蛋白質(zhì)合成試劑盒以及使用自動(dòng)純化設(shè)備表達(dá)和純化蛋白質(zhì)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)合成方法。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成方法使用自動(dòng)生物材料純化裝置，所述自動(dòng)生物材料純化裝置包含：孔板試劑盒、加熱部件和磁場(chǎng)施加部件，使得與通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)／純化蛋白質(zhì)之現(xiàn)有方法獲得的目標(biāo)蛋白相比，可以更迅速和簡(jiǎn)單地獲得多種目標(biāo)蛋白，并且由于反應(yīng)孔間沒(méi)有偏差所以可以獲得對(duì)同一蛋白的可重復(fù)合成效率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】蛋白質(zhì)合成試劑盒以及使用自動(dòng)純化設(shè)備表達(dá)和純化蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，并且更具體地，涉及這樣的用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括在使用自動(dòng)生物材料純化裝置的自動(dòng)系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)和純化，該自動(dòng)生物材料純化裝置包含:加熱部件和磁場(chǎng)施加部件。
【背景技術(shù)】
[0002]作為用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方法，已經(jīng)被普遍使用的方法是，主要使用細(xì)胞例如大腸桿菌(Escherichia coli)和酵母,將重組蛋白質(zhì)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入細(xì)胞,并培養(yǎng)該經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以表達(dá)蛋白質(zhì)。上述方法需要選擇穩(wěn)定地表達(dá)重組蛋白質(zhì)的菌株的過(guò)程，并且難以在細(xì)胞中表達(dá)具有毒性的蛋白質(zhì)，使得至少花費(fèi)數(shù)天至數(shù)月來(lái)獲得一種蛋白質(zhì)。
[0003]近來(lái)，不使用細(xì)胞而在試管中合成蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)方法受到了關(guān)注，并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種與其相關(guān)的產(chǎn)品。該無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)方法為這樣的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其通過(guò)添加能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的模板DNA例如表達(dá)載體、PCR產(chǎn)物，細(xì)胞溶解產(chǎn)物，表達(dá)溶液和焦碳酸二乙酯(DEPC)蒸餾的水進(jìn)入管中并且在適當(dāng)溫度(30°C至40°C )持續(xù)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(I小時(shí)至3小時(shí))來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，所述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)方法的優(yōu)勢(shì)為能夠表達(dá)在細(xì)胞中有毒性的蛋白質(zhì)，以及與以上提到的使用細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的方法相比可以顯著減少所需要的時(shí)間。在這里，為了表達(dá)蛋白質(zhì)，需要合適的溫度和時(shí)間。原因是所有過(guò)程期間均應(yīng)伴隨酶的活性，包括在管中從DNA合成RNA和從RNA合成蛋白質(zhì)，其中上述過(guò)程能夠在將溫度保持在多種酶顯示活性的溫度(即30°C至40°C )的情況下進(jìn)行。
[0004]因?yàn)樵谝驯磉_(dá)了重組蛋白質(zhì)的樣品中混合了多種蛋白質(zhì)，所以為了從樣品中容易地純化經(jīng)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，該經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有與特異性物質(zhì)的親和力。最近，主要使用了通過(guò)表達(dá)偶聯(lián)狀態(tài)的重組蛋白質(zhì)與組氨酸并且利用組氨酸和金屬離子(鎳離子、鈷離子等)的親和性的蛋白質(zhì)純化方法，并且與其相關(guān)的多種產(chǎn)品已經(jīng)開(kāi)始銷(xiāo)售。在這些方法中，主要使用了利用磁顆粒的方法，其中磁顆粒表面的金屬離子與目標(biāo)蛋白的組氨酸偶聯(lián)，使得只有目標(biāo)蛋白能夠從多種蛋白質(zhì)中被提取出來(lái)。
[0005]然而，根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率和高純度純化，并且因非有效的細(xì)胞培養(yǎng)物而難以控制蛋白質(zhì)的復(fù)雜表達(dá)，使得仍沒(méi)有解決同一蛋白質(zhì)的可重復(fù)產(chǎn)生這一基本問(wèn)題。
[0006]因此，需要能夠?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)率和高純度純化并且對(duì)同一蛋白質(zhì)具有可重復(fù)合成效率的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法。
