫鍵用LAP與SLTGF-β結(jié)合。LTGF-β主要以LLTGF-β形式分泌[EMBO Journal,10,1091(1991)]。TGF-β和LAP作為具有信號肽的相同蛋白質(zhì)分子(TGF-β前體)被合成,其氨基酸序列已知[(Nature),316,701(1985)]。
      已發(fā)現(xiàn)參與休眠型TGF-β活化的一些相關(guān)蛋白酶,其中血纖蛋白溶酶研究最透徹。即血纖蛋白溶酶部分降解LAP釋放出非共價鍵結(jié)合的TGF-β[細(xì)胞生物學(xué)雜志(Journal of cell Biology),110,1361(1990)]。細(xì)胞水平上血纖蛋白溶酶對休眠型TGF-β的活化的分析表明通過血纖蛋白溶酶的活化在細(xì)胞膜表面進(jìn)行[細(xì)胞生物學(xué)雜志,109309(1989)],休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合對于活化是必需的[細(xì)胞生物學(xué)雜志121 439(1993),出處同前,120,995(1993),出處同前,123,1249(1993)],且休眠型TGF-β通過LAP與細(xì)胞膜結(jié)合[細(xì)胞生物學(xué)雜志,123,1249(1993),Tohoku實驗藥學(xué)雜志(Journal ofExperimental Medicine),179,23(1996)]。但是,休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的調(diào)控與TGF-β的活性調(diào)控的相互關(guān)系還不清楚。
      已知休眠型TGF-β與血管平滑肌細(xì)胞結(jié)合而不與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合[細(xì)胞生物學(xué)雜志,123,1249(1993)]。
      TGF-β具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制免疫機(jī)能、刺激成纖維細(xì)胞的趨化性等多種生理活性。TGF-β與多種疾病相關(guān)。例如,已報道TGF-β活性的缺乏與糖尿病性視網(wǎng)膜癥[細(xì)胞生物學(xué)雜志,109,309(1989),眼科學(xué)檔案(Archieves of Ophthalmology),66,366(1961)]、動脈粥樣硬化的初期病變[天然藥物(Nature Medicine),1,1067(1995)]有關(guān)。另外,期望TGF-β本身對骨折、心肌梗塞、缺血后再灌注性心肌紊亂、腦梗塞、視網(wǎng)膜剝離等有治療效果[細(xì)胞生物學(xué)雜志,119,1017(1992)]。此外,已知TGF-β對多種癌細(xì)胞的生長有抑制作用[內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology),128,1981(1991),臨床研究雜志(Jounal of Clinical Investigation),87,277(1991),細(xì)胞生長與分化(Cell Growth and Differentiation),1,549(1990)],期望可成為一種抗腫瘤藥物[美國國家科學(xué)院院報(Proceedings of the National Aceademy of Science U.S.A),92,4254(1995)]。
      在體內(nèi)產(chǎn)生、分泌的休眠型TGF-β中,僅有一部分被活化。相應(yīng)地,通過增加體內(nèi)休眠型TGF-β的活化效率可增強(qiáng)TGF-β的活性。所以,認(rèn)為促進(jìn)休眠型TGF-β活化的化合物是治療與缺乏TGF-β活性相關(guān)的疾病以及認(rèn)為施用外源性TGF-β可有效治療的疾病如癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜癥、動脈粥樣硬化、骨折、心肌梗塞、缺血后再灌注性心肌紊亂、腦梗塞、視網(wǎng)膜剝離等疾病的一種有效治療劑。
      另一方面,也已知由于TGF-β活性增加而引起細(xì)胞外基質(zhì)變化所伴隨的多種疾病。所以期望得到抑制TGF-β活性的物質(zhì)用作對治療例如腎小球腎炎、糖尿病性腎病、腎移植排斥反應(yīng)、HIV腎炎、突發(fā)性肺纖維化癥、自身免疫性肺纖維化癥、肝硬化、靜脈狹窄性肝障礙(常在治療癌癥后引發(fā))、全身性硬化癥、瘢痕瘤、嗜酸性粒細(xì)胞增加肌肉痛綜合癥、血管成形術(shù)后再狹窄、眼內(nèi)纖維化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、各種纖維化癥如鼻息肉的治療有效藥物[Border W.A.和Noble N.A.,組織纖維化中的轉(zhuǎn)化生長因子-β,(Transforming growth factor-β intissue fibrosis),新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.)331,1286,(1994)以及Border W.A.和Rouslanti E.,疾病中的轉(zhuǎn)化生長因子組織修復(fù)的暗面(Transforming growth factor-β in diseaseThe dark sideof tissue repair),臨床研究雜志(J.Clin Invest.),90,1,(1992)]。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明提供了具有促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β或具有促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的活性的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽。在一個實施方案中,本發(fā)明提供了具有促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β或具有促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的活性的一種肽,其由通式(I)表示R1-A-R2(I)(其中R1為H、取代或未取代的鏈烷?;?、取代或未取代的芳?;⑷〈蛭慈〈碾s芳基羰基、取代或未取代的烷氧羰基、或者取代或未取代的芳氧羰基、取代或未取代的雜芳氧羰基;R2為羥基、取代或未取代的烷氧基、或者取代或未取代的氨基;且A為選自TGF-β前體序列的部分序列的一種氨基酸序列,該序列可以缺失、取代或添加1~5個氨基酸殘基;從選自包括序列內(nèi)N末端及C末端氨基酸殘基中的任意二個氨基酸殘基之間、N端氨基或側(cè)鏈的氨基與C端的羧基或側(cè)鏈羧基之間可以形成用CO-NH表示的一種酰胺鍵,或用NH-CO表示的一種反酰胺鍵,或側(cè)鏈的巰基可形成一種二硫鍵),或其藥學(xué)可接受的鹽。
      在另一實施方案中,本發(fā)明提供具有促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β或具有促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜的活性的一種肽或其一種藥學(xué)可接受的鹽,其由通式(I)表示,其中A是一種選自人TGF-β1前體序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的一種氨基酸序列的部分序列的氨基酸序列,以及當(dāng)與人TGF-β1前體進(jìn)行序列比較時除去人TGF-β1前體序列之外的TGF-β前體序列中相應(yīng)于人TGF-β1前體序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的氨基酸序列,且在該部分序列中1-5個氨基酸殘基可以被缺失、取代或添加。
      在另一實施方案中,本發(fā)明提供具有促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β或具有促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的活性的一種肽或其一種藥學(xué)可接受的鹽,其由通式(I)表示,其中A為SEQ IDNo.1~16中任一氨基酸序列,該序列中1~5個氨基酸殘基可被缺失、取代或添加。
      在另一實施方案中,本發(fā)明提供了一種篩選用于治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的的化合物的方法,其包括在向動物細(xì)胞添加休眠型TGF-β后測定與該細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量,向該細(xì)胞添加休眠型TGF-β與待評價的化合物后測定與該細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量,以及從由于添加該化合物引起的與動物細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量的改變來評價該化合物對休眠型TGF-β與動物細(xì)胞結(jié)合的抑制活性或促進(jìn)活性。
      在另一實施方案中,本發(fā)明提供了一種篩選用于治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的的化合物的方法,其包括在向動物細(xì)胞添加一種由通式(I)表示的肽或其藥學(xué)可接受的鹽后測定TGF-β的量,向動物細(xì)胞添加待評價的化合物及一種由通式(I)表示的肽或其藥學(xué)可接受的鹽后測定TGF-β的量,以及從由于添加該化合物引起的TGF-β的量的改變來評價該化合物對從休眠型TGF-β向TGF-β轉(zhuǎn)化的抑制活性或促進(jìn)活性。
      在本發(fā)明的另一實施方案中,提供了根據(jù)本發(fā)明中上述二個方法中任一個方法篩選具有對休眠型TGF-β與細(xì)胞結(jié)合或?qū)男菝咝蚑GF-β向TGF-β轉(zhuǎn)化有抑制活性或促進(jìn)活性的化合物,以及用于治療或預(yù)防與TGF-β相關(guān)疾病的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
      以下,通式(I)中所表示的肽稱為化合物(I)。
      通式(I)中的基團(tuán)定義如下,鏈烷?;ň哂?~20個碳原子的鏈烷酰基,諸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁?;惗□;⑽祯;?、異戊?;?、新戊?;⒓乎;⒏;?、月桂?;?、二十烷?;?。
      芳?;胺佳豸驶姆蓟糠值睦訛楸交洼粱?。
      雜芳基羰基及雜芳氧羰基的雜芳基部分的例子為呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、喹啉基、異喹啉基和喹唑啉基等。
      烷氧羰基和烷氧基的烷基部分包括具有1~20個碳原子的烷基,如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己烷基、庚烷基、癸烷基、十二烷基、二十烷基等。
      取代的鏈烷?;?、取代的烷氧羰基及取代的烷氧基各自有1-3個相同或不同的取代基。取代基的例子有羥基、羧基、有3-8個碳原子的脂族環(huán)烷基(如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基)、取代或未取代的苯基和芴基等。取代的苯基有1~3個相同或不同的取代基。取代基的例子有烷基、烷氧基、羥基、硝基、磺基、氰基和鹵素等。鹵素包括氟、氯、溴、碘。作為取代的苯基的取代基的烷基和烷氧基的烷基部份與上述烷氧羰基及烷氧基的烷基部分具有相同含義。
      取代的芳酰基、取代的芳氧羰基、取代的雜芳羰基及取代的雜芳氧羰基各自有1-3個相同或不同的取代基。取代基和上述取代的苯基的取代基相同。
      取代的氨基有1-2個相同或不同的取代基。取代基的例子為取代或未取代的烷基和取代或未取代的芳基。烷基與前述烷氧基和烷氧羰基(包括其取代基)的烷基部分有相同含義。
      對于TGF-β前體序列,可以采用源自任何動物的任何種類的TGF-β。合適的例子為人TGF-β1(J05114)[Nature,316,701(1985)](SEQ ID No.17),人TGF-β2(Y00083)[EMBO.J.,6,3673(1987)](SEQ ID No.18),人TGF-β3(J03241)[美國國家科學(xué)院院報,854715(1988)](SEQ ID No.19),小鼠TGF-β1(M13177)[生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),261,4377(1986)](SEQ ID No.20),小鼠TGF-β2(X57413)[分子內(nèi)分泌學(xué)(Mol.Endocrinol.),3,1108(1989)](SEQ ID No.21),小鼠TGF-β3(M32745)[分子內(nèi)分泌學(xué),3,1926(1989)](SEQ ID No.22),大鼠TGF-β1(X52498)[核酸研究(Nucleic Acids Res.),18,3059(1990)](SEQ ID No.23),大鼠TGF-β3(U03491)[生物化學(xué)雜志,270,2722(1995)](SEQ IDNo.24),牛TGF-β1(M36271)[分子內(nèi)分泌學(xué),1,693(1987)](SEQ IDNo.25),豬TGF-β1(Y00111)[核酸研究,15,3187(1987)](SEQ IDNo.26),豬TGF-β3(X14150)[EMBO J.,7,3737,(1988)](SEQ IDNo.27),犬TGF-β1(L34956)[基因(Gene),155,307(1995)](SEQID No.28),綿羊TGF-β1(X76916)[基因,150,371(1994)](SEQ IDNo.29),雞TGF-β2(X58071)[分子內(nèi)分泌學(xué),7,175(1991)](SEQ IDNo.30),雞TGF-β3(M31154)[分子內(nèi)分泌學(xué),2,747(1988)](SEQ IDNo.31),雞TGF-β4(M31160)[分子內(nèi)分泌學(xué),6,989(1992)](SEQ IDNo.32),猴(非洲綠猴)TGF-β(M16658)[DNA,6,239(1991)](SEQID No.33),蛙(Xenopus laevis)TGF-β5(J05180)[生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),265,1089(1990)](SEQ ID No.34)等。TGF-β前體序列名稱后面括弧內(nèi)的數(shù)字所顯示的是GenBank的保藏號。
      對于A無特別限定,只要A是選自TGF-β前體序列的部分序列中的一種氨基酸序列,該序列中1~5個氨基酸殘基可以被缺失、取代或添加。優(yōu)選的A是選自人TGF-β1前體序列中的序數(shù)30~60的氨基酸序列、序數(shù)142~186的氨基酸序列及序數(shù)269~297的氨基酸序列部分序列的一種氨基酸序列以及除去人TGF-β1以外的TGF-β前體序列當(dāng)與人TGF-β1進(jìn)行序列比較時相應(yīng)于人TGF-β1前體序列中序數(shù)30~60的氨基酸序列、序數(shù)142~186的氨基酸序列及序數(shù)269~297的氨基酸序列中的部分序列的一種氨基酸序列,而且在該氨基酸序列中,1~5個氨基酸殘基可以被缺失、取代、添加。
      特別優(yōu)選的A是選自人TGF-β1前體序列中序數(shù)30~60的氨基酸序列、序數(shù)142~168的氨基酸序列及序數(shù)269~297的氨基酸序列中的部分序列以及除去人TGF-β1以外的TGF-β前體序列當(dāng)與人TGF-β1序列進(jìn)行序列比較時相應(yīng)于人TGF-β1前體序列中序數(shù)30~60的氨基酸序列、序數(shù)142~186的氨基酸序列及序數(shù)269~297的氨基酸序列中的部分序列。
      與人TGF-β1前體序列進(jìn)行序列比較的上面所舉例的動物來源的各種TGF-β前體如表1-1~表1-8所示。序列前后的數(shù)字表示氨基酸的位置號,氨基酸序列中的“-”表示空位的位置。
      表1-1

      表1-2

      表1-3

      >
      表1-4

      表1-5

      表1-6

      <p>表1-7

      >
      表1-8<

      <p>相應(yīng)于人TGF-β1前體中序數(shù)30~60、序數(shù)142~186、序數(shù)269~297的氨基酸序列部分(表1中人TGF-β1前體序列中下加線的氨基酸序列)為例如,人TGF-β2前體上分別為序數(shù)21~51、序數(shù)137~188、序數(shù)291~320的氨基酸序列,人TGF-β3前體上分別為序數(shù)24~54、序數(shù)139~190、序數(shù)288~318的氨基酸序列。這些序列比較使用Barton和Sternberg法進(jìn)行[分子生物學(xué)雜志(Jonrnal ofMolecular Biology),198,327(1987)]。
      優(yōu)選的化合物(I)是肽及其藥學(xué)可接受的鹽,其中A是選自SEQ IDNo.1~16的氨基酸序列,其序列中1~5氨基酸殘基可以缺失、取代、添加。特別優(yōu)選的A是選自SEQ ID No.1~16序列的氨基酸序列的肽。
      “序列中1~5氨基酸殘基可以被缺失、取代、添加”的表述此處指序列中可以包含的任意單一或多個所選位置上單一或多個氨基酸殘基的缺失、取代或添加,這種缺失、取代或添加的總數(shù)為1-5,且缺失、取代和添加可以同時包含在序列中。取代和添加的氨基酸是否為天然型不限。
      添加的例子為帶有巰基(如半胱氨酸和同型半胱氨酸)或在序列兩端有有機(jī)基團(tuán)的氨基酸。取代的例子為序列中存在的半胱氨酸殘基被取代為絲氨酸或丙氨酸殘基以及絲氨酸或丙氨酸殘基被取代為半胱氨酸殘基。而且序列中所含二個巰基之間可形成二硫鍵以發(fā)生環(huán)化。N末端的氨基或側(cè)鏈的氨基與C末端的羧基或側(cè)鏈的羧基之間可以形成由CO-NH表示的一種酰胺鍵或由NH-CO表示的一種反酰胺鍵以發(fā)生環(huán)化。
      天然氨基酸的例子,包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸和L-色氨酸。
      休眠型TGF-β一詞包括含有TGF-β和抑制其活性的LAP的小分子量休眠型TGF-β(SLTGF-β)以及含有TGF-β和抑制其活性的LAP和LTBP的大分子量休眠型TGF-β(LLTGF-β)。
      由本發(fā)明的方法所篩選的化合物和化合物(I)的藥學(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽、金屬鹽、有機(jī)堿加成鹽等。藥學(xué)可接受的酸加成鹽的例子包括如鹽酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽等無機(jī)鹽及如醋酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽等有機(jī)酸鹽。藥學(xué)可接受的金屬鹽的例子為如鈉鹽和鉀鹽等堿性金屬鹽、如鎂鹽和鈣鹽等堿土類金屬鹽及鋁鹽、鋅鹽等。藥學(xué)可接受的有機(jī)堿加成鹽的例子包括與如甲胺、乙胺、苯胺等伯胺,與如二甲胺、二乙胺、吡咯烷、哌啶、嗎啉、哌嗪等仲胺及與如三甲胺、三乙胺、N,N-二甲基苯胺、吡啶等叔胺所形成的鹽和銨鹽等。
      下面對本說明書中所用的氨基酸和其保護(hù)基團(tuán)相關(guān)的縮寫進(jìn)行說明。
      氨基酸及其保護(hù)基團(tuán)相關(guān)的縮寫,遵從IUPAC-IUP聯(lián)合委員會對生物化學(xué)命名的規(guī)定[歐洲生物化學(xué)雜志(European Journal ofBiochemistry);138,9(1984)]。
      除非另有說明,本說明書中使用下面的縮寫表示氨基酸和其保護(hù)基團(tuán)。
      Gly或G甘氨酸Ala或AL-丙氨酸Thr或TL-蘇氨酸Asp或DL-天冬氨酸Asn或NL-天冬酰胺AsxL-天冬氨酸或L-天冬酰胺Glu或EL-谷氨酸Gln或QL-谷氨酰胺GlxL-谷氨酸或L-谷氨酰胺Val或VL-纈氨酸Leu或LL-亮氨酸Ser或SL-絲氨酸Met或ML-蛋氨酸Ile或IL-異亮氨酸Phe或FL-苯丙氨酸Tyr或YL-酪氨酸Lys或KL-賴氨酸Ary或RL-精氨酸His或HL-組氨酸Pro或PL-脯氨酸Cys或CL-半胱氨酸Trp或WL-色氨酸Fmoc9-芴基甲氧羰基t-Bu叔丁基Trt三苯甲游基Pmc2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?;鵅oc叔丁氧羰基下列縮寫表示對應(yīng)的側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸。Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-L-天門冬氨酸β-叔丁酯Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-L-谷氨酸γ-叔丁酯Fmoc-Thr(t-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-o-叔丁基-L-蘇氨酸Fmoc-Ser(t-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-o-叔丁基-L-絲氨酸Fmoc-Tyr(t-Bu)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-o-叔丁基-L-酪氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸Fmoc-Asn(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nγ-三苯甲游基-L-天冬酰胺Fmoc-Gln(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nδ-三苯甲游基-L-谷氨酸Fmoc-Arg(Pmc)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Ng-2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫呋喃-6-磺酰基-L-精氨酸Fmoc-His(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nim-三苯甲游基-L-谷氨酸Fmoc-Cys(Trt)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-S-三苯甲游基-L-半胱氨酸Fmoc-Trp(Boc)-OHNα-9-芴基甲氧羰基-Nind-叔丁氧羰基-L-色氨酸下面縮寫對應(yīng)反應(yīng)溶劑和反應(yīng)試劑等。PyBOP苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸酯HOBtN-羥基苯并三唑DCC二環(huán)己酰碳二亞胺NMMN-甲基嗎啉DMFN,N-二甲基甲酰胺NMPN-甲基吡咯烷酮TFA三氟醋酸DTT二硫蘇糖醇HBTu2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯DIPCN,N′-二異丙基碳二亞胺DIEAN,N-二異丙基乙胺DCM二氯甲烷化合物(I)的制造過程說明如下。
