專利名稱：微生物生物轉(zhuǎn)化法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用微生物生物轉(zhuǎn)化法對特定藥物中間體化合物O-去甲基化。更具體地，其涉及利用特定微生物以對特定藥物中間體化合物O-去甲基化。
分析化學學報(Analytica Chimica Acta)(1990)233，199-98中的一篇文章涉及利用雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans)對特定正丙基去甲阿樸啡化合物去甲基化。
生物醫(yī)藥與環(huán)境質(zhì)譜(Biomedical and Enviromental MassSpectrometry)(1986)13，223-229涉及利用雅致小克銀漢霉制備N-正丙基去甲阿樸嗎啡的潛在代謝物。
在酶及微生物技術(Enzyme and Microbial Technology)(1984)6，242-253中公開的一篇綜述性文章的第250-252頁，廣泛綜述了特定微生物的用途，例如利用真菌，諸如小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、曲霉屬(Aspergillus)、Thamnostylum、青霉屬(Penicillium)和瘤孢屬(Sepedonium)的種類以對特定化合物O-去烷基化。
在H.G.Davies等人的《制備有機化學中的生物轉(zhuǎn)化法》第5.5章黃瘤孢(Sepedonium chrysospermum)和雅致小克銀漢霉對包括文朵靈和10，11-二甲氧基阿樸啡的特定化合物去甲基化。
在植物化學(Phytochemistry)(1997)44(8)，1479-1482中的一篇文章涉及了黑曲霉(Aspergillus niger)由(±)-桉素的O-去甲基化制備(-)-松脂酚。
1997年4月18日授權的美國專利5,618,707涉及利用Zygosaccharomyces bailii ATCC 38924以將戊酸化合物立體選擇性還原為苯基噁唑烷酮產(chǎn)物。
美國專利5,580,764涉及利用來自植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、甲蟲畢赤酵母(Pichia haplophila)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、Lactobacillus buchmans、黃曲霉(Aspergillus flavus)和粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的氧化/還原酶以還原在碳酸酐酶抑制劑合成中的中間體。


圖1-4顯示利用3種真菌培養(yǎng)物進行微生物法生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的高壓液相層析曲線。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種由式(II)的化合物制備
式(I)化合物的工藝，包括在一種來自單孢霉屬(Monosporium)的
微生物培養(yǎng)物的酶存在下，選擇性地將式(II)的化合物去甲基。
優(yōu)選的工藝中所述微生物是Monosporium olivaceum。
同樣優(yōu)選的工藝中所述Monosporium olivaceum是Monosporiumolivaceum ATCC 36300。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種由式(II)化合物
制備式(III)化合物的工藝，包括在一種來自Thamnostylum屬的微生
物培養(yǎng)物的酶存在下，選擇性地將式(II)的化合物去甲基。
優(yōu)選的工藝中所述微生物是Thamnostylum piriforme。
同樣優(yōu)選的工藝中所述Thamnostylum piriforme是Thamnostylumpiriforme ATCC 8992。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及利用式(II)化合物
以制備式(I)的化合物的用途。
優(yōu)選的用途中式(II)化合物被非選擇性去甲基化。
