專(zhuān)利名稱(chēng)：選擇性復(fù)制的病毒載體的制作方法
背景技術(shù)：
重組腺病毒目前在各種治療方案中用于傳送治療性轉(zhuǎn)基因。然而，這類(lèi)載體系統(tǒng)的廣泛感染性已經(jīng)引起對(duì)所述病毒在非腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)可能引起對(duì)非贅生性細(xì)胞的伴隨損傷的擔(dān)心。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種導(dǎo)向系統(tǒng)，以在特定的細(xì)胞類(lèi)型中優(yōu)先表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因。組織特異性啟動(dòng)子和腫瘤特異性啟動(dòng)子已經(jīng)用于在某些細(xì)胞類(lèi)型中優(yōu)先復(fù)制所述載體。例如，1997年1月16日公開(kāi)的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US96/10838(國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO97/01358)描述了載體的應(yīng)用，所述載體利用驅(qū)動(dòng)E1、E2或E4功能的前列腺特異性啟動(dòng)子元件在特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制，所述啟動(dòng)子元件任選地可含有細(xì)胞毒性轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。具體而言，該說(shuō)明書(shū)描述一種構(gòu)建物，其中前列腺特異性增強(qiáng)子控制E1的表達(dá)，并具有一個(gè)含CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒，所述CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)插入到E3區(qū)中的胞嘧啶脫氨酶基因的表達(dá)。這些載體為可復(fù)制載體，并能夠在特定細(xì)胞類(lèi)型中包裝入完整病毒體中。
使用腫瘤特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)病毒復(fù)制的一個(gè)可替代途徑是使用特異性缺失的腺病毒E1b 55K蛋白編碼序列。在1997年10月14日頒發(fā)的美國(guó)專(zhuān)利第5,677,178號(hào)中描述了在編碼E1b 55K的核苷酸序列中含有缺損的重組腺病毒。然而，已經(jīng)觀(guān)察到這些組織或腫瘤特異性控制元件是“滲漏的”，即允許在非優(yōu)選靶細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型中復(fù)制。
使用徹底消除E1功能的復(fù)制缺陷型腺病毒載體可替代所述類(lèi)型的選擇性復(fù)制載體。具體而言，已經(jīng)使用消除E1、E2、E3并含有部分F4缺失的載體輸送外源性轉(zhuǎn)基因。已經(jīng)使用這類(lèi)載體向靶細(xì)胞輸送p53基因。已經(jīng)證明，外源性給予的野生型p53在p53缺失型(p53突變或p53無(wú)效)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)能夠在該腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的凋亡。目前Schering Corporation和Introgen Corporation正在研制這類(lèi)用于輸送p53的病毒載體。此外，這些載體已經(jīng)表現(xiàn)出可接受的毒理學(xué)特征和用于人類(lèi)治療用途的治療效力，并在成年男子中進(jìn)行治療p53相關(guān)惡性腫瘤的II期臨床試驗(yàn)。
復(fù)制缺陷型載體和選擇性復(fù)制載體至少在理論上具有臨床醫(yī)生擔(dān)心的設(shè)計(jì)缺點(diǎn)。因?yàn)閺?fù)制缺陷型載體將不會(huì)在患者體內(nèi)不受控地增殖，所以理論上它們具有更吸引人的安全性。但是，因?yàn)橛行[瘤需要感染相當(dāng)大部分的待感染腫瘤細(xì)胞，所以通常使用摩爾數(shù)顯著過(guò)量的載體，以確保治療的有效性。因?yàn)檫x擇性復(fù)制載體能夠在患者體內(nèi)復(fù)制并潛在性地突變成為可充分復(fù)制的載體，所以人們更多的是從前瞻性安全角度看待選擇性復(fù)制載體問(wèn)題。然而，通過(guò)保持所述病毒在特定條件下繁殖的本能，能夠使這些載體擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞周?chē)?。因?yàn)樗鲚d體本身能夠復(fù)制，所以要求這類(lèi)載體的初始劑量較低。這從免疫學(xué)角度以及生產(chǎn)這類(lèi)藥物的經(jīng)濟(jì)理由來(lái)講是有利的。因此，本領(lǐng)域中需要選擇性復(fù)制載體，該載體解決了認(rèn)識(shí)到的安全性問(wèn)題，同時(shí)提高了治療指數(shù)。
本發(fā)明通過(guò)提供含途徑靶向性途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的選擇性復(fù)制腺病毒載體解決了這些問(wèn)題，所述途徑效應(yīng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)病毒復(fù)制阻遏物的表達(dá)，使得所述載體優(yōu)先在所述途徑缺陷的細(xì)胞中復(fù)制。本發(fā)明還提供包含此類(lèi)載體的藥用制劑。本發(fā)明還提供使用這類(lèi)載體從正常細(xì)胞群中消除途徑缺陷細(xì)胞的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供重組病毒，該重組病毒通過(guò)使用驅(qū)動(dòng)病毒復(fù)制抑制物表達(dá)的途徑效應(yīng)啟動(dòng)子，隨著靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境選擇性地復(fù)制所述病毒基因組，所述病毒復(fù)制抑制物基于被感染細(xì)胞的表型或基因型在所述宿主細(xì)胞中顯著抑制病毒復(fù)制。在所述靶細(xì)胞中，所述途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子元件是失活的，因此允許所述病毒復(fù)制。這導(dǎo)致(1)通過(guò)所述病毒的自然裂解特性殺傷所述細(xì)胞，和/或(2)提供針對(duì)所述靶細(xì)胞的治療劑量(相對(duì)于不能復(fù)制的載體增加)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，和(3)引起所述病毒在局部濃集，促進(jìn)周?chē)陌屑?xì)胞感染所述重組病毒。本發(fā)明還提供利用所述載體的治療和診斷方法、包含所述載體的藥用制劑、制備所述載體和含所述載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1檢測(cè)編碼E2F-Rb融合編碼序列的重組腺病毒載體的細(xì)胞致病作用的CPE測(cè)定結(jié)果，所述編碼序列處于或者TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(PAI或SRE)或者p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(RGC或p53CON)控制之下。另外，還在所述載體中加入了編碼綠色熒光蛋白的基因作為報(bào)道基因。A組代表MRC-9細(xì)胞，B組代表Hep3B細(xì)胞，C組代表WIDR細(xì)胞。泳道1表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的復(fù)制缺陷型(E1缺失)重組腺病毒；泳道2PAI-Ad；泳道3SRE-Ad；泳道4RGC-Ad；泳道5p53CON-Ad。在該圖右側(cè)標(biāo)明了顆粒濃度。
圖2圖示與途徑導(dǎo)向性載體一起表達(dá)的GFP的熒光顯微鏡檢查(上面各組)結(jié)果。A組代表GFCB對(duì)照載體，B組代表SRE-Ad載體，C組代表p53CON-Ad載體。以5×105顆粒/ml進(jìn)行感染。
圖3用重組病毒U3EE(正方形)、T1LT(圓形)以及L9IU(三角形)感染正常支氣管上皮細(xì)胞(A圖)和C33A細(xì)胞(B圖)的結(jié)果?？v軸表示未感染對(duì)照的百分率，橫軸以顆粒/ml表示病毒劑量。通過(guò)將每種細(xì)胞的培養(yǎng)物暴露于六種不同濃度(105-109病毒顆粒/ml)的病毒，進(jìn)行所述試驗(yàn)。將所述細(xì)胞暴露于所述病毒1小時(shí)，洗去過(guò)量的病毒，基本上按照生產(chǎn)商(Promega，Madison WI)的說(shuō)明，用MTS分析檢測(cè)在感染后的6天中活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。水平線(xiàn)代表50％的所述細(xì)胞保持存活狀態(tài)的水平。由所述數(shù)據(jù)生成的曲線(xiàn)與水平點(diǎn)線(xiàn)的交叉點(diǎn)為所述病毒的ED50檢測(cè)值。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供含途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的選擇性復(fù)制重組病毒，所述途徑效應(yīng)啟動(dòng)子有效連接至一種病毒復(fù)制阻遏物。
術(shù)語(yǔ)“選擇性復(fù)制”是指相對(duì)于另一種表型狀態(tài)的細(xì)胞，能夠在一種表型狀態(tài)的細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制的載體。不同表型狀態(tài)的實(shí)例應(yīng)當(dāng)包括給定細(xì)胞類(lèi)型的p53途徑缺陷型細(xì)胞與正常細(xì)胞。優(yōu)先復(fù)制的病毒顯示，在給定的劑量水平，相對(duì)于在相同類(lèi)型的正常(對(duì)照)細(xì)胞中的復(fù)制，所述病毒在靶細(xì)胞類(lèi)型中的復(fù)制效率增加至少為5倍。為了測(cè)定病毒是否確實(shí)具有選擇性，必須在考慮許多因素的情況下，相對(duì)于相同細(xì)胞類(lèi)型的正常細(xì)胞，評(píng)價(jià)所述病毒在靶細(xì)胞中的復(fù)制能力。
最好是比較給定載體在具有被靶向條件的靶細(xì)胞中復(fù)制的能力與在不具有這種條件的相同類(lèi)型正常細(xì)胞中復(fù)制的能力。例如，在病毒感染后的第一步是誘導(dǎo)所述細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，因?yàn)樽罡卟《緩?fù)制效力所必需的因素僅存在于S期。然而，如果人們?cè)噲D根據(jù)載體在腫瘤細(xì)胞中的選擇性來(lái)評(píng)價(jià)載體的選擇性，即相對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞周期的另一種細(xì)胞(例如無(wú)限增殖化細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系)評(píng)價(jià)載體在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力，則在某種程度上模糊了所述病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性。另外，已經(jīng)觀(guān)察到不同細(xì)胞類(lèi)型對(duì)給定病毒的感染性差別較大。盡管某些病毒例如腺病毒具有廣泛的組織嗜性，但其它病毒更受限于它們感染的細(xì)胞類(lèi)型。通過(guò)嘗試評(píng)價(jià)給定病毒在感染性差別較大的細(xì)胞中的性能，難以確定缺乏效力是緣于所述載體在所述細(xì)胞中的性能，還是僅僅由于所述病毒根本不能感染所述細(xì)胞。通過(guò)評(píng)價(jià)在給定類(lèi)型的靶細(xì)胞和正常細(xì)胞中的選擇性，使得這種感染性作用最小。
還必須考慮所述病毒生命周期的時(shí)序性。例如，相對(duì)于感染后不久的正常細(xì)胞，即使是野生型載體似乎在腫瘤細(xì)胞中也具有選擇性，因?yàn)樗黾?xì)胞已進(jìn)入細(xì)胞周期。但是，一旦所述病毒已經(jīng)刺激所述細(xì)胞周期，則這種表觀(guān)選擇性隨時(shí)間減弱。因此，在感染后評(píng)價(jià)選擇性的時(shí)間必須足以避免正常細(xì)胞中的這種起始復(fù)制延遲。盡管所述起始延遲將隨所使用的病毒類(lèi)型改變，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易測(cè)定這種起始延遲。
在確定給定的重組腺病毒是否在靶細(xì)胞類(lèi)型中呈現(xiàn)選擇性作用時(shí)，還必須考慮劑量的作用。例如，如果人們目標(biāo)在于消除腫瘤細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)該作用，則可以制備似乎按劑量的不同具有選擇性細(xì)胞毒性的病毒。已經(jīng)觀(guān)察到足夠高劑量的幾乎任何病毒，不管其基因組被修飾的程度如何，僅由于存在已知的具有細(xì)胞毒性的病毒蛋白(例如在腺病毒，為六鄰體)的作用而具有細(xì)胞毒性。同樣地，即使科技文獻(xiàn)可以將病毒稱(chēng)為“復(fù)制缺陷型”(提示所述病毒在缺乏能夠互補(bǔ)該病毒缺陷的細(xì)胞系的情況下完全不能復(fù)制)，這樣的病毒更精確地描述為“復(fù)制衰減型”。例如，通常稱(chēng)為“復(fù)制缺損型”或“復(fù)制缺陷型”的整個(gè)E1區(qū)缺失的腺病毒將在某種程度上復(fù)制，尤其是處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞或快速分裂的細(xì)胞。正如Mulligan(1990，Science 260926-932)觀(guān)察到的盡管E1區(qū)的表達(dá)已經(jīng)顯示影響復(fù)制所必需的其它病毒基因產(chǎn)物的表達(dá)(援引Horwitz，M.，載于Virology，B.N.Fields編輯(Raven，New York，1990，第60章))，但是病毒復(fù)制似乎并不絕對(duì)需要E1基因表達(dá)。E1缺損型病毒的早期特征證實(shí)，在高感染復(fù)數(shù)時(shí)，所述E1區(qū)不是復(fù)制所必需的(援引Jones和Shenk(1979)PNAS(USA)76(8)3665-3669)。因此，在確定病毒是否以選擇性方式復(fù)制時(shí)，病毒劑量的作用不能被忽視。