      一般可采用液相或固相肽合成法[肽合成的基礎(chǔ)與實驗,NobuoIzumiya等,Maruzen(1985年)]或其適宜的組合方法合成化合物(I)。也可使用一種自動肽合成儀合成化合物(I)。即通過使用島津公司生產(chǎn)的肽合成儀、Applied Biosystems公司(美國,ABI公司)所生產(chǎn)的肽合成儀、Advanced ChemTech公司(美國,ACT公司)所生產(chǎn)的肽合成儀等商業(yè)可得的肽合成儀,按各自的合成程序使用適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈保護(hù)的Nα-9-芴基甲氧羰基氨基酸或Nα-叔丁氧羰基氨基酸進(jìn)行合成。
      作為化合物(I)合成起始材料的受保護(hù)的氨基酸及載體樹脂,可購自ABI公司、島津公司、國產(chǎn)化學(xué)(株)、Nova Biochem公司、渡邊化學(xué)(株)、ACT和肽研究有限公司等。
      在通過固相法、液相法或其組合或者在肽鏈延伸過程中結(jié)合了全部組分的氨基酸殘基和有機(jī)基團(tuán)后進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。后一種情況下,所得的環(huán)化產(chǎn)物再與氨基酸殘基或有機(jī)基團(tuán)縮合后以制備化合物(I)。環(huán)狀結(jié)構(gòu)可通過在反應(yīng)的最后一步形成一種構(gòu)成通式(T)中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的二硫鍵、酰胺鍵或反酰胺鍵,或者在上述鍵形成后在普通序列中作為構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)組分的氨基酸殘基與相鄰的氨基酸殘基之間形成一種酰胺鍵。下面描述環(huán)化過程。1.通過形成二硫鍵的環(huán)化首先,通過固相法、液相法或其組合制備在序列中兩個位點(diǎn)上帶有適當(dāng)保護(hù)的巰基的氨基酸殘基的一種肽。再將巰基保護(hù)基團(tuán)以外的其它保護(hù)基團(tuán)除去,隨后除去巰基保護(hù)基團(tuán)。再將所得前體肽進(jìn)行氧化反應(yīng),通過普通有機(jī)化學(xué)反應(yīng)中的純化步驟純化產(chǎn)物以得到期望的含有二硫鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽。1-1按照液相法通過形成二硫鍵的環(huán)化通過將上述前體肽在空氣中進(jìn)行氧化或在隋性溶劑中與一種氧化劑反應(yīng)可制備帶有二硫鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽。在肽濃度為0.5~5000μmol/l,優(yōu)選在50~500μmol/l下進(jìn)行反應(yīng)。對于溶劑,緩沖液如50mM-1M三(羥甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)調(diào)整至pH4-9(優(yōu)選地pH6-8)、5~50%酸水溶液、水以及如DMF、DMSO、乙腈、四氫呋喃、甲醇和乙醇等有機(jī)溶劑可單獨(dú)或組合使用。氧化劑的例子為鐵氰化鉀和碘,使用與前體肽重量比分別為0.1~1倍的量和0.5~5倍量(優(yōu)選是等量)。濃度為10~50%的DMSO也可用作氧化劑。反應(yīng)通常在0~40℃進(jìn)行1小時至一周。有時,通過加入谷胱甘肽可提高氧化產(chǎn)物的產(chǎn)率,且反應(yīng)在與該前體肽重量比0.5~5倍量的氧化型谷胱甘肽和1/2氧化型谷胱甘肽量的還原型谷胱甘肽的存在下進(jìn)行[美國化學(xué)會雜志(Journal of American Chemical Society),103,5867(1981);醫(yī)藥品的開發(fā),第二集,第14卷,肽合成,239頁,天島治明監(jiān)修,廣川書店(1991)]。當(dāng)用碘作為氧化劑時,在反應(yīng)結(jié)束后加入鋅粉末至反應(yīng)混合液中碘的顏色消失,就這樣或通過減壓濃縮后采用各種層析法純化混合物。當(dāng)用鐵氰化鉀作氧化劑時,通過加入醋酸使反應(yīng)混合物呈弱酸性,然后就這樣或通過減壓濃縮后采用各種層析法純化。此外,可加入如Dowex 1×2(AcO-)(Dow化學(xué)公司)等陰離子交換樹脂以通過吸附除去過剩的鐵氰化鉀(鐵氰酸離子和亞鐵氰酸離子)后混合物就這樣或減壓濃縮后采用各種層析法進(jìn)行純化。
      另外,可以將一個巰基進(jìn)行吡啶基亞磺?;?-硝基吡啶基亞磺?;?,再在選擇性除去其它巰基的同時完成環(huán)化反應(yīng)[國際肽及蛋白質(zhì)研究雜志(International Journal of Peptide and Protein Research),29,162(1987)]。環(huán)化反應(yīng)所用的溶劑、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間等與上述基本相同。另外,在二個巰基的保護(hù)基團(tuán)除去后,加入等量用于吡啶基亞磺?;?-硝基吡啶基亞磺酰化試劑。吡啶基亞磺?;磻?yīng)中通過加入1-3倍等量的試劑如2,2′-的二硫代聯(lián)吡啶到含有肽的溶劑中,隨后攪拌。2-硝基吡啶基亞磺?;惨韵嗨品绞竭M(jìn)行。反應(yīng)所用溶劑、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間等均與前述基本相同[肽化學(xué)(PeptideChemistry),1991,125(1992)]。l-2按照固相法通過形成二硫鍵的環(huán)化帶有在序列中的二個位置有用適宜的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的巰基氨基酸殘基的肽,采用固相法延伸。在從樹脂上切除肽之前,選擇性除去巰基保護(hù)基團(tuán),將該肽進(jìn)行氧化反應(yīng)以制備帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽組分。在此之后再從樹脂上切除肽并除去殘留的保護(hù)基團(tuán),于是可得到所期望的帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽。
      巰基保護(hù)基團(tuán)的例子包括如乙酰胺基甲基(Acm)及三苯甲游基(Trt)。樹脂上被保護(hù)的肽通過在如DMF或DCM等適當(dāng)?shù)娜軇┲信c碘反應(yīng)除去Acm基團(tuán)和Trt基團(tuán),形成分子內(nèi)二硫鍵。對于50mg樹脂,使用0.5~2ml溶劑與用樹脂上肽的計算重量的重量比0.5~5倍量(優(yōu)選為等量)的碘反應(yīng)。反應(yīng)通常在0~40℃進(jìn)行1小時至1周。反應(yīng)結(jié)束后,樹脂經(jīng)過固相法中通常的處理,即用少量如DMF或DCM等溶劑清洗,再經(jīng)過后續(xù)反應(yīng)。
      如前1-1中所述一個巰基的吡啶基亞磺酰化或2-硝基吡啶基亞磺?;捎霉滔喾ㄟM(jìn)行。環(huán)化反應(yīng)所用溶劑、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間等基本與前述相同。與前述液相法相似,二個巰基的保護(hù)基團(tuán)除去后,加入等量吡啶基亞磺酰化試劑或2-硝基吡啶基亞磺?;噭?。通過加入1-3當(dāng)量的反應(yīng)試劑(如2,2′-二硫代聯(lián)吡啶)到用溶劑溶脹過的樹脂,隨后攪拌,進(jìn)行吡啶基亞磺酰化反應(yīng)。2-硝基吡啶基亞磺酰化也以相似方式進(jìn)行。反應(yīng)所用溶劑、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間等與前述采用固相法環(huán)化反應(yīng)基本相同。2、通過形成酰胺鍵或反酰胺鍵的環(huán)化通過固相法、液相法或其組合制備一種肽,該肽在序列中的兩個位點(diǎn)上帶有一種有合適的保護(hù)的氨基基團(tuán)的氨基酸殘基和一種有合適的保護(hù)的羧基基團(tuán)的氨基酸殘基,且其中的側(cè)鏈、N-端和C-端均被保護(hù)。選擇性除去氨基及羧基的保護(hù)基團(tuán)之后,該肽經(jīng)過分子間縮合反應(yīng)后再經(jīng)過有機(jī)化學(xué)反應(yīng)普通純化步驟以產(chǎn)生帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)及側(cè)鏈、N端及C端被保護(hù)的肽。再除去殘留的保護(hù)基團(tuán),獲得期望的肽。也可通過首先制備一種帶有一環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽組分再將其延伸以制備所期望的肽。2-1按照液相法通過形成酰胺鍵和反酰胺鍵的環(huán)化通過液相法制備一種肽,該肽在序列中的兩個位點(diǎn)上帶有一種有合適的保護(hù)的氨基基團(tuán)的氨基酸殘基和一種有合適的保護(hù)的羧基基團(tuán)的氨基酸殘基。在從樹脂上切除肽之前,選擇性除去氨基和羧基的保護(hù)基團(tuán),將所得具有游離氨基和羧基的肽進(jìn)行縮合反應(yīng)以產(chǎn)生帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽組分。之后從樹脂上切除該肽,除去殘留的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán),于是得到帶有一環(huán)狀結(jié)構(gòu)的所期望的肽。
      當(dāng)使用4-甲基三苯甲游基作氨基保護(hù)基團(tuán)時,該保護(hù)基團(tuán)可通過使用醋酸/三氟乙醇/DCM(1/2/7)反應(yīng)去除。反應(yīng)通常在0~40℃進(jìn)行0.5~6小時。反應(yīng)結(jié)束后,加入乙醚等沉淀肽,(如需要在減壓下)除去溶劑。必要時可使用有機(jī)化學(xué)反應(yīng)中普通純化步驟包括上述步驟。
      當(dāng)使用烯丙基氧羰基作為氨基保護(hù)基團(tuán)且使用烯丙基酯基作為羧基保護(hù)基團(tuán)時,在鈀催化劑的存在下,通過與一種還原劑反應(yīng)可以同時去除這些保護(hù)基團(tuán)。也可僅用烯丙基酯基作為羧基保護(hù)基團(tuán)。對于相同體系在反應(yīng)中可使用任何0價的鈀催化劑。合適的催化劑包括四(三苯膦)鈀(0)及醋酸三苯磷鈀(II)等。相對上述保護(hù)基團(tuán)所用催化劑的量為0.0l~1當(dāng)量,優(yōu)選為0.1~0.5當(dāng)量。以過量于上述保護(hù)基1倍的量加入添加劑,如甲酸、甲酸三乙銨、氫化三丁基錫、氫化三苯基錫、三甲基氫化硅烷、硼氫化鈉、醋酸、醋酸-NMM等。對于溶劑,可單獨(dú)或混合使用如乙醚、四氫呋喃、乙腈、DMF、氯仿等。對1mM烯丙氧羰基及烯丙基酯基中加入上述試劑和3~10ml溶劑。反應(yīng)在-20~80℃(優(yōu)選在0-30℃)進(jìn)行10分鐘至6小時。反應(yīng)結(jié)束后,應(yīng)用有機(jī)化學(xué)反應(yīng)中的一般純化步驟。
      所得到的肽經(jīng)過反應(yīng)以形成游離氨基與游離羧基之間的分子間酰胺鍵。下面描述用于環(huán)化的典型的酰胺化反應(yīng)。常見反應(yīng)條件如下。對于溶劑,單獨(dú)或混合使用如DMF、NMP、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氫呋喃等。所用肽的濃度為0.5~5000μmol/l,優(yōu)選為50~500μmol/l。反應(yīng)通常在0~40℃、優(yōu)選在4~25℃下帶攪拌進(jìn)行3小時至一周。反應(yīng)完成后,應(yīng)用有機(jī)化學(xué)反應(yīng)程序中一般純化方法。
      用如相對于羧基1~10當(dāng)量的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或水溶性碳二亞胺(WSC)等碳二亞胺進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。加入相對碳二亞胺1.5~2當(dāng)量的NMM、DIEA或碳酸氫鈉。必要時可加入相對碳二亞胺等摩爾量的HOBt或HONSu。
      也可使用相對于羧基1~10當(dāng)量的聯(lián)苯磷酰基疊氮(DPPA)或氰基磷酸二乙酯(diethyl phosphorocyanidate,DEPC)進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。加入相對于碳二亞胺的1.5-2當(dāng)量的NMM、DIEA或碳酸氫鈉。
      此外,可使用相對于羧基1~10當(dāng)量、優(yōu)選為2~5當(dāng)量的PyBOP或HBTU以及相對于PyBOP或HBTU的等摩爾的HOBt進(jìn)行酰胺化反應(yīng)。加入相當(dāng)于PyBOP或HBTU的1.5~2當(dāng)量的NMM、DIEA或碳酸氫鈉。
      也可以轉(zhuǎn)化羧基成為一種活潑酯后,選擇性去除氨基的保護(hù)基團(tuán),再形成酰胺鍵。活潑酯的例子為對硝基苯酯、五氟苯酯和N-氧琥珀酰亞胺酯等。形成活潑酯的方法有多種。例如加入相對羧基1~10當(dāng)量的DCC與等摩爾量的對硝基苯酚、五氟苯酚或HONSu后,混合物在0~5℃下攪拌1小時~1天,過濾除去所生成的二環(huán)己基尿(Dcurea)。再用有機(jī)化學(xué)反應(yīng)中一般純化步驟純化。形成活潑酯反應(yīng)中所用溶劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等與上述酰胺化反應(yīng)基本相同。2-2按照固相法形成酰胺鍵或反酰胺鍵的環(huán)化通過固相法制備一種肽,該肽在序列中的兩個位點(diǎn)上帶有一種有合適的保護(hù)的氨基基團(tuán)的氨基酸殘基或有機(jī)基團(tuán)和一種有合適的保護(hù)的羧基基團(tuán)的氨基酸殘基或有機(jī)基團(tuán)。在從樹脂上切除肽之前,選擇性除去氨基和羧基的保護(hù)基團(tuán),所得具有游離氨基和羧基的肽進(jìn)行縮合反應(yīng)以產(chǎn)生帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽組分。之后從樹脂上切除該肽,除去殘留的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán),于是得到帶有一環(huán)狀結(jié)構(gòu)的所期望的肽。
      當(dāng)使用4-甲基三苯甲游基作為氨基保護(hù)基團(tuán)時,對于50mg樹脂,該保護(hù)基可通過使用0.5-2ml醋酸/三氟乙醇/DCM(1/2/7)反應(yīng)去除。反應(yīng)通常在0~40℃進(jìn)行0.5~6小時。反應(yīng)結(jié)束后,用固相法用的常用方法處理,即用少量如DMF的溶劑清洗樹脂,再用于后續(xù)反應(yīng)。
      當(dāng)使用烯丙氧羰基作為氨基保護(hù)基團(tuán)且使用烯丙基酯基作為羧基保護(hù)基團(tuán)時,可使用如含0.1~0.2M的四(三苯膦)鈀(O)、5%醋酸和2.5%NMM的氯仿等溶液進(jìn)行反應(yīng)以除去這些保護(hù)基團(tuán)。對于1mM烯丙基氧羰基和烯丙基酯基加入上述氯仿溶液3~10ml。反應(yīng)通常在0~40℃下進(jìn)行0.5~6小時。反應(yīng)結(jié)束后,用固相法通常的處理即用少量如DMF等溶劑清洗樹脂,再用于后續(xù)反應(yīng)。
      對于50mg樹脂,使用含有相對樹脂上羧基計算量1~10當(dāng)量(優(yōu)選為2~5當(dāng)量)的PyBOP或HBTU、以相對PyBOP或HBTU等摩爾的HOBt及以相對PyBOP或HBTU的1.5~2當(dāng)量的NMM或DIEA的1ml DMF、DCM或NMP等有機(jī)溶劑進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)通常在0~40℃(優(yōu)選在4~25℃)帶攪拌進(jìn)行3小時至一周。反應(yīng)結(jié)束后,用固相法通常的處理即用少量如DMF等溶劑清洗樹脂,再用于后續(xù)反應(yīng)。
      由上述方法所得的化合物(I)可用C-4、C-8及C-18等反相硅膠柱進(jìn)行高效液相層析(HPLC)或使用分配樹脂、吸附樹脂、離子交換樹脂、硅膠、化學(xué)修飾硅膠、反相硅膠、氧化鋁、硅薄土或硅酸鎂等通過如凝膠過濾的柱層析或薄層層析進(jìn)行純化。
      化合物(I)的藥學(xué)可接受的鹽按普通方法得到。即通過在相應(yīng)的酸或有機(jī)堿的水溶液中溶解化合物(I)后冷凍干燥得到化合物(I)的酸加成鹽及有機(jī)堿加成鹽。通過用含相應(yīng)的金屬離子水溶液將化合物(I)溶解后經(jīng)凝膠過濾純化或HPLC純化后得到化合物(I)的金屬鹽。
      下面,在表2中表示化合物(I)的具體例子。
      表2

      下面描述篩選治療或者預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的化合物的方法,其包括把休眠型TGF-β加到動物細(xì)胞中后測定該細(xì)胞所結(jié)合的休眠型TGF-β的量,把休眠型TGF-β與待評價的化合物加入動物細(xì)胞后測定該細(xì)胞所結(jié)合的休眠型TGF-β的量,且根據(jù)由于添加該化合物引起結(jié)合于動物細(xì)胞的休眠型TGF-β的量的變化評價該化合物對休眠型TGF-β與細(xì)胞結(jié)合的抑制活性或者促進(jìn)活性。
      作為本發(fā)明的篩選對象,可以是合成化合物也可以是天然物質(zhì)。例如天然或者合成的肽或者向天然蛋白質(zhì)中加入酶分解得到的肽均可被評價。
      休眠型TGF-β可以用例如Okata等的方法[生物化學(xué)雜志,106,304(1987)]從動物細(xì)胞中提取并純化,或者用重組DNA技術(shù)[生物化學(xué)雜志,271,29891(1996)]所得。本發(fā)明所使用的動物細(xì)胞是可以被休眠型TGF-β結(jié)合的細(xì)胞。例如血小板,血管平滑肌細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。細(xì)胞是從如人、牛、豬、大鼠等動物中分離純化得到的,或者由上述細(xì)胞培養(yǎng)得到。細(xì)胞的分離純化方法可以用例如Okada等方法[生物化學(xué)雜志,106,304(1989)]。休眠型TGF-β與細(xì)胞的結(jié)合可以如此進(jìn)行,例如首先用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,向其加入休眠型TGF-β,培養(yǎng)后清洗該細(xì)胞,測定結(jié)合于細(xì)胞的休眠型TGF-β。
      優(yōu)選地使用如氯胺T方法等由125I標(biāo)記的休眠型TGF-β[分子與細(xì)胞生物學(xué),(Molecular&amp;Cellular Biology),2,599(1992)]。通過測定放射活性可以測定與細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量。
      另外,因為休眠型TGF-β與細(xì)胞結(jié)合之后被活化,所以要測定與細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量,可以通過測定活性型TGF-β量來進(jìn)行?;钚孕蚑GF-β的定量可以用任何一種方法進(jìn)行。例如可以直接用一種抗TGF-β抗體的酶免疫測定法[酶學(xué)方法(Methods inEnzymology),198,303(1991)],或者用安部等的[分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry),216,276(1994)]熒光素酶鑒定,或者用血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移度[細(xì)胞生物學(xué)雜志,123,1249(1993)]、血管平滑肌細(xì)胞的增殖[實驗藥物雜志(Tohoku Journal of ExperimentalMediaine),179,23(1996)]、各種癌細(xì)胞的增殖抑制[臨床研究雜志,277(1991),內(nèi)分泌學(xué),128,1981(1991)]、水貂肺上皮細(xì)胞的增殖抑制[酶學(xué)方法,198,317(1991)]等方法測定。
      比較加入和不加待評價活性的化合物時與細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量或者活性型TGF-β的量的差異,從而判斷此化合作為預(yù)防或者治療TGF-β相關(guān)疾病的藥物的可行性。目的化合物的選擇優(yōu)選地通過例如篩選當(dāng)添加濃度為1mM時比不加化合物時活性型TGF-β的量變化幅度在10%以上的化合物。
      下面再描述一種篩選治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的化合物的方法向動物細(xì)胞加入用化合物(I)來表示的肽或其藥學(xué)可接受的鹽后測定TGF-β的量;向動物細(xì)胞中加入待評價化合物和用化合物(I)表示的肽或其藥學(xué)可接受的鹽后測定TGF-β的量;且根據(jù)由于加入該化合物引起TGF-β量的變化,評價該化合物對休眠型TGF-β向TGF-β轉(zhuǎn)化的促進(jìn)活性或抑制活性。
      本發(fā)明選擇的化合物,可以是合成物也可以是天然化合物。例如可以評價天然或合成的肽以及天然蛋白質(zhì)加酶分解所得的肽。
      適于本方法的細(xì)胞是自身可分泌TGF-β的細(xì)胞。優(yōu)選這種細(xì)胞系,因為不用向?qū)嶒烍w系中加入休眠型TGF-β即可選擇期望的化合物。分泌休眠型TGF-β的細(xì)胞有血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其來自這些細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。
