專利名稱：一種根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從根瘤菌發(fā)酵液中提取及精制根瘤菌胞外多糖的方法，屬于生物 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微生物多糖是細(xì)菌、真菌和藍(lán)藻等微生物在代謝過程中產(chǎn)生的對(duì)微生物有保護(hù)作 用的生物高聚物，根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)不同的存在形式，通常被分為三類①構(gòu)成微生物細(xì)胞成分 的胞內(nèi)多糖；②黏附在細(xì)胞表面上的胞壁多糖；③分泌到培養(yǎng)基中的胞外多糖，包括微莢 膜、莢膜、黏液層和菌膠團(tuán)。微生物多糖具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，如在工業(yè)生產(chǎn)與生活的許多 領(lǐng)域中作為微生物絮凝劑、微生物采油中的生物化學(xué)調(diào)剖劑、食品添加劑、保鮮劑、抗癌醫(yī) 藥品、包裝材料等。根瘤菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是對(duì)宿主植物特異性起決定性作用 的一類重要物質(zhì)，也是根瘤菌與宿主植物之間進(jìn)行細(xì)胞識(shí)別的信息分子，具有免疫調(diào)節(jié)、抗 腫瘤及其他一些功能。例如，來自特殊太陽花根瘤菌分泌的胞外多糖，已經(jīng)開發(fā)成為一種名 為根瘤菌膠的產(chǎn)品，該產(chǎn)品具有優(yōu)異的鎖水和水分平衡能力，且粘度隨溫度差的突變特性 而會(huì)產(chǎn)生超凡的膚感，以及還會(huì)有舒緩皮膚，減輕紅血絲，抗炎及產(chǎn)生皮膚的清涼感，從而 作為一種化妝品原料廣泛地被用于化妝品行業(yè)。根瘤菌胞外多糖作為一種新型的糖資源，已經(jīng)引起人們的關(guān)注。但根瘤菌胞外多 糖的提取和精制方法卻鮮有報(bào)道，國內(nèi)只有山西大學(xué)韓勇等人(根瘤菌N613胞外多糖發(fā)酵 條件及抗腫瘤作用研究，微生物學(xué)通報(bào)，2007年34 (5)，909 913)研究了根瘤菌Rhizobium SP.N613胞外多糖的提取方法，經(jīng)過加水稀釋、離心去除菌體、真空濃縮、乙醇沉淀、Sevage 法除蛋白、乙醇再次沉淀、真空干燥等步驟。此方法具有步驟多、提取成本高、且成品含有中 性和堿性多糖缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種從根瘤菌發(fā)酵液中提取和精制根瘤菌胞外多 糖的方法。此方法通過對(duì)提取和精制工藝的改良，獲得高純度根瘤菌胞外多糖，并且節(jié)省了 成本。本發(fā)明是通過下述步驟完成1)稀釋預(yù)處理在發(fā)酵液中加入1 10倍體積的蒸餾水，采用稀堿調(diào)溶液pH至8 10，開啟攪拌 并加熱至60 80°C，并持續(xù)0. 2 5小時(shí)；2)絮凝除蛋白在經(jīng)稀釋預(yù)處理的根瘤菌發(fā)酵液中加入絮凝劑，然后用稀酸調(diào)整溶液pH至4 6， 攪拌，當(dāng)有大塊絮狀物出現(xiàn)時(shí)停止，采用10000g離心30 120min，收集上清液；3)離子交換
