專利名稱：3種葵花籽多糖及葵花籽水溶性多糖的提取、分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品技術領域。本發(fā)明涉及葵花籽水溶性多糖及葵花籽水溶性多糖的 提取、分離純化方法，所說的水溶性多糖含有三個組分，其中一個組分的分子量約為37KD， 其余組分的分子量小于10KD，該水溶性多糖具有較強的抗氧化活性。
背景技術：
向日葵在全球廣泛種植，不僅是一種經(jīng)濟食用作物，而且是一種值得開發(fā)利用 的藥用植物。向日葵的花盤、桿、葉子和種子都有藥用價值。我國向日葵的生產(chǎn)已由過 去零星種植發(fā)展成為僅次于油菜、大豆、棉籽和花生的第五大油料作物，年栽培面積已達 9. 5X10hm2，年總產(chǎn)量位居世界第六位。葵花籽為向日葵籽實，葵花籽仁低聚糖含量達到10%以上，水不溶性以及水溶性 多糖類2.7%。我國盡管是向日葵的生產(chǎn)大國，但是向日葵的基礎研究工作卻顯得十分薄 弱，目前大部分的研究主要集中在品種資源和種植等方面，而對葵花籽的加工僅局限于油 脂、蛋白質以及綠原酸等酚類化合物等方面，例如，01111025. 2葵花籽水劑一步法分離油蛋 白提取技術，89104414. 0從葵花籽中提取并提純蛋白質提取物的方法，200510047693. 0從 葵花籽餅中提取綠原酸及葵花蛋白的方法，但是國內對葵花籽水溶性多糖及其提取純化方 面的專利及研究未見報道。葵花籽多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎活性、免疫調節(jié)作用、抗氧化及抗衰老作用、 降血糖作用、保肝作用及抗凝血作用。本發(fā)明的目的是將來源廣、成本低的葵花籽充分利 用，以脫脂葵花籽粕為原料，提取、分離純化水溶性多糖，并對其性質進行初步研究，這為進 一步了解葵花籽糖類物質的結構與生物活性關系提供理論基礎，填補國內該項研究空白， 豐富了糖類科學，為葵花籽糖類物質的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。該研究成果對提升葵花籽 的產(chǎn)業(yè)價值，拓展葵花籽深加工途徑具有重要的理論和實踐價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供葵花籽水溶性多糖的提取、分離純化方法。以下將具體描述該發(fā)明的實施方法。以脫脂葵花籽粕為原料提取、分離純化水溶性多糖的工藝流程如附圖所示。要點如下1.浸提脫脂葵花籽粕中有大量的酚類物質，其含量為3% 4%，其中綠原酸是對葵花籽 蛋白質質量影響最大的酚類物質。在提取過程中，由于多酚氧化酶和空氣中氧的作用，在中 性或者堿性條件下提取時，綠原酸很容易被氧化成醌，使得提取出來的蛋白質變色，并且影 響了多糖和低聚糖的色澤。亞硫酸氫鈉作為抑制多酚氧化酶酶促褐變的高效抑制劑，既可 直接作用于酶本身，降低酶對單酚和二酚類的催化反應活性，又可與第一步酶促反應生成 的醌類物質發(fā)生不可逆的結合形成無色物質，同時，亞硫酸鹽有漂白的作用；堿性條件有利于蛋白質的溶出。采用堿性亞硫酸氫鈉法浸提脫脂葵花籽粕低聚糖有利于產(chǎn)品的精制。浸 提條件浸提溫度40 70°C (例如40 70°C，如約50°C )；液固比5 20 lv/w (液固 比指亞硫酸氫鈉溶液體積與葵花籽粕的質量之比，亞硫酸氫鈉濃度以0. 2% w/v (例 如，0. 1%，0· 2%，0· 3%或 0. 5% w/w)存在)袖值7.5 10. 0 (例如，7. 5，8. 0，8. 5 或 9， 如約8.0)；浸提時間0.5 Mi (例如，1，2，4，5或乩，如約5h)；2.離心除渣在轉速為5000r/min的條件下離心lOmin，收集上清液。3.酸沉除蛋白用0. 1 2mol/L鹽酸調節(jié)上清液pH至4. O 4. 5后，3000 5000r/min離心 10 30min，收集上清液。4.堿中和用0. 1 2mol/L氫氧化鈉調節(jié)上清液pH至7. O。5.超濾:在壓力為O. Ol O. IMpa(例如0. 02 0. 06MPa,如約0. 05MPa)、溫度為10 400C (例如20 30°C，如約25°C )的條件下對上清液進行超濾處理，收集濃縮液。