本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

目前，藥用蛋白質(zhì)的制備方法主要是通過等電點(diǎn)沉淀、凝膠過濾、親和層析等方法進(jìn)行分離提純。最常采用的柱層析方法，雖然分離效率可以達(dá)到80％以上，但是填充柱的裝柱時(shí)間長(zhǎng)，從裝柱至分離完成往往需要數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天，而一次分離得到的純品的數(shù)量有限，導(dǎo)致分離效率低；而柱層析的填料昂貴，成本比較高。

藥用蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)是牛血清中的一種球蛋白，包含583個(gè)氨基酸殘基，其中35個(gè)半胱氨酸組成17個(gè)二硫鍵，在肽鏈的第34位有一自由巰基，分子量為66.446kDa，等電點(diǎn)為4.7，含氮量16％，含糖量0.08％，僅含己糖和己糖胺，含脂量只有0.2％。牛血清白蛋白主要起維持滲透壓作用、pH緩沖作用、載體作用和營(yíng)養(yǎng)作用。在動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到生理和機(jī)械保護(hù)作用和載體作用，在生化研究、遺傳工程和醫(yī)藥研究中有廣泛的應(yīng)用，例如在western blot中作為Blocking agent，用作醫(yī)藥保健食品、調(diào)味品，以及在PCR體系中有助于Taq酶的穩(wěn)定性及活性，可以提高PCR的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，可快速有效地分離、純化出藥用蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

一種密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟：

步驟一，取1體積的含有藥用蛋白質(zhì)的原料，加入5體積的2M KH2PO4水溶液和2.2體積的異丁醇均勻混合，得到混合液；

步驟二，用0.1M KOH調(diào)節(jié)步驟一得到的混合液的pH值至5.5±0.1；

步驟三，將調(diào)節(jié)pH值后的混合液倒入分離器中靜置分層5分鐘，分成上中下三層，上層為有機(jī)層，下層為水層，中間層為藥用蛋白質(zhì)層，收集中間層得到所述藥用蛋白質(zhì)。

優(yōu)選的，上述的密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，其中：在步驟一中，所述混合為在攪拌機(jī)中以500轉(zhuǎn)/分鐘～1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌5分鐘。

優(yōu)選的，上述的密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，其中：在步驟一中，所述混合為在離心機(jī)中以500轉(zhuǎn)/分鐘～1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

優(yōu)選的，上述的密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，其中：所述藥用蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白，所述含有藥用蛋白質(zhì)的原料為牛全血，牛血漿，牛血清，牛乳清和牛奶中的一種或幾種。

優(yōu)選的，上述的密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，其中：所述藥用蛋白包括細(xì)胞色素C，辣根過氧化物酶，抗體和肌紅蛋白。

優(yōu)選的，上述的密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，其中：所述步驟一～ 步驟三是在常溫常壓下進(jìn)行操作。

本發(fā)明的突出效果為：本發(fā)明的一種密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法，可以用于藥用蛋白質(zhì)，包括單克隆抗體藥物。傳統(tǒng)的科恩分餾法(Cohn fractionation process)和柱層析法的步驟繁瑣，一般耗時(shí)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天，需要大量緩沖液(一般需要幾百至幾千升)，本發(fā)明采用的密度差別法純化藥用蛋白質(zhì)的方法可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成藥用蛋白質(zhì)的分離、純化，一步完成純化，節(jié)省了時(shí)間成本和物料成本，并且有效保留了藥用蛋白質(zhì)的生物活性和溶解性，具有耗時(shí)短，體積小，反應(yīng)快，效率高，成本低，活性好等優(yōu)點(diǎn)。

以下便結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例的一種利用密度差別法純化牛血清白蛋白的方法，包括以下步驟：

步驟一，在常溫常壓下取10mL含有0.685％牛血清白蛋白的牛血漿，加入50mL的2M KH2PO4水溶液和22mL的異丁醇在攪拌機(jī)中以500轉(zhuǎn)/分鐘～1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌5分鐘，均勻混合，得到混合液；

步驟二，用0.1M KOH調(diào)節(jié)步驟一得到的混合液的pH值至5.5±0.1；

步驟三，將調(diào)節(jié)pH值后的混合液倒入分離器中靜置分層5分鐘，分成上中下三層，上層為有機(jī)層，下層為水層，中間層為牛血清白蛋白層，收集中間層得到牛血清白蛋白。

經(jīng)過測(cè)定，本實(shí)施例的方法制備得到的牛血清白蛋白的純度為90％，回收效率為85％。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的一種利用密度差別法純化牛血清白蛋白的方法，包括以下步驟：

步驟一，在常溫常壓下取10mL含有0.685％牛血清白蛋白的牛血漿，加入50mL的2M K2HPO4水溶液和22mL異丁醇，在離心機(jī)中以500轉(zhuǎn)/分鐘～1000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，均勻混合，得到混合液；

步驟二，用0.1M KOH調(diào)節(jié)步驟一得到的混合液的pH值至5.5±0.1；

步驟三，將調(diào)節(jié)pH值后的混合液倒入分離器中靜置分層5分鐘，分成上中下三層，上層為有機(jī)層，下層為水層，中間層為牛血清白蛋白層，收集中間層得到牛血清白蛋白。

經(jīng)過測(cè)定，本實(shí)施例的方法制備得到的牛血清白蛋白的純度為90％，回收效率為85％。

本發(fā)明尚有多種實(shí)施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。