本發(fā)明屬于血液制品領域，具體涉及一種制備靜注人免疫球蛋白的方法。

背景技術：
靜注人免疫球蛋白(pH4，以下簡稱IVIG)是由健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取的免疫球蛋白組分，經(jīng)深加工和病毒滅活等步驟精制而成。IVIG具有免疫替代和免疫調節(jié)的雙重治療作用，臨床使用廣泛，在原發(fā)性或獲得性免疫球蛋白缺陷癥、細菌感染、病毒感染、血液系統(tǒng)疾病、川崎病等的治療中有顯著的效果。為了保證IVIG臨床治療療效,對其進行嚴格的質量控制非常重要，歐洲、美國以及我國的藥典都對IVIG的質量控制有相應的規(guī)定。IVIG的質量控制標準包括以下幾點:主要成分應為IgG，其純度應不低于蛋白總量的95.0％,且IgG亞類應齊全，其含量與正常人血清lgG亞類分布相近；IVIG制品應盡可能不含IgA、IgE等非IgG免疫球蛋白成分，其中，IgA會導致先天性選擇性IgA缺乏癥出現(xiàn)過敏反應，其含量應當越少越好；保證抗體的生物活性、高滴度以及高效性；此外還應保證制品的病毒安全性。目前，靜注人免疫球蛋白的分離方法基本都采用低溫乙醇工藝。1940s，美國哈佛大學的E.J.Cohn教授發(fā)明了低溫乙醇分離血漿蛋白的工藝，其后，Nistchmann和Kistler等人在Cohn氏低溫乙醇法的基礎上進行了改進，提出了改良的低溫乙醇分離血漿蛋白方法，簡化了步驟，縮短了生產(chǎn)周期。然而，目前的低溫乙醇工藝制備的免疫球蛋白制劑中IgA的含量相對較高，先天性選擇性IgA缺乏癥患者輸注后易發(fā)生不良反應，需要進行改進，如公開號為CN102532307A的專利申請文件中公開的方法，制備得到的人免疫球蛋白制品的IgA含量平均為15.03μg/ml。

技術實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的制備靜注人免疫球蛋白的方法。本發(fā)明制備靜注人免疫球蛋白的方法，它包括如下步驟：a、溶解：取Cohn法FⅡ沉淀，溶于注射用水中，澄清過濾，調節(jié)pH為6.60±0.1，攪勻，調節(jié)電導率為1.40±0.05ms/cm，調節(jié)溫度為0～5.0℃，攪勻；b、層析：用DEAESepharoseFastFlow的層析柱純化，收集人免疫球蛋白組份液；c、超濾：將步驟b的人免疫球蛋白組份液超濾并透析，至滲透壓低于30mOsmol/kg時，濃縮，濃縮至蛋白濃度4.0％±1％(w/v)，得濃縮液；d、病毒滅活：在濃縮液中添加山梨醇至濃度為(33±1)％(w/v)，調整pH至5.00±0.1，在60℃±0.5℃下恒溫10小時，冷卻，澄清過濾；e、超濾，透析，配制，即可。步驟a中，所述Cohn法FⅡ沉淀采用如下方法制備：(1)取Cohn法FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀，與0.01mol/L氯化鈉溶液混勻，得離子強度為0.015、蛋白濃度為0.8～1.2％的懸濁液；(2)第一次低溫乙醇沉淀：取步驟(1)的懸濁液，調pH為5.00～5.20，添加乙醇至濃度為15％～18％(v/v)，冷卻至溫度為-4.0～-6.0℃，測定pH，若pH不在5.00～5.20范圍，補調至5.00～5.20，攪拌3h以上，靜置3h以上，添加助濾劑，攪拌，壓濾，收集FⅠ+Ⅲ上清；其中助濾劑的加入量為FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的2％(w/w)；(3)第二次低溫乙醇沉淀：取FⅠ+Ⅲ上清，調節(jié)離子強度至0.05，調pH為7.10～7.40，添加乙醇至濃度23～25％(v/v)，調節(jié)溫度為-9.0℃～-11.0℃，攪拌3小時，靜置3小時以上，添加助濾劑，攪拌，壓濾，得FⅡ沉淀；其中助濾劑的加入量為FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的0.5％(w/w)。步驟(1)中，所述氯化鈉溶液的用量為FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的9～12倍(w/w)；；所述混勻是在-1.0～2.0℃條件下混勻。步驟(2)中，在懸濁液溫度為0～-4.0℃條件下添加乙醇；乙醇添加速率低于1L/min。