評(píng)價(jià)病毒對(duì)靶細(xì)胞的復(fù)制選擇性的一個(gè)方法是使用如下的評(píng)價(jià)病毒的“選擇性指數(shù)”。通常使用的參數(shù)ED50(定義為足以誘導(dǎo)50％的所述細(xì)胞死亡的劑量)提供了合適的比較基礎(chǔ)。通過(guò)典型的體外劑量擴(kuò)大試驗(yàn)可以輕易測(cè)定病毒的ED50。為了確保比較基礎(chǔ)最大程度地一致，相對(duì)于病毒對(duì)照表示ED50是最合適的，以使待比較的細(xì)胞類(lèi)型之間的感染性變化和任何測(cè)定變異的作用最小。因此，無(wú)單位比率ED50(病毒)/ED50(對(duì)照)用于表示所述病毒在所述細(xì)胞中的相對(duì)毒性，并將其稱(chēng)為“相對(duì)毒性指數(shù)”或“RTI”。給定病毒的“選擇性指數(shù)”表示為RTI(靶細(xì)胞)/RTI(正常細(xì)胞)比。選擇性復(fù)制載體將具有至少為10的選擇性指數(shù)，但優(yōu)選為50、100或更高。
例如，設(shè)計(jì)選擇性復(fù)制的腺病毒載體U3EE和T1LT以實(shí)現(xiàn)選擇性復(fù)制和殺傷具有p53途徑缺陷的腫瘤細(xì)胞。基本上按照本文實(shí)施例的講述制備U3EE。簡(jiǎn)而言之，所述U3EE病毒包含一個(gè)含有驅(qū)動(dòng)E2F-Rb融合蛋白表達(dá)的p53效應(yīng)元件(p53 CON)的第一表達(dá)盒。E2F-Rb融合蛋白是腺病毒E2啟動(dòng)子活性的有效抑制物，其在所述細(xì)胞中的存在將有效抑制病毒復(fù)制。所述p53效應(yīng)元件在功能性p53途徑存在下是有活性的。因此，在p53途徑完整的正常細(xì)胞中，所述U3EE病毒將表達(dá)E2F-Rb融合蛋白，并且該病毒將不復(fù)制。然而，在p53途徑缺損的細(xì)胞(大多數(shù)腫瘤細(xì)胞)中，所述p53CON效應(yīng)元件是無(wú)活性的，因此不存在對(duì)病毒復(fù)制的抑制。所述U3EE載體還包含一個(gè)含有驅(qū)動(dòng)Ad5 E3-10.5K原凋亡(pro-apoptotic)基因表達(dá)的MLP啟動(dòng)子的表達(dá)盒。在使用原凋亡基因時(shí)最好使用所述時(shí)序啟動(dòng)子(例如MLP啟動(dòng)子)，因?yàn)槿藗兿Ｍ诩せ钤蛲鲂盘?hào)之前促進(jìn)病毒DNA在所述靶細(xì)胞中的復(fù)制。MLP啟動(dòng)子大約在感染后7小時(shí)被激活，在激活以后如果U3EE基因組復(fù)制，則誘導(dǎo)E3-10.5K蛋白的活性。所述T1LT腺病毒載體與所述U3EE載體基本相同，只是T1LT腺病毒載體在E1a區(qū)中含有其它的缺失以去除243R和289R腺病毒E1a蛋白的氨基酸4-25。此缺失破壞了p300蛋白結(jié)合這些E1a蛋白的能力。
使用L9IU載體作為對(duì)照，評(píng)價(jià)U3EE和T1LT病毒在正常人支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)和C33A(具有p53缺陷途徑的上皮腫瘤細(xì)胞系)中復(fù)制的能力以及殺傷該細(xì)胞的能力。這些試驗(yàn)的結(jié)果示于附圖的圖3。下表概述了所獲得的數(shù)據(jù)
由所示數(shù)據(jù)可見(jiàn)，U3EE和T1LT病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高選擇性。如前所論述，相對(duì)于休眠的正常細(xì)胞，L9IU病毒在處于周期中的腫瘤細(xì)胞中具有輕微的復(fù)制優(yōu)勢(shì)。通過(guò)在計(jì)算選擇性指數(shù)之前比較每種細(xì)胞類(lèi)型的ED50(病毒)/ED50(對(duì)照)比率，可使這種變化的作用最小化。
術(shù)語(yǔ)“重組”是指已經(jīng)通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾的基因組。
術(shù)語(yǔ)“病毒”是指任何不具有蛋白合成機(jī)制或能量產(chǎn)生機(jī)制的專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生物。所述病毒基因組可以是包含在脂質(zhì)膜蛋白的包膜結(jié)構(gòu)中的RNA或DNA。用于實(shí)施本發(fā)明的病毒的實(shí)例包括桿狀病毒科、細(xì)小病毒科、小RNA病毒科(picornoviridiae)、皰疹病毒科(herepesviridiae)、痘病毒科、腺病毒科、小轉(zhuǎn)移RNA病毒科(picotrnaviridiae)。術(shù)語(yǔ)重組病毒包括嵌合(乃至多嵌合)病毒，即采用互補(bǔ)編碼序列由一個(gè)以上的病毒亞型構(gòu)建的載體。參見(jiàn)例如Feng等，Nature Biotechnology 15866-870。
術(shù)語(yǔ)“腺病毒”與術(shù)語(yǔ)“腺病毒載體”同義，是指腺病毒科的病毒屬。術(shù)語(yǔ)腺病毒科總起來(lái)說(shuō)是指乳腺病毒屬的動(dòng)物腺病毒，包括但不限于人、牛、綿羊、馬、犬、豬、鼠和猿腺病毒亞屬。具體而言，人腺病毒包括a-F亞屬以及它們各自的血清型，各自的血清型和A-F亞屬包括但不限于人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11A和Ad11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型。術(shù)語(yǔ)牛腺病毒包括但不限于牛腺病毒1、2、3、4、7和10型。術(shù)語(yǔ)犬腺病毒包括但不限于犬腺病毒1型(CLL、Glaxo、RI261、Utrect、Toronto26-61病毒株)和2型。術(shù)語(yǔ)馬腺病毒包括但不限于馬腺病毒1型和2型。術(shù)語(yǔ)豬腺病毒包括但不限于豬腺病毒3和4型。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，所述腺病毒得自人腺病毒血清型2或5。
術(shù)語(yǔ)“途徑效應(yīng)啟動(dòng)子”是指DNA序列，該序列結(jié)合某種蛋白并引起鄰近基因?qū)φ＜?xì)胞的該蛋白結(jié)合作轉(zhuǎn)錄性應(yīng)答?？梢酝ㄟ^(guò)加入效應(yīng)元件制備這類(lèi)啟動(dòng)子，所述效應(yīng)元件為與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的序列。這種效應(yīng)通常是誘導(dǎo)性的，但是存在蛋白水平的增加降低轉(zhuǎn)錄的一些情況。途徑效應(yīng)啟動(dòng)子可以是天然產(chǎn)生或者合成獲得。途徑效應(yīng)啟動(dòng)子通常根據(jù)途徑或被靶向的功能性蛋白構(gòu)建。例如，天然產(chǎn)生的p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子包括由于存在功能性p53(如p21或bax啟動(dòng)子)而被激活的轉(zhuǎn)錄控制元件?；蛘撸梢允褂煤钚?dòng)子(例如SV40TATA盒區(qū))上游p53結(jié)合位點(diǎn)的合成啟動(dòng)子產(chǎn)生合成途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。合成途徑效應(yīng)啟動(dòng)子通常由一個(gè)或多個(gè)拷貝的匹配共有結(jié)合基元的序列構(gòu)建。這種共有DNA結(jié)合基元易于測(cè)定。這種共有序列通常以直線(xiàn)或以被幾個(gè)堿基對(duì)分隔的頭-尾重復(fù)序列排列。含頭-頭重復(fù)序列(例如AGGTCATGACCT)的元件稱(chēng)為回文序列或反向重復(fù)序列，而那些含尾-尾重復(fù)序列的元件稱(chēng)為反卷重復(fù)序列。
用于實(shí)施本發(fā)明的途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的實(shí)例包括含共有胰島素結(jié)合序列的合成性胰島素途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(Jacob等，(1995).J.Biol.Chem.27027773-27779)、細(xì)胞因子途徑效應(yīng)啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(Lange等(1992)J Biol Chem 26715673-80)、IL1和IL6途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(Won K.-A和Baumann H.(1990)Mol.Cell.Biol.103965-3978)、T3途徑效應(yīng)啟動(dòng)子、含共有基元5′AGGTCA 3′的甲狀腺激素途徑效應(yīng)啟動(dòng)子、TPA途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(TRE)、TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(如在Grotendorst等，(1996)Cell Growth and Differentiation 7469-480中所述)。其它途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的，并可以在通過(guò)國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)http//www.eimb.rssi.ru/TRRD獲得的真核生物基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)其進(jìn)行鑒定。
本文列舉的本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，所述載體包含在功能性TGF-β途徑存在下有活性的合成性TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子，諸如含SRE和PAI-RE效應(yīng)元件的啟動(dòng)子。PAI-RE是指包含TGF-β信號(hào)、分離自纖溶酶原激活物-I啟動(dòng)子區(qū)的效應(yīng)序列的合成TGF-β效應(yīng)元件。PAI-RE的構(gòu)建描述于本文的實(shí)施例3。所述PAI-RE途徑效應(yīng)啟動(dòng)子可以作為分離自質(zhì)粒p800luc的一個(gè)749個(gè)堿基對(duì)片段分離(如在Zonneveld等，(1988)PNAS 855525-5529中所述并可以登錄號(hào)J03836由GenBank獲得)。SRE是指包含重復(fù)的4個(gè)Smad-4 DNA結(jié)合序列(GTCTAGAC，如在Zawel等，(1988)Mol.Cell1611-617中所述)的合成TGF-β效應(yīng)元件。SRE的構(gòu)建描述于本文的實(shí)施例3。所述SRE效應(yīng)元件可以通過(guò)退火編碼Smad-4結(jié)合序列的互補(bǔ)寡核苷酸并在質(zhì)粒pGL#3-啟動(dòng)子熒光素酶載體(購(gòu)自ProMega)中克隆而產(chǎn)生。
同樣地，“p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子”是指在功能性p53途徑存在下有活性的轉(zhuǎn)錄控制元件。所述p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子可以是在功能性p53途徑存在下有活性的天然產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如p21或mdm2啟動(dòng)子?；蛘?，所述p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子可以是在功能性p53途徑存在下有活性的合成性轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如SRE和PAI-RE途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。p53-CON代表一個(gè)含合成p53效應(yīng)元件的p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子，它通過(guò)在SV40 TATA盒的上游插入兩個(gè)合成p53共有DNA結(jié)合序列(如在Funk等，(1992)Mol.Cell Biol.122866-2871中所述)而構(gòu)建。p53-CON途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的構(gòu)建描述于本文的實(shí)施例3。RGC是指使用單一p53結(jié)合域的、在核糖體基因簇中鑒定的合成p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。Kern等(1991)Science 2521708-1711和Park等(1996)MolecularCarcinogenesis 16101-108。p53CON和RGC效應(yīng)元件可以通過(guò)退火互補(bǔ)寡核苷酸構(gòu)建，而p53效應(yīng)啟動(dòng)子可以通過(guò)在質(zhì)粒pGL3-啟動(dòng)子熒光素酶載體(可購(gòu)自ProMega)中克隆構(gòu)建(在實(shí)施例3中更充分地描述)。
術(shù)語(yǔ)“靶細(xì)胞”是指希望通過(guò)給予治療性轉(zhuǎn)基因處理的特定表型狀態(tài)的細(xì)胞。通過(guò)使用各種途徑效應(yīng)啟動(dòng)子元件，人們可以將所述病毒的表達(dá)導(dǎo)向具有完整途徑的任何特定細(xì)胞。例如可以在贅生性靶細(xì)胞中，通過(guò)使用TGF-β或p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子表達(dá)病毒復(fù)制阻遏物。同樣地，可以在關(guān)節(jié)炎靶細(xì)胞中，通過(guò)炎癥效應(yīng)啟動(dòng)子表達(dá)病毒復(fù)制阻遏物，其中所述載體可選地編碼IL-10。
術(shù)語(yǔ)“有效連接的”是指多核苷酸元件以功能性關(guān)系連接。當(dāng)一個(gè)核酸序列與另一個(gè)核酸序列處于功能性關(guān)系時(shí)，該核酸序列是“有效連接的”。例如，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與所述編碼序列有效連接。有效連接意指所連接的核苷酸序列通常是連續(xù)的。然而，因?yàn)樵鰪?qiáng)子通常在與所述啟動(dòng)子相隔幾千個(gè)堿基時(shí)起作用，并且內(nèi)含子序列的長(zhǎng)度可以變化，所以某些多核苷酸元件可以有效連接但不直接位于側(cè)翼，甚至可以在不同等位基因或染色體的易位中起作用。
