專利名稱：一種膠原蛋白溫敏型水凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種膠原蛋白溫敏型水凝膠及其制備方法。
背景技術(shù)：
整形美容行業(yè)中的祛除皺紋、改善面部輪廓、填平凹陷瘢痕或唇部和修復受傷組織等都需要軟組織填充材料，人們先后研究了白蠟、脂肪移植、硅樹脂、凝膠植入體等材料用于軟組織整形，臨床應用發(fā)現(xiàn)都存在著硬化，瘤狀腫塊、吸收過快、慢性炎癥等問題。近些年來，美國F道爾頓相繼批準了幾個用于軟組織填充的產(chǎn)品，其主要成分為牛膠原、透明質(zhì)酸鈉、PMMA小球等，已經(jīng)有了較好的效果，但對于部分使用者仍然存在著使用部位紅腫、 過敏及降解過快等情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種機械性能良好、生物相容性優(yōu)異、降解時間大大延長的膠原蛋白溫敏型水凝膠及其制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)
步驟一將膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為1. 0-5. 0%的溶液； 步驟二 將多糖用注射用水或稀酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為0. 5-2. 0%的溶液； 步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為20-50%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按(1-3):(1-5):(1-2)的體積比混合后在0-15°C條件下攪拌 10-30分鐘混合均勻，并同時將pH調(diào)整至7. 4 ； 步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。所述的步驟一中的膠原蛋白為動物源膠原蛋白或類人膠原蛋白。所述的步驟二中的多糖為殼聚糖、透明質(zhì)酸鈉中的一種，殼聚糖的脫乙酰度為 80-95%，殼聚糖分子量為105-5X 105道爾頓，透明質(zhì)酸鈉分子量為5X105_8X105道爾頓。所述的步驟二中的稀酸為稀鹽酸、稀醋酸或稀乳酸中的一種，質(zhì)量分數(shù)為 0. 5-1. 0%。所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)
步驟一將動物源膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液； 步驟二 將脫乙酰度為85%、分子量為5X IO5道爾頓的殼聚糖用質(zhì)量分數(shù)為1%的稀乳酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為2、的溶液；
步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為50%的溶液；
步驟四將上述三種溶液按3 3 1的體積比混合后在5°C條件下攪拌20分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4 ；
步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。如所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
本發(fā)明提供的膠原蛋白溫敏型水凝膠在37°C具有良好的成膠性，成膠時間在10分鐘以內(nèi)，機械強度良好，且降解時間長，免疫排異反應較弱，應用更加安全有效。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細的說明。膠原蛋白，又稱為膠原，是脊椎動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白， 是脊椎動物身體結(jié)構(gòu)的重要材料，也是在哺乳動物中含量最豐富的蛋白。膠原由多糖蛋白分子組成，是結(jié)締組織的主要蛋白成分，占機體總蛋白的20-30%。機體中大約一半的膠原蛋白存在于皮膚中，膠原蛋白占真皮和筋腱干重的70%，相當于體重的6%。膠原蛋白具有良好的生物學特性和功能，促新細胞形成和促上皮細胞、成纖維細胞生長功能，免疫排異反應低。殼聚糖是目前已知存在于自然界中的惟一一種帶陽離子能被生物降解的分布極其廣泛的高分子材料，大量存在于昆蟲、甲殼綱動物外殼及真菌的細胞壁中，是地球上僅次于纖維素的第二大可再生資源，但不溶于水及有機溶劑，很難被人體利用。其脫乙?；卯a(chǎn)物稱為殼聚糖，則能被人體吸收利用。這類多糖既可生物合成，又可生物降解，與動物的器官組織及細胞有良好的生物相容性，無毒，降解過程中產(chǎn)生的低分子寡聚糖在體內(nèi)不積累，幾乎無免疫原性。