步驟(2)中，在壓濾之前，用淋洗液與助濾劑進行預鋪，吹流；其中，淋洗液的用量是FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的2.5倍(v/w)，每1000L淋洗液由如下配比的成分組成：注射用水：821L、NaCl：878g、乙醇(95％)：179L。步驟(2)或(3)中，所述助濾劑為硅藻土；所述壓濾的使用壓力為1.0～1.5kg/cm2，出液溫度控制在-3.0～-5.0℃。步驟(3)中，調節(jié)pH時，F(xiàn)Ⅰ+Ⅲ上清的溫度維持在-4.0～-6.0℃；添加乙醇時，F(xiàn)Ⅰ+Ⅲ上清的溫度維持在-7.0～-9.0℃，乙醇添加速率低于1L/min。步驟a中，F(xiàn)Ⅱ沉淀溶于注射用水時，液溫維持在0～5.0℃；澄清過濾時，采用裝配了A-80濾芯的ALSOP濾器過濾；出液溫度控制在0～5.0℃。所述步驟b包括如下步驟：ⅰ、用pH6.6±0.1磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，調節(jié)樣品pH為5.00±0.1，上樣，流速控制為2.00±0.50L/min，收集流穿液；ⅱ、上樣結束后，用pH6.6±0.1磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液用量為柱體積的1.0～1.5倍，收集洗脫液；ⅲ、合并步驟ⅰ的流穿液和步驟ⅱ的洗脫液，即為靜注人免疫球蛋白組份液。步驟c中，超濾時，使用壓力為2～3kgf/cm2，液溫控制在0～5.0℃；所述透析采用的透析液為注射用水。步驟d中，冷卻至溫度低于10℃后，采用裝配了A-80濾芯的ALSOP濾器進行澄清過濾。本發(fā)明還提供了前述方法制備的靜注人免疫球蛋白。名詞解釋：澄清過濾：將液體中的顆粒和懸浮物截留在濾膜上，透出的液體澄清透亮，一般采用孔徑0.65um或1um；預鋪：在過濾前，用含過濾劑(如硅藻土)的液體預先過濾一下，在濾板的表面形成濾餅，增加過濾效率；吹流：過濾結束后，用壓縮空氣將殘留在里面的液體吹出來；壓濾：就是深層過濾，是分離的一種方式，將懸浮液中的固體和液體分離。離子強度：衡量溶液中存在離子所產(chǎn)生的電場強度的量度。綜上，本發(fā)明方法制備的靜注人免疫球蛋白純度高，F(xiàn)c段生物學活性高，品質好，IgA等雜質因子含量低，副作用小，得率高，具有良好的市場應用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。具體實施方式實施例1用本發(fā)明制備靜注人免疫球蛋白的生產(chǎn)方法1、實驗材料Cohn法組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅱ沉淀(FⅠ+Ⅱ+Ⅱ)，按照《醫(yī)學生物制品學》(人民衛(wèi)生出版社)，第二版，1194頁記載的低溫乙醇沉淀法制備。2、實驗方法如下方法中，涉及攪拌的步驟，攪拌頻率均為70～90rpm/min，攪拌的目的均是使溶液充分混勻。2.1Cohn法組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅱ沉淀(FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀)的確認2.1.1所使用FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀的原生產(chǎn)血漿應符合《中國藥典》有關血液制品生產(chǎn)用人血漿規(guī)程的規(guī)定.2.1.2操作開始前,確認被指定的FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀的批號和重量及有效期。2.2FⅠ+Ⅱ+Ⅱ的懸濁2.2.1FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀添加到準備好的懸濁用0.01mol/L的氯化鈉溶液中，懸濁比例為1kg組份Ⅱ+Ⅱ沉淀配9～12kg的0.01mol/L氯化鈉溶液(用注射用水配制0.01mol/L的氯化鈉溶液)，至懸濁液的離子強度為0.015，蛋白濃度0.8～1.2％。2.2.2攪拌3小時以上，使其完全懸濁(取樣觀察是否完全溶解)。2.2.3懸濁時，調整循環(huán)冷媒，在不致凍的情況下，使液溫保持在-1～+2℃。2.2.4充分攪拌后，從罐的底閥接出懸濁液，檢查是否充分懸濁。