[0007]技術(shù)問(wèn)題
[0008]本發(fā)明人在對(duì)有效和容易地`控制蛋白質(zhì)表達(dá)之表達(dá)系統(tǒng)以及使用其生物合成蛋白質(zhì)的方法的持續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)合成方法，從而完成了本發(fā)明，所述蛋白質(zhì)合成方法包括同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)和提取從而與相關(guān)領(lǐng)域相比更有效和容易進(jìn)行。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于合成蛋白質(zhì)的方法，其包括在使用自動(dòng)生物材料純化裝置的自動(dòng)系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)和提取，該自動(dòng)生物材料純化裝置包含:加熱部件和磁場(chǎng)施加部件。
[0010]另外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供蛋白質(zhì)合成試劑盒，其通過(guò)將表達(dá)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法與使用偶聯(lián)親和標(biāo)簽的磁顆粒的蛋白質(zhì)純化方法相組合來(lái)同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)和純化。
[0011]技術(shù)方案
[0012]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其能夠使用自動(dòng)生物材料純化裝置在6小時(shí)內(nèi)合成和產(chǎn)生多至16種目標(biāo)蛋白，所述自動(dòng)生物材料純化裝置包含加熱部件和磁場(chǎng)施加部件，并且通過(guò)將表達(dá)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法與使用偶聯(lián)親和標(biāo)簽的磁顆粒的蛋白質(zhì)純化方法相組合而施用。
[0013]下文將詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0014]在一個(gè)一般性方面中，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法包括:
[0015](1)制備用于無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板，
[0016](2)將模板添加至無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液以表達(dá)蛋白質(zhì)，
[0017](3)將偶聯(lián)親和標(biāo)簽的磁顆粒添加至經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)以將目標(biāo)蛋白連接至所述磁顆粒，以及
[0018](4)從所述磁顆粒分離連接的目標(biāo)蛋白，
[0019]其中在使用包含加熱部件和磁場(chǎng)施加部件之自動(dòng)生物材料純化裝置的自動(dòng)系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)和純化。
[0020]可以使用第二多孔板試劑盒420'和第一多孔板試劑盒420，該第二多孔板試劑盒420'包含:
[0021](a)用于稀釋無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板的溶液，
[0022](b)用于從模板表達(dá)目標(biāo)蛋白的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液，以及
[0023]第一多孔板試劑盒420包含:(C)用于將目標(biāo)蛋白連接至磁顆粒的磁顆粒溶液，
[0024](d)用于目標(biāo)蛋白的洗脫溶液，
[0025](e)用于將目標(biāo)蛋白與磁顆粒偶聯(lián)的磁顆粒反應(yīng)溶液和洗滌溶液。
[0026]在另--般性方面中，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法包括:
[0027](I)制備用于無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板，
[0028](2)將模板添加至無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液以表達(dá)蛋白質(zhì)，
[0029](3)將偶聯(lián)親和標(biāo)簽的磁顆粒添加至經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)以將目標(biāo)蛋白連接至磁顆粒，以及
[0030](4)從磁顆粒分離連接的目標(biāo)蛋白，
[0031]其中使用包含加熱部件和磁場(chǎng)施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置，
[0032]使用第二多孔板試劑盒42(V和第一多孔板試劑盒420，該第二多孔板試劑盒包含:(a)用于稀釋無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板的溶液，(b)用于從模板表達(dá)目標(biāo)蛋白的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液，以及第一多孔板試劑盒包含(C)用于連接目標(biāo)蛋白的磁顆粒溶液，(d)用于目標(biāo)蛋白的洗脫溶液，(e)用于將目標(biāo)蛋白與磁顆粒偶聯(lián)的磁顆粒反應(yīng)溶液和洗滌溶液，并且在自動(dòng)系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行目標(biāo)蛋白的表達(dá)和純化。
