本發(fā)明涉及一種納米銀復(fù)合聚合物抗菌膠束及其制備方法，屬于高分子化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程和生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
細(xì)菌無(wú)處不在，并在一定條件下生長(zhǎng)、繁殖，甚至變異，不僅會(huì)引起各種材料的分解、變質(zhì)和腐敗，還會(huì)危害人類的健康。因此，如何有效地抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在眾多的抗菌劑中，銀系抗菌劑具有廣譜、高效及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地運(yùn)用于各種抗菌場(chǎng)合。銀系抗菌劑主要分為銀離子抗菌劑和銀單質(zhì)抗菌劑。目前市場(chǎng)上有多種銀離子抗菌劑產(chǎn)品，如山寧泰Sanitized產(chǎn)品、TRA公司Silpure、陶氏SilvaDur?ET等產(chǎn)品都有廣泛的使用。銀單質(zhì)抗菌劑也受廣泛的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，有超過(guò)250種消費(fèi)產(chǎn)品使用了銀單質(zhì)抗菌劑。然而，無(wú)論是銀離子還是單質(zhì)銀抗菌劑均存在許多不足之處。例如，銀離子具有水溶性，在溶液中容易流失，從而降低其局部濃度；其次，銀離子化學(xué)性質(zhì)較活潑，對(duì)光和熱敏感，易發(fā)生氧化反應(yīng)，也導(dǎo)致其抗菌和殺菌性能下降。另外，人體內(nèi)存在大量的蛋白質(zhì)和氨基酸，銀離子容易與巰基（-SH），氨基（-NH2）形成配位鍵，使蛋白質(zhì)凝固，破壞細(xì)胞合成酶的活性，產(chǎn)生一定的毒性。銀單質(zhì)存在一個(gè)難以忽視的缺點(diǎn)，即銀單質(zhì)抗菌劑易發(fā)生團(tuán)聚，釋放銀的速率較慢，抗菌效果不如銀離子抗菌劑。針對(duì)銀離子在水溶液中易流失、易氧化、毒性大等問(wèn)題，目前常通過(guò)靜電相互作用或配位鍵將銀離子負(fù)載在基質(zhì)材料上，基質(zhì)材料多采用天然高分子和合成高分子材料。也可將銀離子還原為單質(zhì)銀顆粒，增加銀系抗菌材料的穩(wěn)定性。與微米或更大尺寸的單質(zhì)銀相比，納米銀處于固體和分子之間的“介態(tài)”，比表面積極大，具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)，具備超強(qiáng)的抗菌能力。公開(kāi)號(hào)為CN101278896A的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種殼聚糖納米銀凝膠劑，具有抗菌效果好、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)耐藥性、對(duì)組織有修復(fù)功能等優(yōu)點(diǎn)。聚合物膠束是一種基于兩親性聚合物鏈段在溶液中親疏水鏈段性質(zhì)不同自組裝形成具有“核-殼”結(jié)構(gòu)的聚集體。組成膠束的聚合物分子隨著外界的pH、溫度、磁場(chǎng)、電場(chǎng)、光和氧化還原等條件的變化會(huì)發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)或組成上的變化，從而可賦予膠束優(yōu)異的生物化學(xué)性能和應(yīng)用發(fā)展?jié)摿Α＞酆衔锬z束常用于納米藥物載體的的構(gòu)建。聚合物膠束作為負(fù)載銀顆粒的基質(zhì)材料用于生物體內(nèi)抗菌、殺菌用途也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：膠束具有極低的臨界膠束濃度（通常為10-6M），經(jīng)靜脈稀釋后，仍能在較低濃度下穩(wěn)定存在；膠束尺寸極小，滲透性強(qiáng)，能穿透生物體組織殺死深層的細(xì)菌；膠束具有“核-殼”結(jié)構(gòu)，核層多為親水層，能有效地避免蛋白質(zhì)吸附，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，同時(shí)也避免了納米銀發(fā)生氧化及團(tuán)聚。