2.3FⅠ+Ⅱ的反應(第一次低溫乙醇沉淀)反應的條件pH：5.00～5.20溫度：-4.0～-6.0℃乙醇：15～18％離子強度：0.015蛋白濃度：0.8～1.2％2.3.1pH調整,取1L懸濁液用pH4.0的醋緩滴定pH至5.00～5.20,根據(jù)滴定量計算需添加的試劑量.2.3.2pH4.0的醋緩添加，以低于50ml/min的速度添加。2.3.3添加完后，攪拌30分鐘以上，測定pH，如果pH不在5.00～5.20范圍內，則用醋酸鈉緩沖液或1mol/LNaHCO3補調。2.3.4確認總液量.2.3.5乙醇的添加舉例：如控制乙醇濃度為17％，計算公式為：乙醇量(L)＝(2.3.4中的總液量)×17÷(95-17),把計算出的乙醇量，以低于1L/min的速度添加。2.3.6添加時，用循環(huán)冷媒使液溫維持在0～-4.0℃，添加完后慢慢冷卻，使液溫控制到-4.0～-6.0℃。2.3.7乙醇量的100％添加完后，取出樣品，復測pH。2.3.8此時如果pH不在5.00～5.20內，則用pH4.0醋酸鈉緩沖液或1mol/LNaHCO3補調。2.3.9pH符合條件時，攪拌3小時，靜置3～5小時，過濾前按每100KgFⅠ+Ⅱ+Ⅱ添加2Kg硅藻土，攪拌半小時。2.4組份Ⅰ+Ⅱ的壓濾2.4.1每100KgFⅠ+Ⅱ+Ⅱ組裝8～10對框架,每個框架組裝兩枚EKS50或50SP濾板。2.4.2進行過濾之前，用下列成份的淋洗液添加2kg硅藻土后進行預鋪(預過濾)。每100KgFⅠ+Ⅱ+Ⅱ配250L淋洗液.以下是1000L淋洗液的配制方法舉例:注射用水：821LNaCl：878g乙醇(95％)：179LpH：5.10～5.30液溫：-4.0～-6.0℃2.4.3進行預鋪的淋洗液,返回到淋洗液配制罐里循環(huán)。進行30分鐘循環(huán)后，再進行30分鐘吹流(用0.2～0.4MPa的潔凈壓縮空氣吹)來收集回收液；把液溫調整到-6.0℃，用于壓濾后淋洗。2.4.4攪拌沉淀Ⅰ+Ⅱ，同時進行壓濾，通常使用1.0～1.5kg/cm2的壓縮空氣驅動氣動隔膜泵,并且壓力不超過2.0kg/cm2，出液溫度控制在-3.0～-5.0℃。2.4.5隨時檢查過濾的程度，并在過濾結束后，進行30分鐘的吹流；吹流完時，再用淋洗液通過一遍來回收有效成份一并收集到上清液中。2.4.6淋洗液過濾結束后，進行30分鐘吹流，測定并記錄濾液的溫度和液量，進入分離組份Ⅱ操作。2.4.7組份Ⅰ+Ⅱ的固形物回收后記錄重量，然后滅菌廢棄。2.5組份Ⅱ的反應(第二次低溫乙醇沉淀)反應的條件：pH：7.10～7.40溫度：-9.0～-11.0℃乙醇：23～25％離子強度：0.05蛋白濃度：0.5～0.8％2.5.1以每升Ⅰ+Ⅱ上清濾液添加3mol/LNaCl溶液17ml，調節(jié)離子強度為0.052.5.2用1mol/LNaHCO3進行滴定pH調到7.10～7.40(1升1mol/LNaHCO3配制方法：將84gNaHCO3，溶解在注射用水里制成1L溶液)。2.5.3把調制成的1mol/LNaHCO3的總量以低于0.3L/min速度添加，此時調整循環(huán)冷媒，使液溫保持-4.0～-6.0℃。2.5.4添加完后，攪拌30分鐘，取樣測定pH，如果pH不在7.10～7.40內，則用醋酸鈉緩沖液或1mol/LNaHCO3補調。符合條件后，測定并記錄液量和pH。2.5.5添加乙醇添加乙醇之前，查看一下添加泵的運行情況。2.5.6按下述方法，計算出需要添加乙醇的量(使用-15℃以下的95％乙醇)。舉例：如反應液乙醇濃度按25％添加，計算方法為：乙醇量(L)＝濾液3量(L)×(8÷70)+(3mol/L氯化鈉量+1mol/L碳酸氫鈉量)×(25÷70)，式中8＝25％－17％；70＝95％－25％。把計算好的乙醇，以低于1L/min速度添加。2.5.7添加中，使液溫保持在-7.0～-9.0℃，用循環(huán)冷媒來慢慢冷卻，全部添加完后，取出樣品，復測pH并記錄。2.5.8把液溫調整至-9.0～-11.0℃后，攪拌3小時，靜置3～5小時，然后進行組份Ⅱ壓濾。2.6組份Ⅱ壓濾2.6.1所用板框數(shù)，通常是100KgFⅠ+Ⅱ+Ⅱ使用3～5對板框，每對板框組裝兩枚EKS50或50SP濾板。過濾時，按100KgFⅠ+Ⅱ+Ⅱ加0.5Kg硅藻土到反應液中。2.6.2進行過濾(不攪拌狀態(tài))，通常使用壓力為1.0～1.5kg/cm2的壓縮空氣，不可超過2.0kg/cm2，出液溫度控制在-7.0～-10.0℃。2.6.3隨時檢查過濾進行情況，過濾完后20分鐘循環(huán)。循環(huán)結束后，吹流30分鐘。