一種灰樹花多糖的提純方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種灰樹花多糖的提純方法，將灰樹花粉碎，去離子水作為溶劑，微波提??；采用HD-8陽離子交換樹脂脫蛋白純化，多糖提取液稀釋或濃縮上樣，控制一定流速，收集流出液，即得純度較高的生物活性物質(zhì)灰樹花多糖提純液。本方法工藝流程短，操作簡便，效率高，能耗少，避免了大量有機(jī)試劑的消耗，分離純化過程可連續(xù)化，且樹脂可回收再利用，安全環(huán)保，制備工藝流程成本低，有利于降低產(chǎn)品價(jià)格，很適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種灰樹花多糖的提純方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從食用菌中提純生物活性物質(zhì)的方法，特別涉及一種利用微波提取一HD-8陽離子交換樹脂純化集成工藝提純灰樹花多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]灰樹花又名栗子蘑、蓮花菌、千佛菌等，是一種珍貴的藥食兼用真菌，口味鮮美，富含多種生物活性物質(zhì)、礦物質(zhì)與維生素等。其主要生物活性物質(zhì)灰樹花多糖是近年來研宄的熱點(diǎn)。
[0003]眾多藥理與臨床試驗(yàn)證實(shí)，灰樹花多糖具有抗腫瘤，降血壓，調(diào)節(jié)血糖、血脂水平，抗HIV病毒，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能的作用，尤其是抗腫瘤活性，日本醫(yī)學(xué)專家實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)灰樹花多糖腫瘤抑制率可達(dá)86.2%，比國際公認(rèn)的抗癌新藥香菇多糖抑制率高32%。對癌細(xì)胞生成和轉(zhuǎn)移防治、高血壓、糖尿病、艾滋病及免疫系統(tǒng)功能紊亂均有一定的療效，且無毒副作用。因此，灰樹花多糖的制備工藝備受關(guān)注，具有良好的開發(fā)前景。
[0004]目前，國內(nèi)外灰樹花多糖提取物產(chǎn)品還很少見，文獻(xiàn)中更多是用水提醇沉工藝法提取和脫蛋白及色素等雜質(zhì)，或者是用傳統(tǒng)的提取方法如熱水提取法、酸提法、堿提法等聯(lián)合一般的脫蛋白純化方法如醇沉法、Sevage法，三氯乙酸法等提純多糖，存在操作時(shí)間長、有機(jī)試劑用量大、效率低、效果差等缺點(diǎn)，多糖的得率和純度都受到很大的限制，不利于工業(yè)化生產(chǎn)制備多糖產(chǎn)品。
[0005]因此，研宄灰樹花多糖提純方法，開發(fā)操作便捷，高效，低成本的灰樹花多糖的制備工藝，對于降低產(chǎn)品價(jià)格，增加產(chǎn)品附加值具有重大的經(jīng)濟(jì)效益，并滿足市場需求，為社會增益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種操作便捷、成本低即經(jīng)濟(jì)高效的提純藥食兩用真菌灰樹花多糖的方法，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要。該發(fā)明提純工藝亦可應(yīng)用于其他食用菌。具體技術(shù)方案如下:
[0007]一種灰樹花多糖的提純方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0008](1)將灰樹花粉碎，選用粒徑為20目的灰樹花，在pH為6的去離子水中進(jìn)行微波提取，得到灰樹花多糖提取液；
[0009](2)將樹脂用去離子水反復(fù)浸洗，然后用NaOH溶液浸泡18?24h，再用鹽酸溶液浸泡18?24h，最后用去離子水浸洗，待用；
[0010](3)將步驟⑵處理過的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，形成樹脂床層后，靜置過夜備用；使用前用去離子水過柱，將樹脂柱活化；
[0011](4)將步驟(1)得到的灰樹花多糖提取液取適量裝入步驟(3)的活化樹脂柱，收集流出液，即為脫蛋白純化后灰樹花多糖提純液。
[0012]步驟(1)中微波提取的裝置的輸出功率為500?650W，頻率為2450MHz，輻射過程中鼓泡攪拌；液固比為20?40mL/lg，提取時(shí)間為60s?270s。
[0013]微波提取一段時(shí)間，提取液冷卻至室溫后，需要進(jìn)行稱重補(bǔ)水，再抽濾。
[0014]預(yù)處理的樹脂是氨基酸分離專用樹脂HD-8陽離子交換樹脂。
[0015]步驟⑵中將樹脂用去離子水反復(fù)浸洗的方法如下:浸洗時(shí)每隔5?10分鐘換一次水，并不時(shí)攪動(dòng)，換水4?5次后，再每隔15?20分鐘換水一次，浸洗至浸洗水不褐色為止。
[0016]步驟(2)中所述NaOH溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，浸泡樹脂的前兩個(gè)小時(shí)內(nèi)不斷攪動(dòng)，用水沖洗，直至浸泡水pH值為6?7。
[0017]步驟(2)中所述鹽酸溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，將樹脂轉(zhuǎn)成H+型，鹽酸浸泡后，用去離子水浸洗，至pH值為6以上時(shí)，即可進(jìn)行裝柱。
[0018]稱取20g預(yù)處理過的HD-8陽離子交換樹脂濕法上柱，將去離子水注入層析柱內(nèi)(1.5X 50cm)，趕走空氣；再將經(jīng)過步驟(2)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜置過夜備用。
[0019]步驟(4)中將80?100mL去離子水以0.5?2.5mL/min的流速流過樹脂柱，重復(fù)操作3遍，即可上樣。
[0020]步驟⑷中所述灰樹花多糖提取液中蛋白質(zhì)的濃度為0.15?0.5mg/mL。
[0021]所述的灰樹花多糖溶液的上樣量為200?500mL，上樣濃度:蛋白質(zhì)濃度為0.15?05mg/mL，采用苯酚硫酸法檢測多糖濃度，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白含量。