上清液采用0.5 2BV速度上陰離子交換劑(Cl—型)柱，采用酚-硫酸法檢測(cè)多 糖，漏吸停止上柱，采用蒸餾水沖洗至無色為止，采用2mol/L濃度的NaCl溶液洗脫，然后收 集多糖洗脫峰；4)濃縮除鹽收集的含多糖離子交換液，采取1000 IOOOOODa分子量的超濾膜，控制過濾壓力 0. 3 2. 8Mpa，濃縮至多糖質(zhì)量濃度至15 40%時(shí)停止；5)酒精醇沉在多糖濃縮液中，緩慢加入2 4倍體積質(zhì)量濃度> 95 %的酒精，并采用稀酸調(diào)至 PH4 7，然后降溫至-20 4°C，放置4 24小時(shí)醇沉，然后采用IOOOOg離心30min，收集 多糖沉淀物；6)真空干燥多糖沉淀置于40 70°C真空干燥箱內(nèi)，控制相對(duì)真空度彡0. 085Mpa，進(jìn)行干燥， 獲得成品。所述多糖是由植物、海澡或微生物所產(chǎn)生的酸性多糖。所述多糖優(yōu)選自微生物產(chǎn)生的酸性多糖。所述絮凝除蛋白步驟中，所述絮凝劑為食品級(jí)，選自聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、殼聚 糖、聚丙烯酰銨中的任意一種。所述絮凝除蛋白步驟中，菌體分離方法采用離心分離或板框分離。所述離子交換步驟中，所述陰離子交換劑采用DEAE-纖維素、DEAE-Sepharose、強(qiáng) 或弱堿性陰離子交換聚丙乙烯系列樹脂。所述離子交換步驟中，所述陰離子交換劑優(yōu)選為DEAE-纖維素。所述在真空干燥步驟中，所述干燥的方式為真空干燥、噴霧干燥、滾筒干燥或流化 床干燥方式。而且在絮凝除蛋白步驟中，沉淀可根據(jù)殘留多糖含量采取數(shù)次菌體洗滌，然后再 合并過濾液。在酒精醇沉步驟中，所得多糖沉淀還可用酒精進(jìn)行多次洗滌，以去除雜質(zhì)和色
ο最后得到的多糖產(chǎn)品可作為一種提高免疫功能有效成份用于食品、保健品、化妝 品或藥品。在本發(fā)明中，采用絮凝法去除蛋白，與傳統(tǒng)多糖提取中除蛋白的三氯乙酸法、 Sevage法、三氟三氯乙烷法等方法相比，具有成本低，處理工藝簡單的特點(diǎn)；另外，在除去 菌體和雜蛋白之后，本發(fā)明采用了超濾進(jìn)行濃縮，與減壓濃縮相比，具有低溫的特點(diǎn)，在達(dá) 到濃縮目的及避免色素的產(chǎn)生的同時(shí)，還可起到部分脫鹽和除去小分子色素的目的；最后， 由于具有多種生理功能的根瘤菌胞外多糖為一種酸性多糖，通過離子交換工序，可去除中 性多糖及堿性多糖，達(dá)到進(jìn)一步純化多糖的目的。因此由本發(fā)明所述的根瘤菌發(fā)酵液中提 取和精制根瘤菌胞外多糖的方法具有工藝步驟少，效率高、成本低、適宜工業(yè)化生產(chǎn)的特 點(diǎn)，而且制備的胞外多糖純度高。
具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1、從根瘤菌發(fā)酵液中提取和精制根瘤菌膠的方法由下述工藝步驟完成發(fā)酵液的制備發(fā)酵菌種采用紫云英根瘤菌Rhizobium astragula(CICC 20026)，斜面培養(yǎng)基配方牛肉膏0. 5 %，蛋白胨3. 9 %，葡萄糖0. 1 %，氯化鈉0. 5 %，瓊 脂1. 5 2. 0%，pH7. 2，培養(yǎng)溫度30°C ；搖床種子培養(yǎng)基除不加瓊脂外，配制方法同上； 發(fā)酵培養(yǎng)基配方:NaC10. 01 %，葡萄糖 2%，K2HPO4O. 4 %, MgSO4. 7Η20 0. 5 %，豆柏 2%, Na2Mo4. 2H200. 002%, pH7. 0，培養(yǎng)溫度30°C ；種子培養(yǎng)18小時(shí)后，按5%的接種量接入發(fā)酵 罐，培養(yǎng)40小時(shí)后，經(jīng)60°C滅酶30分鐘，放罐獲得發(fā)酵液。1.稀釋預(yù)處理在發(fā)酵液中加入3倍體積的蒸餾水，采用4% NaOH溶液調(diào)發(fā)酵液pH至8，開啟攪 拌并加熱至80°C，并持續(xù)0. 3小時(shí)，促使多糖得到稀釋且降低溶液粘度。2.