專利名稱：：一種具有抗腫瘤作用的紅豆杉多糖的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種紅豆杉多糖的制備方法，具體的說是一種具有抗腫瘤作用的紅豆杉多糖的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
：紅豆杉是當(dāng)前世界上研究最熱門的藥用植物之一，現(xiàn)在圍繞紅豆杉的化學(xué)成分所作的研究當(dāng)中，絕大多數(shù)集中在紫杉烷類化合物的研究上，對非紫杉烷類化合物，特別是對大極性成分之一——多糖的關(guān)注相對較少。多糖本身是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有廣泛的藥理活性，從多糖組分著手，尋找紅豆杉中其它具有優(yōu)良生物活性的成分，是一個極具潛力的研究領(lǐng)域，多糖研究已成為天然藥物學(xué)和保健食品學(xué)的研究熱點問題之一，它既是尋找天然活性藥物分子的有效途徑，也是保健食品功能因子的研究項目之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有腫瘤治療作用的中草藥有效部位——紅豆杉多糖的制備方法與其藥物應(yīng)用。通過該制備方法制備得到的紅豆杉多糖以苯酚-硫酸法測得總多糖>90%，以凱式定氮法測定，其含氮量<1%，分子量分面范圍為12.9KDa-74.5KDa。所制備的紅豆杉多糖可制成軟膏、凝膠、片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿劑、滴丸、注射劑等制劑。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下—種具有腫瘤治療作用的中草藥有效部位——紅豆杉多糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)脫脂粉碎的紅豆杉干燥枝葉，以有機溶劑脫脂，將脫脂過的原料晾干，揮發(fā)除去有機溶劑。2)提取加入蒸餾水提取，水提取液過濾后，離心取上清液。上清液濃縮，將濃縮的水提取液用乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為70%，低溫靜置過夜后離心，取沉淀，用水復(fù)溶，冷凍結(jié)冰后，凍干。3)除蛋白將凍干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。4)除有機溶劑除蛋白后的溶液裝入透析袋進行透析以除去殘留的有機溶劑。透析后的多糖溶液濃縮后冷凍干燥得到粗多糖。根據(jù)上述制備方法，其特征在于更為具體的步驟為1)脫脂粉碎的紅豆杉干燥枝葉，以有機溶劑脫脂，將脫脂過的原料晾干，揮發(fā)除去有機溶劑。2)提取加入蒸餾水提取，水提取液過濾后，離心取上清液。清液減壓濃縮，將濃縮的水提取液用乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為70%，低溫靜置過夜后離心，取沉淀，用水復(fù)溶，冷凍結(jié)冰后，凍干。3)除蛋白將凍干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。4)除有機溶劑除蛋白后的溶液裝入透析袋進行透析以除去殘留的有機溶劑。透析后的多糖溶液濃縮后冷凍干燥得到粗多糖。以本發(fā)明所提供的制備方法簡單，適于工業(yè)化生產(chǎn)，通過該制備方法制備得到的紅豆杉多糖以苯酚_硫酸法測得總多糖>90%，以凱式定氮法測定，其含氮量<1%，分子量范圍為12.9KDa-74.5KDa，經(jīng)過體內(nèi)外試驗證明其具有很好的抗腫瘤作用，可在制備治療各種腫瘤的藥物中應(yīng)用?？筛鶕?jù)需要制成軟膏、凝膠、片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿劑、滴丸、注射劑等制劑。具體實施例方式實施例1:紅豆杉多糖的提取取紅豆杉干燥枝葉200g，粉碎后過20目篩，使用石油醚乙酸乙酯(1:1)除脂后，在8(TC進行熱水提取，按照1:3加入無水乙醇，在4t:醇沉24小時后，離心取沉淀，復(fù)溶后使用Sevag法除蛋白，將除蛋白后的糖溶液透析后凍干，得到紅豆杉多糖26.04g，為淺褐色，產(chǎn)率為13.02%。取提取得到的紅豆杉多糖，按照苯酚-硫酸法測定其糖含量，測定結(jié)果為93.2%，測得紅豆杉多糖的分子量分布為12.9KDa-68.5KDa。實施例2:紅豆杉多糖的提取取紅豆杉干燥枝葉200g，粉碎后過20目篩，使用石油醚乙酸乙酯(1:1)除脂后，在9(TC進行熱水提取，按照1:3加入無水乙醇，在4t:醇沉24小時后，離心取沉淀，復(fù)溶后使用酶解法除蛋白，將除蛋白后的糖溶液透析后凍干，得到紅豆杉多糖25.48g，產(chǎn)率為12.74%。取提取得到的紅豆杉多糖，按照苯酚-硫酸法測定其糖含量，測定結(jié)果為91.24%。取紅豆杉多糖，按照凝膠排阻色譜的方法測定多糖的分子量分布。測得紅豆杉多糖的分子量分布為14.5KDa-74.5KDa。通過凱式定氮測定紅豆杉多糖的含氮量為0.856%。