[0033]無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板可以是具有環(huán)狀形式或線性形式的脫氧核糖核酸(DNA)。優(yōu)選地，可以使用質(zhì)粒DNA作為具有環(huán)狀形式的DNA，可以使用PCR產(chǎn)物作為具有線性形式的DNA，但是本發(fā)明不限于此。
[0034]具體而言，可以通過(guò)以下來(lái)產(chǎn)生具有線性形式的DNA:使用制備的擴(kuò)增目標(biāo)基因并提供5'和3'端的重疊序列的引物組擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)基因以獲得初始反應(yīng)物，和PCR預(yù)混物(premix),以及
[0035]使用含有以下組合物A的PCR預(yù)混物(下文中稱(chēng)為“PCR試劑盒”)來(lái)再次擴(kuò)增獲得的初始反應(yīng)物，
[0036][組合物A]
[0037](a)定位在目標(biāo)基因的5'和3'兩端的上游盒組和下游盒組，和
[0038](b)在所述盒組的5'和3'兩端具有重疊序列的第二引物組。
[0039]PCR預(yù)混物是含有擴(kuò)增反應(yīng)所需之混合組分的混合物，其可以含有脫氧核苷酸三磷酸混合物(dNTP混合物)和緩沖劑，以及熱穩(wěn)定DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。此外，可以以液體或干燥形式制備PCR預(yù)混物。
[0040]在本發(fā)明中，用于產(chǎn)生具有線性形式的DNA的PCR試劑盒可以含有PCR預(yù)混物，0.1ng / μ I至0.5ng / μ I的用于在目標(biāo)基因的5'和3'兩端編碼親和標(biāo)簽的盒組和各0.1pmole / μ I至1.0pmole / μ I的在盒組的5'和3'端具有重疊序列的第二正向和反向引物。
[0041]在本發(fā)明中，術(shù) 語(yǔ)“盒”總體是指具有雙鏈的寡核苷酸，其被短地合成以人工連接至DNA產(chǎn)物。由于在盒的5'端不具有磷酸基團(tuán)，由雙鏈組成的盒中僅單鏈可以連接至基因組 DNA。
[0042]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“引物”是具有短和自由3'羥基的單鏈核酸序列，表示形成模板的短核酸序列和互補(bǔ)核酸的堿基對(duì)，其功能為核酸模板的鏈副本的起始點(diǎn)。引物可以在聚合反應(yīng)試劑(即DNA聚合酶)和四種不同dNTP的存在下在恰當(dāng)?shù)木彌_劑和溫度下起始DNA合成。本發(fā)明的PCR試劑盒包含對(duì)目標(biāo)基因的核苷酸序列特異的引物和對(duì)盒序列特異的引物。
[0043]在本發(fā)明中，自動(dòng)生物材料純化裝置包含加熱部件和磁場(chǎng)施加部件，其可以包含移液器模塊100，在移液器模塊100上安裝有多個(gè)可分離的移液器142和142并且將含有目標(biāo)物質(zhì)的生物樣品移液至每個(gè)移液器141和142的每個(gè)中；支持移液器模塊100的固定體200 ;安裝在固定體200上并且垂直移動(dòng)移液器模塊100的移液器模塊上下移動(dòng)部件；水平移動(dòng)固定體200以水平移動(dòng)移液器模塊100的移液器模塊前后移動(dòng)部件；位于固定體200的下部并且安裝有多孔板試劑盒420'和420的基板400，多孔板試劑盒420'和420具有配置彼此相鄰的兩列孔的多個(gè)單元孔；磁場(chǎng)施加部件700，其位于多孔板試劑盒420'和420的特定單元孔的下部以對(duì)多孔板試劑盒42(V和420的特定單元孔施加磁場(chǎng)和從其移除磁場(chǎng)；以及加熱多孔板試劑盒420'和420的特定單元孔的加熱部件810。
[0044]此外，在根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁場(chǎng)施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置中，其上安裝磁體的磁安裝部件和用于加熱的加熱部件垂直移動(dòng)，使得可以在施加或移除磁場(chǎng)時(shí)控制溫度，以及作為在磁安裝部件中形成的多個(gè)列的孔插入槽覆蓋多孔板試劑盒的單元孔下部，使得更好地提高反應(yīng)效率。
[0045]具體而言，磁場(chǎng)施加部件700可以包含其上安裝有磁體711的磁體安裝部件710 ；起吊和放下磁體安裝部件710的起吊部件760 ;其中磁體安裝部件710具有在其上形成的單元孔插入槽713以插入多孔板試劑盒420'和420之特定單元孔的下部，并且基板400具有單元孔暴露口 400-3，以使得在磁體安裝部件710起吊時(shí)，多孔板試劑盒42(V和420之特定單元孔的下部插入單元孔插入槽713，多孔板試劑盒420'和420之特定單元孔的下部與其鄰近的多孔板試劑盒420'和420之單元孔的下部隔開(kāi)預(yù)定的距離以插入單元孔插入槽713，并且磁體711圍繞單元孔插入槽713插入和安裝。
[0046]所述方法可以包括:注入步驟S10，將無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板注入多孔板試劑盒420'的單元孔。
[0047]第一混合步驟S20，將注入多孔板試劑盒420'的單元孔以稀釋模板的DEPC蒸餾水以與注入的模板混合；
[0048]第二混合步驟S30，將無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液與第一混合步驟的混合物混合；
[0049]混合物制備步驟S40，通過(guò)將第二混合步驟的混合物與細(xì)胞破裂液(celldisrupted liquid)混合來(lái)制備蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液；
[0050]加熱步驟S50，通過(guò)使用加熱單元720對(duì)具有混合物的多孔板試劑盒420'之特定單元孔的下部加熱來(lái)對(duì)在特定單元孔中的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液施加熱，
[0051]磁顆粒反應(yīng)混合物的制備步驟S70 ;
[0052]蛋白質(zhì)表達(dá)注入步驟S110，將注入多孔板試劑盒420'之單元孔的蛋白質(zhì)表達(dá)注入到制備的磁顆粒反應(yīng)混合物；