絮凝除蛋白在根瘤菌發(fā)酵液加入0.04%終濃度的陰離子絮凝劑聚丙烯酸鈉，然后用稀鹽酸 調(diào)節(jié)溶液PH至4，底部充氣攪拌，當(dāng)有大塊絮狀物出現(xiàn)時(shí)停止，采用IOOOOg離心力離心 30min,去除沉淀，獲得多糖上清液。3.離子交換多糖上清液采用0. 5 2BV速度上柱DEAE-纖維素柱(Cl_型)，采用酚-硫酸法 檢測(cè)多糖，漏吸停止上柱，采用蒸餾水沖洗至無色為止，然后采用2mol/L濃度的NaCl溶液 洗脫，收集多糖洗脫峰。4.超濾濃縮采取20000Da分子量的超濾膜，控制過濾壓力0. 5Mpa，過程中取樣采用苯酚-硫酸 法測(cè)定多糖含量，當(dāng)濃縮至多糖濃度至30%時(shí)停止。5.酒精醇沉在多糖濃縮液中，緩慢加入2倍體積質(zhì)量濃度> 95%的酒精，并采用稀鹽酸調(diào)至 PH6，然后降溫至4°C，放置24小時(shí)醇沉，然后采用IOOOOg離心30min，收集多糖沉淀物。6.真空干燥多糖沉淀置于60°C真空干燥箱內(nèi)，控制相對(duì)真空度彡0.085Mpa，進(jìn)行干燥，獲得
Φ 口
廣 BFI ο實(shí)施例2從根瘤菌發(fā)酵液中提取和精制根瘤菌膠的方法由下述工藝步驟完成發(fā)酵液的制備發(fā)酵菌種采用放射形根瘤菌Rhizobiumradiobacter (CICC 10270)，斜面培養(yǎng)基配方蛋白胨5克牛肉膏3克，氯化鈉5克瓊脂15克，蒸餾水1000 毫升調(diào)PH至7. 0 ；搖床種子培養(yǎng)基除不加瓊脂外，配制方法同上；發(fā)酵培養(yǎng)基配方 NaClO. 01%，葡萄糖 2%, K2HPO4O. 4%, MgSO4. 7H20 0. 5%，豆粕 2%, Na2Mo4. 2Η200· 002%, ρΗ7. 0，培養(yǎng)溫度30°C;種子培養(yǎng)20小時(shí)后，按3%的接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)48小時(shí)后，經(jīng) 60°C滅酶30分鐘，放罐獲得發(fā)酵液。1.稀釋預(yù)處理在發(fā)酵液中加入2倍體積的蒸餾水，采用4% KOH溶液調(diào)發(fā)酵液pH至10，開啟攪 拌并加熱至70°C，并持續(xù)1小時(shí)，促使多糖得到稀釋且降低溶液粘度。2.絮凝除蛋白
在根瘤菌發(fā)酵液加入0. 05%終濃度的陰離子絮凝劑聚丙烯酸鈉，然后用稀硫酸調(diào) 節(jié)溶液PH至4. 5，底部充氣攪拌，當(dāng)有大塊絮狀物出現(xiàn)時(shí)停止，控制板框過料壓力至0. SMPa 然后維持30分鐘左右得到多糖過濾液。3.離子交換所得的多糖過濾液，采用IBV速度上柱DEAE-纖維素柱(Cl—型)，采用酚-硫酸法 檢測(cè)多糖，漏吸停止上柱，采用蒸餾水沖洗至無色為止，然后采用2mol/L濃度的NaCl溶液 洗脫，收集多糖洗脫峰。4.超濾濃縮多糖洗脫峰采取IOOOOODa分子量的超濾膜，控制過濾壓力0. 3Mpa，過程中取樣采 用苯酚_硫酸法測(cè)定多糖含量，當(dāng)濃縮至糖液濃度至25%時(shí)停止。5.酒精醇沉在多糖濃縮液中，緩慢加入3倍體積質(zhì)量濃度> 95%的酒精，并采用稀硫酸調(diào)至 PH5，然后降溫至-20°C，放置8小時(shí)醇沉，然后采用IOOOOg離心30min，收集多糖沉淀物。6.真空干燥多糖沉淀置于50°C真空干燥箱內(nèi)，控制相對(duì)真空度彡0.085Mpa，進(jìn)行干燥，獲得
女口
