一種呋喃半乳寡糖及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種呋喃半乳寡糖,其特征在于:該呋喃半乳糖的結(jié)構(gòu)簡式為[→5)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→]n,由不同聚合度n為2~7的呋喃構(gòu)形的半乳糖通過β-(1→5)連接方式依次連接,本發(fā)明還公開了其制備方法和應用,與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果在于:采用真菌灰黃青霉的發(fā)酵液中分離得到一種結(jié)構(gòu)新穎的半乳甘露聚糖,其獨特之處在于其半乳糖全部以呋喃構(gòu)型存在,其氫鍵具有高效性及立體多樣性,含有呋喃構(gòu)型的糖復合物及其衍生物很有可能成為候選藥物,具有潛在的生物及化學應用價值,并且本發(fā)明的制備方法具有方法穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好,易于掌握的特點。
【專利說明】一種呋喃半乳寡糖及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以深海真菌灰黃青霉的胞外甘露半乳聚糖為原料制備的呋喃半乳寡糖及其制備方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002]海洋特征寡糖主要是指通過化學和生物酶法從海洋動物多糖、藻類多糖和微生物多糖中降解獲得的寡糖。海洋寡糖與陸地寡糖相比,具有結(jié)構(gòu)特異和生物活性廣泛,和人類健康、重大疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的特點。早期海洋寡糖的制備主要是為了結(jié)構(gòu)分析,而目前則是用于活性和構(gòu)效關(guān)系研究,開發(fā)海洋寡糖類藥物及其功能制品。如海洋中褐藻膠寡糖及其衍生物具有抗心腦血管疾病、抗老年癡呆癥等;卡拉膠寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗腫瘤活性等;瓊膠寡糖則具有抗氧化和抗糖尿病活性等;甲殼胺寡糖及其衍生物具有抗動脈粥樣硬化、提高機體免疫等。這些結(jié)構(gòu)和功能獨特的海洋寡糖具備十分廣闊的開發(fā)應用前景。除了對海洋藥物產(chǎn)業(yè)的貢獻,結(jié)構(gòu)和功能獨特的海洋寡糖在其它領(lǐng)域還具備廣闊的開發(fā)空間,在食品、化妝品、軍工及農(nóng)業(yè)等行業(yè)均有應用。隨著研究的不斷深入,新的寡糖資源和生物功能被不斷發(fā)現(xiàn)。從不同海洋生物中獲得結(jié)構(gòu)特異和活性豐富的海洋特征寡糖,開發(fā)海洋寡糖資源仍然是海洋寡糖研究的重要方向。
[0003]微生物具有發(fā)酵條件可控,發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定的優(yōu)勢。從不同海洋環(huán)境中發(fā)掘新型海洋微生物多糖和寡糖資源也是海洋多糖的研究熱點之一。從采自太平洋2481m左右的深海海底底泥中分離得到的一株真菌灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)的發(fā)酵液中分離得到一種結(jié)構(gòu)新穎的半乳甘露聚糖(Galactomannan),含有聚合度約為8的長鏈呋喃半乳糖[―5)-β-D-Galf-(I — 5)-β-D-Galf-(I — ]n結(jié)構(gòu)。獨特之處在于其半乳糖全部以呋喃構(gòu)型存在。單糖具有吡喃和呋喃兩種構(gòu)型,但從自然界發(fā)現(xiàn)的糖類物質(zhì)中一直以來只有吡喃構(gòu)型,因為吡喃構(gòu)型的糖立體選擇上最為穩(wěn)定,近幾十年才發(fā)現(xiàn)呋喃構(gòu)型的糖。一經(jīng)發(fā)現(xiàn)呋喃構(gòu)型的糖復合物吸引了廣泛的注意。因為呋喃構(gòu)型的六碳己糖只存在于低等生物中主要是細菌和真菌包括一些病原微生物,在哺乳動物體內(nèi)不存在,以及其氫鍵的高效性及立體多樣性,具有潛在的生物及化學應用價值。因此,含有呋喃構(gòu)型的糖復合物及其衍生物很有可能成為候選藥物。