當(dāng)嵌段共聚物中引入具有溫度敏感性的鏈段時(shí)，在聚合物膠束具備天然被動(dòng)靶向功能的同時(shí)，還賦予了其主動(dòng)靶向給藥功能。公開(kāi)號(hào)為CN102671201A的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種制備納米銀修飾聚合物膠束的方法，使用具有一定溫度和pH敏感性的兩親性嵌段聚合物聚氧乙烯-聚（甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-丙烯酸叔丁酯-丙烯酸）（PEO-b-P(DMA-stat-tBA-stat-AA)）自組裝所形成的聚合物膠束為載體，銀離子通過(guò)靜電相互作用吸附到膠束內(nèi)核的丙烯酸結(jié)構(gòu)單元側(cè)鏈羧基上，經(jīng)硼氫化鈉還原，在膠束內(nèi)核原位生成納米銀顆粒，有效地避免了納米銀顆粒的團(tuán)聚問(wèn)題，同時(shí)具有良好的抗菌殺菌效果。通過(guò)銀離子或銀單質(zhì)與聚合物配體基團(tuán)之間的配位鍵，將銀離子負(fù)載在基質(zhì)材料上是本發(fā)明的理論依據(jù)。氮、氧原子含有孤對(duì)電子，可提供給銀離子空軌道，形成銀-氧和銀-氮的金屬配位鍵。公開(kāi)號(hào)為CN103588931A的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種溫度響應(yīng)性納米銀復(fù)合水凝膠的雙原位合成方法，以甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸為單體，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，聚乙二醇為成孔劑，硝酸銀為銀離子源，銀離子與酰胺鍵上的氧和氮原子形成配位鍵，在氮?dú)夥諊潞铣闪藴囟软憫?yīng)性納米納米顆粒復(fù)合水凝膠，納米銀粒子均勻分散在水凝膠中，化學(xué)交聯(lián)穩(wěn)定性好。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述存在問(wèn)題和不足，提供一種通過(guò)銀離子與聚合物的氮、氧原子形成配位鍵，以硼氫化鈉為還原劑，原位還原銀離子生成銀納米顆粒，制備具有良好的生物相容性、獨(dú)特的熱響應(yīng)性、優(yōu)異的抗菌性能，能夠有效抑制、殺滅大腸桿菌等微生物的納米銀復(fù)合聚合物抗菌膠束及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明所述的納米銀復(fù)合聚合物抗菌膠束，其特點(diǎn)是該抗菌膠束由甲氧基封端的聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）兩親性嵌段共聚物構(gòu)成，且該抗菌膠束的結(jié)構(gòu)為核殼結(jié)構(gòu)，其內(nèi)核的疏水段包載納米銀顆粒且具有UCST響應(yīng)性，納米銀顆粒由可溶性銀離子通過(guò)硼氫化鈉還原劑被原位還原生成，銀離子與聚合物中的氮、氧原子形成配位鍵。其中，上述兩親性嵌段共聚物中丙烯酰胺與丙烯腈結(jié)構(gòu)單元的摩爾比例為5：95～95：5。進(jìn)一步地，上述兩親性嵌段共聚物中丙烯酰胺與丙烯腈結(jié)構(gòu)單元的摩爾比例為40：60～60：40。上述可溶性銀離子來(lái)自于硝酸銀。上述抗菌膠束為球形。本發(fā)明所述的納米銀復(fù)合聚合物抗菌膠束的制備方法，其特點(diǎn)是包括如下步驟：1）ω-丙烯酰-聚乙二醇單甲醚的合成將聚乙二醇單甲醚（mPEG）與碳酸鉀按3:1的質(zhì)量比加入到燒瓶中，加入適量溶劑，冰浴下逐滴滴加丙烯酰氯，丙烯酰氯與mPEG摩爾比為5:1，室溫?cái)嚢?8h，過(guò)濾、濃縮、沉淀后，真空干燥得到白色固體產(chǎn)物；2）可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）自由基聚合制備疏水鏈段Poly(AAm-co-AN)將丙烯酰胺單體（AAm）和丙烯腈單體（AN）按一定摩爾比加入到茄形反應(yīng)瓶中，加入適量鏈轉(zhuǎn)移劑S-(芐酯)-S′-(乙醇)三硫代碳酸酯和引發(fā)劑偶氮二異丁腈（AIBN），加入適量溶劑充分?jǐn)嚢枞芙?