專(zhuān)利名稱(chēng)：一種殼聚糖季銨鹽及其應(yīng)用的制作方法
一種殼聚糖季銨鹽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種殼聚糖季銨鹽及其應(yīng)用。背景技術(shù)：
骨科內(nèi)植物術(shù)后感染是此類(lèi)手術(shù)嚴(yán)重并發(fā)癥，由于大塊的金屬內(nèi)植物的存在，此 類(lèi)感染具有特殊性?xún)?nèi)植物周?chē)鷧^(qū)域免疫力低下，致病菌很容易在內(nèi)植物表面黏附繁殖形 成感染灶；甚至一些低毒力的條件致病菌也很容易引起該類(lèi)疾病，如表皮葡萄球菌作為致 病菌在此類(lèi)感染中的比例達(dá)32%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，關(guān)節(jié)置換的感染率在0. 5-5%之間，而開(kāi)放性骨 折的術(shù)后感染率更達(dá)5-33%，并且可以導(dǎo)致骨髓炎和敗血癥。有報(bào)告稱(chēng)全膝關(guān)節(jié)置換后， 感染是繼松動(dòng)之后第二位的導(dǎo)致翻修的主要原因。由于接受骨科內(nèi)植物手術(shù)的病人數(shù)巨大 (僅僅在美國(guó)，目前每年全髖和全膝關(guān)節(jié)成形術(shù)就超過(guò)了 50萬(wàn))，且術(shù)后感染的處理極為困 難，由此耗費(fèi)的醫(yī)療資源巨大，據(jù)估計(jì)在美國(guó)內(nèi)植物相關(guān)感染每年需增加10億美元的醫(yī)療 衛(wèi)生支出。另外，隨著治療上長(zhǎng)期大劑量廣譜抗生素的使用，致病菌耐藥的發(fā)生已成為常見(jiàn) 的現(xiàn)象，因此近些年人們已開(kāi)始針對(duì)這種感染發(fā)病的特殊性研發(fā)新一代的具有抗微生物性 的非抗生素類(lèi)材料，如銀離子等。殼聚糖是一種可再生的來(lái)源廣泛的天然多糖，自然界含量豐富僅次于纖維素。隨 著對(duì)殼聚糖理化性質(zhì)研究的不斷深入，已將其廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)保及醫(yī)療等領(lǐng)域。殼聚糖 在酸性環(huán)境下形成的NH3+因靜電力能與細(xì)菌細(xì)胞壁磷脂成分的磷?；嗷プ饔枚哂锌?微生物的特性，并有許多研究報(bào)告殼聚糖對(duì)葡萄球菌、大腸桿菌及真菌等都具有一定的抗 菌作用；另外，因殼聚糖對(duì)成骨細(xì)胞具有良好的生物相容性，進(jìn)來(lái)有許多研究致力于將其作 為骨組織工程支架的材料。但因其有限的抗微生物效應(yīng)，在骨科內(nèi)植物感染的防治領(lǐng)域的 應(yīng)用僅僅具備一定的可能性，并已有相關(guān)的研究將其與一些抗菌性更強(qiáng)的材料復(fù)合后的應(yīng) 用。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖季銨化以后，其抗菌性能增強(qiáng)。Tsurugai等發(fā)現(xiàn)N，N, N-三甲基 殼聚糖季銨鹽有抗大腸桿菌ATCC 25922和葡萄球菌屬ATCC149909的活性。含有N-長(zhǎng)鏈 烷基殼聚糖的季銨鹽對(duì)芽孢子菌、大腸桿菌有抗菌作用。殼聚糖與碘代甲烷在三乙胺中反 應(yīng)所得到的季銨鹽對(duì)G+有很強(qiáng)的抑制作用?？梢?jiàn)抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌季銨化的 殼聚糖比非季銨化的殼聚糖抗菌活性強(qiáng)。關(guān)于殼聚糖季銨鹽化后與骨的生物相容性，目前 還未見(jiàn)報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種殼聚糖季銨鹽。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種殼聚糖季銨鹽的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種殼聚糖季銨鹽，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為6% -44%。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為18%。
所述的殼聚糖季銨鹽是由殼聚糖和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨合成的。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是殼聚糖季銨鹽在醫(yī)用材料加工中的應(yīng)用。所述的殼聚糖季銨鹽可用于抗骨科內(nèi)植物感染。所述的殼聚糖季銨鹽在骨科和顱面內(nèi)植物的生物活性涂層中的應(yīng)用。本發(fā)明利用前期殼聚糖和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨合成三種取代度的殼聚糖 季銨鹽(HACC，6%，18%，44% )，研究其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984在鈦表面黏附和生物膜形成 的抑制作用，同時(shí)研究HACC的細(xì)胞毒性及對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)在鈦表面增殖分 化的影響。