6.酶法結合三氯乙酸(TCA)法除蛋白采用酶法結合三氯乙酸(TCA)法除蛋白。首先利用堿性蛋白酶法除蛋白酶解溫 度40 65°C，pH值7. 5 9. 0，加酶量1 % 4. 0% w/w,酶解時間O. 5 2h ；酶解結束后， TCA處理酶解液進一步除蛋白TCA濃度以0. 3% 例如，0. 1 %，0. 5%，1. O%或 1. 5% w/w)存在，時間以0.5 3h(例如，0.5，1，2或3h)存在；7.脫色采用D296型樹脂對多糖進行脫色；脫色柱為Φ 1. O X IOcm,樹脂填裝量為5ml。上 樣量為0. 5 IOml (例如，2，3，4或5ml)，蒸餾水洗脫，流速為0. 1 2ml/min (例如，0. 5， 1,1. 5 或 2ml/min)；8.醇沉乙醇濃度為80% ν/ν存在；溫度1 20°C (例如4 10°C，如約4°C )；時間以 12 36小時(例如，15，20，24或36小時)存在；離心轉速為1000 8000r/min(例如 1000 6000r/min，如約 5000r/min)；時間以 15 30min (例如，15，20，25 或 30min)存在；9.柱層析采用DEAE Sepharose Fast Flow柱層析分離葵花籽多糖，分離條件為層析柱 為Φ2. 6X20cm，上樣量為0. 5 IOml (例如，0. 5，1，2或5ml)；洗脫流速為0. 1 :3ml/ 111士11(例如，0.5，1，1.5，2或；31111/1^11)；以蒸餾水、0. 1 0. 4mol/L NaCl 溶液階段梯度洗 脫；蒸餾水洗脫分離得到DPW組分，0. 1 0. 4mol/L NaCl溶液洗脫分離得到DPm組分；采 用^^1!虹0紹CL-6B柱層析進一步分離糖組分，分離條件為層析柱為Φ1.6Χ100αιι，上樣 量為0. 1 5ml (例如，0. 1，0. 5，1或5ml)，洗脫流速為1 5ml/min (例如，1，2，3或5ml/ min)，洗脫液為0. lmol/L NaCl溶液，最終得到三個組分，其中，DPW為單一組分，DPNl含有 兩個組分,分別為DPNl-Sl和DPm-S2。


圖1以脫脂葵花籽粕為原料提取、分離純化水溶性多糖的工藝流程實施例1本發(fā)明還將通過具體實施例的方式作進一步說明，這些實施例僅僅是舉例說明性 的而沒有限制本發(fā)明范圍的意思。取Ikg過60目篩的脫脂葵花籽粕置于容器中，按照液固比10 lv/m加入亞硫酸 氫鈉溶液(其中亞硫酸氫鈉溶液的濃度為0. 30% m/v)，用2mol/L氫氧化鈉將固液混合物 pH至8.0，551條件下攪拌提取證。浸提結束后，在5000r/min的條件下離心IOmin去除渣 子，收集上清液。用2mol/L鹽酸調上清液pH至4. 5，在5000r/min的條件下離心20min，收 集上清液。用2mol/L氫氧化鈉調節(jié)上清液pH值至中性。在壓力為0. 05Mpa，20°C對上清液 進行超濾處理，收集濃縮液；在溫度^°C，pH值8. 0，堿性蛋白酶添加量4. 0% w/w條件下 對超濾所得濃縮液進行酶解處理Ih ；用濃度為1. 5% TCA w/w處理酶解液2h，收集上清液。 用D296型樹脂洗脫上清液，對多糖進行脫色上樣量5ml，蒸餾水洗脫，流速為lml/min ；洗 脫液用80% ν/ν乙醇，4°C醇沉12h，5000r/min離心20min，收集沉淀。沉淀于_50°C，真空 度為801 進行真空冷凍干燥。利用DEAE Sepharose Fast Flow柱層析法分離多糖上樣 量6ml，流速2ml/min，以蒸餾水、0. lmol/L NaCl溶液階段梯度洗脫，蒸餾水洗脫分離得到 DPW組分，0. lmol/L NaCl溶液洗脫分離得到DPm組分；利用kpharose CL-6B柱層析法進 一步分離混合組分上樣量0. 5ml，流速0. 5ml/min，洗脫液為0. lmol/L NaCl溶液，最終得 到三個組分，其中，DPW為單一組分，分子量小于10KD。DPm含有兩個組分，分別為DPm-Sl 和DPm-S2，前者分子量約為37KD，后者分子量小于10KD。
權利要求