2.6.4過濾結束的FⅡ沉淀用清洗干凈的藥用塑料袋包裝好，記錄批號、重量及有效期，放于-30℃以下冷庫保存。2.7組份Ⅱ的溶解2.7.1在-30℃冷庫里保管的組份Ⅱ中，選取即將使用的組份Ⅱ，確認其重量及有效期和批號，把批號和重量記錄在“操作記錄書”上。2.7.2根據(jù)下列計算式準備溶解液冷注射用水(L)＝組份II的重量(kg)×6L/kg。溶解液收集完成后進行內毒素測試，確認測試結果合格后,用冷媒調整溶解液溫度在0～5.0℃。2.7.3把準備使用的組份Ⅱ添加到溶解液中，添加后，使液溫保持0～5.0℃，進行攪拌到組份Ⅱ完全溶解為止。2.8澄清過濾2.8.1確認完全溶解后，進行澄清過濾，用裝配了ALSOPA-80的過濾器進行過濾，(A-80的組裝：把A-80濾芯組裝在ALSOP濾器上，先用熱注射用水沖洗，再試用一下，確認無異常后放置于2～5℃庫冷卻后使用)，過濾出液溫度控制在0～5.0℃,澄清過濾結束后，用淋洗液(100L透析液)通過一遍來回收有效成分。2.8.2用0.25mol/LHCl溶液來調整pH6.60±0.1，緩慢添加，以便最大限度地減少蛋白變性，試劑添加完后要充分攪拌30分鐘以上再測pH。2.8.3用5％NaCl或注射用水調整電導率為1.40±0.05ms/cm(檢測溫度：20℃)。調整完后充分攪拌30分鐘以上進行檢測。2.9層析2.9.1用1.5～2.0倍體積的0.5mol/LNaOH溶液清洗凝膠DEAESepharoseFastFlow的層析柱，流速為1.50±0.50L/min。2.9.2用1.5～2.0倍體積的pH4.00醋酸緩沖液清洗層析柱。2.9.3用13～14倍體積的pH6.6±0.1磷酸鹽緩沖液平衡層析柱。2.9.4將調制好的制品上樣過層析柱，觀察記錄儀層析圖譜，收集人免疫球蛋白組份，流速控制為2.00±0.50L/min，層析過程中，攪拌狀態(tài)下滴加0.25mol/LHCl，使制品pH維持在5.00±0.10。2.9.5制品上柱結束后用pH6.60±0.1磷酸鹽緩沖液洗脫，用量為1.0～1.5倍柱床體積，洗液一并打入收集的人免疫球蛋白組份液，記錄制品總體積。2.9.6用1.5～2.0倍柱床體積的含0.3mol/LNaCl的pH4.00醋酸鹽緩沖液洗脫層析柱吸附的雜蛋白，后用2mol/L氯化鈉溶液清洗,再用1.0～1.5倍柱床體積的0.5mol/LNaOH清洗層析柱。2.9.7用1.5～2.0倍柱床體積的pH4.00醋酸鹽緩沖液清洗層析柱后保存。2.10超濾2.10.1將浸漬超濾機的NaOH溶液排放掉，用注射用水充分洗滌至熱原合格。2.10.2準備2.0～5.0℃注射用水做透析液。2.10.3原液的預濃縮超濾膜使用pellicon2NMWL50KD，以投入1㎏組份Ⅱ，濃縮液量為5L為基準，在濃縮過程中，用10％三氯醋酸溶液檢查濾液中有無蛋白泄漏。2.10.4一邊超濾，一邊添加透析液，此時，用于超濾泵的使用壓力為2～3㎏/cm2，在超濾過程中，液溫控制在0～5.0℃，每30分鐘取一次濾出液測定滲透壓。2.10.5透析至滲透壓測定結果低于30mOsmol/kg時，開始濃縮，濃縮至蛋白濃度4.0％±1％，濃縮完成后，用透析液頂出超濾機內殘液，清洗超濾機后用0.1mol/LNaOH溶液保存。2.11病毒滅活2.11.1病毒滅活是使用山梨醇作為保護劑，添加比例為---濃縮液量：山梨醇＝2:1，添加完山梨醇濃度為33％±1％。添加完后，攪拌30分鐘以上，取出樣品，確認是否完全溶解。用0.25mol/LNaOH調整pH至5.00±0.10。2.11.2檢查病毒滅活裝置有無異常，用熱注射用水加入恒溫槽內循環(huán)，恒溫槽和滅活罐的溫度調節(jié)裝置分別設定為60.5℃和59.5℃，且把計時器設定為10小時。把添加了保護劑的液體送到滅活罐后，一邊進行攪拌一邊用恒溫槽內的循環(huán)液給滅活罐的夾層循環(huán)，使罐內液溫保持在60℃±0.5℃。液溫達到59.5℃時,檢查計時器是否啟動并開始計時,確認一下恒溫槽內加熱器是否工作在控制狀態(tài)，在60℃±0.5℃下恒溫10小時，將病毒滅活。每60分鐘確認一次溫度，并檢查整個系統(tǒng)工作是否正常,到10小時后，確認是否有報警聲響，系統(tǒng)停止工作。滅活完之后，放掉滅活罐夾層內的溫水，用自來水循環(huán)，使罐內液溫冷卻到30℃，冷卻到30℃后，改用循環(huán)冷媒冷卻到10℃以下。2.12澄清過濾時，使用ALSOPA-80濾芯，把濾芯組裝到濾器上，用熱注射用水洗滌，置2.0～5.0℃冷卻后使用，過濾時使用的壓縮空氣為0.5～1.5㎏/cm2，過濾后用壓縮空氣吹流，把過濾機內的殘液完全回收，濾液轉移到超濾罐，進入下一工序。