本發(fā)明涉及埃博霉素B高產(chǎn)菌株的誘變選育及利用該菌株發(fā)酵制備埃博霉素B的方法，涉及微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
埃博霉素B，英文名epothiloneB，纖維堆囊菌Sorangiumcellulosum90的次級代謝產(chǎn)物，分子式為C27H41NO6S，是一種大環(huán)內(nèi)酯類的化合物。與之相似的次級代謝物還有epothiloneA、epothioneC、epothiloneD、epothiloneG、epothiloneH等。EpothiloneB的相對分子量為506.25，熔點為93℃-94℃。埃博霉素B有顯著的選擇性抗乳腺腫瘤細胞和結(jié)腸腫瘤細胞的活性，是一種微管超穩(wěn)定的新型抗腫瘤活性物質(zhì)。它可以通過穩(wěn)定已經(jīng)聚化的微管從而遏制細胞的有絲分裂。在20世紀90年代廣泛應(yīng)用于臨床的是紫杉醇。但是臨床試驗表明，它對不同的實體瘤細胞有明顯的抗腫瘤活性，且副作用多而受限制。如引發(fā)嗜中性白細胞減少癥，外周神經(jīng)病和脫毛癥等；并且紫杉醇的低水溶性使得它必需由乳化方式給定，它本身可能影響心臟功能，導致過敏反應(yīng)；此外，是P-糖蛋白的底物。P-糖蛋白可將許多細胞毒物質(zhì)從細胞泵出，是腫瘤細胞產(chǎn)生多藥物質(zhì)抗性的原因。然而，紫杉醇的復雜的結(jié)構(gòu)阻礙了通過化學修飾改善可溶性和降低毒性副作用的努力，所以引起了人們對相近作用模式但卻具有好的特性化合物的研究。埃博霉素其離體抑制的效果比藥物紫杉醇強2000-5000倍，作用的有效濃度為10～20ng/mL。在埃博霉素的類似物中，帶甲基的埃博霉素B要比A基本上大2倍。比起紫杉醇來，埃博霉素B是一種更不易受P-糖蛋白作用的物質(zhì)。因而埃博霉素B的抗腫瘤性能要比紫杉醇強的多，且其抗腫瘤譜要廣的多。另外，紫杉醇可以從太平洋的紫杉的樹皮中提取，但這種樹生長極慢，所以來源困難。但是對于埃博霉素B來說，可以通過纖維堆囊菌發(fā)酵，無限制的獲得，可以解決抗癌藥物的不足，且價格便宜。所以，此抗癌藥物可能成為紫杉醇更新?lián)Q代的新產(chǎn)品，所以開發(fā)比它更優(yōu)越的埃博霉素來說是非常必要的。然而，有關(guān)纖維堆囊菌的發(fā)酵條件及活性物質(zhì)合成條件的研究報道很少，這一方面反映了纖維堆囊菌研究的困難；另一方面也是全球研究粘細菌生物活性物質(zhì)合成的實驗室太少的緣故。研究粘細菌，尤其是纖維堆囊菌的生長和次級代謝的條件對于開發(fā)粘細菌資源具有重要的意義。纖維素堆囊菌的培養(yǎng)生產(chǎn)埃博霉素，為了進行埃博霉素的大規(guī)模生產(chǎn)，生物發(fā)酵是理想的途徑。粘細菌纖維素堆囊菌的兩種發(fā)酵產(chǎn)物埃博霉素A和B，已有專利報道了大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素A和B。GerthK研究組利用纖維素堆囊菌Soce90進行350L(裝液230L)發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素A和B，以XAD-16樹脂作為吸附劑，分別得到埃博霉素A和B為11和22mg/L。但是在工業(yè)化生產(chǎn)中加入樹脂帶來管子堵住、設(shè)備磨損、滅菌不徹底很多不便，已有專利報道在發(fā)酵液中以環(huán)糊精代替樹脂作為吸附劑來解決這一系列問題。又如李越中等以VY/2培養(yǎng)基作為纖維堆囊菌Soce90菌株的培養(yǎng)基，接種于ME培養(yǎng)液中，發(fā)酵培養(yǎng)4天左右，經(jīng)分離提純便得到埃博霉素B。埃博霉素的發(fā)酵合成近年來研究的比較少，除外國的Gerthk以外，我國山東大學的微生物技術(shù)國家重點實驗室也在研究。其中，吳斌輝等以纖維堆囊菌Soce9733-1作為研究對象，液體搖瓶發(fā)酵用Ck6培養(yǎng)基。結(jié)果表明纖維堆囊菌對可溶性淀粉、木聚糖、纖維素等復雜碳源的利用能力較強，簡單碳源中只利用葡萄糖；KNO3、蛋白胨是較好的氮源，大多數(shù)氮源都能支持生長，表明該菌營養(yǎng)要求簡單，能高效的利用自然界里豐富的纖維素資源。