[0004]自然界中呋喃糖復合物還包括一些糖蛋白、糖肽和糖脂,如今對其生物學功能和生物活性研究還不是很透徹,其生物學功能可能與維持微生物細胞壁的穩(wěn)定性和與微生物的致病力有關(guān)。目前研究的重點主要是對呋喃糖進行結(jié)構(gòu)修飾或者合成特異結(jié)構(gòu)的呋喃糖衍生物用于微生物呋喃糖合成相關(guān)酶類的功能研究和抗菌藥物的新靶點開發(fā),即通過抑制合成呋喃糖的相關(guān)變構(gòu)酶和糖基轉(zhuǎn)移酶達到抑制一些病原體細胞壁合成,使其喪失致病力。對呋喃糖生物活性的深入報道也不多,已有的報道顯示一些呋喃寡糖衍生物具有體外抗腫瘤活性,一些選凝素也能夠識別特定結(jié)構(gòu)的呋喃糖,提示我們具有獨特立體選擇性結(jié)構(gòu)的呋喃糖復合物可能存在特異的生物活性。目前發(fā)現(xiàn)的呋喃構(gòu)型的糖中以呋喃半乳糖(Galf)為主。呋喃半乳寡糖具有獨特的性質(zhì),到目前為止,國內(nèi)外尚未有對呋喃半乳寡糖進行制備和免疫調(diào)節(jié)等生物活性研究和報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種深海真菌來源特征寡糖的呋喃半乳寡糖。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種利用深海真菌灰黃青霉的胞外甘露半乳聚糖為原料制備呋喃半乳寡糖的制備方法。
[0007]本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種呋喃半乳寡糖在免疫調(diào)節(jié)藥物中的應用。
[0008]一種呋喃半乳寡糖,其特征在于:該呋喃半乳糖的結(jié)構(gòu)簡式為[—5) - β -D-Galf-(1 — 5)-β -D-Galf-(I — ]η,由不同聚合度η為2~7的呋喃構(gòu)形的半乳糖通過β - (I — 5)連接方式依次連接。
[0009]一種呋喃半乳寡糖的制備方法,包括步驟:
[0010]a、菌種的發(fā)酵:以深海真菌灰黃青霉菌為出發(fā)菌株,采用斜面菌種進行液體搖瓶培養(yǎng);
[0011]b、真菌胞外多糖的提取:包括①過濾、②脫色、③醇沉、④透析、⑤純化,其中:
[0012]①過濾:取步驟a的發(fā)酵液經(jīng)濾紙抽濾除去菌絲體及其中的粗雜質(zhì),再萃取除去脂溶性小分子物質(zhì);
[0013]②脫色:采用活性炭脫色,在80-100°C水浴中0.5-1.5%活性炭緩慢加入到過濾后的發(fā)酵液中保溫并攪拌5-10min,待溶液冷卻至室溫后,用漏斗抽濾至干即可;
[0014]③醇沉:脫色后的溶液濃縮至原體積1/10-1/5,加入原體積1/5-1/3體積的有機溶劑,劇烈震蕩后離心,吸出上層水相后,將80 % -95 %的乙醇緩慢加入到濃縮液中,使乙醇終濃度達到70% -80%,把醇沉后的溶液放入冰箱中靜置過夜;
[0015]④透析:步驟③所得的沉淀部分用濾紙抽濾,并脫水脫色后于40°C _60°C烘箱烘干,取烘干粉末溶于蒸餾水后離心的上清液置于孔徑為3500Da-5000Da的透析袋在自來水中透析40h-50h,再用去離子水透析20h-30h,收集透析后的提取液,將透析液濃縮凍干即得到胞外多糖粗品;