術(shù)語(yǔ)“病毒復(fù)制阻遏物”是指如果在給定細(xì)胞中表達(dá)，顯著阻遏病毒復(fù)制的蛋白。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)見(jiàn)到的，所述病毒復(fù)制阻遏物將取決于衍生本發(fā)明重組載體的親代腺病毒載體的性質(zhì)。例如，當(dāng)為腺病毒載體或其它DNA腫瘤病毒時(shí)，可以使用E2F-Rb融合構(gòu)建物，該構(gòu)建物描述于1995年12月6日公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)第94108445.1號(hào)(公開(kāi)號(hào)0685493A1)。E2F-Rb融合蛋白由融合Rb生長(zhǎng)抑制域(野生型Rb蛋白的氨基酸379-928)的人E2F轉(zhuǎn)錄因子蛋白(野生型E2F的氨基酸95-286)的DNA結(jié)合域和DP1雜二聚化域組成。E2F-Rb融合蛋白是E2F依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄的有效阻遏物，并使細(xì)胞停滯在G1期。所述DNA結(jié)合域位于氨基酸128-193，而所述二聚化域位于氨基酸194-289。人E2F-1蛋白的序列根據(jù)登錄號(hào)M96577由GenBank(1992年8月10日收錄)獲得。當(dāng)構(gòu)建用于其它物種的載體時(shí)，可以使用來(lái)自其它物種的其它E2F家族成員的E2F序列。在所述重組病毒是基于腺伴隨病毒(AAV)的情況下，不存在腺病毒感染時(shí)，rep蛋白及其衍生物是病毒復(fù)制的有效阻遏物。在所述病毒是衍生自單純皰疹病毒的情況下，ICPO-NX蛋白(立即早期蛋白ICPO的缺失形式(Liun等，(1998)J.Virol.727785-7795))可以用作病毒復(fù)制的有效阻遏物。同樣地，任何顯性失活活性的蛋白都可以用作病毒復(fù)制的阻遏物。
TGF-β和相關(guān)蛋白(包括活化素、抑制素以及BMP)是有效的天然抗增殖劑，據(jù)信它們?cè)谝种颇[瘤發(fā)生中起重要作用。生物活性形式的TGF-β是一個(gè)25 kDa的二硫鍵連接的同型二聚體，并真正在所有人類(lèi)組織中表達(dá)。有趣的是，許多惡性細(xì)胞類(lèi)型保有見(jiàn)于正常細(xì)胞的表達(dá)模式。TGF-β通過(guò)I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的雜二聚化受體復(fù)合物發(fā)送信號(hào)。在這兩種受體激酶中，II型受體具有內(nèi)在的激酶活性，并在結(jié)合TGF-β配體時(shí)，II型受體與I型受體雜二聚化并對(duì)I型受體轉(zhuǎn)磷酸。I型受體的磷酸化激活其激酶活性，這又導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子Smad的磷酸化。磷酸化的I型受體將信號(hào)傳送到細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致如生長(zhǎng)抑制的細(xì)胞反應(yīng)。一旦在細(xì)胞核內(nèi)，則已知Smad復(fù)合物或者通過(guò)它們自身作為轉(zhuǎn)錄因子起作用，或者通過(guò)調(diào)節(jié)其它轉(zhuǎn)錄因子的活性，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。據(jù)信由TGF-β信號(hào)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子包括CTF/NF1、FAST-1、Spl、Jun、SRF/TRF、Oct和CREB。這些相互作用的最終結(jié)果導(dǎo)致各種已知的TGF-β的基因多效作用。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和相關(guān)蛋白是許多細(xì)胞類(lèi)型增殖的有效抑制物。幾種上皮腫瘤和造血源性腫瘤的惡性發(fā)展與TGF-β的抗增殖和抗侵染作用的喪失有關(guān)。已經(jīng)表明，TGF-β不能發(fā)送信號(hào)與所述受體和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子表達(dá)的突變或缺失或缺乏有關(guān)。許多抗TGF-β的惡性腫瘤的其它腫瘤抑制基因也多重缺損，因此限制了用于有效治療的腫瘤抑制基因替換的實(shí)用性。
通過(guò)加入纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-啟動(dòng)子)的序列或SV40TATA盒上游的Smad4/DPC4(SRE-啟動(dòng)子)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)定中，使用熒光素酶作為報(bào)道基因，評(píng)價(jià)這些啟動(dòng)子的活性。結(jié)果示于下表2
這些結(jié)果證實(shí)，這兩種啟動(dòng)子僅在具有功能性TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中有活性。在TGF-β途徑缺陷細(xì)胞系如MDA-MB468(它由于純合缺失Smad4/DPC4而造成TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷)中，轉(zhuǎn)染有效連接熒光素酶的PAI啟動(dòng)子或SRE啟動(dòng)子并用編碼Smad4的重組腺病毒感染，恢復(fù)了以上兩種效應(yīng)元件的活性，這進(jìn)一步證實(shí)這些含效應(yīng)元件的啟動(dòng)子對(duì)TGF-β途徑的特異性，正如下表3所示數(shù)據(jù)所證實(shí)的一樣。
然后構(gòu)建含有效連接至E2F-Rb的PAI啟動(dòng)子的質(zhì)粒，并測(cè)試其在具有完整TGF-β途徑的細(xì)胞中選擇性抑制E2啟動(dòng)子的能力。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)定中，連接熒光素酶的E2啟動(dòng)子與有效連接E2F-Rb的PAI啟動(dòng)子的共轉(zhuǎn)染顯示在293細(xì)胞(具有正常的TGF-β途徑)中選擇性抑制E2啟動(dòng)子活性，而不能在MDA-MB 468細(xì)胞(具有缺損的TGF-β途徑)中選擇性抑制E2啟動(dòng)子活性，如表4所示，這是因?yàn)镋2F-Rb在293細(xì)胞中選擇性表達(dá)。正如所預(yù)料的，與在這兩種細(xì)胞系中都表達(dá)E2F-Rb的CMV-E2F-Rb的共轉(zhuǎn)染在這兩種細(xì)胞系中都抑制E2啟動(dòng)子的活性。
通過(guò)加入已知的源自核糖體基因簇(RGC啟動(dòng)子)或者高親和力p53結(jié)合位點(diǎn)(p53CON啟動(dòng)子)的p53結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)定中，使用熒光素酶作為報(bào)道基因，評(píng)價(jià)這些啟動(dòng)子的活性。這些試驗(yàn)的結(jié)果示于下表5。
結(jié)果表明，這兩種效應(yīng)元件在具有功能性p53的細(xì)胞中有活性。為了證實(shí)所述p53效應(yīng)啟動(dòng)子活性是緣于功能性p53，用驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因表達(dá)的RGC啟動(dòng)子和或者空表達(dá)盒對(duì)照腺病毒載體(ZZCB)或者在CMV啟動(dòng)子控制下組成產(chǎn)生p53的重組腺病毒(FTCB)，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)IDR和U87兩種細(xì)胞系。這些試驗(yàn)的結(jié)果示于表6。
由所示數(shù)據(jù)可以看出，p53效應(yīng)啟動(dòng)子活性以劑量依賴(lài)方式隨p53活性的增加而增加。
產(chǎn)生處于或TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(PAI或SRE)或p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子(RGC或p53CON)控制下的編碼E2F-Rb融合編碼序列的重組腺病毒。另外，還在所述載體中加入編碼綠色熒光蛋白的基因作為報(bào)道基因。測(cè)試產(chǎn)生的病毒的選擇性復(fù)制能力和在細(xì)胞致病作用(CPE)測(cè)定中殺傷TGF-β途徑缺陷或p53途徑缺陷細(xì)胞的能力。結(jié)果示于附圖中的圖1。在MRC9(p53途徑陽(yáng)性和TGF-β途徑陽(yáng)性)中，野生型腺病毒甚至能以低濃度(1×106顆粒/ml)復(fù)制并誘導(dǎo)CPE，而TGF-β或p53途徑導(dǎo)向載體在該濃度不能誘導(dǎo)CPE。途徑導(dǎo)向載體僅在最高測(cè)試劑量(1×108顆粒/ml)顯示一定的CPE。相反，在諸如WIDR(p53和TGF-β途徑均缺損)和Hep3B(p53無(wú)效以及在沒(méi)有外源性TGF-β的情況下TGF-β途徑缺損)細(xì)胞系中，途徑導(dǎo)向載體甚至在低濃度(1×106顆粒/ml)都和野生型病毒一樣有效誘導(dǎo)CPE。熒光顯微檢測(cè)用途徑導(dǎo)向載體(SRE-Ad和p53CON-Ad)感染的Hep3B細(xì)胞，結(jié)果顯示甚至在低顆粒濃度(1×105顆粒/ml，暴露2小時(shí))感染時(shí)，所述細(xì)胞都高水平表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因，并在培養(yǎng)物中擴(kuò)散所述病毒。相反，用復(fù)制缺陷(E1A缺失)的編碼GFP的腺病毒(GFCB)，以相同濃度(1×105顆粒/ml)感染Hep3B細(xì)胞，顯示沒(méi)有GFP表達(dá)。
如先前所指出的，本發(fā)明的載體能夠選擇性復(fù)制并能在選擇條件下裂解靶細(xì)胞。然而，這并不意味著暗示不能將其它層面的選擇性或毒性工程入這些載體。本發(fā)明還提供含病毒基因組其他修飾的重組腺病毒，如導(dǎo)向修飾、轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒或促進(jìn)在特定細(xì)胞類(lèi)型選擇性復(fù)制或表型狀態(tài)的病毒基因組修飾。
術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)向修飾”是指為優(yōu)先感染特定細(xì)胞類(lèi)型而設(shè)計(jì)的病毒基因組修飾。在衍生自特征為廣泛感染性的病毒(諸如腺病毒)的載體中，通過(guò)修飾病毒包膜蛋白，也可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類(lèi)型特異性或細(xì)胞類(lèi)型導(dǎo)向性。例如，用腺病毒載體，通過(guò)選擇性修飾病毒基因組染色紐和尾絲編碼序列，實(shí)現(xiàn)與獨(dú)特細(xì)胞表面受體特異性相互作用的修飾的染色紐和尾絲結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞導(dǎo)向。這種修飾的實(shí)例描述于Wickham等，(1997)J.Virol71(11)8221-8229(在腺病毒尾絲蛋白中加入RGD肽)；Arnberg等，(1997)Virology 227239-244(修飾腺病毒尾絲基因以獲得對(duì)眼和生殖道的向性)；Harris和Lemoine(1996)TIG12(10)400-405；Stevenson等，(1997)J.Virol.71(6)4782-4790；Michael等，(1995)Gene Therapy 2660-668(在腺病毒尾絲蛋白中加入胃泌素釋放肽片段)；以及Ohno等，(1997)Nature Biotechnology 15763-767(在Sindbis病毒中加入A蛋白-IgG結(jié)合域)。已經(jīng)通過(guò)將抗體或抗體片段與包膜蛋白結(jié)合，獲得細(xì)胞特異性導(dǎo)向的其它方法(參見(jiàn)例如Michael等，(1993)J.Biol.Chem.2686866-6869，Watkins等，(1997)GeneTherapy 41004-1012；Douglas等，(1996)Nature Biotechnology 141574-1578)。另一方面，特定部分可以與病毒表面結(jié)合以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性導(dǎo)向(參見(jiàn)例如Nilson等，(1996)Gene Therapy 3280-286(將EGF與逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白接合))?？梢园凑毡景l(fā)明的實(shí)踐生產(chǎn)這些重組修飾的載體。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒”是指在有效連接治療性轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子是指影響另一個(gè)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。啟動(dòng)子的實(shí)例包括弱組成型啟動(dòng)子、時(shí)序病毒啟動(dòng)子或可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。
術(shù)語(yǔ)“時(shí)序啟動(dòng)子”是指相對(duì)于控制途徑效應(yīng)啟動(dòng)子表達(dá)的啟動(dòng)子，在病毒周期晚期的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)驅(qū)動(dòng)治療性轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種時(shí)序調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的實(shí)例包括腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)、其它啟動(dòng)子如E3。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，使用MLP啟動(dòng)子。對(duì)于單純皰疹病毒而言，可以使用潛伏激活啟動(dòng)子。