堆囊菌的鹽耐受能力較低，鹽濃度高于1％的培養(yǎng)基中菌體幾乎不能生長，Mg2+是生長必需的元素，Ca2+對生長沒有明顯的作用，但是子實體的形態(tài)發(fā)生所必需的。培養(yǎng)基的起始pH為7.0時細胞生長較好，大于8.0或小于5.0不生長。李越中等以Soce90作為研究對象，以VY/2培養(yǎng)基作為纖維堆囊菌Soce90菌株的培養(yǎng)基，接種于ME培養(yǎng)液中，發(fā)酵培養(yǎng)4天左右，結(jié)果表明菌體的生長狀態(tài)對產(chǎn)物的合成有影響，指數(shù)期接種物、低氮高碳培養(yǎng)條件、某些鹽離子、氨基酸和乙酸鹽對epothilones的合成有益，以此獲得較為穩(wěn)定epothilons產(chǎn)量的條件因素。德國的GBF中心小組中GerthK研究組利用纖維素堆囊菌Soce90進行350L(裝液230L)發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素A和B，以XAD-16樹脂作為吸附劑，分別得到埃博霉素A和B為11和22mg/L。山東大學李越中等以VY/2培養(yǎng)基作為纖維堆囊菌Soce90菌株的培養(yǎng)基，接種于ME培養(yǎng)液中，發(fā)酵培養(yǎng)4天左右，收獲的樹脂水洗后濾除水份，加50mL甲醇室溫下浸泡提取過夜，溶劑甲醇在40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去，抽提物重新溶于0.5mL甲醇中(即產(chǎn)物濃縮100倍)，離心。HPLC(惠普)連續(xù)梯度洗脫分析epothilones含量。溶劑A為0.2％的乙酸，溶劑B為乙腈，在此條件下，epothiloneA的洗脫峰出現(xiàn)在4min，B出現(xiàn)在5min，最后比較理想的結(jié)果分別得到埃博霉素A和B為26.4mg/L，22.7mg/L。2002年發(fā)布的專利號為WO02/46196中提到了通過對樹脂的收集，經(jīng)過異丙醇洗提，之后和水混合，將溶劑蒸干，剩余的水相中的物質(zhì)通過乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后過濾，通過反相的HPLC，最后是597.1kg的樹脂中獲得150g的埃博霉素B。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，提供一種改良纖維素堆囊菌后發(fā)酵制備埃博霉素B的新方法，該方法具有發(fā)酵單位高、收率高、產(chǎn)品含量高等優(yōu)點。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的，具體步驟順序如下：1、高產(chǎn)菌株篩選采用亞硝酸-紫外線復合處理纖維堆囊菌(Polyangiumcellulosun)ATCC15384。亞硝酸分別處理5、10、15、20、25、30、35、40min，紫外燈15cm照射1min后在30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)16h，進行紅霉素抗性篩選和遺傳穩(wěn)定性考察。2、搖瓶發(fā)酵取10、15、20mL滅菌的2％、3％、4％海藻酸鈉和培養(yǎng)了3天的纖維堆囊菌ABM113(CGMCCNo.6418)2、4、6、8mL進行充分混合，制得直徑3mm大的球狀顆粒。接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到固定化載體，以備發(fā)酵用。凍存菌種經(jīng)50ml種子培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)入200ml種子培養(yǎng)基(接種量接種量2.5％、5％、10％、15％、20％)，48、72、96、120h后轉(zhuǎn)種發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)液體積1％～3％的NK型弱極性大孔吸附樹脂、HLD-16中性大孔樹脂、XAD-16樹脂，滅菌后利用纖維堆囊菌ABM113發(fā)酵制取埃博霉素B，同時對發(fā)酵條件進行優(yōu)化：將發(fā)酵培養(yǎng)基分別調(diào)pH到6.5，7.0，7.5，8.0，使用1‰(V/V)Antifoam204(Sigma)、AntifoamB(Sigma)和1030F三種不同的消泡劑，采用培養(yǎng)基一次性添加和將培培養(yǎng)基的成份分兩次添加、三次添加，在發(fā)酵培養(yǎng)液中添加混合元素，F(xiàn)eCl3、ZnCl2、MnCl2.4H2O、CuCl2·2H2O分別加入1mg/L或者不添加，考察埃博霉素B的產(chǎn)率。