[0016]⑤純化:將步驟④所得多糖溶液配制成水溶液,離心后進行梯度洗脫,經(jīng)分析、分別收集合并各含糖組分,減壓濃縮,透析脫鹽,凍干,得到目標多糖。
[0017]C、呋喃半乳寡糖的制備:先將步驟b的多糖5.0mg-7.0mg,溶于0.01-0.05mol/L三氟乙酸溶液中,混勻后于80°C -100°C的水浴中反應1.5h-3h,中和后備用,再采用凝膠層析柱對降解寡糖樣品進行分離與在線檢測,根據(jù)檢測曲線分別按峰收集各峰對應部分,脫鹽后凍干即得呋喃半乳寡糖。
[0018]進一步地,所述步驟a中,的斜面菌種培養(yǎng),培養(yǎng)基組成是以g/100ml計:所述步驟a中的斜面菌種培養(yǎng),培養(yǎng)基組成是以g/100ml計:馬鈴薯15-25,葡萄糖1_3,瓊脂15-25,加水定容至至1L,pH值為自然,斜面菌種培養(yǎng)溫度25-33°C,培養(yǎng)150-250小時。
[0019]進一步地,所述步驟a中,搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)基組成是以g/100ml計:麥芽糖1_10,甘露醇2-5,葡萄糖1-5,谷氨酸鈉1-3,KH2PO40.05-1, MgSO40.03_2,酵母膏0.3-1和玉米漿
0.1-4 ,加水定容至 1L,pH 調(diào)至 5.5-6.5,25。。_28°C靜置培養(yǎng) 7d_10d。
[0020]進一步地,所述步驟b中的步驟③醇沉中所述的有機溶劑為氯仿和正丁醇,其中氯仿和正丁醇的體積比為4:1。
[0021]進一步地,所述步驟b中的步驟③醇沉中所述的乙醇加入濃縮液中的體積比為5:1。
[0022]進一步地,所述步驟b中的步驟⑤采用梯度洗脫,洗脫液為以0.1-0.5mol/L的NaCl水溶液,流速為lmL/min。
[0023]本發(fā)明還提供一種呋喃半乳寡糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物中的應用。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果在于:采用真菌灰黃青霉的發(fā)酵液中分離得到一種結(jié)構(gòu)新穎的半乳甘露聚糖,含有聚合度約為8以下的長鏈呋喃半乳糖[—5) - β -D-Galf-(l — 5)-β -D-Galf-(I — ]η結(jié)構(gòu),獨特之處在于其半乳糖全部以呋喃構(gòu)型存在,其氫鍵具有高效性及立體多樣性,含有呋喃構(gòu)型的糖復合物及其衍生物很有可能成為候選藥物,具有潛在的生物及化學應用價值,并且本發(fā)明的制備方法具有方法穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好,易于掌握的特點,同時,其分析分法避免了傳統(tǒng)方法因必須進行多步分離純化和多種波譜手段分析而帶來的耗時、費力、成本高、無法快速檢測的缺陷。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明的胞外多糖部分酸水解后寡糖在B1-Gel Ρ4的凝膠純化圖;
[0026]圖2為本發(fā)明的各寡糖組分的單糖組成色譜圖;
[0027]圖3為本發(fā)明的呋喃半乳二糖的ES1-CID-MS質(zhì)譜圖;
[0028]圖4為本發(fā)明的呋喃半乳二糖的ES1-CID-MSMS 二級質(zhì)譜圖;
[0029]圖5為本發(fā)明的1,5連接呋喃半乳寡糖質(zhì)譜斷裂模式示意圖;
[0030]圖6為本發(fā)明的1,5呋喃半乳寡糖的13C-NMR圖譜;
[0031]圖7為本發(fā)明的呋喃半乳寡糖對巨噬細胞吞噬中性紅作用的曲線圖。
【具體實施方式】
[0032]以下通過結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0033]實施例1菌種的發(fā)酵