[0053]反應(yīng)步驟S120，使注入多孔板試劑盒420'之單元孔的蛋白質(zhì)表達(dá)與磁顆粒反應(yīng)；
[0054]移除步驟S140，通過(guò)對(duì)含有蛋白質(zhì)表達(dá)的混合物施加磁場(chǎng)來(lái)移除除磁顆粒和與磁顆粒偶聯(lián)之蛋白質(zhì)之外的混合物；
[0055]洗滌步驟S150，通過(guò)注入注入多孔板試劑盒420之單元孔的洗滌溶液來(lái)洗滌除來(lái)自磁顆粒之目標(biāo)蛋白之外的雜質(zhì)；
[0056]移除步驟S170，通過(guò)對(duì)包含含有混合物之洗滌溶液的混合物施加磁場(chǎng)來(lái)從包含含有洗滌溶液之混合物的洗滌溶液中移除除連接目標(biāo)蛋白的磁顆粒之外的混合物；
[0057]目標(biāo)蛋白分離步驟S180，通過(guò)將注入多孔板試劑盒420的單元孔的用于目標(biāo)蛋白的洗脫溶液注入從移除步驟獲得的混合物中來(lái)分離目標(biāo)蛋白；以及
[0058]含有目標(biāo)蛋白的溶液的獲得步驟S200，通過(guò)對(duì)混合物施加磁場(chǎng)從含有從磁顆粒分離之目標(biāo)蛋白的目標(biāo)蛋白洗脫溶液中獲得除磁顆粒之外的含有目標(biāo)蛋白的溶液。
[0059]具體地，進(jìn)行注入步驟S10，其使用安裝在包含加熱部件和磁場(chǎng)施加部件之自動(dòng)生物材料純化裝置上的多個(gè)移液器141和142將無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板注入多孔板試劑盒420/的單元孔L，并且在注入步驟SlO之后進(jìn)行第一混合步驟S20。
[0060]進(jìn)行第一混合步驟S20，其使用安裝在包含加熱部件`和磁場(chǎng)施加部件之自動(dòng)生物材料純化裝置上的多個(gè)移液器141和142將注入到多孔板試劑盒420'之單元孔的用于稀釋無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板的DEPC蒸餾水H與注入到多孔板試劑盒420'之單元孔L的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板相混合，并且在第一混合步驟S20之后進(jìn)行第二混合步驟S30。
[0061]進(jìn)行第二混合步驟S30，其使用移液器141和142將注入多孔板試劑盒420'之特定單元孔G的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液與注入到多孔板試劑盒420'之單元孔的注入有與DEPC蒸餾水混合之無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成模板的單元孔L相混合，并且在第二混合步驟S30之后進(jìn)行混合物制備步驟S40。
[0062]進(jìn)行混合物制備步驟S40，其使用移液器141和142將注入細(xì)胞破裂液貯存管442-1的細(xì)胞破裂液與注入有與注入多孔板試劑盒420'之單元孔的DEPC蒸餾水混合之無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成模板的單元孔L相混合來(lái)制備蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液，并且在混合物制備步驟S40之后進(jìn)行加熱步驟S50。
[0063]進(jìn)行加熱步驟S50，其是在通過(guò)吊起磁體安裝部件710將多孔板試劑盒42(V之特定單元孔L的下部插入單元孔插入槽713的狀態(tài)下，通過(guò)使用加熱部件720加熱多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部來(lái)對(duì)特定單元孔L中的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液施加熱的第一加熱步驟，并且在加熱步驟S50之后進(jìn)行第一蛋白質(zhì)表達(dá)注入步驟S60。
[0064]進(jìn)行第一蛋白質(zhì)表達(dá)注入步驟S60，其使用移液器141和142將在特定單元孔L中的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液中反應(yīng)的第一蛋白質(zhì)表達(dá)注入多孔板試劑盒420'的單元孔J，并且在第一蛋白質(zhì)表達(dá)注入步驟S60之后進(jìn)行磁顆粒反應(yīng)混合物的制備步驟S70。
[0065]進(jìn)行磁顆粒反應(yīng)混合物的制備步驟S70，其使用移液器141和142將注入多孔板試劑盒420之單元孔A的磁顆粒反應(yīng)溶液與注入多孔板試劑盒420的單元孔F的磁顆粒相混合，并且在磁顆粒反應(yīng)混合物的制備步驟S70之后，可以進(jìn)一步依次進(jìn)行混合磁顆粒之反應(yīng)溶液的注入步驟S80，第一磁場(chǎng)施加步驟S90以及第一移除步驟S100。
[0066]進(jìn)行混合磁顆粒之反應(yīng)溶液的注入步驟S80，其是在磁體安裝部件710被放下的狀態(tài)下，使用移液器141和142將與磁顆粒反應(yīng)溶液混合的混合物注入多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的第二注入步驟，并且在第二注入步驟S80之后進(jìn)行第一磁場(chǎng)施加步驟S90。
`[0067]進(jìn)行第一磁場(chǎng)施加步驟S90，其通過(guò)吊起磁體安裝部件710以將多孔板試劑盒420/之特定單元孔L的下部插入單元孔插入槽713來(lái)從磁體安裝部件710對(duì)多孔板試劑盒420'之特定單元孔的下部施加磁場(chǎng)，并且在第一磁場(chǎng)施加步驟S90之后進(jìn)行第一移除步驟SlOO。
[0068]進(jìn)行第一移除步驟S100，其在通過(guò)施加至多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部的磁場(chǎng)將混合了磁顆粒反應(yīng)溶液的混合物中的磁顆粒和連接至磁顆粒的物質(zhì)附著至多孔板試劑盒420'之特定單元孔下部的內(nèi)壁的狀態(tài)下，使用移液器141和142從混合了磁顆粒反應(yīng)溶液的混合物移除除了磁顆粒和連接至磁顆粒的物質(zhì)之外的混合物，并且在第一移除步驟SlOO之后進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)注入步驟S110。
