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      一種百尾參多糖的分離提取方法

      文檔序號:8519403閱讀:540來源:國知局
      一種百尾參多糖的分離提取方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域,具體來說涉及一種百尾參多糖的分離提取方法。
      [0002]
      【背景技術(shù)】
      [0003] 百尾參為百合科(Zi/iaceae)萬壽竹屬植物萬壽竹應(yīng) 」iferr.)的根及根莖,另IJ名又叫白味參、百尾輿、白龍須。百尾參為多年 生草本植物,系苗族習(xí)用藥材,其味甘、淡,性平,具有潤肺止咳、健脾消積的功效,可用于 虛損咳喘、痰中帶血、腸風(fēng)下血、食積脹滿等癥狀。
      [0004] 以百尾參為主藥的上市復(fù)方制劑有貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司生產(chǎn)的 咳速停糖漿及膠囊。在成分研宄方面,陳磊等人采用化學(xué)分離方法,運(yùn)用現(xiàn)代波譜技術(shù),從 百尾參乙醇提取物中得到了蒲公英賽醇(DCP-1)、木犀草素(DCP-2)、谷留醇(DCP-4)、胡蘿 卜苷(DCP-5)等20個(gè)化合物,但對其主要有效成分的研宄較少。
      [0005] 目前,尚未見對百尾參多糖進(jìn)行相關(guān)研宄的報(bào)道。
      [0006]

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化活性、止咳祛痰作用的百尾參多糖的分離 提取方法。
      [0008] 本發(fā)明的一種百尾參多糖的分離提取方法,包括以下步驟: (1) 脫脂:將百尾參粉末與石油醚按料液比1:50在索氏提取器中,于50°C下回流脫脂 3小時(shí),得去脂百尾參粉末; (2) 提取:向去脂后的百尾參粉末中添加蒸餾水,料液比為1:20-80,于70-100°C下,提 取1-4次,每次1-4小時(shí),提取結(jié)束合并水提液; (3) 分離:水提液用布氏漏斗抽濾,濾液與95%乙醇按1:3. 5-4的比例醇沉,靜置6-8h ; 3000-4000r/min離心15-20min,去掉上清液,沉淀用蒸餾水定容到500ml ; (4) AB-8樹脂脫色純化、濃縮至原體積的1/3,得粗多糖液; (5) 脫蛋白:粗多糖液按質(zhì)量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液,混合液中氯仿 與正丁醇體積比為5:1,振搖后取上層清液,加入3-5倍體積的質(zhì)量濃度為95%的乙醇,于 4°C下靜置24小時(shí),然后通過3000-4000r/min離心15-20min得脫蛋白百尾參多糖; (6) 洗滌,冷凍干燥即得。
      [0009] 上述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:百尾參粉末是將新鮮百尾參洗凈, 干燥后粉碎所得。
      [0010] 上述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(3)中所述百尾參粉末和蒸 餾水的優(yōu)選料液比為1:40-60。
      [0011] 上述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(3)中所述提取溫度優(yōu)選為 8〇°c -loo。。。
      [0012] 上述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(3)中所述提取時(shí)間優(yōu)選為 2-4小時(shí)。
      [0013] 上述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(3)中所述提取次數(shù)優(yōu)選為 2-4 次。
      [0014] 上述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(7)中依次采用乙醇、丙酮洗 滌。
      [0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有明顯有益效果,從以上技術(shù)方案可知:本發(fā)明的分離 提取方法,可獲得純度高、品質(zhì)好的百尾參多糖,通過對小鼠酚紅祛痰作用及對小鼠氨水引 咳試驗(yàn)研宄,證明該百尾參多糖具有較強(qiáng)止咳祛痰作用,同時(shí)其還具有明顯的抗氧化活性, 該抗氧化活性包括? 0H清除率、DPPH ?清除率、Fe2+螯合能力、抗氧化能力及還原能力。且 方法簡單、易操作,因而極具市場推廣價(jià)值。