術(shù)語(yǔ)“可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子”是指誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或腫瘤特異性啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”是指優(yōu)選(或僅)在某些條件下和/或應(yīng)答外界化學(xué)物質(zhì)或其它刺激物，促進(jìn)所述治療性轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例在科學(xué)文獻(xiàn)中是已知的(參見(jiàn)例如Yoshida和Hamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230426-430；Iida等，(1996)J.Virol.70(9)6054-6059；Hwang等，(1997)J.Virol71(9)7128-7131；Lee等，(1997)Mol.Cell.Biol.17(9)5097-5105；以及Dreher等，(1997)J.Biol.Chem.272(46)；29364-29371。輻射誘導(dǎo)啟動(dòng)子的實(shí)例描述于Manome等，(1998)Human Gene Therapy 91409-1417)?？梢酝ㄟ^(guò)使用組織特異性或腫瘤特異性啟動(dòng)子賦予其它水平的選擇性。組織特異性啟動(dòng)子和腫瘤特異性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域眾所周知的，包括優(yōu)選在平滑肌中有活性的啟動(dòng)子(α-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、胰腺特異性啟動(dòng)子(Palmiter等，(1987)Cell 50435)、肝特異性啟動(dòng)子(Rover等，(1992)J.Biol.Chem.26720765；Lemaihne等，(1993)J.Biol.Chem.26819896；Nitsch等，(1993)Mol.Cell.Biol.134494)、胃特異性啟動(dòng)子(Kovarik等(1993)J.Biol.Chem.2689917)、垂體特異性啟動(dòng)子(Rhodes等，(1993)Genes Dev.7913)、前列腺特異性啟動(dòng)子等。
術(shù)語(yǔ)“治療性轉(zhuǎn)基因”是指其在靶細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生治療作用的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)治療性轉(zhuǎn)基因包括但不限于腫瘤抑制基因、抗原基因、細(xì)胞毒性基因、細(xì)胞靜止基因、前體藥物激活基因、凋亡基因、藥用基因或抗血管生成基因。本發(fā)明的載體可以或者通過(guò)串聯(lián)使用IRES元件，或者通過(guò)獨(dú)立調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，用于生產(chǎn)一個(gè)或多個(gè)治療性轉(zhuǎn)基因。
術(shù)語(yǔ)“腫瘤抑制基因”是指其在靶細(xì)胞中的表達(dá)能夠抑制贅生性表型和/或誘導(dǎo)凋亡的核苷酸序列。用于實(shí)施本發(fā)明的腫瘤抑制基因的實(shí)例包括p53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(Lee等，(1987)Nature329642)、MMAC-1基因、腺瘤息肉大腸桿茵蛋白(Albertsen等，美國(guó)專(zhuān)利5,783,666號(hào)，1998年7月21日授予)、缺失的結(jié)腸癌(DCC)基因、MMSC-2基因、NF-1基因、位于染色體3p21.3.的鼻咽癌腫瘤抑制基因(Cheng等，1998.Proc.Nat.Acad.Sci.953042-3047)、MTS1基因、CDK4基因、NF-1基因、NF-2基因以及VHL基因。
術(shù)語(yǔ)“抗原基因”是指其在靶細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)別的細(xì)胞表面抗原蛋白的核苷酸序列?？乖虻膶?shí)例包括癌胚抗原(CEA)、p53(如在1994年2月3日公開(kāi)的Levine，A的PCT國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO94/02167中的描述)。為了易于免疫識(shí)別，抗原基因可以和MHCI類(lèi)抗原融合。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性基因”是指其在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生毒性作用的核苷酸序列。此類(lèi)細(xì)胞毒性基因的實(shí)例包括編碼假單胞桿茵外毒素、蓖麻毒蛋白毒素、白喉(diptheroa)毒素等的核苷酸序列。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞靜止基因”是指其在細(xì)胞中的表達(dá)引起細(xì)胞周期停滯的核苷酸序列。此類(lèi)細(xì)胞靜止基因的實(shí)例包括p21、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、編碼細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑的基因如P16、p15、p18以及p19、Branellec等所述的生長(zhǎng)抑制特異性同源框(GAX)基因(1997年5月9日公開(kāi)的PCT公開(kāi)號(hào)WO97/16459和1996年10月3日公開(kāi)的PCT公開(kāi)號(hào)WO96/30385)。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子基因”是指其在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞因子的核苷酸序列。此類(lèi)細(xì)胞因子的實(shí)例包括GM-CSF；白介素，尤其是IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-10、IL-19、IL-20；α、β和γ亞型干擾素，尤其是α-2b干擾素；以及諸如干擾素α-2α-1的融合體。
術(shù)語(yǔ)“趨化因子基因”是指其在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞因子的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)趨化因子是指一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的低分子量細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子由結(jié)構(gòu)上相關(guān)的并具有促有絲分裂活性、趨化活性或炎性活性的細(xì)胞分泌。它們主要為共享4個(gè)半胱氨酸殘基的70-100個(gè)氨基酸殘基的陽(yáng)離子蛋白。這些蛋白可以根據(jù)兩個(gè)N端半胱氨酸的間隔分為兩組。在第一組中，所述兩個(gè)半胱氨酸被單個(gè)殘基分隔(C-x-C)，而在第二組中，它們是相鄰的(C-C)?！瓹-x-C’趨化因子成員的實(shí)例包括但不限于血小板因子4(PF4)、血小板堿性蛋白(PBP)、白介素-8(IL-8)、黑素瘤生長(zhǎng)刺激活性蛋白(MGSA)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)、小鼠Mig(m119)、小雞9E3(或pCEF-4)、豬塵細(xì)胞趨化因子I型和II型(AMCF-I和-II)、前B細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子(PBSF)以及IL10?！瓹-C’組成員的實(shí)例包括但不限于單細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、單細(xì)胞趨化蛋白2(MCP-2)、單細(xì)胞趨化蛋白3(MCP-3)、單細(xì)胞趨化蛋白4(MCP-4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(MIP-1-α)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP-1-β)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1γ(MIP-1-γ)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3-α(MIP-3-α)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β(MIP-3-β)、趨化因子(ELC)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白4(MIP-4)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白5(MIP-5)、LD78β、RANTES、SIS-ε(p500)、胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子(TARC)、eotaxin、I-309、人蛋白HCC-1/NCC-2、人蛋白HCC-3、小鼠蛋白C10。
術(shù)語(yǔ)“藥物蛋白基因”是指其表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生的蛋白在靶細(xì)胞中具有藥理作用的核苷酸序列。此類(lèi)藥物基因的實(shí)例包括胰島素原基因和類(lèi)似物(如PCT國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O98/31397中所述)、生長(zhǎng)激素基因、多巴胺、血清素、表皮生長(zhǎng)因子、GABA、ACTH、NGF、VEGF(增加對(duì)靶組織的血液灌流、誘導(dǎo)血管生成，1998年7月30日公開(kāi)的PCT公開(kāi)號(hào)WO98/32859)、血小板反應(yīng)蛋白等。
術(shù)語(yǔ)“原凋亡基因”是指其表達(dá)導(dǎo)致所述細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的核苷酸序列。原凋亡基因的實(shí)例包括p53、腺病毒E3-11.6K(衍生自Ad2)或腺病毒E3-10.5K(衍生自Ad)、腺病毒E4orf4基因、p53途徑基因以及編碼caspases的基因。
術(shù)語(yǔ)“前體藥物激活基因”是指核苷酸序列，該序列的表達(dá)產(chǎn)生能夠?qū)⒎侵委熜曰衔镛D(zhuǎn)變?yōu)橹委熜曰衔锏牡鞍祝瑥亩沟盟黾?xì)胞對(duì)外界因子的殺傷敏感或引起所述細(xì)胞毒性狀態(tài)。前體藥物激活基因的實(shí)例是胞嘧啶脫氨酶基因。胞嘧啶脫氨酶將5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶(5-FU)，它是一種有效的抗腫瘤藥物。腫瘤細(xì)胞的裂解在所述腫瘤的局部位置產(chǎn)生局部大量的能夠?qū)?FC轉(zhuǎn)變?yōu)?FU的胞嘧啶脫氨酶，從而殺死許多周?chē)[瘤細(xì)胞。這導(dǎo)致殺死大量的腫瘤細(xì)胞，而不必用腺病毒感染這些細(xì)胞(所謂的“旁觀(guān)者效應(yīng)”)。另外，可以使用胸苷激酶(TK)基因(參見(jiàn)例如Woo等，1997年5月20日頒發(fā)的Freeman等的美國(guó)專(zhuān)利第5,631,236號(hào)，以及1997年2月11日頒發(fā)的美國(guó)專(zhuān)利第5,601,818號(hào))，其中表達(dá)所述TK基因產(chǎn)物的細(xì)胞對(duì)給予9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥(niǎo)嘌呤(gancycloir)的選擇性殺傷易感。
術(shù)語(yǔ)“抗血管生成”基因是指其表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外分泌抗血管生成因子的核苷酸序列?？寡苌梢蜃影ㄖ乒軓埶?、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抑制劑如Tie2(如在PNAS(USA)(1998)958795-8800中的描述)、內(nèi)抑制素(endostatin)。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，修飾和或缺失以上提及的基因，以便編碼所述野生型蛋白的功能性亞片段，可能易于實(shí)施本發(fā)明。例如，提及的p53基因不僅包括野生型蛋白，而且包括修飾的p53蛋白。這類(lèi)修飾的p53蛋白的實(shí)例包括修飾p53以增加核保留、缺失諸如Δ13-19氨基酸以消除鈣蛋白酶共有切割位點(diǎn)、對(duì)寡聚化結(jié)構(gòu)域的修飾(如Bracco等在PCT公開(kāi)申請(qǐng)?zhí)朩O97/0492或美國(guó)專(zhuān)利第5,573,925號(hào)中所述)。
將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，上述治療基因可以分泌到培養(yǎng)基中，或由導(dǎo)向部分(諸如信號(hào)肽或核定位信號(hào)(NLS))的內(nèi)涵體定位于細(xì)胞內(nèi)特定的位置。在治療性轉(zhuǎn)基因的定義中還包括治療性轉(zhuǎn)基因和單純皰疹病毒1型(HSV-1)結(jié)構(gòu)蛋白VP22的融合蛋白。含有所述VP22信號(hào)的融合蛋白當(dāng)在感染細(xì)胞中合成時(shí)，輸出到所述感染細(xì)胞之外，并有效進(jìn)入周?chē)睆郊s為16個(gè)細(xì)胞寬范圍內(nèi)的非感染細(xì)胞。此系統(tǒng)特別用于和轉(zhuǎn)錄活性蛋白(例如p53)結(jié)合，因而融合蛋白能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)到周?chē)?xì)胞的細(xì)胞核中。參見(jiàn)例如Elliott，G.&O′Hare，P.Cell.88223-2331997；Marshall，A.&Castellino，A.Research News Briefs.NatureBiotechnology.152051997，O′Hare等，1997年2月13日公開(kāi)的PCT申請(qǐng)?zhí)朩O97/05265。Vives等在(1997)J.Biol.Chem.27216010-16017中還描述了一種衍生自HIV Tat蛋白的相似導(dǎo)向部分。
增加本發(fā)明載體效力的其它修飾包括但不限于E1內(nèi)部改變、在E4中導(dǎo)入突變以增加細(xì)胞毒性(Muller等(1992)J.Virol.665867-5878)、上調(diào)病毒死亡蛋白如E4orf4或E3 11.6K蛋白。