[0069]進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)注入步驟S110，其使用移液器141和142將注入多孔板試劑盒420'之單元孔J的第一蛋白質(zhì)表達(dá)注入多孔板試劑盒420'之單元孔L，并且在第二蛋白質(zhì)表達(dá)注入步驟SllO之后進(jìn)行反應(yīng)步驟S120。
[0070]進(jìn)行反應(yīng)步驟S120，其使用移液器141和142使注入多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的第二蛋白質(zhì)表達(dá)與注入多孔板試劑盒420，之特定單元孔L的磁顆粒反應(yīng)，并且在反應(yīng)步驟S120之后可以進(jìn)一步進(jìn)行第二磁場(chǎng)施加步驟S130。
[0071]進(jìn)行進(jìn)一步進(jìn)行的第二磁場(chǎng)施加步驟S130，其通過(guò)吊起磁體安裝部件710以將多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部插入單元孔插入槽713來(lái)從磁體安裝部件710對(duì)多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部施加磁場(chǎng)，并且在第二磁場(chǎng)施加步驟S130之后進(jìn)行移除步驟S140。
[0072]進(jìn)行移除步驟S140，其是第二移除步驟，其在通過(guò)施加至多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部的磁場(chǎng)將混合有第二蛋白質(zhì)表達(dá)的混合物中連接了蛋白質(zhì)的磁顆粒附著至多孔板試劑盒420，之特定單元孔L下部的內(nèi)壁的狀態(tài)下，使用移液器141和142移除除磁顆粒和偶聯(lián)至磁顆粒的蛋白質(zhì)之外的混合物，并且在第二移除步驟S140之后進(jìn)行洗滌步驟S150。
[0073]進(jìn)行洗滌步驟S150，其在磁體安裝部件710被放下的狀態(tài)下，使用移液器141和142通過(guò)將注入多孔板試劑盒420的單元孔的洗滌溶液注入多孔板試劑盒420'之特定單元孔L來(lái)分離除了來(lái)自磁顆粒的目標(biāo)蛋白之外的雜質(zhì)，并且在洗滌步驟S150之后進(jìn)行移除步驟S170。
[0074]進(jìn)行移除步驟S170，其是第三移除步驟，其在通過(guò)施加至多孔板試劑盒420'之特定單元孔的下部的磁場(chǎng)將混合有洗滌溶液的混合物中連接了目標(biāo)蛋白質(zhì)的磁顆粒附著至多孔板試劑盒420'之特定單元孔下部的內(nèi)壁的狀態(tài)下，使用移液器141和142移除混合了洗滌溶液的混合物中除連接了目標(biāo)蛋白質(zhì)的磁顆粒之外的混合物，并且在移除步驟S170之后進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)分離步驟S180。
[0075]洗滌除了目標(biāo)蛋白之外的雜質(zhì)的洗滌步驟S150以及移除除了連接至目標(biāo)蛋白的磁顆粒之外的混合物的移除步驟S170可以順序地進(jìn)行一次或更多次，并且在洗滌步驟150之后，可以進(jìn)一步進(jìn)行第三磁場(chǎng)施加步驟S160。
[0076]進(jìn)一步進(jìn)行的第三磁場(chǎng)施加步驟S160通過(guò)吊起磁體安裝部件710以將多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部插入單元孔插入槽713來(lái)從磁體安裝部件710對(duì)多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部施加磁場(chǎng)。
[0077]移除步驟S170之后進(jìn)行的目標(biāo)蛋白分離步驟S180在磁體安裝部件710被放下的狀態(tài)下，通過(guò)使用移液器1 41和142將注入多孔板試劑盒420之單元孔的目標(biāo)蛋白洗脫溶液注入多孔板試劑盒420，之特定單元孔L來(lái)分離目標(biāo)蛋白，并且在目標(biāo)蛋白分離步驟S180之后，可以進(jìn)一步進(jìn)行第四磁場(chǎng)施加步驟S190。
[0078]進(jìn)一步進(jìn)行的第四磁場(chǎng)施加步驟S190通過(guò)吊起磁體安裝部件710以將多孔板試劑盒420'之特定單元孔L的下部插入單元孔插入槽713來(lái)從磁體安裝部件710對(duì)多孔板試劑盒420'之特定單元孔的下部施加磁場(chǎng)，并且在第四磁場(chǎng)施加步驟S190之后進(jìn)行含有目標(biāo)蛋白之溶液的獲得步驟S200。
[0079]含有目標(biāo)蛋白之溶液的獲得步驟S200可以獲得含有目標(biāo)蛋白的溶液，其是除了蛋白質(zhì)洗脫溶液中的磁顆粒之外含有通過(guò)以下獲得目標(biāo)蛋白的混合物:在通過(guò)施加至多孔板試劑盒420,之特定單元孔L的下部的磁場(chǎng)將含有從磁顆粒分離的目標(biāo)蛋白的目標(biāo)蛋白洗脫溶液中的磁顆粒附著至多孔板試劑盒420'之特定單元孔L下部的內(nèi)壁的狀態(tài)下，使用移液器141和142從磁顆粒分離，以產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)。
[0080]在本發(fā)明中，含有目標(biāo)蛋白之溶液的獲得步驟S200可以包括使用移液器141和142將含有目標(biāo)蛋白的溶液注入安裝在基板400上的蛋白質(zhì)貯存管442-3。
[0081]在本發(fā)明中，磁顆?？梢允桥c目標(biāo)蛋白的親和標(biāo)簽偶聯(lián)的磁顆粒，以及更特別地，可以包含金屬離子，優(yōu)選地可以是與鎳離子偶聯(lián)的磁顆粒。