1.一種以脫脂葵花籽粕為原料提取、分離純化水溶性多糖的方法，其特征包括以下步驟(a)采用浸提、離心除渣、酸沉除蛋白、堿中和的方法提取葵花籽粗多糖；(b)對步驟(a)處理所得的物料進行超濾濃縮、酶法結合三氯乙酸(TCA)法除蛋白、脫 色、醇沉、柱層析的方法分離純化葵花籽多糖；
2.權利要求1所述的提取方法，浸提工藝其特征在于溫度40 70°C (例如40 70°C，如約40°C )；液固比5 20 lv/w(液固比指堿 性亞硫酸氫鈉溶液體積與葵花籽粕的質量之比，亞硫酸氫鈉濃度以0. 1 % 2 % w/v (例如，0.1%，0· 2%，0· 3%或 0. 5% w/w)存在；pH 值 7. 5 10. 0 (例如，7. 5，8. 0，8. 5 或 9，如約 8.0)；浸提時間0. 5 6h(例如，1，2，4，5或乩，如約5h)；
3.權利要求1所述的提取方法，離心除渣、酸沉除蛋白及堿中和工藝其特征在于(a)0.1 2mol/L鹽酸調節(jié)上清液pH至4. 0 4. 5后，3000 5000r/min離心10 30min ；(b)0. 1 2mol/L氫氧化鈉調節(jié)上清液pH至7. 0。
4.權利要求1所述的多糖分離方法，超濾工藝其特征在于超濾壓力為0. 01 0. IMpa (例如0. 02 0. 06MPa,如約0. 05MPa)；溫度為10 400C (例如 20 30°C，如約 25°C )。
5.權利要求1所述的多糖分離方法，酶法結合三氯乙酸(TCA)法除蛋白工藝其特征在于(a)堿性蛋白酶法除蛋白溫度40 65°C，pH值7.5 9.0，酶添加量為1^-4.0% w/w，時間 0. 5 2h。(b)TCA處理酶解液進一步除蛋白TCA濃度以0. 2% 例如，0. 1%，0. 5%， 1.0%或1. 5% w/w)存在；時間以0. 5 3h(例如，0. 5，1，2或3h)存在；
6.權利要求1所述的多糖分離方法，采用D296型樹脂對多糖進行脫色，其特征在于 上樣量為0. 5 IOml (例如，2，3，4或5ml)；洗脫液為蒸餾水；洗脫流速為0. 1 ^iil/min(例如，0. 5，1，1· 5 或 2ml/min)；
7.權利要求1所述的多糖純化方法，采用DEAESepharose Fast Flow柱層析法分離葵 花籽多糖，其工藝特征在于上樣量為0. 5 IOml (例如，2，3，4或5ml)；洗脫流速為0. 1 4ml/min (例如，0. 5,1,1.5，2或3ml/min)；以蒸餾水、0. 1 0. 4mol/LNaCl溶液階段梯度洗脫；蒸餾水洗脫分離得 到DPW組分，0. 1 0. 4mol/LNaCl溶液洗脫分離得到DPm組分。
8.權利要求1所述的多糖純化方法，采用kpharoseCL-6B柱層析法分離葵花籽多糖 組分——DPff及DPm，其工藝特征在于上樣量為0. 1 5ml (例如，0. 1,0. 5，1或5ml)；洗脫流速為0. 1 anl/min (例如，0. 1， 0. 5，1或2ml/min)；洗脫液為0. lmol/L NaCl溶液；分離得到三個糖組分，其中DPff為單一 組分，分子量小于iokd。DPm含有兩個組分，分別為DPm-si和DPm-s2，dpni-si分子量 約為37KD，DPN1-S2分子量小于10KD。
9.利用前述權利要求的方法獲得的三種葵花籽水溶性多糖。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品技術領域。以脫脂葵花籽粕為原料提取、分離純化水溶性多糖。采用堿性亞硫酸氫鈉溶液浸提、離心除渣、無機酸酸沉除蛋白、堿中和的方法提取葵花籽粗多糖；所得的葵花籽粗多糖采用超濾分離得濃縮液，濃縮液經(jīng)酶法結合有機酸法除蛋白、離子交換脫色、醇沉及柱層析的方法制備葵花籽多糖。利用該法制備的葵花籽水溶性多糖包含三個組分，其中一個糖組分分子量約為37KD，其余糖組分分子量小于10KD。該水溶性多糖具有較高的抗氧化活性，在食品和醫(yī)藥工業(yè)具有廣泛的應用前景。
文檔編號C08B37/00GK102086235SQ20101056960
公開日2011年6月8日 申請日期2010年11月27日 優(yōu)先權日2010年11月27日
發(fā)明者宋春麗, 李文娟, 王文俠 申請人:齊齊哈爾大學