實施例3:紅豆杉多糖的提取取紅豆杉干燥枝葉lkg，粉碎后使用石油醚乙酸乙酯(1:2)除脂，在8(TC進行水提取，按照l:3加入無水乙醇，在4t:放置24小時后，離心取沉淀，復(fù)溶后使用酶解法除蛋白，將除蛋白后的糖溶液透析后凍干，得到紅豆杉多糖114.2g，產(chǎn)率為11.4%。凱式定氮得含氮量為O.81%。糖含量為93.05%，分子量分布為13.2Da-71.2KDa。試驗例1:紅豆杉多糖的分子量分布取上述實施例所制備的紅豆杉多糖，按照凝膠排阻色譜的方法測定多糖的分子量分布。實驗方法如下制作分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，選用凝膠柱層析填料S印hacy1S_300測定粗多糖分子量分布。分別稱取5mg已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T3、T70、T500，溶于0.5ml洗脫液中，分次上柱，以蒸餾水作為洗脫液，流速18ml/h，自動部分收集器收集洗脫液，每管收集10min。用苯酚_硫酸法跟蹤檢測多糖洗脫液出峰情況，計算每種標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖出峰的洗脫體積Ve。以已知分子量為200萬的藍色葡聚糖標(biāo)定凝膠柱的空體積Vo，以葡萄糖確定凝膠柱的總體積Vt。以有效分配系數(shù)Kav為縱坐標(biāo)，以lgMw為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中分配系數(shù)Kav可由以下公式求得Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)其中Ve:待測樣品的糖峰洗脫體積；Vo:凝膠過濾色譜層析柱的空體積；Vt:凝膠過濾色譜層析柱的總體積。測定多糖分子量分布情況分別稱取紅豆杉粗多糖TMP5mg，溶于0.5ml洗脫液后分次上柱，測定多糖糖樣的分子量分布，根據(jù)所得的多糖糖樣的出峰洗脫體積，代入分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算紅豆杉粗多糖的分子量分布。結(jié)果顯示實施例1所制備得到的紅豆杉多糖的分子量分布為12.9KDa-68.5KDa;實施例2所制備得到的紅豆杉多糖的分子量分布為14.5KDa-74.5KDa;實施例3所制備得到的紅豆杉多糖的分子量分布為13.2Da-71.2KDa。所得紅豆杉多糖，分子量分布為12.9KDa-74.5KDa。試驗例2:紅豆杉多糖的對腫瘤細胞的細胞毒作用對上述實施例所制備的紅豆杉多糖，按照下述方法考察對人乳腺癌細胞MCF-7、人纖維瘤細胞HT1080、人宮頸癌細胞Hela、人慢性髓性白血病細胞K562、人前列腺癌細胞PC3、人肝癌細胞S匪C7721、人急性早幼粒白血病細胞HL-60的細胞毒作用。1、腫瘤細胞的培養(yǎng)在腫瘤細胞株人乳腺癌細胞MCF-7、人纖維瘤細胞HT1080、人宮頸癌細胞Hela、人慢性髓性白血病細胞K562、人前列腺癌細胞PC3、人肝癌細胞S匪C7721、人急性早幼粒白血病細胞HL-60在含體積分數(shù)為10%的小牛血清中加入RPMI1640或匿EM培養(yǎng)液，置于5%(A、37t:的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。2、實驗分組及處理實驗設(shè)1個空白對照組和6個不同濃度實驗組，分別為12.5、25、50、100、200、400iig/ml。取對數(shù)生長期人乳腺癌細胞MCF-7、人纖維瘤細胞HT1080、人宮頸癌細胞Hela、人慢性髓性白血病細胞K562、人前列腺癌細胞PC3、人肝癌細胞S匪C7721、人急性早幼粒白血病細胞HL-60以濃度1X104個/ml接種于25ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，24h后加入前述不同濃度的多糖樣品，作用48h后，胰酶消化離心，將細胞懸浮于PBS中，調(diào)濃度為1X105個/ml細胞懸液，備用。3、四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法測定收集對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF-7、人纖維瘤細胞HT1080、人宮頸癌細胞Hela、人慢性髓性白血病細胞K562、人前列腺癌細胞PC3、人肝癌細胞S匪C7721、人急性早幼粒白血病細胞HL-60接種于96孔板上，每個濃度設(shè)6個平行孔，在37°C，5%C02條件下繼續(xù)孵育24h，加入不同濃度的多糖溶液10iil，使終濃度分別12.5、25、50、100、200、400iig/ml，同時設(shè)陰性(0.9%NaCl)和陽性(順鉬)對照組。培養(yǎng)72h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20iil，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入100iil二甲亞砜振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)免疫測定儀490nm處測定各孔光密度值A(chǔ)，根據(jù)公式計算抑制率抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)X100%4、MTT法測定紅豆杉多糖對MCF-7細胞生長的影響結(jié)果見表2。