具體方法是三種殼聚糖季銨鹽分別用TSB細(xì)菌液體培養(yǎng)基配制溶液，用倍比稀 釋法分別測(cè)定不同取代度的HACC的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度；用AlarmarBlue法檢 測(cè)HACC對(duì)鈦表面細(xì)菌代謝的影響；并用組織培養(yǎng)板法、熒光染色法及掃描電鏡觀(guān)察HACC對(duì) 鈦表面細(xì)菌形成生物膜的影響。分別用MTT法和堿性磷酸酶染色法觀(guān)察HACC對(duì)hMSCs增 殖和分化的影響。結(jié)果=HACC對(duì)該菌的代謝增殖和形成生物膜的抑制效應(yīng)隨取代度升高而 增強(qiáng)，且在較低的濃度就可有效地抑制鈦表面細(xì)菌生物膜的形成；另外，隨著取代度升高， 44%的HACC的細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng)且對(duì)hMSCs的增殖和分化的抑制也增強(qiáng)，而6%及18%的 HACC無(wú)細(xì)胞毒性且也不抑制hMSCs的增殖和分化。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于在防止細(xì)胞黏附和生物膜形成的策略指導(dǎo)下，研制新一代的具 備良好生物相同性的涂層抗菌材料_殼聚糖季銨鹽，減少骨科內(nèi)植物術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)并可 避免臨床抗生素濫用、抗生素耐藥菌的出現(xiàn)及抗生素的全身毒副作用。具體來(lái)說(shuō)，選擇具有 天然價(jià)廉儲(chǔ)量豐富且具有良好生物相容性及一定的抗菌作用的殼聚糖為基礎(chǔ)，但因其有限 的抗菌效應(yīng)，并不適于應(yīng)用到臨床，本發(fā)明通過(guò)殼聚糖季銨化提高其抗菌性以達(dá)到抑制和 殺滅骨科內(nèi)植物致病菌，防止微生物在內(nèi)植物表面的大量定植，從根本上防止感染的發(fā)生。 另外，對(duì)于對(duì)骨科內(nèi)植物來(lái)說(shuō)，良好的骨整合對(duì)其功能的發(fā)揮也十分重要，因此本發(fā)明不僅 發(fā)明了取代度為6% -44%殼聚糖季銨鹽的抗感染效果外，還發(fā)明了其對(duì)細(xì)胞增殖和成骨 分化，以及對(duì)骨整合的影響，這樣能更全面地反映取代度為6% -44%殼聚糖季銨鹽的應(yīng)用 效果。取代度為6% -44%殼聚糖季銨鹽可望作為涂層材料抗骨科內(nèi)植物感染，或作為骨的 替代材料、傷口敷料等發(fā)揮作用。

附圖1 :1/1殼聚糖季銨鹽取代度的滴定檢測(cè)曲線(xiàn)。附圖2 不同取代度HACC對(duì)表皮葡萄球菌代謝抑制率的影響，($) (#) ( Y)分別表 示取代度為6%，18%和44% HACC在相應(yīng)的濃度下對(duì)表皮葡萄球菌代謝抑制率和空白對(duì)照 組比較有顯著性增強(qiáng)。附圖3 =TCP法定量觀(guān)察HACC對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成的影響，($) (#) ( Y)分 別表示取代度為6%，18%和44% HACC在相應(yīng)的濃度下對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成的量和 空白對(duì)照組比較有顯著性抑制。附圖4 培養(yǎng)24h熒光顯微鏡觀(guān)察鈦板表面細(xì)菌生物膜形成的大體情況(活菌為 綠色，死菌為紅色)，a，b，c，d 為 6% HACC, e, f，g，h 為 18% HACC, i, j, k, 1 為 44% HACC ； 濃度依次為 Oug/ml，4ug/ml，32ug/ml，256ug/ml。
附圖5 培養(yǎng)24h掃描電鏡觀(guān)察鈦板表面細(xì)菌生物膜形成的大體情況，a, b，c，d為 6% HACC，e，f，g，h 為 18% HACC，i，j，k，l % 44% HACC ；濃度依次為 Oug/ml, 4ug/ml, 32ug/ ml,256ug/ml。附圖6 =HACC的細(xì)胞毒性以及HACC對(duì)hMSCs增殖結(jié)果圖。附圖7 hMSCs在添加HACC的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后堿性磷酸酶(ALP)染色的結(jié)果。附圖8 hMSCs在添加HACC的培養(yǎng)基中培養(yǎng)28d后茜素紅染色的結(jié)果。附圖9 取代度為6%，18%，44%殼聚糖季銨鹽與取代度為37%，56%，81 %殼聚 糖季銨鹽的抑菌效應(yīng)和生物相容性的曲線(xiàn)。附圖10 取代度為6%，18%，44%殼聚糖季銨鹽與殼聚糖的抑菌效應(yīng)和生物相容 性的曲線(xiàn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1一，材料與方法(一 )實(shí)驗(yàn)材料及儀器材料殼聚糖季銨鹽(HAAC，DS37. 3 %, 56. O %, 81. 5 % )由殼聚糖(Mw = 2. OX 105，脫乙酰度91. 83%，浙江玉環(huán)海洋生物化學(xué)有限公司)和2，3-環(huán)氧丙基三甲基 氯化銨(純度96%，山東三貢化工有限公司)合成，大豆蛋白胰蛋白胨培養(yǎng)基(Trypticase Soy Broth, TSB，英國(guó)OXOID公司)，其他試劑均為市售分析純?cè)噭?。