透明質(zhì)酸鈉是廣泛存在于動物和人體的生理活性物質(zhì)，在人皮膚、關(guān)節(jié)滑膜液、臍帶、房水及眼玻璃體中均有分布。其溶液具有高黏彈性及仿形性，是目前公認的生物相容性極好的生物醫(yī)用材料，為眼科手術(shù)的輔助劑，并有保護角膜內(nèi)皮細胞及眼內(nèi)組織，減少手術(shù)并發(fā)癥，促進傷口愈合的作用。膠原蛋白、殼聚糖和透明質(zhì)酸鈉都具有良好的生物相容性，單純使用殼聚糖或透明質(zhì)酸鈉制備溫敏型水凝膠存在著降解速度過快，機械強度過低的問題，不能完全滿足臨床應用要求，我們在殼聚糖的基礎(chǔ)上引入了膠原蛋白和，經(jīng)過反復試驗，我們得到了理想的溫敏型水凝膠。本發(fā)明所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，由以下步驟實現(xiàn) 步驟一將動物源膠原蛋白或類人膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為1.0-5. 0%
的溶液；
步驟二 將殼聚糖或透明質(zhì)酸鈉用注射用水或稀酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為0. 5-2. 0%的溶液，殼聚糖和透明質(zhì)酸鈉的脫乙酰度為80-95%，殼聚糖分子量為105-5 X IO5道爾頓，透明質(zhì)酸鈉分子量為5X IO5-SX IO5道爾頓；稀酸為稀鹽酸、稀醋酸或稀乳酸中的任意一種，質(zhì)量分數(shù)為0. 5-1. 0% ；
步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為20-50%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按(1-3):(1-5):(1-2)的體積比混合后在0-15°C條件下攪拌 10-30分鐘混合均勻，并同時將pH調(diào)整至7. 4 ；
4步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。以下為本發(fā)明的具體實施例 實施例一
步驟一將動物源膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為1.0%的溶液； 步驟二 將脫乙酰度為80%、分子量為IO5道爾頓的殼聚糖用質(zhì)量分數(shù)為0. 5%的稀鹽酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為0. 5%的溶液；
步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為20%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按1:1:1的體積比混合后在0°C條件下攪拌10分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4;
步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。本例水凝膠材料經(jīng)過如下試驗
將制備好的混合液移入ImL的注射器中，放于4°C下備用。選優(yōu)良的昆明小鼠50只， 雄性，體重25-30g，25只為實驗組，25只為陰性對照組，試驗前一周常規(guī)飼養(yǎng)，待小鼠適應新環(huán)境后，提前一天用脫毛劑對小鼠背部脫毛備皮，注射時常規(guī)麻醉，使用碘伏進行皮膚消毒，75%酒精脫碘，用注射器注射于小鼠皮下組織。注射時，用左手拇指和食指輕提小鼠皮膚，右手持注射器，將針頭與皮膚呈30°角刺入皮下，確保不刺入肌肉，注射0. 2mL后緩慢拔出針頭，然后用手指稍壓針刺部位片刻，以防止凝膠外漏。待注射液體不流動觸之有彈性視為形成凝膠，記錄形成凝膠時間，成膠完成認為注射成功。于1周、2周、4周、12周和M 周試驗組和陰性對照組分別處死5只小鼠，將注射凝膠部位皮膚連同材料一起取下，先做大體觀察并記錄試驗結(jié)果，用刀片切成寬為l.OcmX 1.0cm的小塊，立即用中性甲醛固定， 固定完成后酒精梯度脫水二甲苯透明浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色后做病理分析。本次實驗結(jié)果
注射后形凝膠時間6分鐘；
注射部位標本大體觀察結(jié)果1周時注射部位皮膚基本恢復正常，與陰性對照組無顯著差異，2周、4周、12周和M周時注射部位與陰性對照組外觀無異，注射部位形成的凝膠隆起逐漸變小，其中第2周到第4周變化不大，第4周到第12周有較為顯著的變化，第12 周到第M周注射部位隆起顯著下降，但是隆起并未完全消除，可見M周時材料并未完全降解；