在本文例舉的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)踐中，本發(fā)明的載體包含條件性復(fù)制的腺病毒，它含有驅(qū)動(dòng)E2F-Rb融合蛋白表達(dá)的p53或TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子，還含有處于時(shí)序性E3啟動(dòng)子控制下的胞嘧啶脫氨酶基因。在此情況下，胞嘧啶脫氨酶只在病毒復(fù)制之后的腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，所述前體藥物轉(zhuǎn)化基因處于相對(duì)弱的組織特異性啟動(dòng)子或腫瘤特異性啟動(dòng)子控制之下。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述載體包含具有驅(qū)動(dòng)E2F-Rb融合蛋白表達(dá)的p53或TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的重組腺病毒和單獨(dú)表達(dá)胞嘧啶脫氨酶或以含胞嘧啶脫氨酶的雙順?lè)醋颖磉_(dá)盒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒，以及IRES元件和MIP-3-α蛋白。因?yàn)楸磉_(dá)胞嘧啶脫氨酶，所以在給予如5-氟胞嘧啶的前體藥物時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。低水平表達(dá)MIP-3-α將有助于形成抗腫瘤免疫。
在本文中可交替使用的多水平、多功能或多途徑效應(yīng)級(jí)聯(lián)是指構(gòu)建途徑效應(yīng)元件，以便產(chǎn)生治療作用，在該治療作用中可以同時(shí)探測(cè)到一個(gè)以上的途徑。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以組合如上所述的載體控制元件，以提供對(duì)本發(fā)明載體的多層選擇性。作為多水平控制的實(shí)例，應(yīng)該能夠設(shè)計(jì)一種可復(fù)制并殺死Rb、TGF-β或p53途徑缺陷細(xì)胞的條件復(fù)制腺病毒。這種載體將包括表達(dá)由p53效應(yīng)啟動(dòng)子作為第一控制水平控制的病毒復(fù)制的顯性失活抑制劑。結(jié)果，在任何具有功能性p53的細(xì)胞(例如所有的正常細(xì)胞)中，但不是在p53失活的細(xì)胞中，表達(dá)所述顯性失活抑制劑并阻斷所述病毒復(fù)制。然而，該載體可以在具有功能性p53但其它途徑(如TGF-β和Rb途徑)缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。因此，可以插入使功能性p53在腫瘤細(xì)胞中基本失活的其它水平的控制，由此當(dāng)其他途徑缺陷時(shí)允許病毒復(fù)制。
作為第二水平的控制，所述載體還應(yīng)包括含腺病毒E1B-51K蛋白的表達(dá)盒，它可以在僅在TGF-β途徑缺陷細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子控制下使p53功能失活。可以通過(guò)將阻遏物結(jié)合位點(diǎn)插入啟動(dòng)子中，使得使用TGF-β效應(yīng)啟動(dòng)子在所述載體的其它位置表達(dá)所述阻遏物將導(dǎo)致在具有完整TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中阻斷所述啟動(dòng)子活性，從而構(gòu)建僅在TGF-β途徑缺陷細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。在另一方面，在TGF-β途徑缺陷的細(xì)胞中不合成所述阻遏物，所述啟動(dòng)子將因此有活性。因?yàn)镋1B-55K由僅在TGF-β途徑缺陷細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子表達(dá)，所以?xún)?nèi)源性p53失活?；蛘撸梢允褂萌魏斡捎赥GF-β信號(hào)發(fā)送而下調(diào)的天然啟動(dòng)子。上述兩種表達(dá)盒的內(nèi)含物將確保僅在p53和TGF-β途徑都正常時(shí)(導(dǎo)致復(fù)制阻斷)表達(dá)顯性失活抑制物，但在它們中的一個(gè)缺陷或兩個(gè)都缺陷時(shí)(導(dǎo)致病毒復(fù)制)不表達(dá)。
作為第三水平的控制，在相同載體中實(shí)現(xiàn)了蛋白的表達(dá)，所述蛋白例如Smad7或任何其它顯性失活形式的Smad，它能夠使E2F效應(yīng)啟動(dòng)子控制的TGF-β途徑失活(Nakao等，Nature1997年10月9日；389(6651)631-635)的。當(dāng)Rb途徑缺陷時(shí)，E2F效應(yīng)啟動(dòng)子(諸如E2F1啟動(dòng)子、E2啟動(dòng)子或在最小啟動(dòng)子如SV40 TATA盒上游具有多個(gè)E2F結(jié)合位點(diǎn)的合成啟動(dòng)子)有活性。因?yàn)榇说谌降目刂?，在Rb途徑缺陷細(xì)胞中，Smad7的表達(dá)又使Smad4失活，并阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，制備E1B-55K和p53失活導(dǎo)致所述顯性失活抑制物不能表達(dá)。因此，病毒復(fù)制可以不受妨礙地進(jìn)行。另一方面，如果Rb途徑正常，則Smad7不能合成，因此TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)正常進(jìn)行。因此，不制備E1B-55K，導(dǎo)致功能性p53能夠表達(dá)顯性失活抑制物以阻斷病毒復(fù)制。
在上述三種控制水平的情況下，所述三種途徑(Rb、TGF-β以及p53)中的任何一種或兩種或全部缺陷將最終導(dǎo)致病毒復(fù)制和細(xì)胞裂解。只有所有三種途徑都和在正常細(xì)胞中一樣起作用時(shí)，才不會(huì)發(fā)生病毒復(fù)制。
正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠意識(shí)到的，本發(fā)明的載體可以采用各種不同的途徑效應(yīng)啟動(dòng)子，以許多變化用于檢測(cè)和治療多種多樣的途徑缺陷。然而，在本文例舉的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)踐中，重組腺病毒載體得自腺病毒科病毒屬。特別優(yōu)選的病毒得自人腺病毒2型或5型。當(dāng)腺病毒載體用做親代載體時(shí)，優(yōu)選的病毒復(fù)制抑制物是E2F-RB融合蛋白。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，當(dāng)使用本發(fā)明載體治療與不受控的細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病時(shí)，最好是要使用的腺病毒載體在E1A區(qū)含有特異性缺失，以便消除E1a基因產(chǎn)物結(jié)合p300和Rb蛋白的能力，同時(shí)保留E1a CR3結(jié)構(gòu)域的反式激活功能。本發(fā)明載體在E1a編碼序列中包含缺失，以消除在13S編碼序列中的p300和p105-Rb結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，p300結(jié)合缺失表現(xiàn)為缺失約4至約25的氨基酸或約36至約49的氨基酸。
對(duì)于實(shí)現(xiàn)消除p300和pRb結(jié)合所必需的E1a289R編碼序列中的缺失最好是最低限度的，以盡可能防止對(duì)E1a289R蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的大的破壞。為了消除p300結(jié)合，最好是在289R的p300結(jié)合域DNA編碼序列中導(dǎo)入突變。盡管優(yōu)選較小的修飾，但最好是在C末端區(qū)缺失低于約30個(gè)氨基酸，以消除p300結(jié)合。例如，可優(yōu)先選擇缺失氨基酸4至25(dl1101)、缺失約氨基酸30至氨基酸49(dl1103)以及更具體的缺失氨基酸36至49，以消除p300結(jié)合。特別優(yōu)選足以破壞p300結(jié)合的點(diǎn)突變。例如，已經(jīng)證實(shí)，在289R蛋白中的第二個(gè)氨基酸由精氨酸變?yōu)楦拾彼?Arg2→Gly2)的點(diǎn)突變破壞p300結(jié)合(參見(jiàn)例如pm563，Whyte等，(1989)Cell5667-75)。同樣地，關(guān)于消除pRb105結(jié)合，優(yōu)選最小修飾。最好是在pRb105結(jié)合域中消除選擇的氨基酸，例如氨基酸111-123(dl1107)和氨基酸124-127(dl1108)。特別優(yōu)選消除氨基酸111-123(dl1107)，因?yàn)樗Ａ?89R蛋白的p107結(jié)合活性。
另外，可以導(dǎo)入對(duì)Ela 289R蛋白由約219至289氨基酸的消除，以及對(duì)ElA 243R蛋白的由173至243氨基酸的消除。例如，通過(guò)在相當(dāng)于人Ad5基因組的位置1131的位置引入點(diǎn)突變(即將胞嘧啶1131變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤)，產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子。該突變消除Ela 289R蛋白的氨基酸219至289和E1A 243R蛋白的氨基酸173至243。除了上述的Rb和p300結(jié)合缺失以外，可任選地產(chǎn)生該突變。這類(lèi)親代載體的其它實(shí)例描述于共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)60/104,317和1998年10月15日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)08/09/172，684。
在本文例舉的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)踐中，優(yōu)選的p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子是p53-CON和RGC。優(yōu)選的TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子選自PAI-RE和SRE。
在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)踐中，治療性基因是前體藥物激活基因，例如胞嘧啶脫氨酶。在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)踐中，本發(fā)明的載體編碼MIP-3-α。
用于表達(dá)所述治療性基因的優(yōu)選啟動(dòng)子是諸如MLP和E3的時(shí)序啟動(dòng)子。
在腺病毒構(gòu)建物中，實(shí)現(xiàn)了消除或延遲Ad E3-11.6K蛋白的作用，以使腺病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解最小化，直至復(fù)制。特別優(yōu)選消除天然E3-11.6K/10.5K基因。這將使免疫應(yīng)答最小化，直至首輪局部擴(kuò)散發(fā)生之后。在所述后一時(shí)刻，一旦最初感染的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡并允許局部病毒擴(kuò)散，那么所述免疫應(yīng)答將是有利的。所述11.6K蛋白(或?qū)?yīng)的Ad5的E3-10.5K蛋白)是原凋亡基因，并可以用于殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，因?yàn)槿藗兿Ｍ舆t靶細(xì)胞的早期裂解以使病毒復(fù)制最大化，所以最好是將所述11.6K/10.5K基因置于時(shí)序啟動(dòng)子如MLP啟動(dòng)子控制之下，以延遲其凋亡作用的發(fā)生。
藥用制劑本發(fā)明還提供藥學(xué)上可接受的所述重組病毒與載體組合的制劑。本發(fā)明的載體可以實(shí)際配制為按照外加載體和賦形劑的常規(guī)藥物便于按劑量給予的制劑。給藥方式可以包括靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)(intratumoral)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部、基質(zhì)或氣溶膠傳遞。
術(shù)語(yǔ)“載體”是指通常用于藥用化合物制劑的化合物，用來(lái)增強(qiáng)所述治療性化合物的穩(wěn)定性、無(wú)茵性和傳遞能力。當(dāng)所述病毒配制為溶液或懸浮液時(shí)，傳遞系統(tǒng)采用可接受的載體，最好是水性載體?？梢允褂酶鞣N各樣的水性載體，例如水、緩沖液、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可以通過(guò)常規(guī)的、眾所周知的除茵技術(shù)除菌，或者可以無(wú)茵過(guò)濾除茵。獲得的水溶液可以封裝原樣使用或凍干，凍干制劑在給予前和無(wú)菌溶液混合。所述組合物根據(jù)需要可以包含藥學(xué)上可接受的輔助性物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，諸如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨醇(sorption)一月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的病毒和載體以及一種(或多種)輸送增強(qiáng)劑的藥用制劑。術(shù)語(yǔ)“輸送增強(qiáng)物”或“輸送增強(qiáng)劑”在本文中交替使用，包括一種或多種促進(jìn)所述病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的物質(zhì)。輸送增強(qiáng)物的實(shí)例描述于共同未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)第09/112,074號(hào)(1998年7月8日提交)和第08/938,089號(hào)(1997年9月26日提交)。這種輸送增強(qiáng)劑的實(shí)例包括洗滌劑、醇類(lèi)、二元醇、表面活性劑、膽汁鹽、肝素拮抗劑、環(huán)加氧酶抑制劑、高滲鹽溶液和乙酸鹽。醇類(lèi)包括例如脂肪族醇，諸如乙醇、正丙醇、異丙醇、丁基乙醇、乙?；掖肌６及ū?、丙二醇、聚乙二醇和其它低分子量二元醇如甘油和硫代甘油。輸送增強(qiáng)劑的其它實(shí)例是乙酸鹽，例如乙酸、葡糖酸和乙酸鈉。高滲鹽溶液如1M NaCl也是輸送增強(qiáng)劑的實(shí)例。表面活性劑的實(shí)例是十二烷基硫酸鈉(SDS)和溶血卵磷脂、多乙氧基醚、壬基苯氧基聚氧乙烯、溶血磷脂酰膽堿、聚乙二醇400、多乙氧基醚、聚氧乙烯醚、聚乙二醇醚表面活性劑和DMSO。可以使用的膽汁鹽例如為?；悄懰帷⑴；敲撗跄懰徕c、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸鹽、甘氨膽酸、鵝脫氧甘膽酸和其它收斂劑，例如硝酸銀。還可以使用象季銨一樣的肝素拮抗劑，例如硫酸魚(yú)精蛋白。可以使用的環(huán)加氧酶抑制劑例如為水楊酸鈉、水楊酸和非甾族類(lèi)抗炎藥(NSAIDS)，例如吲哚美辛、萘普生、雙氯酚酸鈉。輸送增強(qiáng)劑包括式I的化合物I其中X1和X2選自膽酸基、脫氧膽酸基和糖基，m為2-8的整數(shù)，優(yōu)選為2或3，n為2-8的整數(shù)，優(yōu)選為2或3，而R是陽(yáng)離子基團(tuán)、糖基或-CO-X3結(jié)構(gòu)，其中X3為糖基。所述糖基可選自戊糖單糖基、己糖單糖基、戊糖-戊糖二糖基、已糖-己糖二糖基、戊糖-已糖二糖基和己糖-戊糖二糖基。