[0034]1.1 來源:
[0035]以中國海洋大學醫(yī)藥學院提供的深海真菌灰黃青霉菌,為出發(fā)菌株,采用斜面菌種進行液體搖瓶培養(yǎng);
[0036]1.2 培養(yǎng)基:
[0037]斜面培養(yǎng)基,該馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基組成是以g/100ml計:馬鈴薯15,葡萄糖2,瓊脂20,加水定容至至1L,pH值為自然,斜面菌種培養(yǎng)溫度25°C,培養(yǎng)160小時。
[0038]搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)基組成是以g/100ml計:麥芽糖2,甘露醇2,葡萄糖I,谷氨酸鈉1,KH2PO40.05,MgSO40.03,酵母膏0.3和玉米漿0.1,加水定容至1L,pH調(diào)至6.5,28°C靜置培養(yǎng)8d。
[0039] 1.3培養(yǎng)方法:按上述配方配制好馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基,將深海真菌灰黃青霉菌菌株原種4°C保存在培養(yǎng)基上;發(fā)酵時,菌株孢子接種于含有300mL培養(yǎng)液的100mL錐形瓶中進行搖瓶培養(yǎng)。
[0040]1.4真菌胞外多糖的提取:海洋真菌Penicillium griseofulvum的發(fā)酵液經(jīng)布氏漏斗雙層濾紙抽濾除去菌絲體及其中的粗雜質(zhì),用乙酸乙酯萃取除去脂溶性小分子物質(zhì),然后用活性炭脫色,即在100°c水浴中1.5%活性炭緩慢加入到發(fā)酵液中保溫并攪拌7min,待溶液冷卻至室溫后,用含有硅藻土濾餅的布氏漏斗抽濾至干即可。脫色后的溶液濃縮至原體積1/10,并加入多糖1/5體積的Sevag液(氯仿:正丁醇=4:1, v/v)。劇烈震蕩后離心,上層為多糖層,發(fā)酵液中變性蛋白會出現(xiàn)在上下兩層的界面處。吸出上層水相,重復上述操作兩次后,將預冷的95%的乙醇緩慢加入到濃縮液中(乙醇與濃縮液的體積比為5:1),使乙醇終濃度達到80%,邊加邊攪拌,多糖以白色絮狀沉淀析出,把醇沉后的溶液放入冰箱中靜置過夜。傾去上層清液,取沉淀部分用布氏漏斗二層濾紙抽濾,并依次用無水乙醇、丙酮數(shù)次脫水脫色后于40°C烘箱烘干。取烘干粉末溶于適量蒸餾水后離心后的上清液置于截留分子量為3500Da的透析袋中透析2d,電導率儀測試透析后外液至恒定值時停止透析,將透析液濃縮凍干即得到胞外多糖粗品。
[0041]1.5真菌胞外多糖的分離純化:將多糖溶液配制成50mg/ml的水溶液2mL,離心后采用Q Sepharose Fast Flow柱層析(2.6cmX50cm)連于ΑΚΤΑ-FPLC快速蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進行洗脫。流動相分別以水、0.U0.25,0.35mol/L的NaCl洗脫,流速為lmL/min,采用部分收集器收集0.lmol/L的NaCl洗脫組分,用苯酚_硫酸法分析并分別收集合并各含糖組分,減壓濃縮,透析脫鹽,凍干,得到目標多糖。
[0042]實施例2呋喃半乳寡糖的制備及組成測定:
[0043]2.1呋喃半乳寡糖的制備
[0044]將多糖5.0mg,溶于ImL0.01mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液中,混勻后于100°C的水浴中反應1.5h,中和后備用。米用B1-Gel P4(100X 1.6cm)凝膠層析柱根據(jù)分子量的大小對降解寡糖樣品進行分離。流動相為0.2mol/L NH4HCO3溶液,流速為0.15mL/min,采用示差檢測器在線檢測,自動部分收集器收集樣品,根據(jù)檢測曲線分別按峰收集各峰(F1-F6)對應部分,脫鹽后凍干即得寡糖,結(jié)果如圖1所示為全排阻樣品,不在寡糖的范圍之列,F(xiàn)l為呋喃半乳6糖,F(xiàn)2為呋喃半乳5糖,F(xiàn)3為呋喃半乳4糖,F(xiàn)4為呋喃半乳3糖,F(xiàn)5為呋喃半乳2糖,F(xiàn)6為單糖。