，無(wú)氧無(wú)水條件下反應(yīng)24h，沉淀，真空干燥得到聚合物Poly(AAm-co-AN)；3）聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）[mPEG-b-Poly(AAm-co-AN)]的合成將Poly(AAm-co-AN)和ω-丙烯酰-聚乙二醇單甲醚按1:10的摩爾比充分共溶于適量溶劑中，加入正己胺和三乙胺，正己胺、三乙胺與Poly(AAm-co-AN)的摩爾比為60:20:1，無(wú)水無(wú)氧條件下反應(yīng)48h，沉淀，真空干燥得到聚合物mPEG-b-Poly(AAm-co-AN)；4）制備負(fù)載納米銀顆粒的抗菌膠束將適量的mPEG-b-Poly(AAm-co-AN)聚合物溶于一定量的去離子水中，制得聚合物膠束溶液，升高溫度加熱至膠束溶液完全澄清透明，在超聲下逐滴加入適量的硝酸銀(AgNO3)溶液，mPEG-b-Poly(AAm-co-AN)聚合物中氰基與AgNO3的摩爾比為1：1，室溫?cái)嚢?4h，逐滴加入硼氫化鈉溶液，硼氫化鈉與AgNO3的摩爾比為30:1，繼續(xù)攪拌4h，透析除去未反應(yīng)的硼氫化鈉，得到包載納米銀顆粒的mPEG-b-Poly(AAm-co-AN)膠束，冷凍干燥備用即可。本發(fā)明以丙烯酰胺、丙烯腈和ω-丙烯酰-聚乙二醇單甲醚（mPEG）為原料，制備兩親性聚合物聚乙二醇單甲醚-聚（丙烯酰胺-丙烯腈），并通過(guò)直接溶解法自組裝形成具有高臨界溶解溫度響應(yīng)性（UCST）的膠束，且該膠束具有良好的生物相容性、優(yōu)異的抗菌性能，能夠有效抑制、殺滅大腸桿菌等微生物，而且本發(fā)明中所涉及的聚乙二醇單甲醚(mPEG)和Poly(AAm-co-AN)的數(shù)均分子量對(duì)應(yīng)為2000g/mol和7000g/mol，與目前制備銀抗菌材料的方案相比，本發(fā)明制備的兩親性聚合物膠束具有獨(dú)特的溫度敏感性質(zhì)，且制備方法簡(jiǎn)單，聚合物在加熱條件下可直接溶解在水中，避免了有機(jī)溶劑溶劑殘留問(wèn)題，同時(shí)聚合物中含有大量的氮原子和氧原子，利用銀離子與聚合物側(cè)鏈胺基和氰基的氮原子或mPEG鏈段上的氧原子形成配位鍵，在硼氫化鈉作用下，原位還原生成納米銀納米顆粒，避免了納米銀的團(tuán)聚，因此本發(fā)明有著重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明中聚合物Poly(AAm-co-AN)7k和mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k的核磁共振氫譜譜圖。圖2是本發(fā)明中聚合物mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k膠束的溫度響應(yīng)性曲線圖。圖3是本發(fā)明中負(fù)載納米銀的mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k膠束的X射線光電子能譜圖。圖4是本發(fā)明中所得納米銀復(fù)合聚合物膠束的粒徑大小和形態(tài)示意圖。圖5是本發(fā)明中由動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量的納米銀復(fù)合聚合物膠束一周時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性結(jié)果示意圖。圖6是本發(fā)明中負(fù)載納米銀前后的mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k膠束圖片和紫外吸收情況示意圖。圖7是本發(fā)明中納米銀復(fù)合mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k膠束抗菌效果照片。