      可用任何方法測定活性型TGF-β的量,例如使用前述的方法。
      如本發(fā)明篩選的化合物,不僅有上述的肽,還包括全部具有能促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β的活性或具有能促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的活性的化合物。
      由本發(fā)明的篩選方法得到的化合物及化合物(I)或其藥學(xué)可接受的鹽,可用以治療或預(yù)防多種疾病。這些疾病包括癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜癥、動脈粥樣硬化、骨折、心肌梗塞、缺血再灌注后心肌紊亂、腦梗塞、視網(wǎng)膜剝離、腎小球腎炎、糖尿病性腎病、移植性腎排斥、HIV腎病、突發(fā)性肺纖維化癥、自身免疫性肺纖維化癥、肝硬化、靜脈狹窄性肝障礙(治療癌癥后容易發(fā)生)、全身性硬化癥、瘢痕疙瘩、嗜酸性粒細(xì)胞增多—肌肉痛綜合癥、血管成形術(shù)后再狹窄、眼內(nèi)纖維化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和鼻息肉等,并且,特別地優(yōu)選用作各種抗纖維化癥藥劑、抗癌藥劑及抗動脈硬化藥劑。本化合物可以原樣使用或制成各種給藥劑型。例如,把由本發(fā)明篩選方法得到的化合物及化合物(I)或其藥學(xué)可接受的鹽溶于生理鹽水、葡萄糖、乳糖、甘露糖等的水溶液就可制成適于作為注射液的藥物組合物。另外,例如可以把由本發(fā)明的篩選方法得到的化合物及化合物(I)或其藥學(xué)可接受的鹽冷凍干燥,加入NaCl制成用于注射的粉末組合物。這些藥物組合物可以根據(jù)需要含有制劑領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的添加劑,例如藥學(xué)可接受的鹽。
      另外,由本發(fā)明的篩選方法得到的化合物及化合物(I)或其藥學(xué)可接受的鹽與適當(dāng)?shù)馁x形劑、崩解劑、結(jié)合劑、潤滑劑等混合制成片劑、顆粒劑、粉劑、糖漿劑等可以用作經(jīng)口給藥的劑型。而且更進(jìn)一步地,將由本發(fā)明的篩選方法得到的化合物及化合物(I)或其藥學(xué)可接受的鹽與常用載體混合制成栓劑可以進(jìn)行直接給藥。
      有效劑量隨給藥方法、由本發(fā)明篩選方法得到的化合物及化合物(I)或其藥學(xué)可接受的鹽的種類、患者的年齡、癥狀等不同而不同。另外給藥方法也可以隨癥狀及給藥量而改變。例如由本發(fā)明的篩選方法得到的化合物及化合物(I)或其藥學(xué)可接受的鹽一日可服0.00001~100mmg/kg,優(yōu)選為0.01~10mg/kg。


      圖1是通過放射活性測定的豬血管平滑肌細(xì)胞(PSMC)內(nèi)活性型TGF-β的結(jié)合度?!叭軇毙惺翘砑硬缓囼灮衔锏娜芤旱姆派浠钚?,其他的行分別表示把各試驗化合物以100μg/ml的濃度加入時的放射活性。
      圖2是通過放射活性測定的牛血管平滑肌細(xì)胞(BSMC)內(nèi)活性型TGF-β的結(jié)合度?!叭軇毙惺翘砑硬缓囼灮衔锏娜芤旱姆派浠钚裕盁o細(xì)胞”行是向不存在細(xì)胞的培養(yǎng)皿上僅加入125I-LL TGF-β時的放射活性。其他的行分別表示把所示各試驗化合物以100μg/ml的濃度加入時的放射活性。
      圖3是根據(jù)遷移入顯微鏡視野中的細(xì)胞數(shù)計數(shù)確定對活性型TGF-β在牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)上的遷移抑制度?!叭軇毙惺翘砑硬缓囼灮衔锏娜芤簳r的細(xì)胞數(shù),其他的各行分別表示添加各試驗化合物(濃度為50μg/ml)時視野中的細(xì)胞數(shù)。
      圖4是根據(jù)遷移入顯微鏡視野中的細(xì)胞數(shù)計數(shù)確定活性型TGF-β在牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)上的遷移抑制度。“溶劑”行是添加不含試驗化合物的溶液時的細(xì)胞數(shù),其它的各行分別表示添加各試驗化合物(濃度為100μg/ml)時視野中的細(xì)胞數(shù)。
      圖5是根據(jù)遷移入顯微鏡視野中的細(xì)胞數(shù)計數(shù)確定活性型TGF-β對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)上的遷移抑制度?!叭軇毙惺翘砑硬缓囼灮衔锏娜芤簳r的細(xì)胞數(shù),其他的各行分別表示添加各試驗化合物(濃度為所示)時視野中的細(xì)胞數(shù)。
      圖6是通過熒光酶鑒定系統(tǒng)測定活性型TGF-β量時的所測發(fā)光強(qiáng)度?!癝TD”行是恒定狀態(tài)的發(fā)光強(qiáng)度,“溶劑”行是添加不含試驗化合物的溶液的發(fā)光強(qiáng)度,其它的行分別表示添加各行內(nèi)所示化合物(濃度為所示)時各自的發(fā)光強(qiáng)度。
      圖7是由圖6表示的發(fā)光強(qiáng)度換算過來的活性型TGF-β的量。各行的意義與圖6相同。
      實施此發(fā)明的最佳模式以下的實施例中,化合物的理化性質(zhì)由以下方法測定。質(zhì)譜分析是用日本電子JEOL JMS-SX102A按TAB法進(jìn)行。氨基酸分析以Bidlingmeyer B.A.等的方法[色譜雜志(Journal ofChromatograply),336,93(1984)]進(jìn)行。水解在鹽酸蒸汽中110℃下進(jìn)行22小時;所得水解物的氨基酸組成以Pico Tag氨基酸分析儀(Waters公司產(chǎn)品)進(jìn)行分析。實施例1化合物1(SEQ ID No.1)(H-Leu-Gln-Ser-Ser-Arg-His-Arg-Arg-Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Phe-Ser-Ser-Thr-Glu-Lys-Asn-Cys-OH)的合成將結(jié)合了62.5μmmol的Fmoc-Cys(Trt)的載體樹脂(Wang樹脂,123mg)裝入一種自動合成儀(ABI,430A型)按照ABI公司的合成程序以Fmoc法進(jìn)行以下操作(a)向載體樹脂加入20%哌啶-NMP溶液,攪拌混合物20分鐘,排出該溶液。
      (b)載體樹脂用NMP清洗5分鐘,排出該漂洗液。由此得到結(jié)合Cys(Trt)而無Fmoc基團(tuán)的載體樹脂。
      (c)250μmol(相當(dāng)于樹脂上氨基酸的4當(dāng)量)Fmoc-Asn(Trt)-OH與DCC、HOBt的NMP溶液攪拌50分鐘的預(yù)先制備溶液,加于樹脂,攪拌所得混合物60分鐘,排出溶液。
      (d)載體樹脂用NMP洗3分鐘。這樣,就在載體樹脂上合成Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)。
      下面,進(jìn)行(a)、(b)的脫保護(hù)和清洗步驟后在步驟(c)中使用Fmoc-Lys(Boc)-OH進(jìn)行縮合反應(yīng),接著經(jīng)過(d)的清洗步驟,合成了加在載體樹脂上的Fmoc-lys(Boc)-Asn(Trt)-Cys(Trt)。再重復(fù)步驟(a)-(d)以獲得結(jié)合了被保護(hù)的肽的載體樹脂。以下,重復(fù)過程中的步驟(c)中順次使用Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH,F(xiàn)moc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-His(irt)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH等。更加進(jìn)一步地,進(jìn)行了(a)~(b)的脫保護(hù)、清洗步驟之后,把載體樹脂用甲醇、丁醚按順序清洗后,減壓下干燥12小時,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂310.3mg。向得到的載體樹脂中加入10ml TFA(82.5%)、苯硫基甲烷(5%)、水(5%)、甲基-乙基硫胺(3%)、1,2-乙二硫醇(2.5%)以及苯硫酚(2%)組成的混合溶液,所得混合物在室溫放置8小時以除去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán),并從樹脂上切除肽鏈。通過過濾分離樹脂后,得到的濾液在減壓下濃縮至2ml,加入約10ml乙醚。離心分離、干燥后回收生成的沉淀,獲得145mg粗肽。將所得粗提物的一部分(70mg)溶于2M醋酸,再用反相柱(資生堂有限公司、CAPCELL PAKC18 30mmI.D.X25mm)以HPLC進(jìn)行純化。向1%TFA水溶液中加入含0.1%TFA的90%的乙腈水溶液,以1%線性梯度進(jìn)行洗脫,在220nm檢測以得到含化合物1的流分。把所得流分冷凍干燥得到25.5mg化合物1。質(zhì)譜分析[FABMS]m/z=270.1(M+H+)氫基酸分析Asx 3.1(3),Glx 2.1(2),Ser 5.0(5),His 1.0(1),Arg 2.9(3),Thr 2.0(2),Ala 1.0(1),Tyr 1.0(1),Leu 1.9(2),Phe 1.0(1),Lys 1.1(1),Cys 1.1(1)實施例2化合物2(SEQ ID No.2)(H-Pro-Val-leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Cys-OH)的合成用結(jié)合100μmol Fmoc-Cys(Trt)181.8mg的載體樹脂(Wang樹脂)作為起始物質(zhì),用如實施例1相同的方法,將Fmoc-Val-OH,F(xiàn)moc-His(Trt)-OH,F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH,F(xiàn)moc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH按順序進(jìn)行縮合。將縮合產(chǎn)物清洗干燥,得到568.4mg結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。用如實施例1相同的方法,切除肽的側(cè)鏈保護(hù)基并將肽從樹脂上切除,取得320mg粗肽。所得粗肽用反相柱(資生堂公司,CAPCELLPAKC18 30mmI.D.X250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到265.4mg化合物2。質(zhì)譜分析[FABMS]m/z=2870.4(M+H+)氨基酸分析Glx 3.0(3),Ser 1.1(1),His 1.0(1),Arg 3.8(4),Ala 1.1(1),Pro 0.9(1),Val 2.6(3),Leu 7.3(7),Lys 2.1(2),Cys 1.2(1)實施例3化合物3(SEQ ID No.3)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys-OH)的合成將結(jié)合33μmol Fmoc-Cys(Trt)的載體樹脂(Wang樹脂,60mg)加入島津制作所制自動合成儀PSSM-8的反應(yīng)器中,按合成步驟進(jìn)行以下操作(a)載體樹脂用500μl的DMF洗3分鐘,排出該漂洗液。(b)向載體樹脂加入30%哌啶-DMF溶液500μl,攪拌混合物4分鐘,排出該漂洗液,重復(fù)此操作一次。(c)將載體樹脂用500μl的DMF洗一分鐘,排出該漂洗液,重復(fù)此操作5次。由此得到結(jié)合Cys(Trt)而不帶有Fmoc的載體樹脂。(d)含330μmol Fmoc-Gly-OH、330μmol PyBOP、330μl HOBt一水合物、及495μmol NMM的1155μl DMF攪拌3分鐘。將得到的溶液加入載體樹脂中,混合物攪拌30分鐘,再排出溶液。(e)將載體樹脂用500μl的DMF洗1分鐘,重復(fù)此操作5次。由此,在載體樹脂上合成了Fmoc-Gly-Cys(Trt)。
      接著,進(jìn)行(a)~(c)的清洗、脫保護(hù)步驟后,通過在步驟(d)中使用Fmoc-Arg(Pmc)-OH進(jìn)行縮合反應(yīng),經(jīng)過其后(e)的清洗步驟,在載體樹脂上合成了Fmoc-Arg(Pmc)-Gly-Cys(Trt)。反復(fù)進(jìn)行(a)~(e),得到結(jié)合保護(hù)的肽的載體樹脂。以下,通過重復(fù)步驟在步驟(d)中順次使用Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OHb。隨后,(a)~(c)的清洗、脫保護(hù)步驟進(jìn)行之后,用500μl的DMF將載體樹脂洗1分鐘,反復(fù)進(jìn)行此操作五次,用甲醇、丁醚順次清洗載體樹脂,減壓下干燥12小時,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。如實施例1一樣切除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,獲得103.2mg粗肽。使用反相柱(YMC,YMC-Pack ODS-AM30mmI.D.X 250mm)以HPLC純化所得的粗肽,得到25.4mg化合物3。質(zhì)譜分析[FABMS]m/z=2648.1(M+H+)氨基酸分析Asx 1.1(1),Glx 2.1(2),Ser 1.9(2)Gly 1.1(1),Arg 2.5(3),Thr 1.8(2),Ala 1.1(1),Val 0.9(11),Met 1.0(1),Ile 3.0(3),Leu 2.1(2),Lys 3.1(3),Cys 1.2(1)實施例4化合物4(SEQ ID No.4)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)的合成以結(jié)合33μmol Fmoc-Gly的60mg載體樹脂(Wang樹脂)為起始材料,以如實施例1相同的方法,依次用Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH,F(xiàn)moc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-BU)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr-(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合。清洗、干燥縮合產(chǎn)物得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。以如實施例1相同的方法,切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,獲得115.3mg粗肽,使用反相柱(YMC、YMC-Pack ODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC純化所得的粗肽,得63.3mg化合物4。質(zhì)譜分析[FABMS]m/z=2545.1(M+H+)氨基酸分析Asx 1.1(1),Glx 2.1(2),Ser 1.9(2),Gly 1.1(1),Arg 2.6(3),Thr 1.9(2),Ala 1.1(1),Val 0.9(1),Met 0.9(1),Ile 3.0(3),Leu 2.1(2),Lys 3.0(3)實施例5化合物5(SEQ ID No.5)(H-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)的合成用結(jié)合25μmol Fmoc-Gly的51.0mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,用ACT公司的肽合成儀ACT357進(jìn)行以下操作(a)載體樹脂以1ml DMF洗30秒,排出該漂洗液。(b)向載體樹脂加入1ml 25%哌啶-DMF溶液,將混合物攪拌2分鐘,排出該漂洗液,再向載體樹脂加入1m125%哌啶-DMF溶液,將混合物攪拌10分鐘,排出該漂洗液。(c)將載體樹脂以DMF洗12秒鐘,排出該漂洗液。重復(fù)此操作7次,由此得到結(jié)合Gly而不帶Fmoc的載體樹脂。(d)向載體中加入125μl DMF,500μl含有0.25M Fmoc-Arg(Pmc)-OH和0.25M HOBt一水合物的NMP溶液,500μl含濃度為0.25M的PyBOP的DMF溶液及125μl含2.0M NMM的DMF溶液。攪拌60分鐘后,排出漂洗溶液。(e)將反應(yīng)容器用500μl DMF清洗后,以1ml的DMF帶攪拌洗30秒鐘,再次用500μl的DMF清洗,由此在載體樹脂上合成了Fmoc-Arg(Pmc)-Gly。
      然后,進(jìn)行(a)~(c)的清洗、脫保護(hù)步驟之后,在步驟(d)中用含F(xiàn)moc-Ile-OH的溶液取代Fmoc-Arg(Pmc)-OH進(jìn)行縮合反應(yīng),然后經(jīng)過清洗步驟(e)在載體樹脂上合成Fmoc-Ile-Arg(Pmc)-Gly。以下,在步驟(d)中,順次用Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu-(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH進(jìn)行縮合??s合產(chǎn)物經(jīng)過清洗干燥,得到132.5mg結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂(Wang樹脂)。以如實施例1的方法,切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,獲得58.3mg粗肽。將所得粗肽以如實施例1的方法,使用反相柱(YMC,YMC-Pack ODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC純化,得到22.6mg化合物5。質(zhì)譜分析[FAB MS]m/z=2029.2(M+H+)氨基酸分析Asx 1.0(1),Glx 2.0(2),Gly 1.0(1),Arg 3.0(3),Thr 1.0(1),Ala 1.1(1),Val 0.9(1),Met 1.1(1),Ile 2.9(3),Leu 1.1(1),Lys 2.0(2)實施例6化合物6(SEQ ID No.6)(H-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH)的合成將結(jié)合25.0μmol Fmoc-Gly的51.0mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,用如實施例5的方法,依次用Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合,縮合產(chǎn)物經(jīng)過清洗、干燥得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂112.2mg。用如實施例1的方法,切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,得到48.7mg粗肽。所得的粗肽再用1ml的TFA溶解,將其滴入50ml乙醚中,通過過濾分離生成的沉淀并干燥,得到35.5mg化合物6。質(zhì)譜分析[FAB MS]m/z=1439.0(M+H+)氨基酸分析Glx 1.1(1),Gly 1.0(1),Arg 3.0(3),Ala 1.1(1),Val 0.8(1),Ile 1.9(2),Leu 1.0(1),Lys 2.0(2)實施例7化合物7(SEQ ID No.7)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-OH)的合成以結(jié)合25.0μmol Fmoc-Ile的56.8mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,以如實施例5的方法依次用Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合。縮合產(chǎn)物經(jīng)過清洗、干燥后得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂280.9mg。以如實施例1的方法切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,獲得粗肽123.1mg。將所得粗肽使用反相柱(YMC,YMC-Pack ODS-AM 30mmI.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到26.7mg化合物7。質(zhì)譜分析[FAB MS]m/z=20/9.2(M+H+)氨基酸分析Asx 1.1(1),Glx 1.1(1),Ser 1.7(2),Arg 2.2(2),Thr 1.7(2),Val1.0(1),Met 1.0(1),Ile 2.1(2),Leu 2.1(2),Lys 3.1(3)實施例8化合物8(SEQ ID No.8)(H-Lea-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Len-Val-Lys-Arg-OH)的合成將結(jié)合25.0μmol Fmoc-Arg(Pmc)的48.1mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,以如實施例5的方法依次用Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmnoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合,縮合產(chǎn)物經(jīng)過清洗干燥得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂79.3mg。以如實施例1的方法切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,得到粗肽18.3mg。將所得粗肽,以如實施例1的方法使用反相柱(YMC、YMC-Pack ODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到4.7mg化合物8。質(zhì)譜分析[FAB MS]m/z=1621.0(N+H+)氨基酸分析Asx 1.0(1),Glx 1.1(1),Ser 1.8(2),Arg 1.1(1),Thr 1.9(2),Val 0.9(1),Met 1.0(1),Ile 1.0(1),Leu 2.1(2),Lys 2.0(2)實施例9化合物9(SEQ ID No.9)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-OH)的合成將結(jié)合125.0μmol Fmoc-Val的48.1mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,以如實施例5的方法,依次用Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合,縮合產(chǎn)物經(jīng)清洗干燥,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂120.3mg。