高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝，該工藝設(shè)置以下3個(gè)變量：電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和酶解時(shí)間；利用design expert軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方法對(duì)提取工藝優(yōu)化，得到最佳優(yōu)化提取工藝條件為電場(chǎng)強(qiáng)度30.96kv/cm，脈沖數(shù)9.22個(gè)，酶解時(shí)間1.67h，在此條件下河蚌多糖得率的預(yù)測(cè)值為6.08％。本發(fā)明的目的旨在提供一種以河蚌內(nèi)臟組織為原料，利用高壓脈沖電場(chǎng)新技術(shù)與木瓜蛋白酶解結(jié)合高效提取河蚌多糖的方法。該提取方法工藝簡(jiǎn)單、提取率高、條件溫和、雜質(zhì)少、成本低，且野生河蚌資源豐富，價(jià)格僅為打撈成本0.5元/斤，以廢棄物扔掉的內(nèi)臟組織為原料制取的河蚌多糖附加值高，可應(yīng)用于食品、保健品、美容、醫(yī)藥和臨床治療等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001] :本發(fā)明涉及河蛘多糖的高壓脈沖電場(chǎng)(PEF)輔助酶解提取技術(shù)，特別 是涉及利用響應(yīng)曲面優(yōu)化河蚌多糖提取條件的方法。

【背景技術(shù)】 [0002] :自二十世紀(jì)六十年代以來(lái)，人們對(duì)多糖物質(zhì)所具有的抗腫瘤、抗輻射損 傷、提高人體免疫等功能給予了高度重視，我國(guó)在這方面也做了許多研宄工作，特別是從中 藥中提取多糖，并對(duì)這些多糖在抑制腫瘤及其它一些生理活性等方面進(jìn)行了大量研宄。實(shí) 驗(yàn)證明，生物多糖除具有抗腫瘤、抗輻射、增加免疫功能外，還具有抗病毒、抗感染、抗衰老、 降血脂、降血壓、降血糖等多種生理、藥理活性，并且無(wú)副作用。粘多糖是一種重要的生物多 糖，由于含有糖醛酸和硫酸基，所以又稱酸性粘多糖。由于它具有一些特殊功效，近二十多 年來(lái)倍受人們關(guān)注，相繼從多種動(dòng)物組織中提取并獲得應(yīng)用。進(jìn)入21世紀(jì)，人們又熱衷于 從貝類，如牡蠣、扇貝等軟體組織提取粘多糖。自上世紀(jì)九十年代，我國(guó)、日本等國(guó)家開(kāi)展了 從河蚌、田螺等淡水貝類中提取粘多糖的研宄。研宄表明，河蚌多糖與其它動(dòng)物粘多糖一樣 屬于酸性粘多糖，河蚌多糖不僅有植物多糖的臨床治療效果，還有動(dòng)物粘多糖在抗腫瘤、抗 輻射、抗凝血、增強(qiáng)免疫功能等功效。此外，河蚌多糖在治療暈眩、盜汗、慢性肝炎、燒燙傷以 及降血脂等心腦血管疾病方面有其特殊的功效。目前關(guān)于貝類養(yǎng)殖技術(shù)方面的研宄及報(bào)道 很多，但有關(guān)貝類多糖的提取方法和工藝方面的研宄及報(bào)道甚少。貝類多糖的提取可采用 水提法、堿提法、超臨界流體萃取法、酶提法等。傳統(tǒng)水提法產(chǎn)率較低，提取時(shí)間長(zhǎng)，耗能大， 提取成本高；堿提法有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，縮短提取時(shí)間，但提取液 中含有其它雜質(zhì)，使粘度過(guò)大，過(guò)濾困難，且浸提液有較濃的堿味，溶液顏色呈黃色；超臨界 流體萃取法提取多糖原料利用率高，產(chǎn)品得率高等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備復(fù)雜，運(yùn)行成本高。


【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] :基于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的旨在提供一種以河蚌內(nèi) 臟為原料，利用高壓脈沖電場(chǎng)新技術(shù)與酶相結(jié)合提取河蚌多糖的方法。該方法工藝簡(jiǎn)單，可 提高河蚌多糖的得率，具有提取條件溫和、雜質(zhì)易于去除等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)河蚌多糖的低成本 尚效提取。
[0004] 其工藝流程及其控制條件如下：
[0005] A.原料及處理：將鮮活河蚌用水清洗干凈，瀝干后用刀將其剖開(kāi)，取其全部?jī)?nèi)臟 組織冷凍備用。
[0006] B.打漿：將河蚌內(nèi)臟組織從冰柜中取出，在室溫下自然解凍，用打漿機(jī)打漿。
[0007] C.勻漿：將打漿后的漿液用膠體磨勻衆(zhòng)，得到均勻的漿液。
[0008] D.高壓脈沖電場(chǎng)處理：按料液比6g/mL將河蚌勻漿液與水混合均勻，經(jīng)高壓脈沖 電場(chǎng)處理，電場(chǎng)強(qiáng)度25?35kv/cm，脈沖數(shù)6?10個(gè)。
[0009] E.酶解提?。簩⒔?jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理后的漿液調(diào)pH為7. 5,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 4%、比活力為8X 105U/g的木瓜蛋白酶，攪拌后置于恒溫水浴振蕩器中，作用溫度55°C、 酶解時(shí)間1?2h，然后置于90°C水浴中滅酶lOmin。
