一種硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖及其在抗凝血醫(yī)藥方面的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥免疫領(lǐng)域，涉及一種硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖及其在抗凝血醫(yī)藥方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]世界衛(wèi)生組織報(bào)道，心血管疾病近年已經(jīng)成為世界上主要引起死亡的原因之一。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的重要基本病志，在此基礎(chǔ)上的動(dòng)脈內(nèi)血栓形成是急性心血管疾病的重要原因，減少血栓的形成可以減少心血管疾病的發(fā)生。血栓的形成是血管內(nèi)壁、凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)等多種因素共同作用的結(jié)果。高凝狀態(tài)與血栓及血栓栓塞等并發(fā)癥有關(guān)。高凝狀態(tài)(HCS)，即血栓前狀態(tài)(PTS)，是由多種因素引起的止血系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)及抗凝系統(tǒng)失調(diào)的一種病理過(guò)程，存在容易導(dǎo)致血栓形成的多種血液學(xué)變化。因此，研宄生物活性物質(zhì)對(duì)尚凝狀態(tài)的改善具有臨床意義。
[0003]肝素常被用作抗凝血?jiǎng)?，是一種分子量不定的酸性粘多糖，此多糖分子中含有許多硫酸根陰離子，主要是通過(guò)協(xié)同抗凝血酶III (AT-1II)或封閉有活性的凝血因子的絲氨酸蛋白酶殘基，使其滅活，從而拮抗凝血活酶及凝血酶的形成，妨礙纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，阻止血小板聚集和被破壞等。實(shí)際上，肝素在臨床應(yīng)用中存在副作用，如自發(fā)性出血和骨質(zhì)疏松等。因此，研宄開(kāi)發(fā)具有天然低毒和使用方便的抗凝血?jiǎng)┚哂兄匾饬x。
[0004]多糖是一類(lèi)天然高分子化合物，通常具有重要的生物活性，而且?guī)缀鯚o(wú)毒。近年來(lái)，學(xué)者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)某些多糖具有明顯的抗凝血活性，如紅藻多糖、褐藻多糖、馬尾藻多糖、海參多糖等。研宄發(fā)現(xiàn)真菌多糖還具有明顯的利肝健胃、降血糖、抗腫瘤等藥理功能，在食品加工、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域均具有重要的應(yīng)用。
[0005]粒毛盤(pán)菌屬(Lachnum)是屬于柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)的一類(lèi)腐生性真菌。本發(fā)明通過(guò)發(fā)酵與提取優(yōu)化，從不同菌株的粒毛盤(pán)菌中獲得了具有不同結(jié)構(gòu)的多糖，包括同多糖和雜多糖。同時(shí)，通過(guò)評(píng)價(jià)這些多糖的生物活性，發(fā)現(xiàn)粒毛盤(pán)菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、降血糖和降脂利肝等功效。這為本發(fā)明從粒毛盤(pán)菌多糖中尋找抗凝血藥物提供途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖及其在抗凝血醫(yī)藥方面的用途，確立了一種全新的多糖一硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖SLEP-1及其抗凝血的藥理作用。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
[0008]本發(fā)明硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖，其特點(diǎn)在于:該硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖由三氧化硫-吡啶復(fù)合物對(duì)粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1進(jìn)行硫酸酯化改性獲得，命名為SLEP-1 ；所述粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1由粒毛盤(pán)菌YM281分泌提取獲得。
[0009]所述粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1可由以下方法制備獲得，但不限于此，步驟包括:將粒毛盤(pán)菌YM281種子液于26°C、發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵8d，獲得粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1的發(fā)酵液，將發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，3倍體積的95%乙醇醇沉24h，4500r ^mirT1離心8min，蒸餾水復(fù)溶；將得到的粗多糖脫蛋白、脫色、13000Da透析，獲得初級(jí)純化的粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1 ；
[0010]其中，發(fā)酵培養(yǎng)基為:無(wú)水葡萄糖30g.I71，酵母膏5g.I71，MgSO4.7H20 Ig.I71，KH2PO4Ig.I71，Vbi 50mg.I71，自然 pH,即不用調(diào)整 pH。
[0011 ] 所述硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖可由以下方法制備獲得，但不限于此，步驟包括:將7.5g三氧化硫-吡啶復(fù)合物緩慢溶于90mL吡啶中，在三頸瓶中加熱攪拌；當(dāng)加熱至90°C時(shí)加入1.5g的粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1粉末，恒溫?cái)嚢鐸h后，停止加熱，冷卻至室溫；用3mol.L-1NaOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至中性后，加入5倍體積95%乙醇，靜置24h，離心，將沉淀復(fù)溶于水，分別用自來(lái)水和蒸餾水透析2d和ld，濃縮后冷凍干燥，制得硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖，命名為SLEP-1。其中，溫度由冷凝管和溫度計(jì)進(jìn)行操作。