儀器超凈工作臺(tái)，BIO-HAZARD, VCM-420,中國(guó)臺(tái)灣；電子分析天平，METTLER TOLEDO, AB204-E，瑞士；電磁攪拌器，STUART，SM24，英國(guó)；低溫離心機(jī)，UNIVERSAL, 32R, HETTICH，德國(guó)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，MULTISKAN, ASCENT, VI. 22，美國(guó)。6% HACC純化殼聚糖與2，3_環(huán)氧丙基三甲基氯化銨按(n(CS)/n(GTMAC)= 2/l(mol/mol))的比例合成；18 % HACC純化殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨按 (n(CS)/n(GTMAC) = 1/1 (mol/mol))的比例合成；44% HACC純化殼聚糖與2，3-環(huán)氧丙基 三甲基氯化銨按(n(CS)/n(GTMAC) = 1/3 (mol/mol))的比例合成。合成后的取代度由殼聚 糖季銨鹽用0. lmol/L AgNO3溶液電導(dǎo)滴定曲線(xiàn)計(jì)算HACC。具體過(guò)程如下(HACC的制備依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的殼聚糖季銨鹽合成方法并有所改 進(jìn)在裝有攪拌器和回流冷凝管的150ml三頸瓶中加入4. Og純化殼聚糖、3. 6g的2，3-環(huán) 氧丙基三甲基氯化銨(n(CS)/n(GTMAC) = 1/1 (mol/mol))和60ml蒸餾水。油浴80°C，恒 速攪拌，反應(yīng)36h。反應(yīng)結(jié)束，產(chǎn)物用透析膜(截留分子量14000)透析純化，用0. lmol/L AgNO3檢測(cè)透析液至無(wú)白色沉淀時(shí)，透析完畢。將透析袋內(nèi)液體旋蒸濃縮后，凍干得到粉末 狀殼聚糖季銨鹽樣品。用同樣方法分別以η (CS) /n (GTMAC) = 2/1，1/3 (mol/mol)的投料比來(lái)制備殼聚糖 季銨鹽，以期獲得不同取代度的殼聚糖季銨鹽。見(jiàn)表1。HACC取代度測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取純化后的樣品，用0. lmol/L AgNO3溶液電導(dǎo)滴定樣品中Cl—，按下式計(jì)算 HACC的取代度。圖1為1/1殼聚糖季銨鹽樣品的電導(dǎo)滴定曲線(xiàn)，體系電導(dǎo)率發(fā)生轉(zhuǎn)折時(shí)消
權(quán)利要求
一種殼聚糖季銨鹽，其特征在于，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為6％ 44％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖季銨鹽，其特征在于，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為 18%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的殼聚糖季銨鹽，其特征在于，所述的殼聚糖季銨鹽是由殼 聚糖和2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨合成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的殼聚糖季銨鹽，其特征在于，所述的殼聚糖季銨鹽在醫(yī)用 材料加工中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的殼聚糖季銨鹽可用于抗骨科內(nèi)植 物感染。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的殼聚糖季銨鹽在骨科和顱面內(nèi)植 物的生物活性涂層中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖季銨鹽及其應(yīng)用，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為6％-44％。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為18％。本發(fā)明還提供了殼聚糖季銨鹽的新用途。本發(fā)明不僅發(fā)明了取代度為6％-44％殼聚糖季銨鹽的抗感染效果，還發(fā)明了其對(duì)細(xì)胞增殖和成骨分化、以及骨整合的影響，這樣更全面地反映了取代度為6％-44％殼聚糖季銨鹽的應(yīng)用效果。取代度為6％-44％殼聚糖季銨鹽可望在骨科關(guān)節(jié)假體、釘板及髓內(nèi)釘?shù)雀鞣N金屬內(nèi)植物表面涂層發(fā)揮其抗感染作用，另外也可以作為骨的替代材料、傷口敷料等發(fā)揮作用。
文檔編號(hào)C08B37/08GK101935364SQ200910195678
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者彭兆祥, 湯亭亭, 汪靈, 郭圣榮 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院;上海交通大學(xué)