3、提取純化發(fā)酵結(jié)束后，待樹脂完全沉淀，棄去發(fā)酵液。用適量水清洗樹脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍樹脂體積的乙酸乙酯，30℃振蕩(150r/min)解吸過夜，重復解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇適量復溶，獲得粗品。粗品經(jīng)SephadexLH-20柱層析，10×100cm。流動相：甲醇。上樣量為柱體積的1％～5％，提取物使用甲醇溶解后，離心取上清液，約100ml上樣。流動相流速為6～10ml/min，展開距離約7.5cm/h。經(jīng)HPLC分析，收集6.5min后的洗脫液。經(jīng)SephadexLH-20分離后的餾分，通過C18反相色譜柱進一步純化。填料：C18，15μm，，80×100mm。流動相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。檢測波長：UV230。經(jīng)HPLC分析，收集75min后的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到白色結(jié)晶狀埃博霉素B。本發(fā)明的創(chuàng)造性在于采用亞硝酸-紫外線復合誘變獲得埃博霉素B高產(chǎn)菌株——纖維堆囊菌(Polyangiumcellulosum)，該菌株已于2012年8月7日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號：CGMCCNo.6418。采用間隔添加培養(yǎng)基發(fā)酵，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加混合微量元素培養(yǎng)，選用海藻酸鈉作為固定化材料進行包埋，發(fā)酵能力大大提高。本發(fā)明具有操作簡便、易于大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)品收率高、純度高(干基含量≥99.0％)等特點。附圖說明圖1為埃博霉素B的結(jié)構(gòu)式，R1＝H，R＝Me。具體實施方式實施例1一種發(fā)酵法制取埃博霉素B的方法，按以下步驟依次進行：(1)菌懸液的制備：將甘油冷凍保存的纖維堆囊菌(Polyangiumcellulosun)ATCC15384菌種于4℃條件下解凍，在種子培養(yǎng)基中30℃、150r/min條件下活化24h，將活化的菌種按10％的接種量接入種子培養(yǎng)基中，于30℃、150r/min條件下進行培養(yǎng)16h，作為種子培養(yǎng)液，按10％的量接種于新的ATCC培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14h。然后在培養(yǎng)瓶中加入玻璃珠繼續(xù)培養(yǎng)2h，將菌團打散，培養(yǎng)液2000r/min離心10min，去上清，菌體采用生理鹽水洗兩次，然后重懸于生理鹽水中，用血球計數(shù)板進行計數(shù)，備用。種子培養(yǎng)基成分：鮮酵母5.0g/L，CaCl2·2H2O1.0g/L，VB120.5mg/L，瓊脂15g/L，定容至1L，用3mol/L的KOH調(diào)pH至7.2，121℃滅菌20min。(2)亞硝酸-紫外誘變：按照上述方法制備107個/mL的菌懸液，取2mL菌懸液，2000g離心，加入1mL0.2mol/L亞硝酸鈉溶液和1mL1mol/LpH4.5醋酸緩沖液，分別處理5、10、15、20、25、30、35、40min，加入18mL0.7mol/L的pH8.6的Na2HPO4緩沖液終止反應(yīng)，將誘變菌液稀釋1、10和102倍，取100μL涂布平板，平板距離38mW/cm2紫外燈15cm進行照射1min，在30℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)16h，觀察菌落數(shù)，計算致死率。