[0022]本發(fā)明的方法，與其他工藝相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0023](1)避免使用有機(jī)溶劑，液固比30mL/g，微波提取，提取率高達(dá)22.75%,與酶法提取率相當(dāng)，但微波提取更節(jié)省時(shí)間(只有210s)，不使用酶制劑，減少雜質(zhì)的帶入，比傳統(tǒng)熱水浸提法的得率提高了 50%多，具有省時(shí)高效，減少耗能，提升產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)。
[0024](2)HD-8陽離子交換樹脂為氨基酸分離專用樹脂，純化效果與常規(guī)的Sevage法(脫蛋白率為37.95%，多糖含量為78.32% )相比，灰樹花多糖的保留率和脫蛋白率均高達(dá)90%以上，純度近60%，且可回收再利用，安全環(huán)保，并適用于連續(xù)化操作，處理量大。
[0025](3)微波提取一HD-8陽離子交換樹脂純化集成工藝對提純灰樹花多糖具有操作便捷，高效，成本低，產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)勢，工藝簡短有利于工業(yè)化生產(chǎn)，并且該工藝可應(yīng)用于其他食用菌多糖的提純與制備，具有較高的實(shí)用價(jià)值，開發(fā)意義大。

【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
[0027]從灰樹花中提取純化多糖:
[0028](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取210s，冷卻至室溫，再稱重補(bǔ)水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0029](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復(fù)浸洗5次，期間不時(shí)攪動(dòng)每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0030](3)稱取20g經(jīng)過預(yù)處理的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(nèi)(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經(jīng)過預(yù)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0031](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0032](5)將400mL，蛋白質(zhì)含量為0.33mg/mL微波提取的灰樹花子實(shí)體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質(zhì)含量。
[0033]灰樹花多糖微波提取得率為22.61%, HD-8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為95.94%，脫蛋白率為92.02%，純度為58.7%，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
[0034]實(shí)施例2
[0035]從灰樹花中提取純化多糖:
[0036](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取180s，冷卻至室溫，再稱重補(bǔ)水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0037](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復(fù)浸洗5次，期間不時(shí)攪動(dòng)每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0038](3)稱取20g經(jīng)過預(yù)處理的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(nèi)(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經(jīng)過預(yù)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0039](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0040](5)將400mL，蛋白質(zhì)含量為0.309mg/mL微波提取的灰樹花子實(shí)體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質(zhì)含量。
[0041]灰樹花多糖微波提取得率為21.95%, HD-8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為93.94%，脫蛋白率為94.08%，純度為56.01 %，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
[0042]實(shí)施例3
[0043]從灰樹花中提取純化多糖:
[0044](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取210s，冷卻至室溫，再稱重補(bǔ)水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0045](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復(fù)浸洗5次，期間不時(shí)攪動(dòng)每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0046](3)稱取20g經(jīng)過預(yù)處理的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(nèi)(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經(jīng)過預(yù)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0047](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0048](5)將300mL，蛋白質(zhì)含量為0.248mg/mL微波提取的灰樹花子實(shí)體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質(zhì)含量。