[0082]根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)將使用磁顆粒純化蛋白質(zhì)的方法和表達(dá)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法相組合，并且將相組合的方法應(yīng)用到包含加熱部件和磁場(chǎng)施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置，可以在6個(gè)小時(shí)內(nèi)合成并生產(chǎn)多至16種目標(biāo)蛋白。
[0083]有益效果
[0084]根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法使用包含孔板試劑盒；加熱部件和磁場(chǎng)施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置，從而使得與通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)使用現(xiàn)有的蛋白質(zhì)表達(dá)/純化方法獲得的目標(biāo)蛋白質(zhì)相比，可以更迅速且簡(jiǎn)單地獲得多種目標(biāo)蛋白質(zhì)，并且由于反應(yīng)孔之間沒(méi)有偏差從而可以獲得對(duì)同一蛋白質(zhì)的可重復(fù)合成效率。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0085]圖1示出根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置的基板插入外殼(casing)的狀態(tài)；
[0086]圖2示意性示出了根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置的移液器模塊；
[0087]圖3是根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置的移液器模塊主要部分的截面；
[0088]圖4是從根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置部分移除外殼的情況下的透視圖；
[0089]圖5示出根據(jù) 本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置之基板被使用的狀態(tài)；
[0090]圖6是根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置的磁體安裝部件和起吊部件的透視圖；
[0091]圖7示出使用根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置制備生產(chǎn)蛋白質(zhì)的模板PCR產(chǎn)物的圖；
[0092]圖8是使用根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法的圖；
[0093]圖9是使用根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置的實(shí)驗(yàn)的圖；
[0094]圖10示出在根據(jù)本發(fā)明的包含加熱部件和磁施加部件的自動(dòng)生物材料純化裝置中使用的第一多孔板試劑盒(A)和第二多孔板試劑盒(B)。
[0095](列G:具有無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液的孔區(qū)域，列H:具有DEPC稀釋水的孔區(qū)域，列L:具有無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板的孔區(qū)域，列A至D:具有磁顆粒反應(yīng)溶液和用于將目標(biāo)蛋白與磁顆粒偶聯(lián)的洗滌溶液的孔區(qū)域，列E:具有目標(biāo)蛋白洗脫的孔區(qū)域，和列F:具有用于連接目標(biāo)蛋白之磁顆粒的孔區(qū)域)
[0096]圖11示出通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生蛋白質(zhì)之方法產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白(GFP)的SDS-PAGE凝膠結(jié)果；并且
[0097](M:Bioneer Corporation 的 AccuLadder? 蛋白質(zhì)大小標(biāo)記(低)，E:表達(dá)的 GFP樣品，P:經(jīng)純化的GFP樣品，I至16:在每個(gè)單位孔中反應(yīng)的GFP合成蛋白質(zhì))
[0098]圖12示出通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生蛋白質(zhì)之方法產(chǎn)生的多種模板DNA的目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE凝膠結(jié)果。[0099]主要元件的詳細(xì)描述
[0100]100:移液器模塊110:注射器栓支架(SYRINGE PIN HOLDER)
[0101]112:信息指引(INFORMATION ⑶IDE) 120:注射器栓
[0102]130:注射器栓引導(dǎo)模塊131:注射器栓引導(dǎo)口
[0103]133:移液器安裝部件 133-1:連通口(COMMUNICATING HOLE)
[0104]133-2:連接環(huán)(ADHESION RING) 134:移液器安裝部件
[0105]134-1:連通口 134-2:連接環(huán)
[0106]141:移液器142:移液器
[0107]150:注射器栓引導(dǎo)模塊支持板152:上下移動(dòng)螺母
[0108]160:引導(dǎo)桿(⑶IDE ROD) 171:注射器栓控制馬達(dá)支持板
[0109]172:注射器栓控制馬達(dá)173:注射器栓控制螺桿
[0110]181:上解吸附板(DESORPTION PLATE) 182:解吸附板
[0111]183:連接桿184:伸出桿
[0112]185:彈簧200:固`定的主體
[0113]231:上下移動(dòng)馬達(dá)232:上下移動(dòng)帶
[0114]233:上下移動(dòng)螺桿241:前后移動(dòng)滑塊
[0115]300:外殼310:前后移動(dòng)支持桿
[0116]311:前后導(dǎo)軌350:門(mén)