(3)紅霉素抗性篩選：誘變菌液稀釋成不同濃度梯度，涂布于含有14mg/L紅霉素抗性篩選培養(yǎng)基，有156株存活，將這些菌株編號為纖維堆囊菌ABM001～ABM156，測定突變株的埃博霉素B含量，將產(chǎn)量最高的5株突變株進行遺傳穩(wěn)定性考察，5個突變菌株連續(xù)傳10代，突變株ABM113遺傳穩(wěn)定性好，其余高產(chǎn)菌株在連續(xù)傳4代以上時埃博霉素B產(chǎn)量下降。(4)細胞固定化：取10mL滅菌的2％海藻酸鈉和培養(yǎng)了3天的纖維堆囊菌ABM1132mL進行充分混合，用吸管吸取混合液慢慢的滴加到3％的CaCl2(20℃)，靜置2個小時，之后用滅菌水清洗，這樣制得的是直徑3mm大的球狀顆粒。接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天后，棄去培養(yǎng)液，無菌水反復沖洗三次，得到固定化載體，以備發(fā)酵用。(5)吸附劑預處理：樹脂使用前，需根據(jù)使用要求，進行程度不同的預處理，是將樹脂內(nèi)孔殘存的惰性溶劑浸除。樹脂預處理方法：第一步，加入高于樹脂層10cm的乙醇浸漬4小時，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在試管中用水稀釋不渾濁時為止。最后用水反復洗滌至乙醇含量小于1％或無明顯乙醇氣味后即可；第二步，加入高于樹脂層10cm的3％-5％鹽酸溶液浸泡2-4小時，用鹽酸進行淋洗后，用凈水洗至接近中性；第三步，用3％-5％的氫氧化鈉溶液浸泡4小時后用同濃度的3-4倍樹脂體積的氫氧化鈉溶液通柱，最后用凈水清洗至pH值為中性，備用。(6)發(fā)酵：固定化菌種經(jīng)50ml種子培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)入200ml種子培養(yǎng)基(接種量5％)，72h后轉(zhuǎn)種發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)液體積1％的NK型弱極性大孔吸附樹脂(樹脂用蒸餾水浸泡一天)，121℃滅菌20min。利用纖維堆囊菌ABM113在如下條件下發(fā)酵制取埃博霉素B：500ml三角瓶，裝瓶量200ml，發(fā)酵培養(yǎng)基pH6.5(用3mol/L的KOH調(diào)節(jié))，使用1‰(V/V)AntifoamB(Sigma)作為消泡劑，發(fā)酵培養(yǎng)基分兩次添加，起始添加一半發(fā)酵培養(yǎng)基，四天后添加另一半發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)液中添加混合元素FeCl3、ZnCl2、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O各1mg/L，32℃，120r/min發(fā)酵培養(yǎng)9天后收獲。發(fā)酵培養(yǎng)基成分：脫脂奶粉10g/L，酵母粉5g/L，馬鈴薯淀粉25g/L，CaCl2·2H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，F(xiàn)e-EDTA8mg/L。(7)粗提物制備：發(fā)酵結(jié)束后，待樹脂完全沉淀，棄去發(fā)酵液。用適量水清洗樹脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍樹脂體積的乙酸乙酯，30℃振蕩(150r/min)解吸過夜，重復解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇適量復溶，獲得粗品。(8)葡聚糖凝膠LH-20柱層析：葡聚糖凝膠SephadexLH-20，10×100cm。流動相：甲醇。上樣量為柱體積的3％，提取物使用甲醇溶解后，離心取上清液，約100ml上樣。流動相流速為8ml/min，展開距離約7.5cm/h。經(jīng)HPLC分析，收集6.5min后的洗脫液。(9)C18反相色譜：經(jīng)SephadexLH-20分離后的餾分，通過C18反相色譜柱進一步純化。填料：C18，15μm，，80×100mm。