[0012]本發(fā)明還提供了上述硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用，所制備的抗凝血藥物為按藥劑學(xué)的常規(guī)制備方法，以硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖為活性物質(zhì)制備的口服片劑或膠囊。
[0013]本發(fā)明還提供了一種抗凝血藥物，該藥物的主要成分為上述硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖，該硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖的含量占藥物總質(zhì)量的60%以上?？鼓幬锟梢詾槠瑒?、膠囊、顆粒劑、混懸劑、糖漿劑，根據(jù)不同的劑型，按照常規(guī)方法制備即可。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
[0015]本發(fā)明創(chuàng)造性地在粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1的基礎(chǔ)上進(jìn)行硫酸酯化獲得硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖SLEP-1，經(jīng)過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)，粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1、硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖SLEP-1在低劑量(30mg/kg)、高劑量(90mg/kg)狀態(tài)下均對(duì)小鼠的出血時(shí)間(BT)、小鼠凝血時(shí)間(CT)有延長(zhǎng)作用，說(shuō)明粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1、硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖SLEP-1均有抗凝血作用，這為抗凝血研宄提供了新的途徑。
[0016]尤其是經(jīng)過(guò)硫酸酯化的硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖SLEP-1即使再低劑量(30mg/kg)狀態(tài)下，也能夠明顯延長(zhǎng)高凝模型小鼠的出血時(shí)間(BT)、小鼠全凝血時(shí)間(CT)、凝血酶時(shí)間(TT)和活化的部分凝血酶時(shí)間(APTT)，并顯著降低高凝模型小鼠血漿中纖維蛋白原(FIB)含量，使高凝模型小鼠血漿中抗凝血酶III (ATIII)的活性大于70%，且顯著降低了凝血因子X(jué)a(FXa)的濃度，說(shuō)明，硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖SLEP-1是一種有效的全新抗凝血多糖。
[0017]本發(fā)明多糖通過(guò)粒毛盤(pán)菌獲得，不僅可以通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，簡(jiǎn)單易得，適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)；而且天然無(wú)毒，穩(wěn)定較強(qiáng)，可以制成多種劑型抗凝血藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為粒毛盤(pán)菌多糖LEP-1和硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖SLEP-1對(duì)模型小鼠血漿的BT和CT的影響；其中，圖1-A是對(duì)模型小鼠血漿BT的影響；圖1-B是對(duì)模型小鼠血漿CT的影響；
[0019]圖2為L(zhǎng)EP-1和SLEP-1對(duì)模型小鼠血漿的APTT(A) ,PT(B)和TT(C)的作用其中，圖2-A是對(duì)模型小鼠血漿APTT (A)的作用；圖2-8是對(duì)模型小鼠血漿？1'?)的作用；圖2_〇是對(duì)對(duì)模型小鼠血漿TT (C)的作用；
[0020]圖3為L(zhǎng)EP-1和SLEP-1對(duì)模型小鼠的血漿中FIB濃度的影響；
[0021]圖4為L(zhǎng)EP-1和SLEP-1對(duì)模型小鼠的血漿中AT-1II活性和FXa濃度的影響；其中，圖4-A是對(duì)模型小鼠的血漿中AT-1II活性的影響；圖4-B是對(duì)模型小鼠的血漿中FXa濃度的影響。
[0022]以上各圖中，aP < 0.05和空白組比顯著；bP < 0.001和空白組比極顯著；CP<0.05和模型組比顯著；dP < 0.001和模型組比極顯著；肝素作為陽(yáng)性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段，或按照制造廠商的建議條件。
[0024]實(shí)施例1
[0025](一 )粒毛盤(pán)菌YM281胞外多糖的制備
[0026]將粒毛盤(pán)菌YM281 (該菌株來(lái)源于文獻(xiàn)“Purificat1n, structure, lipidlowering and liver protecting effects of polysaccharide from Lachnum YM281，，，期刊 Carbohydrate Polymers, ISSN: 0144-8617，發(fā)表日期:2013.10，頁(yè)碼:922 - 930)種子液接種到100L的發(fā)酵罐中發(fā)酵，攪拌速度160r發(fā)酵溫度26°C，發(fā)酵時(shí)間8d。發(fā)酵培養(yǎng)基:無(wú)水葡萄糖 30g.ΙΛ 酵母膏 5g.L-1，MgSO4.7H20 Ig.L-1，KH2PO4 Ig.L-1，Vbi50mg噸―1，自然pH。將發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，3倍體積的95%乙醇醇沉24h，4500r.mirT1離心8min，蒸餾水復(fù)溶。將得到的粗多糖脫蛋白、脫色、透析(透析袋13000Da)和凍干，獲得初級(jí)純化的多糖LEP-1。
[0027]( 二)硫酸酯化粒毛盤(pán)菌胞外多糖的制備
[0028]將三氧化硫-吡啶復(fù)合物7.5g緩慢溶于90mL吡啶中，在附有冷凝管和溫度計(jì)的三頸瓶中用電磁加熱攪拌器攪拌。當(dāng)加熱至90°C時(shí)加入1.5g LEP-1粉末，恒溫?cái)嚢鐸h后，停止加熱，冷卻至室溫。用3mol.T1NaOH溶液將反應(yīng)液