本發(fā)明包括利用微生物實現(xiàn)CP-336,156(雌激素激動劑/骨質(zhì)疏松癥)合成中的中間體的O-去甲基化。利用微生物避免了產(chǎn)生甲基溴的化學步驟，甲基溴作為副產(chǎn)物是一種難以收集且處理昂貴的“溫室效應”氣體。
生物轉(zhuǎn)化可以利用微生物的完整細胞結構、微生物細胞提取物或獲自微生物的純化的酶來進行。
用于本微生物生物轉(zhuǎn)化的起始材料是CP-324,098，其是順式非對映體的混合物。已發(fā)現(xiàn)進行這種反應的三種真菌具有不同的立體選擇性。刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)O-去甲基化非對映體的全部兩種，以形成稱為CP-319,609的外消旋混合物，其是由非對映體CP-336,156和CP-335,992組成。Monosporium olivaceum和Thamnostylum piriforme僅作用于CP-324,098的非對映體中的一種，產(chǎn)生如下所示的一種非對映體產(chǎn)物。
(僅有順式非對映體)刺孢小克銀漢霉無非對映體選擇性Thamnostylum piriforme非對映體選擇性-“不是期望”的產(chǎn)物(CP-335,992)Monosporium olivaceum 非對映體選擇性-期望的產(chǎn)物(CP-336,156)由這三種微生物制備的起始材料和產(chǎn)物如圖1-4如示通過手性HPLC測定。所有三種微生物的反應終產(chǎn)物從發(fā)酵液中分離，且用NMRMS表征，用手性HPLC以確證其一致性。
用通用術語描述本發(fā)明后，下面參考特定實施例。應當理解這些實施例不是意在限制本發(fā)明及由所附權利要求確定的范圍。
可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得Monosporium olivaceumATCC 36300和Thammostylum piriforme ATCC 8992。將如此獲得的培養(yǎng)物加入合適的生長培養(yǎng)基，并持續(xù)振搖培養(yǎng)直到開始生長。如此制備的培養(yǎng)物用于接種斜面。將部分這樣的斜面冷藏作為原種貯存。分別將各個微生物從斜面中接種入含有生長培養(yǎng)基(組分見后)的兩只搖瓶中。在溫度范圍從約22到約32℃范圍進行發(fā)酵；然而，為了優(yōu)化結果，優(yōu)選在約28℃進行發(fā)酵。利用合適的有機或無機緩沖液摻入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，或通過周期性加入堿以控制培養(yǎng)基的pH在約pH6-7。在48至72小時內(nèi)實現(xiàn)微生物良好生長。將搖瓶中的培養(yǎng)液移入馮巴赫瓶中，其中含有與先前所用生長培養(yǎng)基相同組成的新鮮生長培養(yǎng)基。不同的培養(yǎng)基將改變化合物的產(chǎn)率和其生產(chǎn)速率。優(yōu)選的培養(yǎng)基組成列于實施例部分。再振搖一天后，加入溶于適當溶劑(如二甲亞砜或二甲基酰胺(dimethyl formamdide)的無菌過濾的雷怕霉素溶液。繼續(xù)發(fā)酵1-6天。優(yōu)選為繼續(xù)發(fā)酵2天。
用于本發(fā)明工藝的合適的培養(yǎng)基含有可利用的碳源或多種碳源、可利用的氮源和無機鹽，包括必需的礦物質(zhì)。通常，許多糖類如葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、淀粉、甘油、小米凝膠(millet jelly)、糖蜜、黃豆等可用作可利用的碳源?？衫玫牡窗ㄈ缃湍?、酪蛋白水解物、初級酵母、酵母提取物、棉籽粉、大豆固形物、小麥胚芽提取物、蛋白胨、玉米漿和銨鹽?？蓳饺肱囵B(yǎng)基的無機鹽養(yǎng)分是常用的鈉鹽、鐵鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈷鹽、磷酸鹽等。當然，所用的技術不意在限制本發(fā)明的范圍。