[0117]320:前后移動(dòng)馬達(dá)330:前后移動(dòng)帶
[0118]340:紫外燈360:觸屏
[0119]400:基板 401:門(mén)把手(D00RN0B)
[0120]420':多孔板(MULTI WELL PLATE)420:多孔板
[0121]430:移液器架440:蛋白質(zhì)貯存管架
[0122]450:廢物盤(pán)(WASTE tray) 442-1:細(xì)胞破裂液貯存管
[0123]442-3:蛋白質(zhì)貯存管700:磁場(chǎng)施加部件
[0124]710:磁體安裝部件711:磁體
[0125]713:單元孔插入槽720:磁體安裝部件支持物
[0126]730:引導(dǎo)桿740:引導(dǎo)模塊
[0127]750:拉簧(TENSION SPRING) 760:起吊部件(LIFTING PART)
[0128]761:起吊馬達(dá)762:第一起吊軸
[0129]763:起吊凸輪(CAM) 764:第二起吊軸
[0130]780:高度傳感器781:傳感部件
[0131]782:傳感靶向部件(SENSING TARGET PART)810:加熱部件
[0132]812:加熱部件固定板
[0133]最佳模式
[0134]盡管在下文中將會(huì)參考以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但是公開(kāi)實(shí)施例是用于說(shuō)明性目的，對(duì)于領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以不受以下實(shí)施例的限制的情況下進(jìn)行修飾和改變。在本發(fā)明中的實(shí)施例中使用的材料和方法如下。
[0135]<實(shí)施例1>模板DNA的制備[0136](I)質(zhì)粒DNA的制各
[0137]制備用于蛋白質(zhì)合成的模板DNA-質(zhì)粒DNA。每個(gè)基因通過(guò)基因合成方法合成(NBiochem.Biophys.Res.Commun.1998，248，200-203)，隨后用限制酶處理，并且克隆入大腸桿菌(E.coli)的表達(dá)載體。
[0138]可以使用pBIVT(Bioneer Corporation,韓國(guó))、pIVEX(Roche,德國(guó))、pET(Novagen,德國(guó))、pK7、pQE等作為大腸桿菌的表達(dá)載體,但本發(fā)明不限于此。
[0139]此外,用于大腸桿菌的表達(dá)載體,應(yīng)當(dāng)在表達(dá)載體中包含親和標(biāo)簽。在本實(shí)施例中，使用了包含組蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體，但是本發(fā)明不限于此，并且因此表達(dá)載體可以包含
另一標(biāo)簽。
[0140]在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用了 CalmL3、RNaseH, DUSP3、CAT、AcGFP、EF_Ts、VF、多聚A 聚合酶、MMLV RTase、BM3 基因。
[0141]更具體地，對(duì)于用限制酶處理基因合成物質(zhì)，向每個(gè)管添加I μ I的BamHI (Bioneer Corporation,韓國(guó))> Iul 的 NotI (Bioneer Corporation,韓國(guó))、2μ I 的10 X AccuCut?緩沖劑(Bioneer Corporation,韓國(guó))、10μ I的基因合成物質(zhì)和6 μ I的滅菌蒸餾水，將它們混合在一起并放置于恒定溫度(37°C)下3小時(shí)。對(duì)于用限制酶處理用于大腸桿菌的表達(dá)載體，向每個(gè)管添加I P I的BamHI (Bioneer Corporation,韓國(guó))、1 μ I的NotI (Bioneer Corporation,韓國(guó))、2 μ I 的 10 X AccuCut?緩沖劑(Bioneer Corporation,韓國(guó))、10 μ I的用于大腸桿菌的表達(dá)載體和6μ I的滅菌蒸餾水，將它們混合在一起并放置于恒定溫度(37°C )下3小時(shí)。使用Accuprep凝膠提取試劑盒(Bioneer Corporation,韓國(guó))從用各限制酶處理的每個(gè)反應(yīng)物中提取DNA。
[0142]向管中添加5 μ I的2 X快速連接緩沖劑(Promega Corporation,美國(guó))、1 μ I的T4DNA連接酶(Promega Corporation,美國(guó))、3μ I的限制酶處理基因合成物質(zhì)、I μ I的限制酶處理載體，將它們混合在一起并`放置于恒定溫度(16°C )下I小時(shí)。隨后，將放置于恒定溫度的10 μ I反應(yīng)溶液放入100 μ I的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將混合物放置于冰上30分鐘并在42°C培養(yǎng)90秒，隨后再次放置于冰上5分鐘。將反應(yīng)物接種在含有卡那霉素的LB板上并在37°C培養(yǎng)16小時(shí)。
[0143]獲取白色菌落并在IOml的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)之后，隨后離心，移除這樣獲得的上清液并且使用AccuPrep質(zhì)粒DNA制備試劑盒(AccuPrep plasmid DNA prepkit) (Bioneer Corporation,韓國(guó))從沉淀中提取質(zhì)粒DNA。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)提取的DNA是否是通過(guò)各基因合成方法合成的基因，并且對(duì)于待用于蛋白質(zhì)合成的DNA，通過(guò)相同的方法培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的菌落以獲得質(zhì)粒DNA。通過(guò)UV分光光度計(jì)(Shimazu Corporation,日本)測(cè)量濃縮并純化的質(zhì)粒DNA，并且證實(shí)質(zhì)粒DNA具有為1.8至2.0的純度。
[0144](2) PCR產(chǎn)物的制各