2.13超濾2.13.1透析液的準備，用注射用水，冷卻至0～5.0℃，使用0.45/0.22μm濾芯過濾后用。2.13.2將澄清過濾后的濾液進行濃縮，使用超濾膜為Pellicon2NMWAL50KD，使用前把NaOH浸漬液放掉，并用注射用水徹底沖洗，原液預濃縮(濃縮基準量為組份II(㎏)×3.5L/㎏)后，加入透析液進行超濾，過程中控制制品溫度在0～5.0℃，如此進行連續(xù)的超濾時，每隔1小時用滲透壓計檢測一次滲透壓濃度。在超濾過程中，隨時用10％三氯醋酸溶液檢查濾出的廢液有無蛋白泄露。當滲透壓濃度與透析液接近或相同時，停止超濾，進行最終濃縮工序。濃縮時，用“折射儀”測定濃度，達到8.5％為止。最終濃縮完后，把濃縮液轉移到調制罐里，使用過的超濾機，清洗后用0.1mol/LNaOH保存。2.14最終原液的配制2.14.1確認轉移到配制罐的濃縮液的液量，用折射儀再確認一次濃度，取出樣品，測定pH。2.14.2麥芽糖的配制濃度為30％。以1L濃度為8.5％的濃縮液添加30％麥芽糖0.50L，調整后原液含麥芽糖濃度為10％±1％，蛋白濃度為5.0％以上。2.14.3pH調整，用0.25mol/LHCl溶液調整pH為4.10±0.30，攪拌30分鐘以上檢測符合要求后進行除菌過濾。2.15除菌過濾，在原液罐上，連接1.0μm+0.22μm的濾芯，開始過濾，過濾時使用壓縮空氣為0.5～0.8㎏/cm2，過濾中隨時檢查過濾情況，過濾完后給原液罐內加壓，使原液罐保持正壓狀態(tài)，然后置于2～5℃庫存放。用起泡點測定儀，對使用過的濾芯進行完整性檢測試驗，確認濾芯無破損。用無菌法取出樣品，送交質保部進行半成品檢測。3、產(chǎn)品檢驗(1)檢測方法按照《中國藥典》(2010年版三部)232～233頁靜注人免疫球蛋白(IVIG)規(guī)定方法分別檢測產(chǎn)品純度、單體+二聚體即分子大小分布、蛋白含量、產(chǎn)品亞類分布等檢測指標?？偟氖章视嬎惴椒ǎ簷z測蛋白含量×制品體積÷批血漿重量＝Kg(蛋白)/噸血漿病毒滅活前后蛋白損失率：(滅活前蛋白含量×制品體積－滅活后蛋白含量×制品體積)÷(滅活前蛋白含量×制品體積)×100％(2)檢測結果檢測結果如下表所示：表1檢測結果由上表可以看出，本發(fā)明方法獲得的靜注人免疫球蛋白純度高達99.8～99.9％，IgA含量平均值僅9.3μg/ml，遠遠低于現(xiàn)有技術中報道的同類產(chǎn)品中IgA的含量，即15.03μg/ml(詳見公開號為CN102532307A的專利申請文件表1)。同時，平均收率高達6.06Kg/噸血漿。實驗結果說明，本發(fā)明方法制備的靜注人免疫球蛋白純度高，IgA含量遠遠低于現(xiàn)有技術其他方法制備的同類產(chǎn)品，臨床安全性更好；同時，本發(fā)明方法的收率高。以下通過檢測采用本發(fā)明實施例1的方法生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品的性質的實驗例，進一步說明本發(fā)明的有益效果：實驗例1本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品的Fc段檢測1、實驗材料1.1藥品本發(fā)明靜注人免疫球蛋白(5％2.5g/瓶，批號：20130511、20130512、20130513、20130514、20130515、20130516、20130617、20130618、20130619)，Octapharma生物制品有限公司生產(chǎn)靜注人免疫球蛋白5％，批號：C141E8532)，靜注人免疫球蛋白參考標準品(用于Fc段功能及分子量大小檢測)：歐洲藥品醫(yī)療質量管理局，批號Y0001512。2、檢測方法制備參考標準品溶液：a.歐洲參考標準品溶液用氫氧化鈉溶液將參考品pH調節(jié)至6.8-7.0，再用牛白蛋白-牛巴比妥緩沖液將參考品IgG濃度稀釋至40mg/ml。b.Octapharma公司IVIG參考標準品用歐洲參考標準品標定Octapharma公司IVIG樣本的Fc段生物學活性，以Octapharma公司批號C141E8532(Fc段生物活性111.1005102％)為標準品，用于本研究中待檢IVIG樣本Fc段生物學活性的測定。用氫氧化鈉溶液將本發(fā)明和Octapharma公司生產(chǎn)IVIG制品的pH調節(jié)至6.8-7.0，再用牛白蛋白-牛巴比妥緩沖液將參考品IgG濃度稀釋至40mg/ml。