HE染色分析1周時小鼠皮下有輕微的炎癥，材料植入處皮膚有一定量的炎細胞浸潤， 處于急性炎癥的恢復期；2周時與陰性對照組相比有極輕微的炎癥，4周、12周和M周材料周圍細胞種類和形態(tài)正常，與陰性對照組無顯著差異。試驗組1周和2周時材料和組織界面明顯，4周、12周和M周材料和組織界面模糊，材料降解過程較為緩慢。結(jié)論本例水凝膠材料體內(nèi)成凝膠速度極快，注射后小鼠皮下急性炎癥期短，不引起慢性炎癥，生物相容性好，材料降解時間超過M周，可滿足臨床應用需求，是一種較為理想的臨床修復材料。實施例二
步驟一將動物源膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為2. 5%的溶液； 步驟二 將脫乙酰度為85%、分子量為2. 5X IO5道爾頓的殼聚糖用質(zhì)量分數(shù)為0. 5%的稀醋酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為1. 2%的溶液；步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為35%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按2 2 1的體積比混合后在5°C條件下攪拌15分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4;
步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。本例水凝膠材料經(jīng)過如下試驗
將制備好的混合液移入ImL的注射器中，放于4°C下備用。選優(yōu)良的昆明小鼠50只， 雄性，體重25-30g，25只為實驗組，25只為陰性對照組，試驗前一周常規(guī)飼養(yǎng)，待小鼠適應新環(huán)境后，提前一天用脫毛劑對小鼠背部脫毛備皮，注射時常規(guī)麻醉，使用碘伏進行皮膚消毒，75%酒精脫碘，用注射器注射于小鼠皮下組織。注射時，用左手拇指和食指輕提小鼠皮膚，右手持注射器，將針頭與皮膚呈30°角刺入皮下，確保不刺入肌肉，注射0. 2mL后緩慢拔出針頭，然后用手指稍壓針刺部位片刻，以防止凝膠外漏。待注射液體不流動觸之有彈性視為形成凝膠，記錄形成凝膠時間，成膠完成認為注射成功。于1周、2周、4周、12周和M 周試驗組和陰性對照組分別處死5只小鼠，將注射凝膠部位皮膚連同材料一起取下，先做大體觀察并記錄試驗結(jié)果，用刀片切成寬為l.OcmX 1.0cm的小塊，立即用中性甲醛固定， 固定完成后酒精梯度脫水二甲苯透明浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色后做病理分析。本次實驗結(jié)果
注射后形凝膠時間8分鐘；
注射部位標本大體觀察結(jié)果1周時注射部位皮膚基本恢復正常，與陰性對照組無顯著差異，2周、4周、12周和M周時注射部位與陰性對照組外觀無異，注射部位形成的凝膠隆起逐漸變小，其中第2周到第4周變化不大，第4周到第12周有較為顯著的變化，第12周到第M周注射部位隆起顯著下降，可見注射處皮膚輕微隆起，M周時材料還有一定量未完全降解；
HE染色分析1周時小鼠皮下有極輕微的炎癥，材料植入處皮膚有少量的炎細胞浸潤， 處于急性炎癥的恢復晚期；2周時與陰性對照組相比極輕微炎癥幾乎消除，4周、12周和M 周材料周圍細胞種類和形態(tài)正常，與陰性對照組無顯著差異。試驗組1周和2周時材料和組織界面明顯，4周、12周和M周材料和組織界面模糊，材料降解過程較為緩慢。結(jié)論本例水凝膠材料體內(nèi)成凝膠速度較快，注射后小鼠皮下急性炎癥期短，不引起慢性炎癥，生物相容性好，材料降解時間大于M周，可滿足臨床應用需求，是一種較為理想的臨床修復材料。實施例三
步驟一將動物源膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為5. 0%的溶液； 步驟二 將脫乙酰度為85%、分子量為5X IO5道爾頓的殼聚糖用質(zhì)量分數(shù)為1%的稀乳酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為2. 0%的溶液；
步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為50%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按3 3 1的體積比混合后在5°C條件下攪拌20分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4 ；
步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。本例水凝膠材料經(jīng)過如下試驗