[0010] F.分離：將滅酶后的河蚌酶解液冷卻后離心（4000r/min、10min)取上清液，即為 河蚌多糖母液。
[0011] G.濃縮：將得到的河蚌多糖母液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在50°C條件下減壓濃縮至原 體積的1/10左右。
[0012] Η.醇沉：向濃縮液中邊攪拌邊加入3倍體積無(wú)水乙醇沉淀約12h，離心（4000r/ min、15min)取沉淀物，得到河蚌多糖水溶性粗提物。
[0013] I. Sevag法脫蛋白：將粗提物加適量水溶解，再加入1/5溶液體積的三氯甲烷-正 丁醇（V:V = 5:1)混合液，搖床劇烈振蕩（約25min)，分液漏斗靜止（約25min)使其分層， 去除下層乳白色有機(jī)溶劑-蛋白相。將上層液用相同方法反復(fù)脫蛋白若干次（約需5次以 上），直至分液漏斗內(nèi)兩液面間無(wú)蛋白層為止。
[0014] J.二次濃縮：將上層液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中50°C減壓濃縮至原體積的1/3?1/2。
[0015] K.二次醇沉：向濃縮液中加9倍體積無(wú)水乙醇沉淀12h，離心（4000r/min、15min) 取沉淀物。
[0016] L.干燥：將沉淀物置于50°C干燥箱中干燥，得河蚌多糖。
[0017] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0018] 1.本發(fā)明可用采珠后的河蚌內(nèi)臟，甚至于用剔除蚌肉后的下腳料為原料提取多 糖，對(duì)綜合利用河蚌資源、提高產(chǎn)品附加值和養(yǎng)蚌的經(jīng)濟(jì)效益并擴(kuò)大淡水養(yǎng)殖資源的開(kāi)發(fā) 具有重要意義；
[0019] 2.本發(fā)明確立了高壓脈沖電場(chǎng)與酶解相結(jié)合的方法使河蚌內(nèi)臟組織能更多地分 解出多糖，提高多糖得率；
[0020] 3.本發(fā)明提取到的河蚌多糖，作為新食品資源應(yīng)用于食品、飲料中，制成的多糖溶 液可用于美容及外用保健，純化精制制成藥品用于臨床治療及醫(yī)療保健。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】：
[0021] 圖1是電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)多糖得率的影響規(guī)律圖。
[0022] 圖2是脈沖數(shù)對(duì)多糖得率的影響規(guī)律圖。
[0023] 圖3是酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響規(guī)律圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1、高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)
[0025] 1、試樣制備與試驗(yàn)過(guò)程
[0026] (1)將鮮活河蚌用水清洗干凈，瀝干后用刀將其剖開(kāi)，去除外殼，取其內(nèi)臟組織，用 打漿機(jī)打漿，然后用膠體磨研磨，得到河蚌內(nèi)臟組織試樣。
[0027] (2)稱取5g河蚌試樣，按料液比6g/mL將河蚌試樣與水混合均勻，用泵將樣液打入 高壓脈沖電場(chǎng)提取裝置中，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)提取處理。
[0028] (3)調(diào)pH為7. 5,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、比活力為8X105U/g的木瓜蛋白酶，攪拌 均勻后置于恒溫水浴振蕩器中酶解，作用溫度55°C，酶解時(shí)間I. 0?2. 0h，然后迅速于90°C 水浴中滅酶IOmin。
[0029] (4)離心（4000r/min、IOmin)取上清液，用去離子水將上清液定容到一定刻度，用 蒽酮-硫酸比色法測(cè)定多糖得率。
[0030] (5)多糖得率計(jì)算：多糖得率（％) =[測(cè)多糖質(zhì)量/樣品質(zhì)量]X 100%
[0031] 2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析
[0032] (1)單因素實(shí)驗(yàn)
[0033] 以電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和酶解時(shí)間為主要影響因素，多糖得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí) 驗(yàn)，每個(gè)指標(biāo)值測(cè)三次，取其平均值。
[0034] (2)響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0035] 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)多糖提取效果影響較顯著的電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)、酶解 時(shí)間這三個(gè)因素，利用design expert軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選電 場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和酶解時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。