      [0016]
      【附圖說明】
      [0017] 圖1是百尾參多糖對? 0H清除率; 圖2是百尾參多糖對DPPH ?清除率; 圖3是百尾參多糖對Fe2+螯合能力; 圖4是百尾參多糖的抗氧化能力; 圖5是百尾參多糖的還原能力。
      [0018]
      【具體實(shí)施方式】
      [0019] 下面通過藥效試驗(yàn)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。
      [0020] 以實(shí)施例5得到的產(chǎn)品進(jìn)行百尾參多糖藥效實(shí)驗(yàn)研宄: 1、百尾參多糖的抗氧化活性 1. 1.清除? 0H活性 在10ml的試管中加入3mmol/L的?6304溶液lml,3mmol/L水楊酸-乙醇溶液lml,0. 05% 的H202溶液lml,立即混勾,百尾參糖溶液的濃度為4mg/ml,在7根試管中分別加入20ul, 40ul,80ul,160ul,320ul,640ul,1000ul的百尾參糖溶液,用蒸餾水補(bǔ)齊以等體積 的蒸餾水作為空白對照。37°C反應(yīng)30min,在510nm下測量各濃度的吸光度。
      [0021] 清除率計(jì)算公式為:清除率(%) = (AO-AX) /AO X 100% 其中&為空白對照液的吸光值;A x為加入不同濃度糖溶液的吸光值。
      [0022] 結(jié)果見圖1。
      [0023] 1. 2?清除 DPPH ?活性 以95%乙醇為溶劑,配制濃度為2X 10-4mol/L的DPPH溶液。精確移取加入2mlDPPH 溶液,百尾參糖溶液的濃度為4mg/ml,在7根試管中分別加入40ul,80ul,160ul,320ul, 640ul,1280ul,2000ul的百尾參糖溶液,用蒸餾水補(bǔ)齊2ml使總體積為4ml,搖勻。室溫放 置30min后記錄517nm吸光值為A樣品,向2mlDPPH液中加入2ml的相應(yīng)樣品溶劑,記錄吸 光值為A空白,即空白對照。
      [0024] 根據(jù)公式計(jì)算樣品DPPH清除率,計(jì)算公式為: DPPH清除率(%) = (A空白一 A樣品)/A空白X 100%。
      [0025] 結(jié)果見圖2。
      [0026] 1. 3. Fe2+螯合能力的測定 百尾參糖溶液的濃度為4mg/ml,在7根試管中分別加入20ul,40ul,80ul,160ul, 320ul,640ul,lOOOul的百尾參糖溶液,用蒸餾水補(bǔ)齊lml,再加入3. 7ml蒸餾水, 0? lml2mmol的卩6〇12溶液,混合均勾,最后加入0? 2ml5mmol的ferrozine啟動(dòng)反應(yīng),空白 管用蒸餾水代替樣品液,標(biāo)準(zhǔn)管用蒸餾水代替FeCl2溶液,反應(yīng)體系在室溫放置30min,在 562nm處測定吸光值,同時(shí)以EDTA做對比。
      [0027] 用公式計(jì)算對金屬螯合能力(%),計(jì)算公式為: 金屬螯合能力(%) =[A空白-(A樣品-A標(biāo)準(zhǔn))]/A空白X 100%。
      [0028] 結(jié)果見圖3。
      [0029] 1.4.總抗氧化能力的測定 百尾參糖溶液的濃度為4mg/ml,在7根試管中分別加入20ul,40ul,80ul,160ul, 320ul,640ul,lOOOul的百尾參糖溶液,用蒸餾水補(bǔ)齊lml,再加入4ml試劑液(0. 6mol/L硫 酸,28mmol/L磷酸鈉和4mmol/L鉬酸鈉),混勾后置于95°C水浴中恒溫90min,在695nm處 測其吸光度A??瞻滓河?.4ml水代替樣品液。A越大,則樣品的還原能力越強(qiáng)。以VC為 對照。
      [0030] 結(jié)果見圖4。
      [0031] 1.5?總還原能力的測定 百尾參糖溶液的濃度為4mg/ml,在7根試管中分別加入20ul,40ul,80ul,160ul, 320ul,640ul,lOOOul的百尾參糖溶液,用蒸餾水補(bǔ)齊lml,再加入2.5ml磷酸緩沖液 (0.2mol/,PH=6.6)和2.5ml 1%鐵氰化鉀。此混合物在50°C放置20min后,加入2.5ml 10% 三氧乙酸,然后3000r/min離心10min吸取2. 5ml上清液,加入2. 5ml蒸餾水和0. 5ml 0. 1% 三氧化鐵,混勻后在700nm波長下測定吸光度A。用水作空白對照,所以平行測定3次。吸 光值越高說明樣品的還原能力越強(qiáng)。以VC為對照。
      [0032] 結(jié)果見圖5。