將制備好的混合液移入ImL的注射器中，放于4°C下備用。選優(yōu)良的昆明小鼠50只，雄性，體重25-30g，25只為實驗組，25只為陰性對照組，試驗前一周常規(guī)飼養(yǎng)，待小鼠適應新環(huán)境后，提前一天用脫毛劑對小鼠背部脫毛備皮，注射時常規(guī)麻醉，使用碘伏進行皮膚消毒，75%酒精脫碘，用注射器注射于小鼠皮下組織。注射時，用左手拇指和食指輕提小鼠皮膚，右手持注射器，將針頭與皮膚呈30°角刺入皮下，確保不刺入肌肉，注射0. 2mL后緩慢拔出針頭，然后用手指稍壓針刺部位片刻，以防止凝膠外漏。待注射液體不流動觸之有彈性視為形成凝膠，記錄形成凝膠時間，成膠完成認為注射成功。于1周、2周、4周、12周和M 周試驗組和陰性對照組分別處死5只小鼠，將注射凝膠部位皮膚連同材料一起取下，先做大體觀察并記錄試驗結(jié)果，用刀片切成寬為l.OcmX 1.0cm的小塊，立即用中性甲醛固定， 固定完成后酒精梯度脫水二甲苯透明浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色后做病理分析。本次實驗結(jié)果
注射后形凝膠時間9分鐘；
注射部位標本大體觀察結(jié)果1周時注射部位皮膚基本恢復正常，與陰性對照組無顯著差異，2周、4周、12周和M周時注射部位與陰性對照組外觀無異，注射部位形成的凝膠隆起逐漸變小，其中第2周到第4周變化不大，第4周到第12周有較為顯著的變化，第12周到第M周注射部位隆起顯著下降，但是隆起并未完全消除；
HE染色分析1周時小鼠皮下有輕微的炎癥，材料植入處皮膚有一定量的炎細胞浸潤，可見巨噬細胞聚集，處于急性炎癥的恢復期；2周時與陰性對照組相比有極輕微的炎癥，4周、12周和M周材料周圍細胞種類和形態(tài)正常，與陰性對照組無顯著差異。試驗組1 周和2周時材料和組織界面明顯，4周、12周和M周材料和組織界面逐漸模糊，材料降解過程較為緩慢。結(jié)論本例水凝膠材料體內(nèi)成凝膠速度較快，注射后小鼠皮下急性炎癥期短，未見慢性炎癥，生物相容性好，材料降解時間超過M周，可滿足臨床應用需求，是一種較為理想的臨床皮膚修復材料。實施例四
步驟一將類人膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為1.0%的溶液； 步驟二 將分子量為5X IO5道爾頓的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為0. 5% 的溶液；
步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為20%的溶液；
步驟四將上述三種溶液按1 :4 2的體積比混合后在10°C條件下攪拌20分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4 ；
步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。本例水凝膠材料經(jīng)過如下試驗
將制備好的混合液移入ImL的注射器中，放于4°C下備用。選優(yōu)良的昆明小鼠50只， 雄性，體重25-30g，25只為實驗組，25只為陰性對照組，試驗前一周常規(guī)飼養(yǎng)，待小鼠適應新環(huán)境后，提前一天用脫毛劑對小鼠背部脫毛備皮，注射時常規(guī)麻醉，使用碘伏進行皮膚消毒，75%酒精脫碘，用注射器注射于小鼠皮下組織。注射時，用左手拇指和食指輕提小鼠皮膚，右手持注射器，將針頭與皮膚呈30°角刺入皮下，確保不刺入肌肉，注射0. 2mL后緩慢拔出針頭，然后用手指稍壓針刺部位片刻，以防止凝膠外漏。待注射液體不流動觸之有彈性視為形成凝膠，記錄形成凝膠時間，成膠完成認為注射成功。于1周、2周、4周、12周和M周試驗組和陰性對照組分別處死5只小鼠，將注射凝膠部位皮膚連同材料一起取下，先做大體觀察并記錄試驗結(jié)果，用刀片切成寬為l.OcmX 1.0cm的小塊，立即用中性甲醛固定， 固定完成后酒精梯度脫水二甲苯透明浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色后做病理分析。本次實驗結(jié)果
注射后形凝膠時間-J分鐘；
注射部位標本大體觀察結(jié)果1周時注射部位皮膚基本恢復正常，與陰性對照組無顯著差異，2周、4周、12周和M周時注射部位與陰性對照組外觀無異，注射部位形成的凝膠隆起逐漸變小，其中第2周到第4周有較為輕微的變化，第4周到第12周有變化較為顯著，第 12周到第M周注射部位隆起有較為明顯的下降，凝膠的體積大約有70%的減小，M周時材料未完全降解；
HE染色分析1周時小鼠皮下有輕微的炎癥，材料植入處皮膚有少量的炎細胞浸潤，處于急性炎癥的恢復后期；2周時與陰性對照組相比有極輕微的炎癥，4周、12周和M周材料周圍細胞種類和形態(tài)正常，與陰性對照組無顯著差異。試驗組1周和2周時材料和組織界面明顯，4周、12周和M周材料和組織界面逐漸模糊，材料降解過程較為緩慢。結(jié)論本例水凝膠材料體內(nèi)成凝膠速度快，注射后小鼠皮下急性炎癥期短，未引起慢性炎癥，生物相容性好，材料降解時間超過M周，比目前臨床應用的同類材料降解更慢， 是一種較為理想的臨床修復材料。實施例五