[0049]灰樹花多糖微波提取得率為22.57%, HD_8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為90.08%，脫蛋白率為95.56%，純度為54.13 %，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
[0050]實(shí)施例4
[0051]從灰樹花中提取純化多糖:
[0052](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取210s，冷卻至室溫，再稱重補(bǔ)水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0053](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復(fù)浸洗5次，期間不時(shí)攪動(dòng)每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0054](3)稱取20g經(jīng)過預(yù)處理的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(nèi)(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經(jīng)過預(yù)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0055](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0056](5)將500mL，蛋白質(zhì)含量為0.149mg/mL微波提取的灰樹花子實(shí)體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質(zhì)含量。
[0057]灰樹花多糖微波提取得率為22.68%, HD_8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為94.03%，脫蛋白率為94.56%，純度為55.02 %，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
【權(quán)利要求】
1.一種灰樹花多糖的提純方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將灰樹花粉碎，選用粒徑為20目的灰樹花，在pH為6的去離子水中進(jìn)行微波提取，得到灰樹花多糖提取液； (2)將樹脂用去離子水反復(fù)浸洗，然后用NaOH溶液浸泡18?24h，再用鹽酸溶液浸泡18?24h，最后用去離子水浸洗，待用； (3)將步驟(2)處理過的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，形成樹脂床層后，靜置過夜備用；使用前用去離子水過柱，將樹脂柱活化； (4)將步驟(I)得到的灰樹花多糖提取液取適量裝入步驟(3)的活化樹脂柱，收集流出液，即為脫蛋白純化后灰樹花多糖提純液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(I)中微波提取的裝置的輸出功率為500?650W，頻率為2450MHz，輻射過程中鼓泡攪拌；液固比為20?40mL/lg，提取時(shí)間為60?270s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)所述樹脂是氨基酸分離專用樹脂HD-8陽離子交換樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)中將樹脂用去離子水反復(fù)浸洗的方法如下:浸洗時(shí)每隔5?10分鐘換一次水，并不時(shí)攪動(dòng)，換水4?5次后，再每隔15?20分鐘換水一次，浸洗至浸洗水不褐色為止。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)中所述NaOH溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，浸泡樹脂的前兩個(gè)小時(shí)內(nèi)不斷攪動(dòng)，用水沖洗，直至浸泡水pH值為6?7。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)中所述鹽酸溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，將樹脂轉(zhuǎn)成H+型，鹽酸浸泡后，用去離子水浸洗，至PH值為6以上時(shí)，即可進(jìn)行裝柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提純方法，其特征在于，稱取20g預(yù)處理過的HD-8陽離子交換樹脂濕法上柱，將去離子水注入層析柱內(nèi)，趕走空氣；再將經(jīng)過步驟(2)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜置過夜備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟⑷中將80?10mL去離子水以0.5?2.5mL/min的流速流過樹脂柱，重復(fù)操作3遍，即可上樣。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(4)中所述灰樹花多糖提取液中蛋白質(zhì)的濃度為0.15?0.5mg/mL。
【文檔編號】C08B37/00GK104497161SQ201510003250
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月4日
【發(fā)明者】韓偉, 滿寧, 羅文鋒, 韓樂, 馬迪, 豆欣欣, 汪佳丹 申請人:華東理工大學(xué)