      [0033]2、百尾參多糖的止咳祛痰作用 2.1.百尾參提取物對小鼠酚紅祛痰作用的影響 取健康清潔級昆明種雄性小鼠(20±2g)gll4只,隨機(jī)分為14組:陰性對照組、百尾參 多糖大劑量組(250mg/kg)、中劑量組(125mg/kg)、小劑量組(63mg/kg)、急支糖漿組(20ml/ kg)??瞻讓φ战M灌胃生理鹽水,其余各組分別給予相應(yīng)劑量的藥液。灌胃給藥連續(xù)5天, 每天1次。最后一次給藥前禁食不禁水12h,給藥后30min腹腔注射0. 5%苯酚紅純化水溶 液0.5ml,30min后脫頸椎處死小鼠,暴露氣管,氣管插管與注射器鏈接,用2%碳酸氫鈉溶 液0. 5ml,緩慢注入氣管內(nèi),然后輕輕吸出,如此反復(fù)三次。合并3次沖洗液放置一定時(shí)間使 雜質(zhì)沉淀,得到透明紅色上清液,用紫外分光光度計(jì)于558nm處測定A值,根據(jù)苯酚紅標(biāo)準(zhǔn) 曲線回歸方程分別算出其粉紅濃度,于陰性對照組比較。結(jié)果如表2. 1 表2. 1參多糖對小鼠酚紅排除試驗(yàn)的影響(X 土 S,n=8)
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種百尾參多糖的分離提取方法,包括以下步驟: (1) 脫脂:將百尾參粉末與石油醚按料液比1:50在索氏提取器中,于50°C下回流脫脂 3小時(shí),得去脂百尾參粉末; (2) 提?。合蛉ブ蟮陌傥矃⒎勰┲刑砑诱麴s水,料液比為1:20-80,于70-100°C下,提 取1-4次,每次1-4小時(shí),提取結(jié)束合并水提液; (3) 分離:水提液用布氏漏斗抽濾,濾液與95%乙醇按1:3. 5-4的比例醇沉,靜置6-8h; 3000-4000r/min離心15-20min,去掉上清液,沉淀用蒸餾水定容到500ml; (4) AB-8樹脂脫色純化、濃縮至原體積的1/3,得粗多糖液; (5) 脫蛋白:粗多糖液按質(zhì)量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液,混合液中氯仿 與正丁醇體積比為5:1,振搖后取上層清液,加入3-5倍體積的質(zhì)量濃度為95%的乙醇,于 4°C下靜置24小時(shí),然后通過3000-4000r/min離心15-20min得脫蛋白百尾參多糖; (6) 洗滌,冷凍干燥即得。
      2. 如權(quán)利要求1所述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(3)中所述百尾參 粉末和蒸餾水的料液比為1:40-60。
      3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種百尾參多糖的分離提取方法:其中,步驟(3)中所述提 取溫度為80°C-KKTC。
      4. 如權(quán)利要求3所述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(3)中所述提取時(shí) 間為2-4小時(shí)。
      5. 如權(quán)利要求4所述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:步驟(3)中所述提取次 數(shù)為2-4次。
      6. 如權(quán)利要求5所述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中,:步驟(7)中依次采用 乙醇、丙酮洗滌。
      7. 如權(quán)利要求5所述的一種百尾參多糖的分離提取方法,其中:百尾參粉末是將新鮮 百尾參洗凈,干燥后粉碎得到。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種百尾參多糖的分離提取方法,包括以下步驟:將新鮮百尾參洗凈,干燥后粉碎;與石油醚回流脫脂;添加蒸餾水提取,提取結(jié)束合并水提液;水提液用布氏漏斗抽濾,濾液醇沉后靜置、離心、去掉上清液,沉淀用蒸餾水定容;脫色純化、濃縮,得粗多糖液;粗多糖液按質(zhì)量比3:1的比例加入氯仿和正丁醇的混合液,振搖后取上層清液,加入乙醇、靜置、離心,得脫蛋白百尾參多糖;洗滌,冷凍干燥即得。本發(fā)明的分離提取方法,可獲得純度高、品質(zhì)好的百尾參多糖,方法簡單、易操作,極具市場推廣價(jià)值。
      【IPC分類】C08B37-00
      【公開號】CN104844720
      【申請?zhí)枴緾N201510143327
      【發(fā)明人】曹劍鋒, 任朝輝, 劉丹, 夏麗莎, 龐宇云, 蘭世超
      【申請人】貴州師范學(xué)院
      【公開日】2015年8月19日
      【申請日】2015年6月19日
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