取450μl供試品，加入敏化紅細胞懸液500μl，混勻，置37℃水浴中輕搖30min，離心，1000轉,10min，4℃，棄上清；用牛白蛋白-牛巴比妥緩沖液1ml反復洗滌紅細胞3次，最后一次離心后棄上清，最后向沉淀中加入400μl已預熱的牛白蛋白-牛巴比妥緩沖液，充分混勻，2min后再加入已稀釋至每1ml含206IU的豚鼠補體，混勻后立即按照紫外-可見分光光度法再波長541nm處測定起始吸光度，之后每隔1min測定1次，在波長541nm處的吸光度與時間的溶血反應動力學曲線即得。當吸光度越過了曲線的內取點后即可停止測量(一般30min內)。分別取參考品即陰性對照，同法操作。按照公式分別計算出本發(fā)明IVIG樣品、OctapharmaIVIG樣品和標準品對照曲線斜率，計算待檢IVIG樣品Fc段激活補體的功能指數(shù)。3、檢測結果結果如表2所示：表2靜注人免疫球蛋白制品的Fc肽段檢測由表2可以看出，本發(fā)明靜注人免疫球蛋白的Fc段生物學活性比較高，明顯高于國外知名品牌Octapharma同類產(chǎn)品(p<0.05)，且批間差異較小。實驗結果說明，本發(fā)明方法生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品的質量穩(wěn)定可靠，提示其臨床療效優(yōu)。實驗例2本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品的凝血激活物水平檢測1.實驗材料1.1藥品本發(fā)明靜注人免疫球蛋白(批號:2090101、20090102、20090203、20100202、20100916、20101004、20100921、20101221、20101209、20101221、20110615、20110716、20110819、20110614、20110820)，Octapharma生物制品有限公司生產(chǎn)靜注人免疫球蛋白(5％，批號:A125A853C、A140B8541、C141E8532；10％，批號:A105C843J、A127A8439C148A843B、B148A8444)1.2主要試劑與耗材凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ缺乏血漿：美國太平洋公司；APTT試劑：成都協(xié)和生物技術中心；PT試劑：成都協(xié)和生物技術中心；玉米胰蛋白酶抑制物(CTI):德國默克Calbiochem公司；FⅪa標準品：德國默克Calbiochem公司；凝血酶熒光多肽底物：瑞士Bachem公司；腦磷脂：美國Rochediagnostics；96孔熒光檢測酶標板：丹麥Nunc公司1.3主要設備全自動凝血儀：日本SysmexCA-1500；全自動酶標儀：美國MolecularDevicesSpectraMaxM2e2.方法2.1非活化的部分凝血活酶時間檢測法(NAPTT法)：主要用于人血液制品中活化凝血因子的檢測。方法詳見《中國藥典》2010年版三部附錄IXO。2.2凝血因子促凝活性檢測(Biggs一期法)：用于定量檢測人血液及血液制品中凝血因子促凝活性。按照《中國藥典》2010年版三部附錄XK(FⅦ:C)、XL(FⅨ:C)、XM(FⅩ:C)及XN(FⅧ:C)檢測原理操作；2.3改良的凝血酶生成時間試驗(TGT)：主要用于凝血級聯(lián)反應中的調節(jié)物和激活物檢測。該方法為本實驗室自主建立。優(yōu)點：靈敏度高，通過熒光信號強弱，可間接反映凝血酶生成含量變化；②可準確計算凝血酶水平達到峰值的時間(TTP)。3.結果3.1NAPTT檢測據(jù)文獻報道，國外引起血栓事件(venousandartefialthromboemboficevents，TEEs)的特定批次IVIG中NAPTT值均小于150s。本發(fā)明靜注人免疫球蛋白的NAPTT值與Octapharma同類產(chǎn)品相當，同時明顯高于文獻報道國外引起TEEs的廠家特定批次靜注人免疫球蛋白的NAPTT值(p<0.05)。結果如表3所示：表3靜注人免疫球蛋白NAPTT時間檢測結果3.2凝血因子含量檢測據(jù)文獻報道，國外引起TEEs的廠家特定批次IVIG中FXI的含量為0.08-0.10IU/ml。本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品中凝血因子Ⅱ(FⅡ)、凝血因子Ⅴ(FⅤ)、凝血因子Ⅶ(FⅦ)、FⅨ、凝血因子Ⅹ(FⅩ)、凝血因子Ⅺ(FⅪ)及凝血因子Ⅻ(FⅫ)含量均低于最低檢測限，未檢出。