專利名稱：白細胞介素－11的衍生物及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領域中的重組蛋白質(zhì)藥物。
白細胞介素11(Interleukin11，簡稱IL-11)是人體內(nèi)分泌的一類重要細胞因子，它作用于骨髓細胞中原始的造血干細胞，促進巨核細胞成熟，增加血小板數(shù)目，促進血小板再生。重組白細胞介素11于1997年11月由美國FDA批準上市，成為治療癌癥病人經(jīng)放、化療后血小板數(shù)降低的唯一藥物。
目前，用基因工程方法生產(chǎn)IL-11是唯一有效的途徑。但重組野生型IL-11在大腸桿菌中表達時遇到很大的困難，即游離的完整的IL-11不能直接在大腸桿菌中表達。這是因為完整的IL-11cDNA5’端GC含量特別豐富，尤其是前8個氨基酸中有6個脯氨酸，嚴重地阻礙了完整的IL-11直接表達。為了表達IL-11，只能用隔合蛋白的表達方法。這樣一來又造成了融合蛋白需要酶切的困難，產(chǎn)生了諸如切割用專一蛋白酶價格昂貴及異源蛋白污染等問題。
本發(fā)明的目的是用基因工程中最常用的大腸桿菌表達系統(tǒng)直接表達游離的IL-11。在保證IL-11的生物學活性不變的前提下，發(fā)明出具有表達量高、純化工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉的新型重組白細胞介素11及其制備方法。
本發(fā)明的原理我們試驗中發(fā)現(xiàn)，在野生型IL-11cDNA5’端缺失一部分氨基酸，從而降低GC含量和脯氨酸數(shù)目，可以提高IL-11的表達。當IL-11N端缺的氨基酸數(shù)目從1個增加至8個時，游離IL-11的表達量從無到有并且逐步增加，而表達產(chǎn)物的生物學活性與野生型IL-11相比則基本不變。同樣，若以蘇氨酸和蛋氨酸取代IL-11前8個氨基酸中的脯氨酸或甘氨酸，表達效果與缺失氨基酸相同。這樣，便可通過缺失N端幾個氨基酸或用蘇氨酸取代脯氨酸和甘氨酸來達到在大腸桿菌中直接表達游離的IL-11。
經(jīng)上述改造轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)用菌種，在發(fā)酵表達結(jié)束后，經(jīng)收菌--菌體破碎--固液分離--分子篩層析--離子交換層析等純化步驟，即可制得純度大于95％，比活性達到8×106IU/mg的具有相同于野生型IL-11生物活性的新型重組白細胞介素11。
最佳實施例在構(gòu)建新型重組IL-11的克隆過程中，其N端比野生型的IL-11缺失前5個氨基酸(Pro-Gly-Pro-Pro-Pro)，且第6-8個氨基酸換成Met-Thr-Thr，其余的氨基酸序列與野生型的IL-11相同。上述改造的IL-11cDNA放在表達載體PBV220中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，用溫控誘導的方式可以直接表達產(chǎn)生游離的IL-11，表達水平達20％。游離表達的IL-11是以可溶狀態(tài)存在于大腸桿菌的細胞漿中，且具天然活性，這一優(yōu)勢可以免去包涵體形式的蛋白所需的變性、復性及異構(gòu)體分離等問題，從而大大簡化了純化工藝及降低了IL-11的生產(chǎn)成本。
表達和制備方法如下在菌種平板上挑取一單菌落，接種于2mlLBA培養(yǎng)基中(LBA每升含10g蛋白胨，5g酵母膏，5gNaCl，60mg氨芐青霉素，PH7.0)30℃培養(yǎng)過夜作為種子，按1％的接種量接種于50mlLBA中，30℃生長至0D600=0.5時，迅速升溫至42℃誘導表達4小時，離心收獲菌體。將菌體懸浮在50mMPB(Na2HPO4+NaH2PO4，PH8.0)緩沖液中，超聲破碎菌體，20000g×20分鐘離心，取上清。上清過分子篩SephacrylS-200凝膠層析純化，上樣量為柱體積的1-5％，20mMPB、PH8.0緩沖液洗脫，收集IL-11富集峰。再用陽離子交換柱CM-Sepharose進一步純化，用0-1MNaCl、20mMPB、PH8.0線性梯度洗脫，在0.25MNaCl左右濃度處洗下IL-11活性峰。SDS-PAGE電泳分析表明，得到的IL-11純度大于95％，比活性達8×106IU/mg。通過上述方法，可以得到高純度、高比活性的新型重組IL-11。
本發(fā)明提供了一種新的表達和制備IL-11的方法，與世界上唯一生產(chǎn)IL-11的美國Genetics Institute生產(chǎn)工藝相比具有如下特點①表達水平高，本發(fā)明的游離IL-11表達水平達20％，而G·I·公司的IL-11表達水平只相當于5％；②不需要切割用專一蛋白酶，而G·I·公司的工藝需用價格昂貴的enterokinase來切割融合蛋白；③極少的異源蛋白污染，而G·I·公司的工藝中存在著融合蛋白前導肽和加入eterokinase的異源蛋白污染問題；④生產(chǎn)工藝簡單且成本低廉。上述優(yōu)勢使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性和工藝先進性，使之更適合于工業(yè)化生產(chǎn)且經(jīng)濟實用。
權(quán)利要求
1．白細胞介素-11的衍生物，其特征在于該IL-11的cDNA在野生型的IL-11 cDNA的N端缺失1-8個氨基酸或N端1-8個氨基酸被其它氨基酸取代。
2．白細胞介素-11的衍生物的制備工藝，其特征在于經(jīng)大腸桿菌發(fā)酵--溫度誘導表達--收菌--菌體破碎--固液分離--分子篩層析--離子交換層析等步驟完成。
3．如權(quán)利要求2所述的固液分離，其特征在于用離心方法分離，工藝參數(shù)為15000g～25000g，離心時間是10～30分鐘。
4．如權(quán)利要求2所述的分子篩層析，其特征在于采用S-100或S-200、S-300 Sephacryl凝膠柱層析，上樣量為柱體積的1-5％，洗脫緩沖液是10～30mMPB(PBNa2HPO4+NaH2PO4、PH6～9)。
5．如權(quán)利要求2所述的離子交換層析，其特征在于采用CM-Sepharose陽離子交換柱，洗脫條件是0-1MNaCl，PH7～10，線性梯度洗脫，最佳洗脫濃度是NaCl200～300mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組白細胞介素11及其制備方法,該IL－11的cDNA是在野生型IL－11的cDNA的N端缺失1—8個氨基酸或N端1—8個氨基酸被其它氨基酸取代。改造后的cDNA放在表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后能直接表達產(chǎn)生游離的IL－11,與野生型IL－11具有相同的生物學活性。經(jīng)收菌—菌體破碎—固液分離—分子篩層析—離子交換層析等步驟,可制得高純度、高比活的新型重組IL－11用于治療血小板數(shù)低的病人。本發(fā)明的特點是:①直接表達游離IL－11,表達水平達20%以上;②純化工藝簡單;③極少的異源蛋白污染;④生產(chǎn)成本低廉。
文檔編號C07K14/55GK1280983SQ9911232
公開日2001年1月24日 申請日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者王革, 鄒明富 申請人:王革, 鄒明富