步驟一將類人膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為2. 5%的溶液； 步驟二 將分子量為6. 5X IO5道爾頓的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為 1. 2%的溶液；
步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為35%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按2 5 2的體積比混合后在10°C條件下攪拌25分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4 ；
步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。本例水凝膠材料經(jīng)過如下試驗
將制備好的混合液移入ImL的注射器中，放于4°C下備用。選優(yōu)良的昆明小鼠50只， 雄性，體重25-30g，25只為實驗組，25只為陰性對照組，試驗前一周常規(guī)飼養(yǎng)，待小鼠適應新環(huán)境后，提前一天用脫毛劑對小鼠背部脫毛備皮，注射時常規(guī)麻醉，使用碘伏進行皮膚消毒，75%酒精脫碘，用注射器注射于小鼠皮下組織。注射時，用左手拇指和食指輕提小鼠皮膚，右手持注射器，將針頭與皮膚呈30°角刺入皮下，確保不刺入肌肉，注射0. 2mL后緩慢拔出針頭，然后用手指稍壓針刺部位片刻，以防止凝膠外漏。待注射液體不流動觸之有彈性視為形成凝膠，記錄形成凝膠時間，成膠完成認為注射成功。于1周、2周、4周、12周和M 周試驗組和陰性對照組分別處死5只小鼠，將注射凝膠部位皮膚連同材料一起取下，先做大體觀察并記錄試驗結(jié)果，用刀片切成寬為l.OcmX 1.0cm的小塊，立即用中性甲醛固定， 固定完成后酒精梯度脫水二甲苯透明浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色后做病理分析。本次實驗結(jié)果
注射后形凝膠時間8分鐘；
注射部位標本大體觀察結(jié)果1周時注射部位皮膚基本恢復正常，與陰性對照組無顯著差異，2周、4周、12周和M周時注射部位與陰性對照組外觀無異，注射部位形成的凝膠隆起逐漸變小，其中第2周到第4周變化不明顯，第4周到第12周有較為顯著的變化，第12 周到第M周注射部位隆起顯著下降，隆起體積有80%左右的縮小，M周時材料有一定量未降解；
HE染色分析1周時小鼠皮下有輕微的炎癥，材料植入處皮膚有一定量的炎細胞浸潤， 處于急性炎癥的恢復期；2周時與陰性對照組相比有極輕微的炎癥，4周、12周和M周材料周圍細胞種類和形態(tài)正常，與陰性對照組無顯著差異。試驗組1周和2周時材料和組織界面明顯，4周、12周和M周材料和組織界面模糊，材料降解過程較為緩慢。結(jié)論本例水凝膠材料體內(nèi)成凝膠速度較快，注射后小鼠皮下急性炎癥期短，不引起慢性炎癥，生物相容性好，材料降解時間超過M周，優(yōu)于目前臨床應用的同類產(chǎn)品，是一種較為理想的臨床修復材料。實施例六
步驟一將類人膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為5. 0%的溶液； 步驟二 將分子量為8X IO5道爾頓的透明質(zhì)酸鈉用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為2. 0% 的溶液；
步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為50%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按3 5 2的體積比混合后在15°C條件下攪拌30分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4 ；
步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。本例水凝膠材料經(jīng)過如下試驗
將制備好的混合液移入ImL的注射器中，放于4°C下備用。選優(yōu)良的昆明小鼠50只， 雄性，體重25-30g，25只為實驗組，25只為陰性對照組，試驗前一周常規(guī)飼養(yǎng)，待小鼠適應新環(huán)境后，提前一天用脫毛劑對小鼠背部脫毛備皮，注射時常規(guī)麻醉，使用碘伏進行皮膚消毒，75%酒精脫碘，用注射器注射于小鼠皮下組織。注射時，用左手拇指和食指輕提小鼠皮膚，右手持注射器，將針頭與皮膚呈30°角刺入皮下，確保不刺入肌肉，注射0. 2mL后緩慢拔出針頭，然后用手指稍壓針刺部位片刻，以防止凝膠外漏。待注射液體不流動觸之有彈性視為形成凝膠，記錄形成凝膠時間，成膠完成認為注射成功。于1周、2周、4周、12周和M 周試驗組和陰性對照組分別處死5只小鼠，將注射凝膠部位皮膚連同材料一起取下，先做大體觀察并記錄試驗結(jié)果，用刀片切成寬為l.OcmX 1.0cm的小塊，立即用中性甲醛固定， 固定完成后酒精梯度脫水二甲苯透明浸蠟，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色后做病理分析。本次實驗結(jié)果