術(shù)語(yǔ)“洗滌劑”包括陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子和非離子洗滌劑。洗滌劑的實(shí)例包括但不限于?；悄懰?、脫氧膽酸、脫氧牛磺膽酸、十六烷基苯基偶氮二氨基吡啶、氯化苯甲烴銨(benalkonium chloride)、Zwittergent 3-14洗滌劑、CHAPS(3-[(3-膽酰氨丙基)二甲銨]-1-丙磺酸酯水合物)、Big CHAP、脫氧Big CHAP、Triton-X-100洗滌劑、C12E8、辛基-B-D-吡喃葡糖苷、PLURONIC-F68洗滌劑、吐溫20洗滌劑和吐溫80洗滌劑(CalBiochem Biochemicals)。
本發(fā)明的單位劑型可以包含在一個(gè)產(chǎn)物試劑盒中，該試劑盒含有凍干形式的權(quán)利要求1的重組病毒和重構(gòu)所述凍干產(chǎn)物的溶液。本發(fā)明的重組病毒可以通過(guò)常規(guī)方法凍干并重構(gòu)。
本發(fā)明的載體也可以和鈣蛋白酶抑制劑一起給予。所述“鈣蛋白酶抑制劑”(簡(jiǎn)寫(xiě)為“CI”)是指抑制鈣蛋白酶I例如μ-鈣蛋白酶蛋白水解作用的化合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)鈣蛋白酶抑制劑包括除了其它生物活性以外還具有鈣蛋白酶I抑制活性的那些化合物，或者獨(dú)立于其它生物活性而具有鈣蛋白酶I抑制活性的那些化合物。已經(jīng)證實(shí)，各種各樣的化合物都具有抑制鈣蛋白酶蛋白水解作用的活性。用于實(shí)施本發(fā)明的鈣蛋白酶抑制劑的實(shí)例包括也稱(chēng)為“鈣蛋白酶抑制劑1”的N-乙?；?leu-leu-正亮氨酸(norleucinal)。已經(jīng)觀(guān)察到鈣蛋白酶抑制劑增加細(xì)胞對(duì)病毒載體的感染性，利用增加水平的NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，以及減少對(duì)腺病毒載體的CTL應(yīng)答。因此，本發(fā)明的制劑和方法可任選地包括鈣蛋白酶抑制劑。鈣蛋白酶抑制劑及其應(yīng)用描述于1998年10月15日提交的Atencio等的共同未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)第60/104,321和09/073,076號(hào)。
使用方法本發(fā)明提供一種方法，該方法通過(guò)使靶細(xì)胞與本發(fā)明的選擇性復(fù)制載體接觸，殺傷調(diào)節(jié)途徑缺陷的細(xì)胞。在本文例舉的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含途徑缺陷的所述細(xì)胞是贅生性細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“贅生性細(xì)胞”是表現(xiàn)出與正常細(xì)胞生長(zhǎng)控制無(wú)關(guān)為特征的異常生長(zhǎng)表型的細(xì)胞。因?yàn)橘樕约?xì)胞不一定在任何特定時(shí)間點(diǎn)復(fù)制，所以術(shù)語(yǔ)贅生性細(xì)胞包含可活躍復(fù)制的細(xì)胞或處于暫時(shí)非復(fù)制性靜止?fàn)顟B(tài)(G1或G0)的細(xì)胞。贅生性細(xì)胞的局部群體稱(chēng)為瘤。瘤可以為惡性或良性。惡性瘤也稱(chēng)為癌癥。術(shù)語(yǔ)癌癥和術(shù)語(yǔ)腫瘤在本文中交替使用。瘤性轉(zhuǎn)化是指正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橘樕约?xì)胞，通常為腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明提供一種方法，該方法通過(guò)給予藥學(xué)上可接受的本發(fā)明的重組腺病毒制劑，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)消除贅生性細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“消除”是指活的贅生性細(xì)胞群明顯減少，以便減輕存在所述贅生性細(xì)胞引起的生理失調(diào)。術(shù)語(yǔ)“明顯”是指在哺乳動(dòng)物機(jī)體中活的贅生性細(xì)胞群的減少為處理前群的約20％以上。術(shù)語(yǔ)“活的”是指具有贅生性細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)特征。術(shù)語(yǔ)“活的贅生性細(xì)胞”在本文中用于區(qū)分所述細(xì)胞和不能再?gòu)?fù)制的贅生性細(xì)胞。例如，腫瘤塊可以在治療后繼續(xù)存在，但組成所述腫瘤塊的細(xì)胞群可能是死的。即使某些腫瘤塊還可能保留，但這些死亡的細(xì)胞已經(jīng)被切除或失去復(fù)制能力。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括但不限于人、豬、馬、牛、犬、貓。最好是使用對(duì)治療的哺乳動(dòng)物類(lèi)型為內(nèi)源性的腺病毒載體。盡管使用來(lái)自待治療物種的病毒通常是有利的，但在某些情況下，可優(yōu)選使用具有有利的病原特征的得自不同物種的載體。例如，有報(bào)道(1997年4月10日公開(kāi)的WO97/06826)指出可在人類(lèi)基因治療中使用綿羊腺病毒載體，以使人腺病毒載體的免疫應(yīng)答特征最小化。通過(guò)使免疫應(yīng)答最小化，避免了所述載體的快速系統(tǒng)性清除，導(dǎo)致所述載體作用時(shí)間更長(zhǎng)。
本發(fā)明的載體特別適用于治療與缺乏TGF-β抗增殖作用有關(guān)的腫瘤，包括但不限于乳癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌和皮膚癌，以及B淋巴瘤和T淋巴瘤(Markowitz和Roberts，1996)。已經(jīng)在結(jié)腸癌、胃癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌中鑒定出II型TGF-β受體的突變。也已經(jīng)在Kaposi肉瘤、乳腺腫瘤、卵巢腫瘤和結(jié)腸直腸腫瘤中發(fā)現(xiàn)了I型TGF-β受體缺失的突變。在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子Smad中，Smad4/DPC4被鑒定為侯選腫瘤抑制基因，它在接近50％的胰腺癌中發(fā)生改變。在結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌中也發(fā)現(xiàn)了改變的DPC4基因，盡管機(jī)率低得多。本發(fā)明的載體特別用于治療TGF-β不敏感的腫瘤，例如胰腺癌。
本發(fā)明的載體還適用于治療含p53途徑缺陷的腫瘤細(xì)胞。這些腫瘤包括具有p53、mdm2和p14/p19ARF(INK4a基因)改變的腫瘤。本發(fā)明的載體還可用于治療Rb途徑缺陷的癌細(xì)胞。Rb途徑缺陷起因于Rb、細(xì)胞周期蛋白D、依賴(lài)細(xì)胞周期蛋白的激酶(例如CDK4)和p16(INK4a基因)的改變。
盡管本發(fā)明提供了單獨(dú)使用所述重組腺病毒的方法，但本發(fā)明的重組腺病毒及其制劑還可以同常規(guī)化療藥物或治療方案聯(lián)合使用。這種化療藥物的實(shí)例包括嘌呤合成抑制劑(例如戊制茵素、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤、氨甲蝶呤)或嘧啶合成抑制劑(例如Pala、azarbine)、核糖核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鹾颂呛塑账?例如羥脲)、dTMP合成抑制劑(5-氟尿嘧啶)、DNA損傷劑(例如放射、博來(lái)霉素、鬼臼亞乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、放線(xiàn)菌素、道諾紅霉素、阿霉素、二羥基蒽酮、烷化劑、絲裂霉素、順氯氨鉑、普魯芐肼)以及微管功能抑制劑(例如長(zhǎng)春花生物堿和秋水仙素)?；熤委煼桨钢饕侵赣脕?lái)切除贅生性細(xì)胞的非化學(xué)方法，例如放射性治療。當(dāng)所述治療性基因?yàn)閜53時(shí)，聯(lián)合治療的實(shí)例描述于1998年8月20日公開(kāi)的Nielsen等的WO/9835554A2。
免疫應(yīng)答對(duì)體內(nèi)重復(fù)給予病毒載體是重要的。因此，本發(fā)明的載體可以和免疫抑制劑聯(lián)合給予。免疫抑制劑的實(shí)例包括環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、環(huán)磷酰胺、淋巴細(xì)胞免疫球蛋白、抗CD3復(fù)合物的抗體、腎上腺皮質(zhì)類(lèi)固醇、水楊酸偶氮磺胺吡啶、FK-506、敏白靈和酞胺哌啶酮。
本發(fā)明還提供一種方法，該方法通過(guò)向贅生性細(xì)胞污染的正常細(xì)胞群給予本發(fā)明的重組腺病毒，體外切除所述細(xì)胞群中的贅生性細(xì)胞。目前該方法的一個(gè)應(yīng)用實(shí)例是用于體外用途，例如通常稱(chēng)為骨髓清洗的自身干細(xì)胞制品清洗。術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞制品”是指能夠再建接受myoablative therpay患者的長(zhǎng)期造血功能的造血細(xì)胞群、祖細(xì)胞群和干細(xì)胞群。干細(xì)胞制品通常由取出(apheresis)或流動(dòng)或非流動(dòng)的外周血獲得。通常使用已知方法，采用市售的取出裝置，例如COBEIntemational，Oak街1185號(hào)，Lakewood，CO出售的COBE光譜取出系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)取出。最好是優(yōu)化治療條件以達(dá)到“3個(gè)對(duì)數(shù)的清洗”(即從干細(xì)胞制品中去除約99.9％的腫瘤細(xì)胞)，最優(yōu)選是達(dá)到“5個(gè)對(duì)數(shù)的清洗”(即去除干細(xì)胞制品中約99.999％的腫瘤細(xì)胞)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，100ml體積的干細(xì)胞制品應(yīng)以約2×1011本發(fā)明載體的顆粒數(shù)/有核細(xì)胞比率于37℃處理約4小時(shí)。
診斷用途除了上述治療用途以外，本發(fā)明的載體還用于診斷目的。例如，本發(fā)明的載體可加入在病毒感染和復(fù)制時(shí)表達(dá)的報(bào)道基因。術(shù)語(yǔ)“報(bào)道基因”是指其產(chǎn)物能夠單獨(dú)或與其它元件組合產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的基因。報(bào)道基因的實(shí)例包括β-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、編碼可通過(guò)如X射線(xiàn)的成象系統(tǒng)或磁場(chǎng)成象系統(tǒng)(MRI)檢測(cè)的蛋白的核苷酸序列。這樣的載體將用于檢測(cè)功能性途徑(例如p53途徑或TGF-β途徑)的存在?；蛘?，這類(lèi)載體也可以用于表達(dá)能夠被例如熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合分子識(shí)別的細(xì)胞表面蛋白?；蛘撸渲惺褂猛緩叫?yīng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)病毒復(fù)制阻遏物(例如E2F-Rb)的晚期病毒啟動(dòng)子(例如由E2F-Rb產(chǎn)生的E2或任何具有例如E2F結(jié)合位點(diǎn)的阻遏物結(jié)合位點(diǎn)的其它啟動(dòng)子)，可用于控制用于診斷用途的、其中沒(méi)有途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的報(bào)道基因。這些診斷構(gòu)建物可用于體內(nèi)或體外診斷目的。體內(nèi)的應(yīng)用實(shí)例包括成象用途，例如X射線(xiàn)、CT掃描或磁共振成象(MRI)。
載體的制備方法本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生如上所述的重組病毒的方法，所述方法包括以下步驟
a.用重組病毒感染生產(chǎn)細(xì)胞，b.在多種條件下培養(yǎng)所述感染的生產(chǎn)細(xì)胞，以允許所述病毒基因組在所述生產(chǎn)細(xì)胞中復(fù)制，c.收獲所述生產(chǎn)細(xì)胞，和d.純化所述重組病毒。
術(shù)語(yǔ)“感染”是指在多種條件下將所述重組病毒暴露于所述生產(chǎn)細(xì)胞，以促進(jìn)重組腺病毒感染生產(chǎn)細(xì)胞。在已經(jīng)被多拷貝的特定病毒感染的細(xì)胞中，病毒復(fù)制和病毒體包裝所需的活性是協(xié)同的。因此，最好是調(diào)整這些條件，使得存在明顯的所述病毒多次感染所述生產(chǎn)細(xì)胞的可能性。增強(qiáng)病毒在所述生產(chǎn)細(xì)胞中產(chǎn)生的一個(gè)條件實(shí)例是增加感染階段的病毒濃度。然而，每個(gè)生產(chǎn)細(xì)胞的病毒感染總數(shù)有可能過(guò)多，導(dǎo)致對(duì)所述細(xì)胞的毒性作用。因此，人們應(yīng)當(dāng)努力將病毒感染濃度保持在1×106至1×1010病毒體/ml的范圍內(nèi)，最好是約1×109病毒體ml。也可以使用化學(xué)試劑增加生產(chǎn)細(xì)胞系的感染性。例如，本發(fā)明提供一種利用鈣蛋白酶抑制劑的內(nèi)含物增加生產(chǎn)細(xì)胞系對(duì)病毒感染的感染性的方法。用于實(shí)施本發(fā)明的鈣蛋白酶抑制劑的實(shí)例包括鈣蛋白酶抑制劑1(也稱(chēng)為N-乙?；?亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸，可由Boehringer Mannheim購(gòu)買(mǎi))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑1增加生產(chǎn)細(xì)胞系對(duì)重組腺病毒的感染性。