流動相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。檢測波長：UV230。經(jīng)HPLC分析，收集75min后的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。含埃博霉素B的粗提物經(jīng)兩步分離純化得到純度為99.4％的埃博霉素B。實施例2一種發(fā)酵法制取埃博霉素B的方法，按以下步驟依次進行：(1)、(2)、(3)同實施例1。(4)細胞固定化：取15mL滅菌的3％海藻酸鈉和培養(yǎng)了3天的纖維堆囊菌ABM1134mL進行充分混合，用吸管吸取混合液慢慢的滴加到3％的CaCl2(20℃)，靜置2個小時，之后用滅菌水清洗，這樣制得的是直徑3mm大的球狀顆粒。接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天后，棄去培養(yǎng)液，無菌水反復沖洗三次，得到固定化載體，以備發(fā)酵用。(5)吸附劑預處理：樹脂使用前，需根據(jù)使用要求，進行程度不同的預處理，是將樹脂內(nèi)孔殘存的惰性溶劑浸除。樹脂預處理方法：第一步，加入高于樹脂層10cm的乙醇浸漬4小時，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在試管中用水稀釋不渾濁時為止。最后用水反復洗滌至乙醇含量小于1％或無明顯乙醇氣味后即可；第二步，加入高于樹脂層10cm的3％-5％鹽酸溶液浸泡2-4小時，用鹽酸進行淋洗后，用凈水洗至接近中性；第三步，用3％-5％的氫氧化鈉溶液浸泡4小時后用同濃度的3-4倍樹脂體積的氫氧化鈉溶液通柱，最后用凈水清洗至pH值為中性，備用。(6)發(fā)酵：固定化菌種經(jīng)50ml種子培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)入200ml種子培養(yǎng)基(接種量10％)，96h后轉(zhuǎn)種發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)液體積2％的HLD-16中性大孔樹脂(樹脂用蒸餾水浸泡一天)，121℃滅菌20min。利用纖維堆囊菌ABM113在如下條件下發(fā)酵制取埃博霉素B：500ml三角瓶，裝瓶量200ml，發(fā)酵培養(yǎng)基pH7.0(用3mol/L的KOH調(diào)節(jié))，使用1‰(V/V)Antifoam204(Sigma)作為消泡劑，一次性添加發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)液中添加混合元素FeCl3、ZnCl2、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O各1mg/L，32℃，120r/min發(fā)酵培養(yǎng)9天后收獲。發(fā)酵培養(yǎng)基成分：脫脂奶粉10g/L，酵母粉5g/L，馬鈴薯淀粉25g/L，CaCl2·2H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，F(xiàn)e-EDTA8mg/L。(7)粗提物制備：發(fā)酵結(jié)束后，待樹脂完全沉淀，棄去發(fā)酵液。用適量水清洗樹脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍樹脂體積的乙酸乙酯，30℃振蕩(150r/min)解吸過夜，重復解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇適量復溶，獲得粗品。(8)葡聚糖凝膠LH-20柱層析：葡聚糖凝膠SephadexLH-20，10×100cm。流動相：甲醇。上樣量為柱體積的2％，提取物使用甲醇溶解后，離心取上清液，約100ml上樣。流動相流速為10ml/min，展開距離約7.5cm/h。經(jīng)HPLC分析，收集6.5min后的洗脫液。(9)C18反相色譜：經(jīng)SephadexLH-20分離后的餾分，通過C18反相色譜柱進一步純化。填料：C18，15μm，，80×100mm。流動相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。檢測波長：UV230。