Octapharma公司7批靜注人免疫球蛋白制品中上述凝血因子含量也均低于最低檢測限，未檢出。結果如表4所示：表4靜注人免疫球蛋白系列凝血因子促凝活性檢測結果*：低于試劑最低檢測限，未檢出3.3TGT檢測據(jù)文獻報道，國外引起TEEs的廠家特定批次IVIG中FXIa值均高于0.50nmol/L，TTP均低于10min。由表5可以看出，本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品和Octapharma公司7批靜注人免疫球蛋白制品中FXIa含量均低于檢測限0.12nmol/L，TTP值大于40min。結果如表5所示：表5靜注人免疫球蛋白TTP時間和FXIa檢測結果綜上，Grundmann、Nuria及Etscheid等報道引起TEEs的特定批次IVIG產(chǎn)品中，TTP均小于10min，F(xiàn)XIa的含量均高于0.50nmol/L，F(xiàn)XI活性為0.08–0.10IU/mL，NAPTT時間均小于160s。而本發(fā)明方法生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品中TTP均大于30min，F(xiàn)XIa的含量均低于0.50nmol/L,FXI活性均低于0.04IU/mL，NAPTT凝集時間均高于200s，說明本發(fā)明方法生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品中凝血激活物水平較低，與Octapharma公司同類制品質量相當。實驗結果說明，本發(fā)明方法生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品質量可靠，體外致栓性風險率極低，臨床應用安全性高。實驗例3本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品的免疫球蛋白含量檢測1實驗材料1.1檢測樣品本發(fā)明靜注人免疫球蛋白(規(guī)格2.5g/50ml，批號：20101234、20100916、20101132、20101229、20101221、20100202)，Octapharma生物制品有限公司生產(chǎn)靜注人免疫球蛋白(規(guī)格1g/20ml，批號:C127A8439,B148A8444,C148A843B,A105C843J)1.2主要試劑與耗材人IgAELISA試劑盒(lot:7)、人IgDELISA試劑盒(lot:2Q1)、人IgEELISA試劑盒(lot:8)、人IgGELISA試劑盒(lot:19)、人IgMELISA試劑盒(lot:9)均購自美國ImmunologyConsultantsLaboratory公司；人IgG亞型酶標試劑盒(批號：981606A)購自Invitrogen公司。正常質控血漿(批號20111102，購自成都協(xié)和生物技術公司)。1.3主要設備全自動酶標儀SpectraMaxM2酶標儀(美國MD公司)2方法所有實驗均參照相關試劑盒說明書操作3結果結果如表6和表7所示：表6不同廠家IVIG制品的免疫球蛋白含量以及IgG亞型分布表7泰邦生物與Octapharma生產(chǎn)IVIG制品免疫球蛋白含量T檢驗結果由表6和表7可以看出：1、按照美國藥典、歐洲藥典、英國藥典和中國藥典的相關規(guī)定，靜注人免疫球蛋白制品中IgG含量不低于蛋白總量的95.0％，IgG亞類齊全且比例與正常人血清的IgG亞類分布接近，本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品符合這一相關規(guī)定。與此同時，經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品質量與Octapharma生物制藥公司生產(chǎn)的同類產(chǎn)品相比，IgG含量差異不顯著(p>0.05)，IgG亞型比例差異不顯著(p>0.05)，提示本發(fā)明產(chǎn)品的質量與Octapharma產(chǎn)品質量相當，其臨床應用的有效性和安全性均較高。