以如實施例1的方法,切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下來,得到粗肽49.0mg。但是,此次切開所用的混合液是90%的TFA、5%1,2-乙二硫醇、5%苯硫基甲烷,加入后放置時間為2小時。然后以如實施例1的方式,使用反相柱(YMC,YMC-PackODS-AM 30mm I.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到20.2mg化合物9。質(zhì)譜分析[FAB MS]m/z=1336.7(M+H+)氨基酸分析Asx(1),Glx 1.1(1)Ser 1.8(2),Thr(2)Val1.0(1)Met1.0(1),Ile 1.0(1),Leu 2.1(2),Lys 1.0(1)實施例10化合物10(SEQ ID No.10)[H-環(huán)(Cys-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys)-OH]的合成將結(jié)合16.5μmol Fmoc-Cys(Trt)的30mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,以如實施例3的方法依次用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(PmC)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH進(jìn)行縮合??s合產(chǎn)物經(jīng)清洗干燥,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。每個氨基酸縮合反應(yīng)的時間為60分鐘。以如實施例1的方法,切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,得到粗肽54.5mg。所得粗肽以如實施例1的方法,使用反相柱(資生堂有限公司,CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到14.0mg未環(huán)化形式的化合物10。質(zhì)譜分析[FAB MS]m/z=2751.7(M+H+)將所得化合物溶于10ml的DMSO,加氨水調(diào)溶液pH為7.1,在室溫攪拌29小時。將所得溶液冷凍干燥后,再次溶于2M醋酸水溶液,冷凍干燥,得到13.5mg化合物10。質(zhì)譜分析(FAB MS]m/z=2749.5(M+H+)氨基酸分析Asx 1.2(1),Glx 2.2(2),Ser 2.0(2),Gly 1.1(1),Arg 3.0(3),Thr 2.0(2),Ala 1.1(1),Val 1.0(1),Met 1.1(1),Ile 3.1(3),Leu 2.2(2),Lys 3.1(3),Cys 1.8(2)實施例11化合物11(SEQ ID No.11)[H-Leu-Ser-Thr-環(huán)(Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys)-OH]的合成將結(jié)合16.5μmol Fmoc-Cys(Trt)的30mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,以如實施例3的方法依次用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Ser(t-Bu)-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合。縮合產(chǎn)物經(jīng)過清洗、干燥,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。每個氨基酸縮合反應(yīng)的時間是60分鐘。以如實施例1的方法切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,獲得粗肽55.2mg。將所得粗肽以如實施例1的方法,使用反相柱(資生堂制,CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到9.7mg未環(huán)化形式的化合物11。質(zhì)譜分析[FABMS]m/z=2664.5(M+H+)將所得化合物溶于10ml的DMSO,加氨水調(diào)節(jié)溶液pH為7.3,在室溫下攪拌20小時。將所得溶液冷凍干燥后再次溶于2M醋酸水溶液,進(jìn)行冷凍干燥,得到9.7mg化合物11。質(zhì)譜分析[FAB MS]m/z=2662.5(M+H+)氨基酸分析Asx 0.9(1),Glx 2.0(2),Ser 0.9(1),Gly 1.1(1),Arg 3.0(3),Thr 1.9(2),Ala 1.1(1),Val 0.9(1),Met 1.0(1),Ile 3.2(3),Leu 2.1(2),Lys 2.9(3),Cys 1.5(2)實施例12化合物12(SEQ ID No.12)[H-環(huán)(Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys)-OH]的合成以結(jié)合140μmol H-Cys(Trt)的250mg載體樹脂(Cl-Trt樹脂)作為起始材料,使用ACT公司的肽合成儀ACT357進(jìn)行以下操作。(a)將載體樹脂用2.5ml DMF洗3分鐘,排出該漂洗液。重復(fù)此操作兩次。(b)向載體樹脂加入250μl DMF、含0.5M Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.5M HO-Bt一水合物的1.4ml NMP溶液及含0.5M DIPC的1.4mlNMP溶液。攪拌40分鐘,排出溶液。(c)載體樹脂用2.5ml DMF洗1分鐘,排出該漂洗液,重復(fù)此操作2次。(d)向載體樹脂加入250μl DMF、含0.5M Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.5M HOBt一水合物的1.4ml NMP溶液、含0.5M HBTU的1.4ml DMF溶液及含2.0M DIEA的0.7ml NMP溶液。攪拌20分鐘,排出該漂洗液。(e)進(jìn)行如(c)的處理。由此在載體樹脂上合成Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt)。(f)向載體樹脂加入含25%哌啶的2.5ml DMF溶液,攪拌所得混合物2分鐘,排出該溶液。再次加入相同溶液攪拌混合物10分鐘,排出該溶液。(g)以2.5ml DMF洗載體樹脂1分鐘,排出該漂洗液,重復(fù)此操作7次。由此,得到結(jié)合Lys(Boc)-Cys(Trt)而不帶Fmoc的載體樹脂。
      然后,通過在(a)~(e)步驟中,使用含以Fmoc-Leu-OH替代Fmoc-Lys(Boc)-OH的溶液進(jìn)行縮合反應(yīng),經(jīng)過(f)和(g)的脫保護(hù)、清洗步驟,在載體樹脂上合成Leu-Lys(Boc)-Cys(Trt)。以下,重復(fù)步驟(a)~(e)依次使用Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH??s合產(chǎn)物經(jīng)過清洗、干燥,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。用得到的樹脂的4/5量,以如實施例1的方法切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,獲得粗肽137.2mg。所得的粗肽與100mg DTT溶于2ml的DMF,在50℃放置1小時后。所得溶液用如實施例1的方法,使用反相柱(資生堂CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到12.2mg帶有2個游離SH基的肽。
      質(zhì)譜分析(FABMS)m/z=2284.3(M+H+)將所得的肽溶于5ml的2M醋酸水溶液,所得溶液用水稀釋至50ml后,加入稀氨水調(diào)溶液pH為5.7。向所得混合物加入0.1M K3Fe(CN)6水溶液0.5ml,在室溫攪拌2.5小時。向反應(yīng)溶液中加入1ml醋酸后,以如實施例1的方法使用反相柱(資生堂CAPCELL PAK C18 30mmI.D.X250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到7.3mg化合物12。
      質(zhì)譜分析(FABMS)m/z=2282.5(M+H+)氨基酸分析Glx 1.0(1),Ser 1.0(1),Arg 3.9(4),Ala 1.1(1),Val0.7(1),Leu 7.2(7),Lys 2.1(2),Cys 2.7(2)實施例13化合物13(SEQ ID No.13)[生物素酰-環(huán)-(Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys)-OH]的合成用1ml的DMF洗滌由實施例12得到的1/5量的帶有側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂,洗后加入含68.4mg D-生物素(Nakalai Tesqne公司)的440μl DMF懸濁液及含0.5M DIPC的NMP溶液,室溫下攪拌2天。排出溶液后,載體樹脂經(jīng)清洗干燥,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的樹脂,該肽的N-末端被生物素酰化。以如實施例1的方法,切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂上切下,取得粗肽47.3mg。所得粗肽同50mg DDT一起溶于1ml DMF,溶液在50℃放置1小時后,所得溶液以如實施例1的方法使用反相柱(資生堂CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到11.8mg帶有2個游離SH基的肽。質(zhì)譜分析(FABMS)m/z=2510.8(M+H+)將所得肽溶于5ml 2M的醋酸水溶液。所得溶液用水稀釋至50ml后,加稀氨水調(diào)節(jié)溶液至pH5.5。向所得混合物中加入0.1M的K3Fe(CN)6水溶液0.5ml,室溫下攪拌3小時。向反應(yīng)溶液中加入1ml醋酸后以如實施例1的方法使用反相柱(資生堂CAPCELL PAK C1830mm I.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到3.8mg化合物13。質(zhì)譜分析(FABMS)m/z=2508.8(M+H+)氨基酸分析Glx 1.1(1),Ser 1.0(1),Arg 3.8(4),Ala 1.1(1),Val 0.8(1),Leu 6.8(7),Lys 2.0(2),Cys 2.1(2)實施例14化合物14(SEQ ID No.14)[H-Leu-Ser-Thr-Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Gln-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-OH]的合成將結(jié)合23μmol Fmoc-Arg(Pmc)的50mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,以如實施例3的方法依次用Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合??s合產(chǎn)物經(jīng)清洗、干燥,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。每個氨基酸縮合的反應(yīng)時間是60分鐘。以如實施例1的方法切斷側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并將肽從樹脂切下,得到59.8mg粗肽。將所得粗肽以如實施例1的方法使用反相柱(資生堂CAPCELL PAK C18 30mm I.D.X 150mm)以HPLC進(jìn)行純化,得7.7mg化合物14。
      質(zhì)譜分析(FABMS)m/z=1921.7(M+H+)氨基酸分析Asx 1.0(1),Glx 1.1(1),Ser 0.9(1),Arg 2.2(2),Thr1.6(2),Val 0.9(1),Met 1.1(1),Ile 1.0(1),Leu 2.1(2),Lys 3.1(3),Cys1.3(1)實施例15化合物15(SEQ ID No.15)[H-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH]的合成將結(jié)合23μmol Fmoc-Arg(Pmc)的50mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料以如實施例3的方法依次用Fmoc-Trp(Boc)-OH,F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH進(jìn)行縮合,縮合產(chǎn)物經(jīng)過清洗干燥,得到結(jié)合側(cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。每個氨基酸縮合的反應(yīng)時間是60分鐘。以如實施例1的方法將側(cè)鏈保護(hù)基切除并將肽從樹脂切下,除了如實施例1的混合液額外加入5mg/ml的2-甲基吲哚。另外放置時間為6小時,由此獲得粗肽20.9mg。將所得粗肽使用反相柱(資生堂CAPCELL PAK C18 30mmI.D.X 250mm)以HPLC進(jìn)行純化,得到7.8mg化合物15。質(zhì)譜分析(FABMS)m/z=2663.5(M+H+)氨基酸分析Asx 2.0(2),Glx 3.9(4),Ser 2.0(2),His 1.1(1),Arg 1.1(1),Tyr 2.2(2),Val 1.8(2),Leu 3.0(3),Lys 3.0(3)實施例16化合物16(SEQ ID No.16)[生物素-Gly-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH]的合成將結(jié)合13.8μmol Fmoc-Arg(Pmc)的30mg載體樹脂(Wang樹脂)作為起始材料,以如實施例3的方式依次用Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Gly-OH進(jìn)行縮合。預(yù)先制備的由61.9mg D-生物素、562μl含0.5M HBTU和0.5M HOBt一水合物的DMF溶液、562μl含1MDIEA的DMF組成的溶液,在室溫下攪拌5分鐘后將該溶液加入縮合產(chǎn)物,所得混合物攪拌4小時。排出溶液后產(chǎn)物經(jīng)過清洗、干燥,得到結(jié)合N-末端被生物素?;膫?cè)鏈保護(hù)的肽的載體樹脂。在氨基酸的縮合反應(yīng)步驟(d)中,以HBTU代替PyBOP,以DIEA代替NMM。以如實施例1的方法切斷側(cè)鏈保護(hù)基并從樹脂上切除肽除使用的混合液中與實施例1相比額外加入了5mg/ml的2-甲基吲哚,且放置時間為6小時,由此得到粗肽44.2mg。將其使用反相柱(資生堂CAPCELL PAKC18 30mm I.D.X 250mm)用HPLC進(jìn)行純化,得到10.3mg化合物16。質(zhì)譜分析(FABMS)m/z=3260.0(M+H+)氨基酸分析Asx 2.1(2),Glx 4.1(4),Ser 2.0(2),Gly 1.0(1),His 1.0(1),Arg 2.8(3),Tyr 2.1(2),Val 1.9(2),Leu 3.0(3),Lys 2.9(3)實施例17將化合物10轉(zhuǎn)化為醋酸鹽如實施例10方法得到的22.1mg化合物10,將其溶于5ml%醋酸水溶液,通過一種陰離子交換柱(旭化成化學(xué)工業(yè)有限公司,AsahiPack ES-502N 21.5mm I.D.X 100mm)除去TFA,將化合物轉(zhuǎn)化為醋酸鹽。用1%醋酸水溶液洗脫肽,在220nm處檢出。洗脫液冷凍干燥,得到20.0mg化合物10的醋酸鹽。實施例18將化合物12轉(zhuǎn)化為醋酸鹽如實施例12方法得到的12.5mg化合物12溶于5ml 1%醋酸溶液,將溶液通過陰離子交換柱(旭化成化學(xué)工業(yè)有限公司,Asahi Pack ES-502N 21.5mm I.D.X 100mm)除去TFA,將化合物轉(zhuǎn)化為醋酸鹽。用1%醋酸水溶液洗脫肽,在220nm處檢出。將洗脫液冷凍干燥,得到13.0mg化合物12的醋酸鹽。關(guān)于化合物(I)的生物活性及篩選方法描述于下面的實施例。實施例19通過測定TGF-β對牛血管平滑肌細(xì)胞、豬血管平滑肌細(xì)胞、牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及牛頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合度測定從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β的活性(1-1)125I-標(biāo)記LLTGF-β使用Okada等的方法[生物化學(xué)雜志,106,304(1989)],從人血小板分離純化的LLTGF-β通過氯胺T方法進(jìn)行125I標(biāo)記[分子與細(xì)胞生物學(xué),2,599(1982)]。具體操作如下
      向2μg的LLTGF-β中加入25μl 1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5),37MBq Na-125I(DuPont NEW)和10μl氯胺T(0.05M磷酸鉀緩沖液中含0.5mg/100μl,光純化學(xué)工業(yè)有限公司),室溫下攪拌40秒。加入15μl Na2S2O3(0.05M磷酸鉀緩沖液中含1mg/100μl),混合物室溫下攪拌5秒鐘后,添加100μl酪氨酸水溶液(1mg/ml)。反應(yīng)混合液通過Sephadex G25柱,每500μl洗脫液作為一個流分,用γ-計數(shù)器(ARC-2000,Alok有限公司)檢測其放射活性。選擇含有標(biāo)記蛋白的流分以供實驗之用。(1-2)細(xì)胞的準(zhǔn)備實驗所用細(xì)胞用如Sato等的方法[細(xì)胞生物學(xué)雜志,123,1249(1993)]獲得。牛血管平滑肌細(xì)胞(BSMC)和豬血管平滑肌細(xì)胞(PSMC)分別從牛大動脈和豬大動脈分離且通過外植體法[細(xì)胞生物學(xué)雜志,55,172(1971)]培養(yǎng)。牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)是從牛腎上腺毛細(xì)血管分離并培養(yǎng)的。牛頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)是從牛頸動脈分離、培養(yǎng)得到的。(1-3)TGF-β結(jié)合度的測定按照Sato等的方法[細(xì)胞生物學(xué)雜志,123,1249(1993)]進(jìn)行以下操作。
      如上述方法分離培養(yǎng)的BSMC、PSMC和BCEC分別以4×104細(xì)胞/培養(yǎng)皿的量培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿中。第二天將培養(yǎng)基換為含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基,DMEM,Nissui制藥公司),孵育5小時。用2ml含0.1g/LMgCl2·6H2O和0.1g/L CaCl2的磷酸鹽緩沖鹽水(以下以PBS(+)表示;不含MgCl2·6H2O或CaCl2的磷酸鹽緩沖鹽水記為PBS(-))將細(xì)胞清洗后,將培養(yǎng)基換為含0.1%BSA、2ng/ml125I-LLTGF-β及試驗化合物的1ml冰冷的DMEM,在4℃孵育3小時。將試驗化合物以二甲基亞砜(DMSO)溶液的形式加入,使體系中DMSO的最終濃度為0.1%。用2ml冰冷的PBS(+)洗細(xì)胞3次后,以900μl 0.5%TritonX-100裂解細(xì)胞(室溫,0.5~1小時)。取800μl裂解液,用γ-計數(shù)器測定其放射活性。
      結(jié)果以圖1、2及表3、表6顯示。表3

      表3顯示根據(jù)放射活性測定的活性型TGF-β對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)的結(jié)合度?!叭軇毙惺侵柑砑硬缓囼灮衔锏娜芤旱姆派浠钚?,“無細(xì)胞”行指向不存在細(xì)胞的培養(yǎng)板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性,其他各行分別表示將各行所示化合物以30μg/ml的濃度加入時的放射活性。表4

      表4顯示根據(jù)放射活性測定的活性型TGF-β對牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)的結(jié)合度。“溶劑”行是指添加不含試驗化合物的溶液的放射活性,“無細(xì)胞”行是向不存在細(xì)胞的培養(yǎng)板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性,其他各行分別表示各行所示化合物以100μg/ml的濃度加入時的放射活性。表5

      表5顯示根據(jù)放射活性測定的活性型TGF-β對牛頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)的結(jié)合度。“溶劑行”是添加不含試驗化合物的溶液的放射活性。“無細(xì)胞”行是向不存在細(xì)胞的培養(yǎng)板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性,其他的行分別表示各行所示化合物以100μg/ml的濃度加入時的放射活性。表6

      表6顯示根據(jù)放射活性測定的活性型TGF-β對牛頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)的結(jié)合度。“溶劑”行是加入不含試驗化合物的溶液的放射活性?!盁o細(xì)胞”行是向不存在細(xì)胞的培養(yǎng)板中只加入125I-LLTGF-β的放射活性,其他的行分別表示各行所示化合物以100μg/ml的濃度加入時的放射活性。
      如圖1、2及表3~表6所示,100μg/ml濃度的化合物1~3、5~9及13~16和30μg/ml濃度的化合物12可增加TGF-β對細(xì)胞的結(jié)合度,促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β。
      用本發(fā)明方法可以篩選促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β并使TGF-β對細(xì)胞結(jié)合度增大的化合物。實施例20通過測定牛血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移度確定從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β的活性。