術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)細(xì)胞”是指能夠促進(jìn)所產(chǎn)生的重組腺病毒的病毒基因組復(fù)制的細(xì)胞?？晒_(kāi)獲得各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系用于培養(yǎng)重組腺病毒。例如，已對(duì)293細(xì)胞系(Graham和Smiley(1977)J.Gen.Virol.3659-72)進(jìn)行工程改造，以補(bǔ)充E1功能的缺陷，該細(xì)胞系是用于生產(chǎn)所述載體的優(yōu)選細(xì)胞系。其它生產(chǎn)細(xì)胞的實(shí)例包括Hela細(xì)胞、PERC.6細(xì)胞(如公開(kāi)號(hào)WO/97/00326，申請(qǐng)序列號(hào)為PCT/NL96/00244中所述)。
術(shù)語(yǔ)“在多種條件下培養(yǎng)，以允許所述病毒基因組復(fù)制”是指保持感染生產(chǎn)細(xì)胞的條件，以便允許所述病毒在所述生產(chǎn)細(xì)胞中繁殖。理想的是控制條件，使得每個(gè)細(xì)胞生產(chǎn)的病毒顆粒的數(shù)量最大。因此，監(jiān)測(cè)和控制反應(yīng)條件，例如溫度、溶解氧、pH等，將是必需的。市售的生物反應(yīng)器例如CelliGen Plus生物反應(yīng)器(購(gòu)自New BrunswickScientific，Inc.44 Talmadge Road，Edison，NJ)具有監(jiān)測(cè)和保持這類(lèi)參數(shù)的裝置。然而，最佳的感染和培養(yǎng)條件將多少有所變化，本領(lǐng)域的技術(shù)人員考慮了所述生產(chǎn)細(xì)胞系的已知特性、所述病毒的特性、生物反應(yīng)器類(lèi)型等后，可以獲得病毒有效復(fù)制和生產(chǎn)的條件。當(dāng)使用293細(xì)胞作為生產(chǎn)細(xì)胞系時(shí)，氧濃度最好保持在約50％-約120％溶解氧，優(yōu)選100％溶解氧。當(dāng)病毒顆粒的濃度(通過(guò)常規(guī)方法例如使用Resource Q柱的HPLC進(jìn)行測(cè)定)開(kāi)始達(dá)到穩(wěn)定水平時(shí)，對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行收獲。
術(shù)語(yǔ)“收獲”是指由培養(yǎng)基中收集含所述重組腺病毒的細(xì)胞。這可以通過(guò)常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)，例如差速離心法或?qū)游龇?。在此階段，可儲(chǔ)存的收獲的細(xì)胞，或者可通過(guò)裂解和純化進(jìn)一步加工收獲的細(xì)胞，以分離所述重組病毒。對(duì)于儲(chǔ)存而言，所收獲的細(xì)胞應(yīng)以生理pH或在生理pH左右緩沖，并冷凍于-70℃。
術(shù)語(yǔ)“裂解”是指破裂所述生產(chǎn)細(xì)胞。通過(guò)各種本領(lǐng)域已熟知方法可以實(shí)現(xiàn)裂解。當(dāng)需要由所述生產(chǎn)細(xì)胞分離病毒顆粒時(shí)，使用各種本領(lǐng)域已知方法裂解細(xì)胞。例如，可在低壓(100-200psi分壓)條件下或用常規(guī)凍融法裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通過(guò)用DNA酶/RNA酶降解除去外源性游離的DNA/RNA。
術(shù)語(yǔ)“純化”是指由裂解的生產(chǎn)細(xì)胞中分離大致純的重組病毒顆粒群?？梢允褂贸Ｒ?guī)的純化技術(shù)，例如層析法或密度差異梯度離心法。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)踐中，基本按照如在1995年3月7日提交的共同未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)第08/400,793號(hào)中所述的Huyghe等(1995)Human Gene Therapy 61403-1416的方法，通過(guò)柱層析純化所述病毒。
其它的優(yōu)化本發(fā)明的重組腺病毒生產(chǎn)的方法和步驟描述于1998年5月4日提交的共同未決美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)第09/073,076號(hào)，題目病毒生產(chǎn)方法。
實(shí)施例以下的實(shí)施例提供了試驗(yàn)的方法和結(jié)果，證實(shí)具體重組腺病毒和質(zhì)粒載體的構(gòu)建。對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明可以有別于這些實(shí)施例中具體公開(kāi)的形式實(shí)施，而不背離本發(fā)明的宗旨或基本特征。因此，以下描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案被認(rèn)為是說(shuō)明性的和非限制性的。在以下的實(shí)施例中，“g”代表克，“ml”代表毫升，“mol”代表摩爾，“℃”代表攝氏度，“min”代表分鐘，“FBS”代表胎牛血清，而“PN”是指重組病毒的顆粒數(shù)。
實(shí)施例1.質(zhì)粒構(gòu)建在800bp的PAI啟動(dòng)子控制下編碼熒光素酶的質(zhì)粒p800luc得自David Luskutoff博士(Scripps Institute，LaJolla，California)。在腺病毒-5三聯(lián)前導(dǎo)序列后含一個(gè)CMV啟動(dòng)子和在E2F-RB融合蛋白編碼序列上游含一個(gè)SV40增強(qiáng)子的質(zhì)粒pCTMIE-E2F-Rb由Doug Antelman(Canji)提供。
實(shí)施例2.構(gòu)建具有TGF-β效應(yīng)啟動(dòng)子的熒光素酶質(zhì)粒A.PAI-熒光素酶質(zhì)粒以5′-3′方向顯示所有片段的序列。一個(gè)749bp的片段兩側(cè)于5′和3′末端分別具有SacI位點(diǎn)和XhoI位點(diǎn)，并且由SV40 TATA盒代替所述啟動(dòng)子中的天然TATA盒，使用模板p800luc和引物AGT CGAGCT CCA ACC TCA GCC AGA和GAT CCT CGA GCT CCT CTGTGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC(含SV 40 TATA盒)，通過(guò)PCR擴(kuò)增該片段。獲得的PCR產(chǎn)物用SacI和XhoI消化，并連接至在消化一種不含啟動(dòng)子的熒光素酶構(gòu)建物PGL3-基(basic))(Promega)之后獲得的片段，以獲得PAI-熒光素酶。B.SRE-熒光素酶質(zhì)粒退火以下的寡核苷酸GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGCCCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC和GAT CCT CGA GCT CCTCTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC。用XhoI消化退火產(chǎn)物，并連接至用MluI消化的PGL3-基，用Klenow平端化，并用XhoI消化以獲得pSVT-luc(一種具有SV40 TATA盒的熒光素酶構(gòu)建物)。退火含Smad4/DPC4結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸CGT CTA GAC GTC TAGACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC和AGT CTA GAC GTC TAGACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC，并連接至用KpnI消化的pSVT-熒光素酶，獲得SRE-熒光素酶質(zhì)粒。
實(shí)施例3.構(gòu)建具有p53效應(yīng)啟動(dòng)子的熒光素酶質(zhì)粒A.RGC-熒光素酶質(zhì)粒退火兩個(gè)含核糖體基因簇的p53結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)性5′-磷酸化寡核苷酸AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AACTCG TGG TAC和CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTGCCT TTT CTG TAC。將退火的片段連接至用KpnI消化的pSVT-熒光素酶，獲得RGC-熒光素酶質(zhì)粒。B.p53CON-熒光素酶質(zhì)粒退火兩個(gè)含共有p53結(jié)合位點(diǎn)(p53CON)的互補(bǔ)性5′-磷酸化寡核苷酸CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GACATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC和AG GAC ATG CCC GGG CATGTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGGTAC。將退火的片段連接至周KpnI消化的pSVT-熒光素酶，獲得p53CON-熒光素酶質(zhì)粒。C.PAI-E2F-Rb質(zhì)粒
通過(guò)用BglI和XbaI消化，切除質(zhì)粒pCTMIE-E2F-Rb中的序列，該序列在腺病毒-5三聯(lián)前導(dǎo)序列后含有CMV啟動(dòng)子，并在E2F-RB融合蛋白的編碼序列上游含有一個(gè)SV40增強(qiáng)子，連接所獲得的片段，獲得啟動(dòng)子減少的E2F-RB質(zhì)粒。通過(guò)用SacI和XhoI消化，由質(zhì)粒PAI-熒光素酶切除含修飾的PAI啟動(dòng)子的片段，并用Klenow處理進(jìn)行平端化。將該片段連接至用EeoR消化并用DNA聚合酶I的Klenow片段處理的啟動(dòng)子減少的E2F-RB質(zhì)粒，獲得PAI-E2F-RB質(zhì)粒。
實(shí)施例4.重組腺病毒的制備用BamHI、AccI和Klenow處理由pBHG11(26676至34140)至pNEB193(來(lái)自NEB的質(zhì)粒)的7.4kb的SnaBI片段，通過(guò)克隆該片段構(gòu)建含E3區(qū)缺失3-kb的Ad5序列的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNEBΔE3。通過(guò)退火5-磷酸化寡核苷酸AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCCGCT CGC GAG GAT CCT TAA T和TAA GGA TCC TCG CGA GCGGCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T，并通過(guò)連接至用PacI消化的pNEBΔE3引入退火的片段，將多個(gè)克隆位點(diǎn)引入上述質(zhì)粒中，獲得pNEBΔE3(MCS)質(zhì)粒。
如下構(gòu)建產(chǎn)生重組腺病毒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼處于PΔI-啟動(dòng)子控制下的E2F-Rb和處于CMV啟動(dòng)子控制下的增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(GFP)。通過(guò)連接含PAI啟動(dòng)子的片段和用NacI和XbaI消化PAI-E2F-Rb制備的E2F-Rb編碼序列，并連接至用KpnI消化制備的pABS.4質(zhì)粒(Microbix)片段，用Klenow處理，并用XbaI再消化，制備中間態(tài)載體pABS.4-E2F-Rb。然后用PacI消化，用Klenow處理，由質(zhì)粒pABS.4-E2F-Rb切除含PAI啟動(dòng)子、E2F-Rb編碼序列和卡那霉素基因的片段，并連接至用PacI消化pNEBΔE3質(zhì)粒并用Klenow處理獲得的質(zhì)粒片段，獲得不含PacI位點(diǎn)的質(zhì)粒pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb。通過(guò)用SwaI消化pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb，并將其連接至用AflII和SspI消化并用Klenow處理由pEGFP-N(Clontech)分離的片段，用有效連接至綠色熒光蛋白(GFP)基因的CMV啟動(dòng)子替換該質(zhì)粒中的卡那霉素基因，獲得pΔE3-PAI-E2F-Rb-GFP質(zhì)粒。
如下構(gòu)建產(chǎn)生重組腺病毒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼處于含SRE的TGF-β效應(yīng)啟動(dòng)子控制下的E2F-Rb和處于CMV啟動(dòng)子控制下的增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(GFP)。通過(guò)連接用XbaI和NruI消化pNEBΔE3(MCS)而分離的片段和用XbaI和Nae I消化pCTMIE-E2F-Rb產(chǎn)生的片段，將E2F-Rb編碼序列引入質(zhì)粒pNEBΔE3(MCS)中，獲得質(zhì)粒pNEBΔE3-E2F-Rb。使用SRE熒光素酶模板和磷酸化引物GTA AGGTGC CAG AAC ATT TCT C和GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTGGGC CAC T，通過(guò)PCR擴(kuò)增含SRE的TGF-β效應(yīng)啟動(dòng)子，將該序列引入上述質(zhì)粒中。用SpeI消化所獲得的PCR產(chǎn)物，并連接至用SnaBI和XbaI消化的pNEBΔE3-E2F-Rb，獲得pΔE3-DPC-E2F-Rb。
如下構(gòu)建產(chǎn)生重組腺病毒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，該質(zhì)粒編碼處于p53效應(yīng)啟動(dòng)子控制下的E2F-Rb和處于CMV啟動(dòng)子控制下的增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(GFP)。使用RGC-熒光素酶模板或p53CON熒光素酶模板和磷酸化引物GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C和GAT ATC TAGACG TCC TCT GTG GGC CAC T，通過(guò)PCR擴(kuò)增含來(lái)自核糖體基因簇的p53結(jié)合位點(diǎn)或p53共有位點(diǎn)(p53CON)的p53效應(yīng)啟動(dòng)子序列，將該p53效應(yīng)啟動(dòng)子引入質(zhì)粒pNEBΔE3-E2F-Rb中。獲得的PCR產(chǎn)物用XbaI消化，并連接至SnaBI和XbaI消化的pNEBΔE3-E2F-Rb，獲得pΔE3-RGC-E2F-Rb和pdelataE3-PCON-E2F-Rb。