2、本發(fā)明制品中IgA、IgD、IgE雜蛋白的含量均顯著低于Octapharma生物制藥公司生產(chǎn)的同類產(chǎn)品，提示本發(fā)明制品質量在這三個指標上更有優(yōu)勢；在IgM的含量指標上，本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品質量與Octapharma生物制藥公司生產(chǎn)的同類產(chǎn)品相比差異不顯著，提示二者在這個指標上質量基本相當。其中，選擇性IgA缺乏癥患者注射IVIG時，可因其中存在少量IgA而產(chǎn)生抗IgA的變態(tài)反應，因此IVIG制品中IgA含量越低，說明制品臨床治療安全性越高。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制品中IgA含量遠遠低于Octapharma生物制藥公司生產(chǎn)的同類產(chǎn)品(p<0.05)，也遠遠低于現(xiàn)有技術中報道的人免疫球蛋白制品中IgA的含量，即15.03μg/ml(詳見公開號為CN102532307A的專利申請文件表1)。實驗結果說明，本發(fā)明方法生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品質量可靠，雜蛋白含量低，尤其是IgA含量低，副作用低，臨床應用安全性高。實驗例4本發(fā)明人免疫球蛋白制品的Aβ1-40、Aβ1-42檢測1、檢測樣品：本發(fā)明靜注人免疫球蛋白(規(guī)格5％，批號:20130405、20130408、20130303)，Octapharma生物制品有限公司生產(chǎn)靜注人免疫球蛋白(規(guī)格5％，批號:C048A843B、A140B8541)2、檢測方法多功能酶標儀；洗板機；0.2um過濾膜；人工合成的Aβ；鼠抗人Aβ抗體；生物素偶聯(lián)的羊抗鼠(抗人)抗體、堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白；對硝基苯磷酸二鈉；牛血清白蛋白。包被：取96孔酶標板，將檢測孔分為2組：測定組每孔加入Aβ1-40(單體或寡聚體)溶液，對照組每孔加入BSA溶液(或Tris緩沖液)。包被過夜。封閉：用PBS-T洗板3次后，加入封閉液封閉，再次洗板3次。樣品加入：將待測樣品用PBS-T-BSA(含1％BSA)進行稀釋，樣品稀釋度的選擇是根據(jù)實驗經(jīng)驗，目前檢測的樣品從100～2000倍不等。標準曲線樣品為鼠抗人Aβ抗體，其濃度梯度分別為250ng/ml，125ng/ml，62.5ng/ml，31.25ng/ml，15.6ng/ml，7.8ng/ml。酶標板測定組和對照組每孔分別加入稀釋好的的待測樣品或標準曲線樣品，37℃孵育1h，洗板3次。一抗：標準曲線孔和待測樣品孔中分別加入生物素偶聯(lián)的羊抗鼠(抗人)抗體(1:1000倍稀釋，稀釋液為PBS-T-BSA)，37℃孵育1h，洗板3次。二抗：所有孔加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(1:1000倍稀釋，稀釋液為PBS-T)，37℃孵育1h，洗板3次。顯色與讀數(shù)：加入發(fā)色底物對硝基苯磷酸二鈉(PNPP，1:50稀釋)，37℃孵育30min，加入1mol/lNaOH終止反應，待讀數(shù)穩(wěn)定后用酶標儀在405nm處測定吸光值。結果計算：以不同稀釋度標準曲線樣品對應吸光值的對數(shù)與濃度的對數(shù)作標準曲線，確定標準曲線線性范圍以及在線性范圍內較好待測樣品稀釋度。將待測樣品測定孔吸光值代入標準曲線計算其濃度值，同時，將各樣品的對照孔吸光值代入標準曲線，計算非特異性抗體濃度值。為得到更準確的檢測結果，每個樣品檢測重復3～4次。2、檢測結果結果如表8和表9所示：表8IVIG制品Aβ1-40抗體含量表9IVIG制品Aβ1-42抗體含量由表8和表9可以看出：本發(fā)明靜注人免疫球蛋白制品中Aβ1-40、Aβ1-4抗體含量均顯著高于Octapharma公司生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品(p<0.01)。實驗結果說明，本發(fā)明方法生產(chǎn)的靜注人免疫球蛋白制品在治療老年癡呆的療效較佳。綜上所述，本發(fā)明方法制備的靜注人免疫球蛋白純度高，F(xiàn)c段生物學活性高，Aβ抗體含量較高，IgA等雜蛋白含量低，凝血激活物水平較低，在臨床治療中能體現(xiàn)出較同類產(chǎn)品更好的療效和安全性，同時，本發(fā)明方法的得率高，血漿利用率高，具有良好的市場應用前景。