經(jīng)HPLC分析，收集75min后的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。含埃博霉素B的粗提物經(jīng)兩步分離純化得到純度為99.2％的埃博霉素B。實施例3一種發(fā)酵法制取埃博霉素B的方法，按以下步驟依次進行：(1)、(2)、(3)同實施例1。(4)細胞固定化：取20mL滅菌的4％海藻酸鈉和培養(yǎng)了3天的纖維堆囊菌ABM1136mL進行充分混合，用吸管吸取混合液慢慢的滴加到3％的CaCl2(20℃)，靜置2個小時，之后用滅菌水清洗，這樣制得的是直徑3mm大的球狀顆粒。接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天后，棄去培養(yǎng)液，無菌水反復沖洗三次，得到固定化載體，以備發(fā)酵用。(5)吸附劑預處理：樹脂使用前，需根據(jù)使用要求，進行程度不同的預處理，是將樹脂內(nèi)孔殘存的惰性溶劑浸除。樹脂預處理方法：第一步，加入高于樹脂層10cm的乙醇浸漬4小時，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在試管中用水稀釋不渾濁時為止。最后用水反復洗滌至乙醇含量小于1％或無明顯乙醇氣味后即可；第二步，加入高于樹脂層10cm的3％-5％鹽酸溶液浸泡2-4小時，用鹽酸進行淋洗后，用凈水洗至接近中性；第三步，用3％-5％的氫氧化鈉溶液浸泡4小時后用同濃度的3-4倍樹脂體積的氫氧化鈉溶液通柱，最后用凈水清洗至pH值為中性，備用。(6)發(fā)酵：固定化菌種經(jīng)50ml種子培養(yǎng)基培養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)入200ml種子培養(yǎng)基(接種量15％)，120h后轉(zhuǎn)種發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)液體積3％的XAD-16樹脂(樹脂用蒸餾水浸泡一天)，121℃滅菌20min。利用纖維堆囊菌ABM113在如下條件下發(fā)酵制取埃博霉素B：500m1三角瓶，裝瓶量200ml，發(fā)酵培養(yǎng)基pH7.5(用3mol/L的KOH調(diào)節(jié))，使用1‰(V/V)1030F作為消泡劑，發(fā)酵培養(yǎng)基分三次添加，起始添加一半發(fā)酵培養(yǎng)基，三天后添加1/4發(fā)酵培養(yǎng)基，六天后添加1/4發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)液中不添加混合元素，32℃，120r/min發(fā)酵培養(yǎng)9天后收獲。發(fā)酵培養(yǎng)基成分：脫脂奶粉10g/L，酵母粉5g/L，馬鈴薯淀粉25g/L，CaCl2·2H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，F(xiàn)e-EDTA8mg/L。(7)粗提物制備：發(fā)酵結(jié)束后，待樹脂完全沉淀，棄去發(fā)酵液。用適量水清洗樹脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍樹脂體積的乙酸乙酯，30℃振蕩(150r/min)解吸過夜，重復解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇適量復溶，獲得粗品。(8)葡聚糖凝膠LH-20柱層析：葡聚糖凝膠SephadexLH-20，10×100cm。流動相：甲醇。上樣量為柱體積的4％，提取物使用甲醇溶解后，離心取上清液，約100ml上樣。流動相流速為6ml/min，展開距離約7.5cm/h。經(jīng)HPLC分析，收集6.5min后的洗脫液。(9)C18反相色譜：經(jīng)SephadexLH-20分離后的餾分，通過C18反相色譜柱進一步純化。填料：C18，15μm，，80×100mm。流動相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。檢測波長：UV230。經(jīng)HPLC分析，收集75min后的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。含埃博霉素B的粗提物經(jīng)兩步分離純化得到純度為99.0％的埃博霉素B。