[0036] 表I Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析因素及水平表
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝，其特征在于：以河蚌內(nèi)臟組織為原 料，利用高壓脈沖電場(chǎng)新技術(shù)輔助酶解提取河蚌多糖并借助響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝的新方 法，其工藝流程和操作步驟如下： 高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝流程：原料及處理一打漿一勻漿一高壓脈沖 電場(chǎng)處理一酶解提取一分離一濃縮一醇沉一Sevag法脫蛋白一二次濃縮一二次醇沉一干 燥-河蚌多糖； 高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖操作步驟與要點(diǎn)如下： (1) 原料及處理：將鮮活河蚌用水清洗干凈，瀝干后用刀將其剖開(kāi)，取其全部?jī)?nèi)臟組織 冷凍備用； (2) 打漿：將冷凍河蚌內(nèi)臟組織從冰柜中取出，室溫下自然解凍，用打漿機(jī)打漿備用； (3) 勻漿：將打漿后的漿液用膠體磨勻漿，得到均勻的漿液； (4) 高壓脈沖電場(chǎng)處理：按料液比6g/mL將河蚌勻漿液與水混合均勻，經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng) 處理，電場(chǎng)強(qiáng)度25?35kv/cm，脈沖數(shù)6?10個(gè)； (5) 酶解提?。簩⒔?jīng)高壓脈沖電場(chǎng)處理后的漿液調(diào)pH為7. 5,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4%、 比活力為8X105U/g的木瓜蛋白酶，攪拌后置于恒溫水浴振蕩器中，恒溫水解作用溫度 55°C、酶解時(shí)間1?2h，然后于90°C水浴中滅酶lOmin ; (6) 分離：將滅酶后的河蚌酶解液冷卻后離心（4000r/min、10min)取上清液，得到河蚌 多糖母液； (7) 濃縮：將得到的河蚌多糖母液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在50°C條件下減壓濃縮至原體 積的1/10左右； (8) 醇沉：向濃縮液中邊攪拌邊加入3倍體積無(wú)水乙醇沉淀約12h，離心（4000r/min、 15min)取沉淀物，得到河蚌多糖水溶性粗提物； (9) Sevag法脫蛋白：將粗提物加適量水溶解，再加入1/5溶液體積的三氯甲烷-正丁 醇（V:V = 5:1)混合液，搖床劇烈振蕩（約25min)，分液漏斗靜止（約25min)使其分層， 去除下層乳白色有機(jī)溶劑-蛋白相，將上層液用相同方法反復(fù)脫蛋白若干次（約需5次以 上），直至分液漏斗內(nèi)兩液面間無(wú)蛋白層為止； (10) 二次濃縮：將上層液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中50°C減壓濃縮至原體積的1/3?1/2 ; (11) 二次醇沉：向濃縮液中加9倍體積無(wú)水乙醇沉淀靜置12h，離心（4000r/min、 15min)取沉淀物； (12) 干燥：將沉淀物置于50°C烘箱中烘干，得河蚌多糖。
2. 如權(quán)利要求1所述的高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝，其特征在于，所 述河蚌多糖提取中酶解工藝涉及的料液比為6g/mL的河蚌勻漿液與水的混合液，于溫度 55°C、pH7. 5條件下提取1?2h。
3. 如權(quán)利要求1所述的高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝，其特征在于，所述 的酶制劑選為木瓜蛋白酶，酶比活力為8 X 105U/g，酶用量為河蚌勻漿液質(zhì)量的0. 4% ;蛋白 酶可使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們對(duì)原料的結(jié)合力，有利于多糖的 浸出。
4. 如權(quán)利要求1所述的高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解提取河蚌多糖工藝，其特征在于，所述 的河蚌勻漿液經(jīng)高壓脈沖電場(chǎng)輔助酶解設(shè)置3個(gè)變量：電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖數(shù)和酶解時(shí)間，利用 design expert軟件根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方法對(duì)其提取工藝優(yōu)化。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104497164SQ201510038867
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月26日
【發(fā)明者】周亞軍, 吳都峰, 賀琴, 周丹, 周瑞祎, 王淑杰, 董周永 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)