圖8是本發(fā)明中空白膠束與負(fù)載納米銀膠束的細(xì)胞毒性結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式如圖4所示，本發(fā)明所述的納米銀復(fù)合聚合物抗菌膠束，是由甲氧基封端的聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）兩親性嵌段共聚物構(gòu)成，且該抗菌膠束的結(jié)構(gòu)為核殼結(jié)構(gòu)，且為球形，其內(nèi)核的疏水段包載納米銀顆粒且具有UCST響應(yīng)性，納米銀顆粒由可溶性銀離子通過(guò)硼氫化鈉還原劑被原位還原生成，而且是原位生成平均直徑為4納米的納米銀顆粒并均勻分散在平均直徑為40納米的膠束內(nèi)，可溶性銀離子來(lái)自于硝酸銀，銀離子與聚合物中的氮、氧原子形成配位鍵。其中，兩親性嵌段共聚物中丙烯酰胺與丙烯腈結(jié)構(gòu)單元的摩爾比例為5：95～95：5。進(jìn)一步地，兩親性嵌段共聚物中丙烯酰胺與丙烯腈結(jié)構(gòu)單元的摩爾比例為40：60～60：40。本發(fā)明所述的納米銀復(fù)合聚合物抗菌膠束的制備方法如下：1）ω-丙烯酰-聚乙二醇單甲醚的合成將5.25gmPEG2k、1.80g無(wú)水碳酸鉀與20mL二氯甲烷均勻混合，冷卻至0℃；緩慢滴加2mL含丙烯酰氯（1.10g）的二氯甲烷溶液，室溫下攪拌48h。反應(yīng)完畢后，過(guò)濾，濃縮，在冷乙醚中重沉淀三次，抽濾，真空干燥得到白色固體產(chǎn)物丙烯酸聚乙二醇單甲醚酯；2）可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）自由基聚合制備疏水鏈段Poly(AAm-co-AN)將2.84g丙烯酰胺、1.74g丙烯腈、156mg鏈轉(zhuǎn)移劑S-(芐酯)-S′-(乙醇)三硫代碳酸酯和10.5mgAIBN依次溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），氮?dú)獗Ｗo(hù)60℃下反應(yīng)24h，迅速冷卻，在冷甲醇中重沉淀三次，抽濾，真空干燥得黃色固體Poly(AAm-co-AN)7k；3）聚乙二醇-聚（丙烯酰胺-丙烯腈）[mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k]的合成將0.70gPoly(AAm-co-AN)7k和2.05g丙烯酸聚乙二醇單甲醚酯共溶于15mLDMF，加入0.61g正己胺和0.27g三乙胺，氮?dú)獗Ｗo(hù)50℃反應(yīng)48h。所得溶液在甲醇中重沉淀，離心取沉淀，溶解，純水透析48h，真空冷凍干燥得到白色產(chǎn)物mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k；4）制備負(fù)載納米銀顆粒的抗菌膠束將20mgmPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k溶于40mL去離子水，形成0.5mg/mL的聚合物膠束溶液，然后加熱至60oC，至膠束溶液完全澄清透明，在超聲下逐滴加入1mL10mg/mL的硝酸銀(AgNO3)溶液，室溫?cái)嚢?4h。逐滴加入1mL2.2mg/mL的硼氫化鈉溶液，溶液迅速變?yōu)樽攸S色，繼續(xù)攪拌4h。透析除去未反應(yīng)的硼氫化鈉，得到納米銀復(fù)合的mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k膠束，透析后的納米銀復(fù)合聚合物膠束溶液呈棕黃色，長(zhǎng)時(shí)間無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象。冷凍干燥備用即可。DLS和SEM結(jié)果顯示膠束直徑在40nm左右。納米銀復(fù)合聚合物膠束基質(zhì)材料mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k的結(jié)構(gòu)表征：聚合物膠束基質(zhì)材料mPEG2k-b-Poly(AAm-co-AN)7k的結(jié)構(gòu)由核磁共振氫譜表征，測(cè)試結(jié)果如圖1所示。所得納米銀復(fù)合聚合物膠束基質(zhì)材料的UCST響應(yīng)性由紫外分光光度計(jì)測(cè)量，聚合物膠束濃度為0.3mg/mL，溫度區(qū)間為15～81℃，測(cè)試結(jié)果如圖2所示，膠束溶液隨著溫度升高，透射率逐漸變大。