[0045]2.2呋喃半乳寡糖的單糖組成測定
[0046]采用(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)PMP柱前衍生化方法對寡糖進行單糖組成分析,對等摩爾配制的單糖標準品和各寡糖全水解后產(chǎn)物進行PMP衍生,然后進行液相色譜分析,色譜條件為:色譜柱:安捷倫Agilent XDB-C18色譜柱;柱溫:35°C;流動相:磷酸鹽緩沖液(pH6.7)/CH3CN(83:17,V:V);流速:1.0mL/min ;檢測器:DAD(245nm)。
[0047]實施例3呋喃半乳寡糖的質(zhì)譜鑒定
[0048]3.1寡糖的質(zhì)譜檢測
[0049]本發(fā)明采用E電噴霧離子化碰撞誘導解離串聯(lián)質(zhì)譜(ES1-CID-MS/MS),對寡糖的結(jié)構(gòu)進行分析鑒定。在質(zhì)譜的分析過程中,N2作為溶劑的吹干氣體和噴霧氣體,流速分別為250L/h和15L/h,離子源和溶劑揮發(fā)溫度分別是80°C和150°C。樣品溶解在乙腈/水(1:1,v/v)中濃度約為5-10pM,注射5yL樣品進行質(zhì)譜分析。流動相為乙腈水(1:1,V/V),在泵的動力下,從注射器以10μ L/mi的流速注入。測試中,錐孔電壓維持在50eV,而毛細管電壓為3KV。在碰撞誘導分裂二級質(zhì)譜(CID-MS/MS)對產(chǎn)物離子的掃描中,為了使分子離子峰的強度最大化,需要一個錐孔80eV電壓。氬氣作為碰撞氣體提供了 1.7bar的壓力,同時為了得到最好的反應序列的碎片信息,碰撞能量保持在25-42eV,結(jié)果如圖2、3和4所示。從圖2的結(jié)果表明:F6-F2分別對應2糖至7糖。從圖3的一級質(zhì)譜可以看出呋喃半乳二糖的[Μ-Η]峰341.1和377.1處的[M+C1]_,對圖4的二級質(zhì)譜片段斷裂特征進行對比和歸納判斷,由于環(huán)間斷裂同時出現(xiàn)與分子離子峰差值為60,90,108,120的碎片離子峰,其判斷可能為β_(1 — 5)連接的呋喃半乳寡糖。
[0050]3.2呋喃半乳寡糖的NMR鑒定
[0051]將5.0mg多糖樣品用ImL D2O溶解,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥交換2次,將活潑氫用氘置換。用約0.5mL D2O溶解后置于核磁管,于25°C JNM-ECP600核磁共振波譜儀測定其13C-NMR,以氘代丙酮為內(nèi)標,13C定在31.07ppm。
[0052]通過13C-NMR鑒定發(fā)現(xiàn)只有β-D-Galf的端基碳的化學位移才能向低場位移至105ppm以上,β呋喃半乳糖的核磁在107和105.7ppm附近出現(xiàn)兩個特征信號,為非還原端及還原端的端基碳信號,82.58ppm為β-D-Galf的C4為信號,這三個信號均為β-D-Galf的特征信號如下表所示:
[0053]I, 5呋喃半乳寡糖的13C-NMR分析