      按Sato等的方法[細(xì)胞生物學(xué)雜志,123,1249(1993)],進(jìn)行以下操作。將BCEC培養(yǎng)于35mm培養(yǎng)皿中至細(xì)胞生長鋪滿,將培養(yǎng)基換為含0.1%BSA的DMEM,孵育5小時。用刮刀刮下一部分細(xì)胞,剩余細(xì)胞用PBS(-)清洗后用含試驗化合物和0.1%BSA的DMEM孵育。24小時后,在顯微鏡(IX70,Olympus)下在4個視野中對各板上遷移細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。試驗化合物以如實施例1的方式添加。結(jié)果如圖3~5所示?;衔?、5~9在50μg/ml的濃度下抑制細(xì)胞遷移,且促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β,化合物4在100μg/ml的濃度抑制細(xì)胞遷移,化合物10即使在10μg/ml的濃度下也可抑制細(xì)胞遷移。
      用本發(fā)明方法可以篩選促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β、增大TGF-β對細(xì)胞的結(jié)合度的化合物。實施例21通過熒光酶分析測定活性型TGF-β的量依Abe等的方法[分析生物化學(xué)(Analytial Biochemitry),216,276(1994)],以熒光酶分析系統(tǒng)(Promega)測定帶有在PAI-1啟動子下游導(dǎo)入熒光酶基因的水貂肺上皮細(xì)胞(MLEC)的發(fā)光確定活性型TGF-β的量。具體操作如下將BCEC培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板使之生長至鋪滿,將培養(yǎng)基換為含0.1%BSA的DMEM。6小時后,用梳子將細(xì)胞成網(wǎng)狀刮下,剩余的細(xì)胞用PBS(-)清洗后,用含0.1%BSA和試驗化合物的DMEM孵育24小時。取所得培養(yǎng)上清液作為樣品。取此培養(yǎng)上清液6小時之前向96孔培養(yǎng)板中以每孔2.8×104個細(xì)胞的量加入上述MLEC。用含有10%胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞6小時后,用上述培養(yǎng)上清液樣品取代培養(yǎng)基,培養(yǎng)16小時。用PBS(-)洗滌細(xì)胞2次后,用熒光酶分析系統(tǒng)測定活性型TGF-β濃度。結(jié)果如圖6所示。通過加入化合物3以及10釋放活性型TGF-β。特別是,化合物10即使在濃度為10μg/ml時也有明顯效果。
      根據(jù)本發(fā)明的方法可以篩選促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β以及增加TGF-β細(xì)胞的結(jié)合度。
      工業(yè)實用性本發(fā)明提供了具有通過增加休眠型TGF-β與細(xì)胞的結(jié)合促進(jìn)休眠型TGF-β活性化的活性的新肽或者其藥學(xué)可接受的鹽。
      另外,根據(jù)本發(fā)明的化合物的篩選方法,可以篩選具有促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β的活性,或者具有促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的活性的化合物。
      根據(jù)本發(fā)明的篩選方法得到的化合物或者化合物(I)或者藥學(xué)可接受的上述化合物的鹽,具有抑制或者促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞結(jié)合的活性,或者抑制或者促進(jìn)休眠型TGF-β向TGF-β轉(zhuǎn)化的活性。這些化合物可用作預(yù)防或者治療以下疾病的藥物癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜癥、動脈粥樣硬化、骨折、心肌梗塞、缺血再灌注后心肌紊亂、腦梗塞、視網(wǎng)膜脫離、腎小球腎炎、糖尿病性腎癥、腎移植排斥、HIV腎癥、突發(fā)性肺纖維化癥、自身免疫性肺纖維化癥、肝硬化、靜脈狹窄性肝障礙(癌癥治療以后多發(fā))、全身性硬化癥、瘢痕疙瘩、嗜酸性粒細(xì)胞增多—肌肉痛綜合癥、血管成形術(shù)后再狹窄、眼內(nèi)纖維化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、鼻息肉等。
      序列表(1)一般信息(i)申請人協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社(ii)發(fā)明名稱促進(jìn)休眠型TGF-β活化的肽以及調(diào)節(jié)TGF-β活性的化合物的篩選方法整理序號1060申請日1998年5月12日優(yōu)先權(quán)號平成9年專利申請?zhí)柕?20683號優(yōu)先權(quán)日平成9年5月12日(iii)序列數(shù)目34(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO1的序列描述Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Ser Phe1 5 10 15Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度24(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO2的序列描述Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Arg Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Val Glu Gln His Val Cys2025(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO3的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile Glu Ala Ile Arg Gly Cys20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO4的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile Glu Ala Ile Arg Gly20(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度17(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO5的序列描述Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度12(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO6的序列描述Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly1 5 10(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度17(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO7的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度14
      (B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO8的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg1 5 1015(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度12(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO9的序列描述Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val1 5 10(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度24(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵
      (B)位置1與24(xi)SEQ ID NO10的序列描述Cys Leu Ser Thr Ser Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys1 5 10 15Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Cys20 25(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵(B)位置4與23(xi)SEQ ID NO11的序列描述Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15Ile Glu Ala Ila Arg Gly Cys20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度19(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵(B)位置1與19(xi)SEQ ID NO12的序列描述Cys Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Arg Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Cys20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度19(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞二硫鍵(B)位置1與19(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾過的位點(diǎn)(B)位置1(C)其它信息Xaa表示Nα-生物素酰-L-Cys(xi)SEQ ID NO13的序列描述Xaa Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Arg Leu Lys1 5 10 15Leu Lys Cys20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度16(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO14的序列描述Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度21(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO15的序列描述Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser1 5 10 15Asn Asn Sar Trp Arg20(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征
      (A)長度24(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾過的位點(diǎn)(B)位置1(C)其它信息Xaa表示Nα-生物素酰-Gly(xi)SEQ ID NO16的序列描述Xaa Arg Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln1 5 10 15Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg20 25(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度391(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO17的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Pro Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
      35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser50 55 60Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr115 120 125His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Arg145 150 155 160Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser165 170 175Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp180 185 190Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp195 200 205Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys210 215 220Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe225 230 235 240Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg245 250 255Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu260 265 270Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser275 280 285Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg290 295 300Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala305 310 315 320Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln325 330 335Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser340 345 350Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val355 360 365Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile370 375 380Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser385 390(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度414(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO18的序列描述Met His Tyr Cys Val Leu Ser Ala Phe Leu Ile Leu His Leu Val Thr1 5 10 15Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe20 25 30Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu35 40 45Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro50 55 60Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu65 70 75 80Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu85 90 95Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Pro Phe Phe100 105 110Pro Ser Glu Asn Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Pro Tyr Phe Arg115 120 125Ile Val Arg Phe Asp Val Ser Ala Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu130 135 140Val Lys Ala Glu Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg145 150 155 160Val Pro Glu Gln Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp165 170 175Leu Thr Ser Pro Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr180 185 190Arg Ala Glu Gly Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val His195 200 205Glu Trp Leu His His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu210 215 220His Cys Pro Cys Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro225 230 235 240Asn Lys Ser Glu Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr245 250 255Ser Thr Tyr Thr Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys 5er Thr Arg Lys260 265 270Lys Asn Ser Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser275 280 285Tyr Arg Leu Glu Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu290 295 300Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg305 310 315 320Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His325 330 335Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr340 345 350Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn355 360 365Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp370 375 380Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile385 390 395 400Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410 415(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度412(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO19的序列描述Met Lys Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn1 5 10 15Phe Ala Thr Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe20 25 30Gly His Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu35 40 45Ser Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His50 55 60Val Pro Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu65 70 75 80Glu Glu Met His Gly Glu Arg Glu Glu Gly Cys Thr Gln Glu Asn Thr85 90 95Glu Ser Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile His Lys Phe Asp Met Ile Gln100 105 110Gly Leu Ala Glu His Asn Glu Leu Ala Val Cys Pro Lys Gly Ile Thr115 120 125Ser Lys Val Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Val Glu Lys Asn Arg Thr130 135 140Asn Leu Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Val Pro Asn Pro Ser145 150 155 160Ser Lys Arg Asn Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Arg Pro165 170 175Asp Glu His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Gly Gly Lys Asn Leu Pro180 185 190Thr Arg Gly Thr Ala Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val195 200 205Arg Glu Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser210 215 220Ile His Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu225 230 235 240Asn Ile His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu245 250 255Asp Asp His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp260 265 270His His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu275 280 285Asp Asn Pro Gly Gln Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr290 295 300Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu305 310 315 320Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro325 330 335Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg340 345 350Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu355 360 365Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu370 375 380Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln385 390 395 400Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度390(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈
      (D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO20的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Pro1 5 10 15Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser50 55 60Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Val Asp Arg Asn Asn Ala Ile Tyr Glu Lys Thr Lys Asp Ile Ser115 120 125His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Asp Ile Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Pro Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Gln Arg Leu145 150 155 160Lys Ser Ser Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn165 170 175Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Gly Asn Arg Leu Leu Thr Pro Thr Asp Thr180 185 190Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu195 200 205Asn Gln Gly Asp Gly Ile Gln Gly Phe Arg Phe Ser Ala His Cys Ser210 215 220Cys Asp Ser Lys Asp Asn Lys Leu His Val Glu Ile Asn Gly Ile Ser225 230 235 240Pro Lys Arg Arg Gly Asp Leu Gly Thr Ile His Asp Met Asn Arg Pro245 250 255Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu His260 265 270Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser275 280 285Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys290 295300Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn305 310 315 320Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr325 330 335Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala340 345 350Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr355 360 365Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val370 375 380Arg Ser Cys Lys Cys Ser385 390(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度414(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO21的序列描述Met His Tyr Cys Val Leu Ser Thr Phe Leu Leu Leu His Leu Val Pro1 5 10 15Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe20 25 30Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu35 40 45Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Asp Glu Val Pro50 55 60Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu65 70 75 80Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Sar Glu Gln85 90 95Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Ser His Leu100 105 110Pro Ser Glu Asn Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Pro Tyr Phe Arg115 120 125Ile Val Arg Phe Asp Val Ser Thr Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu130 135 140Val Lys Ala Glu Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg145 150 155 160Val Ala Glu Gln Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp165 170 175Leu Thr Ser Pro Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr180 185 190Arg Ala Glu Gly Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val Gln195 200 205Glu Trp Leu His His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu210 215 220His Cys Pro Cys Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro225 230 235 240Asn Lys Ser Glu Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr245 250 255Ser Thr Tyr Ala Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys260 265 270Lys Thr Ser Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser275 280 285Tyr Arg Leu Glu Ser Gln Gln Ser Ser Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu290 295 300Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg305 310 315 320Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His325 330 335Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr
      340 345 350Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Thr Lys Val Leu Ser Leu Tyr Asn355 360 365Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp370 375 380Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Asn Thr Pro Lys Ile385 390 395 400Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410 415(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度410(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO22的序列描述Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn Leu Ala1 5 10 15Thr Ile Ser Leu Ser Leu Ser Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe Gly His20 25 30Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys35 40 45Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Ser Val Met Thr His Val Pro50 55 60Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu Glu Glu65 70 75 80Met His Gly Glu Arg Glu Glu Gly Cys Thr Gln Glu Thr Ser Glu Ser
      85 90 95Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile His Lys Phe Asp Met Ile Gln Gly Leu100 105 110Ala Glu His Asn Glu Leu Ala Val Cys Pro Lys Gly Ile Thr Ser Lys115 120 125Val Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Val Glu Lys Asn Gly Thr Asn Leu130 135 140Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Val Pro Asn Pro Ser Ser Lys145 150 155 160Arg Thr Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Arg Pro Asp Glu165 170 175His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Gly Gly Lys Asn Leu Pro Thr Arg180 185 190Gly Thr Ala Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val Arg Glu195 200 205Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser Ile His210 215 220Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu Asn Val225 230 235 240His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu Asp Asp245 250 255His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp His His260 265 270Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu Asp Ser275 280 285Pro Gly Gln Gly Ser Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr290 295 300Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile305 310 315 320Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly325 330 335Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala340 345 350Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro355 360 365Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu370 375 380Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser385 390 395 400Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度390(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO23的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Pro1 5 10 15Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser50 55 60Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Val Asp Arg ASn Asn Ala Ile Tyr Asp Lys Thr Lys Asp Ile Thr115 120 125His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Asp Ile Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Pro Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Gln Arg Phe145 150 155 160Lys Ser Thr Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn165 170 175Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Gly Asn Arg Leu Leu Thr Pro Thr Asp Thr180 185 190Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu195 200 205Asn Gln Gly Asp Gly Ile Gln Gly Phe Arg Phe Ser Ala His Cys Ser210 215 220Cys Asp Ser Lys Asp Asn Val Leu His Val Glu Ile Asn Gly Ile Ser225 230 235 240Pro Lys Arg Arg Gly Asp Leu Gly Thr Ile His Asp Met ASn Arg Pro245 250 255Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu His260 265 270Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser275 280 285Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys290 295 300Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn305 310 315 320Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr325 330 335Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala340 345 350Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr355 360 365Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val370 375 380Arg Ser Cys Lys Cys Ser385 390(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度412(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO24的序列描述Met Lys Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn1 5 10 15Leu Ala Thr Val Sar Leu Ser Leu Ser Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe
      20 25 30Gly His Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu25 40 45Ser Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Ser Val Met Thr His50 55 60Val Pro Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu65 70 75 80Glu Glu Met His Gly Glu Arg Glu Glu Gly Cys Thr Gln Glu Thr Ser85 90 95Glu Ser Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile His Lys Phe Asp Met Ile Gln100 105 110Gly Leu Ala Glu His Asn Glu Leu Ala Val Cys Pro Lys Gly Ile Thr115 120 125Ser Lys Val Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Val Glu Lys Asn Gly Thr130 135 140Asn Leu Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Val Pro Asn Pro Ser145 150 155 160Ser Lys Arg Thr Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Arg Pro165 170 175Asp Glu His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Gly Gly Lys Asn Leu Pro180 185 190Thr Arg Gly Thr Ala Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val195 200 205Arg Glu Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser210 215 220Ile His Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu225 230 235 240ASn Val His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu245 250 255Asp Asp His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp260 265 270His His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu275 280 285Asp Ser Pro Gly Gln Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr290 295 300Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu305 310 315 320Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro325 330 335Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg340 345 350Ser Ser Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu355 360 365Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu370 375 380Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln385 390 395 400Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度315(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO25的序列描述Ala Ile Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu1 5 10 15Ser Ala Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu20 25 30Val Thr Arg Val Leu Met Val Glu Tyr Gly Asn Lys Ile Tyr Asp Lys35 40 45Met Lys Ser Ser Ser His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu50 