表2.紅豆杉多糖對MCF-7細胞生長的影響樣品名稱濃度(pg/ml)抑制率IC5012.57,852510.26Abs5018.06>40010026,3220030.2540038.155、MTT法測定紅豆杉多糖對HT1080細胞生長的影響結(jié)果見表3。表3.紅豆杉多糖對HT1080細胞生長的影響樣品名稱濃度(|Jg/ml)抑制率IC5012.59.122524.73Abs5028,62>40010034.5020038.2040044.216、MTT法測定紅豆杉多糖對Hela細胞生長的影響結(jié)果見表4。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>7、MTT法測定紅豆杉多糖對K562細胞生長的影響結(jié)果見表5。表5.<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>8、MTT法測定紅豆杉多糖對PC3細胞生長的影響結(jié)果見表6。表6.紅豆杉多糖對PC3細胞生長的影響樣品名稱濃度(Hg/ml)抑制率IC5012.56.262515.89Abs5021.03>40010028.6420031.3340034.689、MTT法測定紅豆杉多糖對SMMC7721細胞生長的影響見表7。表7.紅豆杉多糖對SMMC7721細胞生長的影響樣品名稱濃度(嗎/ml)抑制率IC50Abs12.51.25>400253.645014.2510025.3120030,2140035.3210、MTT法測定紅豆杉多糖對HL-60細胞生長的影響結(jié)果見表8。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果顯示，不同濃度的紅豆杉多糖溶液對人乳腺癌細胞MCF-7、人纖維瘤細胞HT1080、人宮頸癌細胞Hela、人慢性髓性白血病細胞K562、人前列腺癌細胞PC3、人肝癌細胞S匪C7721、人急性早幼粒白血病細胞HL-60均有抑制作用，且抑制作用與濃度呈線性關(guān)系。權(quán)利要求一種紅豆杉多糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)脫脂粉碎的紅豆杉干燥枝葉，以有機溶劑脫脂，將脫脂過的原料晾干，揮發(fā)除去有機溶劑。2)提取使用蒸餾水提取，水提取液過濾后，高速離心，取上清液。上清液減壓濃縮，將濃縮的水提取液用乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為70％，低溫靜置過夜后離心，取沉淀，用水復(fù)溶，冷凍結(jié)冰后，凍干。3)除蛋白將凍干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。4)除有機溶劑除蛋白后的溶液裝入透析袋進行透析以除去殘留的有機溶劑。透析后的多糖溶液濃縮后冷凍干燥得到多糖。根據(jù)上述制備方法，其特征在于更為具體的步驟為1)脫脂粉碎的紅豆杉干燥枝葉，以有機溶劑脫脂，將脫脂過的原料晾干，揮發(fā)除去有機溶劑。2)提取加入蒸餾水提取，水提取液過濾后，離心取上清液。清液減壓濃縮，將濃縮的水提取液用乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為70％，低溫靜置過夜后離心，取沉淀，用水復(fù)溶，冷凍結(jié)冰后，凍干。3)除蛋白將凍干的提取物用水重新溶解后，使用Sevag法或酶解法除蛋白。4)除有機溶劑除蛋白后的溶液裝入透析袋進行透析以除去殘留的有機溶劑。透析后的多糖溶液減壓濃縮后冷凍干燥得到粗多糖。2.如權(quán)利要求l所述的一種紅豆杉多糖的制備方法，其特征在第(1)步驟中脫脂所用的有機溶劑為乙酸乙酯、石油醚、丙酮、乙醇。3.如權(quán)利要求l所述的一種紅豆杉多糖的制備方法，其特征在第(3)步驟中多糖的除蛋白方法為Sevag法或酶解法或者兩者聯(lián)合使用。4.如權(quán)利要求1所述的一種紅豆杉多糖的制備方法，其特征在于用該工藝制備得到的紅豆杉多糖的含量為>90X，含N量為〈1%，分子量分布范圍為12.9KDa-74.5KDa。5.如權(quán)利要求1所述的一種紅豆杉多糖的制備方法，其特征在于用該工藝制備得到的紅豆杉多糖對腫瘤具有治療作用。全文摘要本發(fā)明涉及一種南方紅豆杉多糖的提取方法及其用途。其步驟包括紅豆杉經(jīng)有機溶劑脫脂、熱水提取，乙醇沉淀，Sevag法除蛋白后，透析，冷凍干燥后得到紅豆杉多糖。得到的紅豆杉多糖經(jīng)硫酸-苯酚法測定糖含量，凝膠分子排阻色譜法測定分子量分布，凱式定氮法測定氮含量。所得紅豆杉多糖對多種癌癥具有緩解和治療作用。文檔編號C08B37/00GK101735330SQ20091019299公開日2010年6月16日申請日期2009年10月12日優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日發(fā)明者于榮敏,原菲申請人:于榮敏