適合的生長培養(yǎng)基包括(a)葡萄糖(20g)，酵母提取物(5g)，NaCl(5g)，K2HPO4(5g)和蒸餾水(1000毫升)，其中pH用HCl溶液調(diào)整到7；(b)糊精(10g)，牛肉提取物(3g)，ardamine pH(5g)，N-Z胺型E，MgSO47H2O(0.5g)，KH2PO4(0.37g)，CaCO3(0.5g)，蒸餾水(1000毫升)，其中用鹽酸溶液pH7.1，隨后第二階段的培養(yǎng)基為葡萄糖(10g)，Hy-CaseSF(2g)，牛肉提取物(1g)，玉米漿(3g)，蒸餾水(1000毫升)，其中pH調(diào)整為7.0；(c)葡萄糖(10g)、玉米漿(6g)、KH2PO4(3g)、CaCO3(3.5g)、大豆油(粗，2.2毫升)、酵母提取物(2.5g)、蒸餾水(1000毫升)，其中用HCl溶液調(diào)至pH7.0-7.3；(d)麥芽糖漿(20g)、大豆粉(5g)、酪蛋白(1g)、干酵母(1g)、NaCl(5g)、蒸餾水(1000毫升)；(e)乳糖(75g)、Pharmamedia(取代酵母提取物，40g)，CaCO3(10g)、Na2SO3(4g)，蒸餾水(1000毫升)；(f)ISP#3；(h)ISP#4；(I)ISP#5等。程序培養(yǎng)物刺孢小克銀漢霉ATCC 9244和ATCC 36190；Monosporium olivaceum ATCC 36300和Thamnostylum piriformeATCC 8992。生物轉(zhuǎn)化法生長培養(yǎng)基(接種和生物轉(zhuǎn)化期)葡萄糖20g/l pH至7.0大豆粉 5g/l酵母提取物 5g/lNaCl 5g/lK2HPO45g/l每125ml三角燒瓶25ml，用于接種物和生物轉(zhuǎn)化。
從斜面或冷凍貯存原種培養(yǎng)物中接種入25ml的培養(yǎng)基中(位于上述125ml三角燒瓶)，28℃振蕩培養(yǎng)2至3天。將2.5ml培養(yǎng)物移入三角燒瓶中的25ml培養(yǎng)基中且再振蕩培養(yǎng)1天。加入溶于DMSO中且無菌過濾至終濃度0.2mg/ml的CP-324,098。以1天間隔加入其它底物。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1至6天。提取和純化用兩倍于培養(yǎng)液的乙酸乙酯在分液漏斗中提取培養(yǎng)液。通過于1000×g離心5分鐘分相，然后將上層乙酸乙酯相小心移出，且蒸發(fā)至干燥。甲醇也可很好地作為一種萃取劑。可利用固相萃取和制備性HPLC純化產(chǎn)物。
手性HPLC試驗柱 手性OD，4.6×250mm(Daicel，ChiralTechnologies)流速 0.7ml/分鐘樣品體積 20μl濃度 0.1mg/ml溫度 30℃檢測 220nm處紫外線(UV)流動相100ml乙醇(USP，脫水，200標準(proof))，加上900ml己烷，加1ml N’N’-二乙胺樣品溶于乙醇。
權利要求
1.一種由式(II)化合物
制備式(I)化合物的方法，
其包括在一種衍生自單孢霉屬微生物培養(yǎng)物的酶存在下，去甲基化式(II)化合物。
2.如權利要求1的方法，其中所述微生物是Monosporiumolivaceum。
3.如權利要求2的方法，其中所述Monosporium olivaceum是Monosporium olivaceum ATCC 36300。
4.一種由式(II)化合物
制備式(III)化合物的方法，
其包括在一種衍生自Thamnostylum微生物培養(yǎng)物的酶存在下，去甲基化式(II)化合物。
5.如權利要求4的方法，其中所述微生物是Thamnostylumpiriforme。
6.如權利要求5的方法，其中所述Thamnostylum是Thamnostylum piriforme ATCC 8992。
7.利用式(II)化合物
制備式(I)化合物的用途。
8.如權利要求7的用途，其中式(II)化合物被非選擇性O-去甲基化。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用Monosporium屬和Thamostylum屬的微生物非對映體選擇性O－去甲基化藥物中間體,以制造式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物。
文檔編號C07D295/00GK1259577SQ9911831
公開日2000年7月12日 申請日期1999年8月27日 優(yōu)先權日1998年8月28日
發(fā)明者S·J·特魯斯戴爾 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司