55 60Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Asp Val65 70 75 80Arg Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr85 90 95Gln Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu100 105 110Ala Pro Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val115 120 125Val Arg Gln Trp Leu Thr Arg Arg Glu Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu130 135 140Ser Ala His Cys Ser Cys Asp Ser Lys Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp145 150 155 160Ile Asn Gly Phe Ser Ser Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His165 170 175Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg180 185 190Ala Gln His Leu His Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn195 200 205Tyr Cys Phe Ser Sar Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr210 215 220Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys225 230 235 240Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser245 250 255Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn260 265 270Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro275 280 285Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu290 295 300Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser305 310 315(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度390(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO26的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser50 55 60Gln Gly Asp Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Val Glu Pro Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Leu Glu Ser Cly Asn Gln Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gly Thr Pro115 120 125His Ser Leu Tyr Met Leu Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu145 150 155 160Lys Leu Lys Val Glu Gln His VAl Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn165 170 175Asp Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser180 185 190Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu195 200 205Thr Arg Arg Glu Ala Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser210 215 220Cys Asp Ser Lys Asp Asn Thr Leu His Val Glu Ile Asn Gly Phe Asn225 230 235 240Ser Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro245 250 255Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu His260 265 270Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser275 280 285Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys290 295 300Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn305 310 315 320Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr32S 330 335Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala340 345 350Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr355 360 365Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val370 375 380Arg Ser Cys Lys Cys Ser385390(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度409(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO27的序列描述Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ser Leu Ser Met Ser Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe Asp His20 25 30Ile Lys Arg Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys35 40 45Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Asp Pro Ser Met Leu Ala Asn Ile Pro50 55 60Thr Gln Val Leu Asp Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu Glu Glu65 70 75 80Val His Gly Glu Arg Gly Asp Asp Cys Thr Gln Glu Asn Thr Glu Ser85 90 95Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile Tyr Lys Phe Asp Met Ile Gln Gly Leu100 105 110Glu Glu His Asn Asp Leu Ala Val Cys Pro Lys Gly Ile Thr Ser Lys115 120 125Ile Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Val Glu Lys Asn Glu Thr Asn Leu130 135 140Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Met Pro Asn Pro Ser Ser Lys145 150 155 160Arg Ser Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Gln Pro Asp Glu165 170 175His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Asp Gly Lys Asn Leu Pro Thr Arg180 185 190Gly Ala Ala Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val Arg Glu195 200 205Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser Ile His210 215 220Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu ASn Ile225 230 235 240Gln Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Ser Glu Asp Asp245 250 255Pro Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Lys Lys Glu His Ser260 265 270Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro Asp Arg Leu Asp Asn Pro275 280 285Gly Leu Gly Ala Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys290 295 300Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp305 310 315 320Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr325 330 335Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp340 345 350Thr Thr His Ser Ser Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu355 360 365Ala Ser Ala Sar Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr370 375 380Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Ala Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn385 390 395 400Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度390(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO28的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Arg Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ser Ser Pro Pro Ser50 55 60Gln Gly Glu Val Pro Pro Val Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Val Glu Asn Thr Asn Lys Ile Tyr Glu Lys Val Lys Lys Ser Pro115 120 125His Ser Ile Tyr Met Leu Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu145 150 155 160Lys Leu Lys Ala Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn165 170 175Asp Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Thr180 185 190Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu195 200 205Ser His Gly Gly Glu Val Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser210 215 220Cys Asp Ser Lys Asp Ash Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Ser225 230 235 240Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro245 250 255Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu His260 265 270Ser Ser Arg Gln Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser275 280 285Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys290 295 300Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn305 310 315 320Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr325 330 335Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala340 345 350Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr355 360 365Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val370 375 380Arg Ser Cys Lys Cys Ser385390(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度390(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO29的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Trp Leu Leu Met Leu Thr Pro Gly Arg Pro Val Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Gly Ile Glu Ala35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser50 55 60Gln Gly Asp Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Ile Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Thr Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Val Glu Tyr Gly Asn Lys Ile Tyr Asp Lys Met Lys Ser Ser Ser115 120 125His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Asp Val Arg Leu Leu Arg Leu145 150 155 160Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn165 170 175Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser180 185 190Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu195 200 205Thr His Arg Glu Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser210 215 220Cys Asp Ser Lys Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Ser225 230 235 240Ser Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro245 250 255Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu His260 265 270Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser275 280 285Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys290 295 300Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn305 310 315 320Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr325 330 335Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala340 345 350Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr355 360 365Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val370 375 380Arg Ser Cys Lys Cys Ser385 390(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度412(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO30的序列描述Met His Cys Tyr Leu Leu Ser Val Phe Leu Thr Leu Asp Leu Ala Ala1 5 10 15Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe20 25 30Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu35 40 45Lys Leu Thr Ser Pro Pro Asp Glu Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro50 55 60Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu65 70 75 80Lys Ala Asn His Arg Ala Ala Thr Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu85 90 95Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Gln Pro Phe Tyr100 105 110Pro Glu Asn Ala Ile Pro Pro Ser Tyr Tyr Ser Leu Tyr Phe Arg Ile115 120 125Val Arg Phe Asp Val Ser Ala Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu Val130 135 140Lys Ala Glu Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Ser Lys Ala Arg Val145 150 155 160Ser Glu Gln Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Val Leu Lys Ser Lys Glu Leu165 170 175Ser Ser Pro Gly Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr Arg180 185 190Ala Glu Gly Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Glu Ala Val His Glu195 200 205Trp Leu His His Arg Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu His210 215 220Cys Pro Cys Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro Asn225 230 235 240Lys Ser Glu Glu Pro Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Asp Tyr Thr245 250 255Tyr Ser Ser Gly Asp Val Lys Ala Leu Lys Ser Asn Arg Lys Lys Tyr260 265 270Ser Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser Tyr Arg275 280 285Leu Glu Ser Gln Gln Pro Ser Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Ala290 295 300Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu305 310 315 320Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro325 330 335Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp340 345 350Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile355 360 365Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu Glu370 375 380Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln385 390 395 400Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長度412(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO31的序列描述Met Lys Met Tyr Ala Gln Arg Ala Leu Val Leu Leu Ser Leu Leu Ser1 5 10 15Phe Ala Thr Val Ser Leu Ala Leu Ser Ser Cys Thr Thr Leu Asp Leu20 25 30Glu His Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu35 40 45Ser Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Ser Val Gly Pro Ala His50 55 60Val Pro Tyr Gln Ile Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu65 70 75 80Glu Glu Met Glu Glu Glu Lys Glu Glu Ser Cys Ser Gln Glu Asn Thr85 90 95Glu Ser Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile His Lys Phe Asp Met Ile Gln