實(shí)施例5.產(chǎn)生重組腺病毒的同源重組如Chartier等，(1996)J.Virol.704805-4810所述，通過(guò)在細(xì)茵中進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒PAI-Ad、SRE-Ad、RGC-Ad和CON-Ad。用AscI消化所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，獲得含有處于途徑效應(yīng)啟動(dòng)子控制下的E2F-Rb和處于位于Ad5序列側(cè)翼的CMV啟動(dòng)子控制下的GFP的片段。將所獲得的片段與用BstBI和SpeI消化PTG4609(得自Transgene，Inc.并描述于Chartier等，(1996)J.Virol.704805-4810)獲得的片段共轉(zhuǎn)化到BJ5183細(xì)菌菌株中。在所獲得的細(xì)菌菌落中篩選存在所需的重組Ad5感染性質(zhì)粒pPAI-GFP-Ad、pSRE-GFP-Ad、pRGC-GFP-Ad和pCON-GFP-Ad的茵落。然后用PacI消化這些感染性質(zhì)粒，使之線(xiàn)性化，并通過(guò)苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀純化，用于轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。
使用Superfect(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用2.5μg的線(xiàn)性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在每孔含12μl Superfect的6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)的250,000個(gè)細(xì)胞。8天后，觀(guān)察到起因于病毒的產(chǎn)生的細(xì)胞致病作用。收獲細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液，并進(jìn)行3輪凍融循環(huán)。通過(guò)再感染293細(xì)胞擴(kuò)增所產(chǎn)生的裂解液中的重組病毒。
實(shí)施例6.細(xì)胞系在本研究中使用的所有細(xì)胞系都得自ATCC(Rockville，MD)，并于CO2培養(yǎng)箱中保持37℃，培養(yǎng)成為單層培養(yǎng)物。293、Hep3B、MRC9、A549、PancI、U87、Caco2、MCF-7和WIDR保持在補(bǔ)加10％胎牛血清的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基中。MDA-MB468細(xì)胞在補(bǔ)加10％胎牛血清的Ham培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而MiaPaca-2細(xì)胞在補(bǔ)加10％胎牛血清和2.5％馬血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
實(shí)施例7.轉(zhuǎn)染將細(xì)胞平板接種或者在6孔培養(yǎng)板(250,000細(xì)胞/孔)或者在24孔培養(yǎng)板(62,500細(xì)胞/孔)中，并使細(xì)胞過(guò)夜附著。然后如所述對(duì)293細(xì)胞使用磷酸鈣進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)其它細(xì)胞使用Superfect(Qiagen)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例8.報(bào)道基因/熒光素酶測(cè)定用1.5μg報(bào)道基因質(zhì)粒和1.0μg所述抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過(guò)將細(xì)胞加入1X報(bào)道基因裂解緩沖液(Promega)中并于室溫溫育10分鐘，制備裂解物。使用Top Count(Packard)和Packard的檢測(cè)試劑盒，按照Packard的說(shuō)明書(shū)測(cè)定熒光素酶活性。
實(shí)施例9.檢測(cè)病毒介導(dǎo)的細(xì)胞致病作用的分析用標(biāo)明的重組或野生型腺病毒感染細(xì)胞，并在感染后的6天中，基本上按照Bischoff等，(1996)Science 274373-376描述的方法，用在20％乙醇中制備的0.5％結(jié)晶紫染色。
實(shí)施例10.構(gòu)建cU3EE和cT1LT病毒使用引物GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCTAGG GC和GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG，使用諸如質(zhì)粒pFG140(Microbix)中的Ad5 DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增MLP啟動(dòng)子序列。然后在質(zhì)粒pdelataE3-PCON-E2F-Rb中的PacI位點(diǎn)克隆MLP PCR產(chǎn)物，獲得pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP。使用引物GCG ACC CAC CCT AAC AGA和GAT CGG ATC CAA AGCGCA ACA AGG GTC A，通過(guò)PCR擴(kuò)增腺病毒E3 10.5K蛋白編碼序列，獲得的PCR產(chǎn)物克隆在質(zhì)粒pCDNA3.1(Invitrogen)中的Xho I位點(diǎn)，獲得pCDNA3-10.5質(zhì)粒。然后用DraIII和XbaI消化繼之以Klenow處理，由pCDNA3-10.5中切除腺病毒E3 10.5K蛋白編碼序列，并將其連接至PacI和Klenow處理的pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP，獲得pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K質(zhì)粒。
如Chartier等，(1996)J.Virol.704805-4810所述，通過(guò)在細(xì)菌中進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒cU3EE和cT1LT。用AscI消化所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，獲得包含處于p53CON序列控制下的E2F-Rb和處于位于Ad5序列側(cè)翼的MLP啟動(dòng)子控制下的E310.5K的片段。將所獲得的片段和通過(guò)用BstBI和SpeI消化PTG4609(Transgene)獲得的片段共轉(zhuǎn)化到BJ 5283細(xì)菌菌株中。在所獲得的細(xì)菌菌落中篩選存在所需的重組Ad5感染性質(zhì)粒pCEMD的菌落。按照相似的方法，但是使用PTG4609衍生物(Transgene)獲得Ad5感染性質(zhì)粒p01/CEMD，在所述PTG4609衍生物中，用含具有01突變的E1A的序列代替野生型E1A序列。然后通過(guò)用PacI消化，使這些感染性質(zhì)粒線(xiàn)性化，并通過(guò)苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀純化，用于轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。
使用Superfect(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明對(duì)質(zhì)粒pCEMD和p01/CEMD進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別產(chǎn)生重組病毒cU3EE和cT1LT。使用2.5μg的線(xiàn)性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在每孔含12μl Superfect的6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)的500,000個(gè)細(xì)胞。8天后，觀(guān)察到起因于病毒產(chǎn)生的細(xì)胞致病作用。收獲細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液，并進(jìn)行3輪凍融循環(huán)。通過(guò)再感染293細(xì)胞擴(kuò)增所產(chǎn)生的裂解液中的重組病毒。
權(quán)利要求
1.一種選擇性復(fù)制的重組病毒，它包含有效連接至病毒復(fù)制阻遏物的途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。
2.權(quán)利要求1的載體，其中所述途徑效應(yīng)啟動(dòng)子選自p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子、Rb途徑效應(yīng)啟動(dòng)子和TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求2的載體，其中所述病毒得自腺病毒科病毒屬(genus adenoviridiae)。
4.權(quán)利要求3的載體，其中所述病毒復(fù)制阻遏物為E2F-RB。
5.權(quán)利要求4的載體，它還包含一個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。
6.權(quán)利要求5的載體，其中所述治療性轉(zhuǎn)基因?yàn)樵蛲?pro-apoptotic)基因。
7.權(quán)利要求6的載體，其中所述前體藥物激活基因?yàn)锳d5E3-10.5K。
8.權(quán)利要求4的載體，它還包含E1功能的缺失，以便消除p300結(jié)合。
9.包含一種選擇性復(fù)制的重組病毒和一種藥學(xué)上可接受的載體的藥用制劑，所述重組病毒含有一個(gè)有效連接至病毒復(fù)制阻遏物的途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求9的制劑，其中所述病毒得自腺病毒科病毒屬。
11.權(quán)利要求10的載體，其中所述病毒復(fù)制阻遏物為E2F-RB。
12.權(quán)利要求11的載體，它還包含一個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。
13.權(quán)利要求12的載體，其中所述治療性轉(zhuǎn)基因?yàn)樵蛲龌颉?br> 14.權(quán)利要求13的載體，其中所述前體藥物激活基因?yàn)锳d5E3-10.5K。
15.權(quán)利要求14的載體，它還包含E1功能的缺失，以便消除p300結(jié)合。
16.權(quán)利要求14的制劑，它還含有一種輸送增強(qiáng)劑。
17.一種方法，通過(guò)使途徑缺陷細(xì)胞接觸包含有效連接至病毒復(fù)制阻遏物的途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的選擇性復(fù)制重組病毒，殺傷所述靶細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述方法在體內(nèi)實(shí)施。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述載體通過(guò)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)(intratumoral)注射給予。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述方法在體外實(shí)施。
21.權(quán)利要求14的方法，其中所述方法在體外實(shí)施，以消除干細(xì)胞制品中的腫瘤細(xì)胞。
22.用選擇性復(fù)制重組病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述重組病毒含有有效連接至病毒復(fù)制阻遏物的途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。
23.基本選自p53CON和RGC的p53途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。
24.選自PAI和SRE的TGF-β途徑效應(yīng)啟動(dòng)子。
25.一種重組腺病毒載體，它包含多個(gè)途徑效應(yīng)啟動(dòng)子，使得所述病毒能夠選擇性地在具有多個(gè)途徑缺陷的細(xì)胞中復(fù)制。
26.組件包含權(quán)利要求1的選擇性復(fù)制病毒的診斷試劑盒，它還含有一個(gè)含報(bào)道基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒和正確使用的說(shuō)明書(shū)。
27.制備權(quán)利要求1的選擇性復(fù)制載體的方法，所述方法包含以下步驟(a)用重組病毒感染生產(chǎn)細(xì)胞，(b)在多種條件下培養(yǎng)所述感染的生產(chǎn)細(xì)胞，以便允許所述病毒(c)基因組在所述生產(chǎn)細(xì)胞中復(fù)制，(d)收獲所述生產(chǎn)細(xì)胞，和(e)純化所述重組病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供重組病毒,所述重組病毒通過(guò)利用途徑效應(yīng)啟動(dòng)子,隨著靶細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境選擇性地復(fù)制所述病毒的基因組,所述途徑效應(yīng)啟動(dòng)子基于被感染細(xì)胞的表型或基因型在宿主細(xì)胞中顯著抑制病毒復(fù)制。在所述靶細(xì)胞中,所述途徑效應(yīng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子元件是失活的,因此允許所述病毒復(fù)制。這導(dǎo)致:(1)通過(guò)所述病毒的自身裂解特性殺傷所述細(xì)胞,和/或(2)提供針對(duì)所述靶細(xì)胞的治療劑量(相對(duì)于不能復(fù)制的載體增加)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物,以及(3)產(chǎn)生局限性濃度的所述病毒,促進(jìn)周?chē)募?xì)胞感染所述重組病毒。本發(fā)明還提供使用所述載體的治療和診斷方法、含所述載體的藥用制劑、制備所述載體及含所述載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C07K14/075GK1330715SQ99814361
公開(kāi)日2002年1月9日 申請(qǐng)日期1999年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月15日
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