納米銀復(fù)合聚合物膠束的配位鍵表征和形貌及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：銀離子，銀單質(zhì)與氧原子和氮原子膠束間的配位共價(jià)鍵作用通過(guò)X射線光電子能譜表征（XPS）。在Ag3dXPS譜圖中，空白膠束沒(méi)有出現(xiàn)銀的特征吸收峰。銀離子膠束在374.5和368.5eV出現(xiàn)了銀的特征吸收峰。經(jīng)硼氫化鈉還原后，在納米銀復(fù)合聚合物膠束，銀的特征峰發(fā)生了偏移，出現(xiàn)在374和368eV，說(shuō)明銀與聚合物形成了金屬配位鍵。在N1s，C1s，和O1sXPS譜圖中也發(fā)生了類似的偏移，證明了銀與聚合物中的氮、氧原子形成了配位鍵。測(cè)量結(jié)果如圖3所示。所得納米銀復(fù)合聚合物膠束的粒徑大小采用動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量，其形態(tài)則通過(guò)透射電子顯微鏡來(lái)觀察確定，測(cè)試結(jié)果如圖4所示。所得納米銀復(fù)合聚合物膠束的穩(wěn)定性由動(dòng)態(tài)光散射系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量，連續(xù)測(cè)量一周，測(cè)量結(jié)果如圖5所示。包載納米銀前后聚合物膠束紫外吸收情況有紫外分光光度計(jì)測(cè)得，可以看到包載納米銀后在400nm波長(zhǎng)處有明顯的吸收峰，證明納米銀的存在，測(cè)量結(jié)果如圖6所示。納米銀復(fù)合聚合物膠束的抗菌性能評(píng)價(jià)：將不同濃度的溶有納米銀復(fù)合聚合物膠束的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基加入到96孔板內(nèi)，調(diào)節(jié)每孔大腸埃希菌濃度為1×107CFU/mL，每孔體積為200L，每孔加入納米銀復(fù)合聚合物膠束濃度分別為6.25、12.5、18.75、25、37.5、50、75、100g/mL，37℃培養(yǎng)24h，每個(gè)濃度三個(gè)平行測(cè)試。將沒(méi)空菌液接種到平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h?？咕阅芙Y(jié)果如圖7所示，分別為12.5、25、37.5、50g/mL，顯示在膠束濃度分別是37.5和50g/mL具有殺菌性，在12.5和25g/mL具有抗菌性。納米銀復(fù)合聚合物膠束的體外毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)：將L02細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞植于培養(yǎng)板內(nèi)，每孔預(yù)先加入200LRPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。然后，分別加入空白聚合物膠束和納米銀復(fù)合聚合物膠束，調(diào)節(jié)至濃度分別為12.5、25、50、75、100g/mL，37℃培養(yǎng)1天。樣品分別在同一時(shí)間取樣，移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞兩次后置于含80μLRPMI-1640培養(yǎng)基和20μLMTT的PBS溶液（5mg/mL）的培養(yǎng)板內(nèi)。所得沉淀物溶解于150LDMSO并用酶標(biāo)儀進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，顯示在較低濃度，負(fù)載納米銀膠束具有較小的細(xì)胞毒性。本發(fā)明是通過(guò)實(shí)施例來(lái)描述的，但并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制，參照本發(fā)明的描述，所公開(kāi)的實(shí)施例的其他變化，如對(duì)于本領(lǐng)域的專業(yè)人士是容易想到的，這樣的變化應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求限定的范圍之內(nèi)。