      100 105 110Gly Leu Pro Glu His Asn Glu Leu Gly Ile Cys Pro Lys Gly Val Thr115 120 125Ser Asn Val Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Ala Glu Lys Asn Ser Thr130 135 140Asn Leu Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Val Pro Asn Pro Ser145 150 155 160Ser Lys Arg Ser Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Arg Pro165 170 I75Asp Glu His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Arg Asn Val Gln180 185 190Thr Arg Gly Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val195 200 205Arg Glu Trp Leu Leu His Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser210 215 220Ile His Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu225 230 235 240Asn Leu His Glu Val Leu Glu Ile Lys Phe Lys Gly Ile Asp Ser Glu245 250 255Asp Asp Tyr Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp260 265 270Leu His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Leu Pro Pro His Arg Leu275 280 285Glu Ser Pro Thr Leu Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr290 295 300Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu305 310 315 320Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro325 330 335Lys Gly Tyr Phe Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg340 345 350Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu355 360 365Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu370 375 380Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln385 390 395 400Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser405 410(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長度373(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO32的序列描述Ala Leu Ser Thr Cys Gln Arg Leu Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Lys1 5 10 15Arg Ile Glu Ala Val Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Thr20 25 30Ala Pro Pro Pro Ala Ser Glu Thr Pro Pro Arg Pro Leu Pro Asp Asp35 40 45Val Arg Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Gln Glu Leu Leu Lys Gln Arg Ala50 55 60Arg Leu Arg Pro Pro Pro Asp Gly Pro Asp Glu Tyr Trp Ala Lys Glu65 70 75 80Leu Arg Arg Ile Pro Met Glu Thr Thr Trp Asp Gly Ala Met Glu His85 90 95Trp Gln Pro Gln Ser His Ser Ile Phe Phe Val Phe Asn Val Ser Arg100 105 110Ala Arg Arg Gly Gly Arg Pro Thr Leu Leu His Arg Ala Glu Leu Arg115 120 125Met Leu Arg Gln Lys Ala Ala Ala Asp Ser Ala Gly Thr Glu Gln Arg130 135 140Leu Glu Leu Tyr Gln Gly Tyr Gly Asn Ala Ser Trp Arg Tyr Leu His145 150 155 160Gly Arg Ser Val Arg Ala Thr Ala Asp Asp Glu Trp Leu Ser Phe Asp165 170 175Val Thr Asp Ala Val His Gln Trp Leu Ser Gly Ser Glu Leu Leu Gly180 185 190Val Phe Lys Leu Ser Val His Cys Pro Cys Glu Met Gly Pro Gly His195 200 205Ala Glu Glu Met Arg Ile Ser Ile Glu Gly Phe Glu Gln Gln Arg Gly210 215 220Asp Met Gln Ser Ile Ala Lys Lys His Arg Arg Val Pro Tyr Val Leu225 230 235 240Ala Met Ala Leu Pro Ala Glu Arg Ala Asn Glu Leu His Ser Ala Arg245 250 255Arg Arg Arg Asp Leu Asp Thr Asp Tyr Cys Phe Gly Pro Gly Thr Asp260 265 270Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp275 280 285Leu Gln Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Met Ala Asn Phe290 295 300Cys Met Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Ala Asp Thr Gln Tyr Thr305 310 315 320Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala325 330 335Pro Cys Cys Val Pro Gln Thr Leu Asp Pro Leu Pro Ile Ile Tyr Tyr340 345 350Val Gly Arg Asn Val Arg Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Arg355 360 365Ala Cys Lys Cys Ser370(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長度390(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO33的序列描述Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr20 25 30Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Thr35 40 45Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
      50 55 60Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu85 90 95Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu100 105 110Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr115 120 125His Ser Ile Tyr Mer Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val130 135 140Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu145 150 155 160Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn165 170 175Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asn Ser180 185 190Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu195 200 205Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser210 215 220Cys Asp Ser Lys Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr225 230 235 240Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro245 250 255Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln260 265 270Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser275 280 285Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys290 295 300Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn305 310 315 320Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr325 330 335Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala340 345 350Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr355 360 365Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val370 375 380Arg Ser Cys Lys Cys Ser385 390(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長度382(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO34的序列描述Met Glu Val Leu Trp Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu His Leu Ser1 5 10 15Ser Leu Ala Met Ser Leu Ser Thr Cys Lys Ala Val Asp Met Glu Glu20 25 30Val Arg Lys Arg Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys35 40 45Leu Lys Leu Asp Lys Thr Pro Asp Val Asp Ser Glu Lys Met Thr Val50 55 60Pro Ser Glu Ala Ile Phe Leu Tyr Asn Ser Thr Leu Glu Val Ile Arg65 70 75 80Glu Lys Ala Thr Arg Glu Glu Glu His Val Gly His Asp Gln Asn Ile85 90 95Gln Asp Tyr Tyr Ala Lys Gln Val Tyr Arg Phe Glu Ser Ile Thr Glu100 105 110Leu Glu Asp His Glu Phe Lys Phe Lys Phe Asn Ala Ser His Val Arg115 120 125Glu Asn Val Gly Met Asn Ser Leu Leu His His Ala Glu Leu Arg Met130 135 140Tyr Lys Lys Gln Thr Asp Lys Asn Met Asp Gln Arg Met Glu Leu Phe145 150 155 160Trp Lys Tyr Gln Glu Asn Gly Thr Thr His Ser Arg Tyr Leu Glu Ser165 170 175Lys Tyr Ile Thr Pro Val Thr Asp Asp Glu Trp Met Ser Phe Asp Val180 185 190Thr Lys Thr Val Asn Glu Trp Leu Lys Arg Ala Glu Glu Asn Glu Gln195 200 205Phe Gly Leu Gln Pro Ala Cys Lys Cys Pro Thr Pro Gln Ala Lys Asp210 215 220Ile Asp Ile Glu Gly Phe Pro Ala Leu Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu225 230 235 240Ser Ser Lys Glu Asn Thr Lys Pro Tyr Leu Met Ile Thr Ser Met Pro
      245 250 255Ala Glu Arg Ile Asp Thr Val Thr Ser Ser Arg Lys Lys Arg Gly Val260 265 270Gly Gln Glu Tyr Cys Phe Gly Asn Asn Gly Pro Asn Cys Cys Val Lys275 280 285Pro Leu Tyr Ile Asn Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His290 295 300Glu Pro Lys Gly Tyr Glu Ala Asn Tyr Cys Leu Gly Asn Cys Pro Tyr305 310 315 320Ile Trp Ser Met Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ser Leu Tyr Asn325 330 335Gln Asn Asn Pro Gly Ala Ser Ile Ser Pro Cys Cys Val Pro Asp Val340 345 350Leu Glu Pro Leu Pro Ile Ile Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Ala Lys Val355 360 365Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Arg Ser Cys Asn Cys Ser370 375 380
      權(quán)利要求
      1.具有促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β或具有促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的活性的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽。
      2.如權(quán)利要求1的一種肽或者其藥學(xué)可接受的鹽,其中該肽由通式(I)表示R1-A-R2(I)(其中R1為H、取代或未取代的鏈烷?;⑷〈蛭慈〈姆减;?、取代或未取代的雜芳羰基、取代或未取代的烷氧羰基、或者取代或未取代的芳氧羰基、取代或未取代的雜芳氧羰基;R2為羥基、取代或未取代的烷氧基、或者取代或未取代的氨基;且A為選自TGF-β前體序列的部分序列的一種氨基酸序列,其中該序列中1-5個氨基酸可以被缺失、取代或添加;且選自序列內(nèi)包括N末端及C末端氨基酸殘基中的任意二個氨基酸殘基之間、N端氨基或側(cè)鏈氨基與C端羧基或側(cè)鏈羧基之間可以形成一種用CO-NH表示的酰胺鍵,或一種由NH-CO表示的反酰胺鍵,或側(cè)鏈的巰基可形成一種二硫鍵)。
      3.如權(quán)利要求2的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽,其中A是一種選自人TGF-β1前體序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的一種氨基酸序列的部分序列的氨基酸序列,以及當(dāng)與人TGF-β1前體序列進(jìn)行序列比較時除去人TGF-β1序列之外的TGF-β前體序列中相應(yīng)于人TGF-β1前體序列的氨基酸序列30-60、142-186及269-297的氨基酸序列,且在該部分序列中1-5個氨基酸可以被缺失、取代或添加。
      4.如權(quán)利要求2的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽,其中A是一種選自人TGF-β1前體序列中氨基酸序列30-60、142-186及269-297的一種氨基酸序列的部分序列的氨基酸序列,以及當(dāng)與人TGF-β1序列進(jìn)行比較時除去人TGF-β1序列之外的TGF-β前體序列中相應(yīng)于人TGF-β1前體序列的氨基酸序列30-60、142-186及269-297的氨基酸序列。
      5.如權(quán)利要求2的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽,其中A為選自SEQ ID No.1~16中的一種氨基酸序列,該序列的1~5個氨基酸殘基可以被缺失、取代或添加。
      6.如權(quán)利要求2的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽,其中A為選自SEQ ID No.1~16中的一種氨基酸序列。
      7.篩選用于治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的化合物的一種方法,其包括向動物細(xì)胞添加休眠型TGF-β后測定與該細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量;向該細(xì)胞添加休眠型TGF-β和待評價的化合物后測定與該細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量;以及從由于添加該化合物引起的與動物細(xì)胞結(jié)合的休眠型TGF-β的量的改變來評價該化合物對休眠型TGF-β與細(xì)胞接合的抑制活性或促進(jìn)活性。
      8.如權(quán)利要求7的一種方法,其中所述的動物細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
      9.如權(quán)利要求7或8的一種方法,其中評價了所述化合物對休眠型TGF-β與動物細(xì)胞結(jié)合的促進(jìn)活性。
      10.篩選用于治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的化合物的一種方法,其包括向動物細(xì)胞添加如權(quán)利要求1-6中任一項的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽后測定TGF-β的量;向動物細(xì)胞添加待評價的化合物及如權(quán)利要求1-6中任一項的一種肽或其藥學(xué)可接受的鹽后測定TGF-β的量;以及從由于添加該化合物引起的TGF-β的量的改變來評價該化合物對休眠型TGF-β向TGF-β轉(zhuǎn)化的抑制活性或促進(jìn)活性。
      11.如權(quán)利要求10的一種方法,其中所述的動物細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
      12.如權(quán)利要求10或11的一種方法,其中評價了所述化合物對休眠型TGF-β向TGF-β轉(zhuǎn)化的抑制活性。
      13.用于治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的一種化合物或其藥學(xué)可接受的鹽,其通過如權(quán)利要求7-12中任一項的方法篩選。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了由下面的通式(Ⅰ)表示的肽,其具有促進(jìn)從休眠型TGF-β中釋放活性型TGF-β或具有促進(jìn)休眠型TGF-β與細(xì)胞膜結(jié)合的活性;本發(fā)明也提供了通過鑒定上述活性篩選用于治療或預(yù)防TGF-β相關(guān)疾病的化合物的方法;以及由這種方法獲得的化合物。上述這些化合物和肽可用于治療或預(yù)防諸如癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜癥、動脈粥樣硬化等疾病。通式(Ⅰ):R
      文檔編號C07K14/435GK1226898SQ9880062
      公開日1999年8月25日 申請日期1998年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月12日
      發(fā)明者山崎基生, 柴田健志, 佐藤靖史 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
      1