注射后形凝膠時間-J分鐘；
注射部位標本大體觀察結(jié)果1周時注射部位皮膚基本恢復正常，與陰性對照組無顯著差異，2周、4周、12周和M周時注射部位與陰性對照組外觀無異，注射部位形成的凝膠隆起逐漸變小，其中第2周到第4周變化較小，第4周到第12周變化較為顯著，第12周到第 24周注射部位隆起顯著下降，但是隆起并未完全消除，可見M周時材料并未完全降解；
HE染色分析1周時小鼠皮下有輕微的炎癥，材料植入處皮膚有一定量的炎細胞浸潤， 處于急性炎癥的恢復期；2周時與陰性對照組相比有極輕微的炎癥，4周、12周和M周材料周圍細胞種類和形態(tài)正常，與陰性對照組無顯著差異。試驗組1周和2周時材料和組織界面明顯，4周、12周和M周材料和組織界面模糊，材料降解過程較為緩慢。
結(jié)論本例水凝膠材料體內(nèi)成凝膠速度快，注射后小鼠皮下急性炎癥期短，不引起慢性炎癥，生物相容性好，材料降解時間超過M周，可滿足臨床應用需求，是一種較為理想的臨床修復材料。
權(quán)利要求
1.一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)步驟一將膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為1. 0-5. 0%的溶液； 步驟二 將多糖用注射用水或稀酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為0. 5-2. 0%的溶液； 步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為質(zhì)量分數(shù)為20-50%的溶液； 步驟四將上述三種溶液按(1-3):(1-5):(1-2)的體積比混合后在0-15°C條件下攪拌 10-30分鐘混合均勻，并同時將pH調(diào)整至7. 4 ； 步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，其特征在于 所述的步驟一中的膠原蛋白為動物源膠原蛋白或類人膠原蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，其特征在于 所述的步驟二中的多糖為殼聚糖、透明質(zhì)酸鈉中的一種，殼聚糖的脫乙酰度為80-95%，殼聚糖分子量為105-5X 105道爾頓，透明質(zhì)酸鈉分子量為5X IO5-SX IO5道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，其特征在于 所述的步驟二中的稀酸為稀鹽酸、稀醋酸或稀乳酸中的一種，質(zhì)量分數(shù)為0. 5-1. 0%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠的制備方法，其特征在于 由以下步驟實現(xiàn)步驟一將動物源膠原蛋白用注射用水溶解成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液； 步驟二 將脫乙酰度為85%、分子量為5X IO5道爾頓的殼聚糖用質(zhì)量分數(shù)為1%的稀乳酸溶解成質(zhì)量分數(shù)為2、的溶液；步驟三將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為50%的溶液；步驟四將上述三種溶液按3 3 1的體積比混合后在5°C條件下攪拌20分鐘混合均勻，并同時將PH調(diào)整至7.4 ；步驟五將上述混合液在無菌條件下灌裝。
6.如權(quán)利要求1所述的一種膠原蛋白溫敏型水凝膠。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種膠原蛋白溫敏型水凝膠及其制備方法。目前整形美容行業(yè)中使用軟組織填充材料大多存在著硬化，瘤狀腫塊、吸收過快、慢性炎癥等問題，美國F道爾頓相繼批準了幾個用于軟組織填充的產(chǎn)品，其主要成分為牛膠原、透明質(zhì)酸鈉、PMMA小球等，雖有良好效果，但對部分使用者仍存在使用部位紅腫、過敏及降解過快等情況。本發(fā)明將膠原蛋白溶液、殼聚糖酸或透明質(zhì)酸鈉溶液和β-甘油磷酸鈉溶液按(1-3)∶(1-5)∶(1-2)的體積比混合后在0-15℃條件下攪拌10-30分鐘混合均勻，并將pH調(diào)整至7.4后制成溫敏型水凝膠。本發(fā)明提供的膠原蛋白溫敏型水凝膠在37℃具有良好的成膠性，成膠時間在10分鐘以內(nèi)，機械強度良好，且降解時間長，免疫排異反應較弱，應用更加安全有效。
文檔編號C08J3/075GK102229705SQ20111014741
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者嚴建亞, 段志廣, 范代娣, 馬曉軒 申請人:陜西巨子生物技術(shù)有限公司