廣 PFt ο以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征是由下述步驟完成1)稀釋預(yù)處理在發(fā)酵液中加入1～10倍體積的蒸餾水，采用稀堿調(diào)溶液pH至8～10，開啟攪拌并加熱至60～80℃，并持續(xù)0.2～5小時(shí)；2)絮凝除蛋白在經(jīng)稀釋預(yù)處理的根瘤菌發(fā)酵液中加入絮凝劑，然后用稀酸調(diào)整溶液pH至4～6，攪拌，當(dāng)有大塊絮狀物出現(xiàn)時(shí)停止，采用10000g離心30～120min，收集上清液；3)離子交換上清液采用0.5～2BV速度上陰離子交換劑(Cl 型)柱，采用酚 硫酸法檢測(cè)多糖，漏吸停止上柱，采用蒸餾水沖洗至無色為止，然后用2mol/L濃度的NaCl溶液洗脫，收集多糖洗脫峰；4)濃縮除鹽收集的含多糖離子交換液，采取1000～100000Da分子量的濾膜，控制過濾壓力0.3～2.8Mpa，濃縮至多糖質(zhì)量濃度至15～40％時(shí)停止；5)酒精醇沉在多糖濃縮液中，緩慢加入2～4倍體積質(zhì)量濃度≥95％的酒精，并采用稀酸調(diào)至pH4～7，然后降溫至 20～4℃，放置4～24小時(shí)醇沉，然后采用10000g離心30min，收集多糖沉淀物；6)真空干燥多糖沉淀置于40～70℃真空干燥箱內(nèi)，控制相對(duì)真空度≥0.085Mpa，進(jìn)行干燥，獲得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于所述多糖 是由植物、海澡或微生物所產(chǎn)生的酸性多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于所述多糖 優(yōu)選自微生物產(chǎn)生的酸性多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于所述絮凝 除蛋白步驟中，所述絮凝劑為食品級(jí)，選自聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、殼聚糖、聚丙烯酰銨中的 任意一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于所述絮凝 除蛋白步驟中，菌體分離方法采用離心分離或板框分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于所述離子 交換步驟中，所述陰離子交換劑采用DEAE-纖維素、DEAE-Sepharose、強(qiáng)或弱堿性陰離子交 換聚丙乙烯系列樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于所述離子 交換步驟中，所述陰離子交換劑優(yōu)選為DEAE-纖維素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，其特征在于所述在真 空干燥步驟中，所述干燥的方式為真空干燥、噴霧干燥、滾筒干燥或流化床干燥方式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根瘤菌胞外多糖的提取及精制方法，通過以下步驟完成稀釋預(yù)處理、絮凝除蛋白、離子交換、濃縮除鹽、酒精醇沉和真空干燥，由本發(fā)明所述的從根瘤菌發(fā)酵液中提取和精制根瘤菌胞外多糖的方法具有工藝步驟少，效率高、成本低、適宜工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，而且制備的胞外多糖純度高。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101942035SQ20101027353
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者張巍, 鄭春陽, 魏國祥 申請(qǐng)人:天津強(qiáng)微特生物科技有限公司