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種呋喃半乳寡糖,其特征在于:該呋喃半乳糖的結(jié)構(gòu)簡式為[―5)-β-D-Galf-(I—5)-β -D-Galf-(I — ]η,由不同聚合度η為2~7的呋喃構(gòu)形的半乳糖通過β _(1 — 5)連接方式依次連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呋喃半乳寡糖的制備方法,包括步驟: a、菌種的發(fā)酵:以深海真菌灰黃青霉菌為出發(fā)菌株,采用斜面菌種進行液體搖瓶培養(yǎng); b、真菌胞外多糖的提取:包括①過濾、②脫色、③醇沉、④透析、⑤純化,其中: ①過濾:取步驟a的發(fā)酵液經(jīng)濾紙抽濾除去菌絲體及其中的粗雜質(zhì),再萃取除去脂溶性小分子物質(zhì); ②脫色:采用活性炭脫色,在80-100°C水浴中0.5-1.5%活性炭緩慢加入到過濾后的發(fā)酵液中保溫并攪拌5-10min,待溶液冷卻至室溫后,用漏斗抽濾至干即可; ③醇沉:脫色后的溶液濃縮至原體積1/10-1/5,加入原體積1/5-1/3體積的有機溶劑,劇烈震蕩后離心,吸出上層水相后,將75% -95%的乙醇緩慢加入到濃縮液中,使乙醇終濃度達到70% -80%,把醇沉后的溶液放入冰箱中靜置過夜; ④透析:步驟③所得的沉淀部分用濾紙抽濾,并脫水脫色后于40°C-60°C烘箱烘干,取烘干粉末溶于蒸餾水后離心的上清液置于孔徑為3500Da-5000Da的透析袋在自來水中透析40h-50h,再用去 離子水透析20h-30h,收集透析后的提取液,將透析液濃縮凍干即得到胞外多糖粗品; ⑤純化:將步驟④所得多糖溶液配制成水溶液,離心后進行梯度洗脫,經(jīng)分析、分別收集合并各含糖組分,減壓濃縮,透析脫鹽,凍干,得到目標多糖。 C、呋喃半乳寡糖的制備:先將步驟b的多糖5.0mg-7.0mg,溶于0.01-0.05mol/L三氟乙酸溶液中,混勻后于80°C -100°C的水浴中反應1.5h-3h,中和后備用,再采用凝膠層析柱對降解寡糖樣品進行分離與在線檢測,根據(jù)檢測曲線分別按峰收集各峰對應部分,脫鹽后凍干即得呋喃半乳寡糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制備方法,其特征在于:所述步驟a中的斜面菌種培養(yǎng),培養(yǎng)基組成是以g/100ml計:馬鈴薯15-25,葡萄糖1-3,瓊脂15-25,加水定容至至1L,pH值為自然,斜面菌種培養(yǎng)溫度25-33°C,培養(yǎng)150-250小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制備方法,其特征在于:所述步驟a中,搖瓶培養(yǎng),培養(yǎng)基組成是以g/100ml計:麥芽糖1-10,甘露醇2-5,葡萄糖1_5,谷氨酸鈉1-3,KH2PO40.05-1,MgS040.03-2,酵母膏 0.3-1 和玉米漿 0.1-4,加水定容至 1L,pH 調(diào)至5.5-6.5,25。。-28°C靜置培養(yǎng) 7d_10d。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制備方法,其特征在于:所述步驟b中的步驟③醇沉中所述的有機溶劑為氯仿和正丁醇,其中氯仿和正丁醇的體積比為4:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制備方法,其特征在于:所述步驟b中的步驟③醇沉中所述的乙醇加入濃縮液中的體積比為5:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制備方法,其特征在于:所述步驟b中的步驟⑤采用梯度洗脫,洗脫液為以0.1-0.5mol/L的NaCl水溶液,流速為lmL/min。
8.—種權(quán)利要求1所述的呋喃半乳寡糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物中的應用。
【文檔編號】C08B37/00GK104072543SQ201410164094
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】陳蔭, 李佩佩, 王斌, 牛慶鳳 申請人:浙江海洋學院