[0145]制備用于蛋白質(zhì)合成的模板DNA-PCR產(chǎn)物。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了使用兩步PCR原理的“用于PCR的試劑盒”用于制備PCR產(chǎn)物，并且在圖7中顯示了制備PCR產(chǎn)物的方法并在下表1中顯示了試劑盒組分。
[0146][表1]用于PCR的試劑盒
【權(quán)利要求】
1.蛋白質(zhì)合成方法，所述方法包括: (1)制備無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板； (2)將所述模板添加至無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液以表達(dá)蛋白質(zhì)； (3)將與親和標(biāo)簽偶聯(lián)的磁顆粒添加至所述經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)，以將目標(biāo)蛋白與所述磁顆粒連接；以及 (4)將所述連接的目標(biāo)蛋白與所述磁顆粒分離； 其中在使用自動(dòng)生物材料純化裝置的自動(dòng)系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行所述目標(biāo)蛋白的表達(dá)和純化，所述自動(dòng)生物材料純化裝置包含:加熱部件；和磁場(chǎng)施加部件。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中使用第二多孔板試劑盒420'和第一多孔板試劑盒420，所述二多孔板試劑盒420'包含: (a)用于稀釋所述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板的溶液； (b)用于從所述模板表達(dá)所述目標(biāo)蛋白的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液；以及 所述第一多孔板試劑盒420包含: (c)用于將所述目標(biāo)蛋白連接至所述磁顆粒的磁顆粒溶液； (d)用于所述目標(biāo)蛋白的洗脫溶液，· (e)用于將所述目標(biāo)蛋白與所述磁顆粒偶聯(lián)的磁顆粒反應(yīng)溶液和洗滌溶液。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板是具有環(huán)狀形式或線性形式的脫氧核糖核酸(DNA)。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中通過(guò)以下產(chǎn)生所述具有線性形式的DNA:通過(guò)使用制備的用于擴(kuò)增目標(biāo)基因并提供5'和3'端之重疊序列的引物組在樣品中擴(kuò)增目標(biāo)基因來(lái)獲得初始反應(yīng)物，以及 使用含有以下組合物A的PCR預(yù)混物再次擴(kuò)增所獲得的初始反應(yīng)物， [組合物A] (a)定位在所述目標(biāo)基因的5'和3'兩端的上游盒組和下游盒組，以及 (b)在所述盒組的5'和3'兩端具有重疊序列的第二引物組。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述組合物A含有0.1ng / μ?至0.5ng/ μ?的用于在所述目標(biāo)基因之5'和3'兩端編碼親和標(biāo)簽的盒組，以及各0.1pmole / μ?至1.0pmole / μ I的在所述盒組之Y和:V端具有重疊序列的第二正向引物和第二反向引物。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述親和標(biāo)簽是組氨酸。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述磁顆粒含有金屬離子。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述金屬離子是鎳離子。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其包括: 注入步驟S10，將所述無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的模板注入多孔板試劑盒420'的單元孔。 第一混合步驟S20，將注入多孔板試劑盒420'的單元孔以稀釋模板的DEPC蒸餾水與注入的模板混合； 第二混合步驟S30，將無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)溶液與所述第一混合步驟的混合物混合； 混合物制備步驟S40，通過(guò)將所述第二混合步驟的混合物與細(xì)胞破裂液混合來(lái)制備蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液；加熱步驟S50，通過(guò)使用加熱部件720加熱具有所述混合物的多孔板試劑盒4201之特定單元孔的下部來(lái)對(duì)在所述特定單元孔中的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液施加熱， 磁顆粒反應(yīng)混合物的制備步驟S70 ； 蛋白質(zhì)表達(dá)物注入步驟S110，將注入多孔板試劑盒420'之單元孔的蛋白質(zhì)表達(dá)物注入所制備的磁顆粒反應(yīng)混合物中； 反應(yīng)步驟S120，使注入多孔板試劑盒420'之單元孔的所述蛋白質(zhì)表達(dá)物與所述磁顆粒反應(yīng)； 移除步驟S140，通過(guò)對(duì)含有所述蛋白質(zhì)表達(dá)物的混合物施加磁場(chǎng)來(lái)移除除磁顆粒和與磁顆粒偶聯(lián)之蛋白質(zhì)之外的混合物； 洗滌步驟S150，通過(guò)將注入多孔板試劑盒420之單元孔的洗滌溶液注入來(lái)洗滌除來(lái)自磁顆粒之目標(biāo)蛋白之外的雜質(zhì)； 移除步驟S170，通過(guò)對(duì)含有混合物的洗滌溶液施加磁場(chǎng)來(lái)從含混合物的洗滌溶液中移除除連接目標(biāo)蛋白的磁顆粒之外的混合物； 目標(biāo)蛋白分離步驟S180，通過(guò)將注入多孔板試劑盒420之單元孔的目標(biāo)蛋白洗脫溶液注入從所述移除步驟獲得的混合物中來(lái)分離所述目標(biāo)蛋白；以及 含有目標(biāo)蛋白的溶液的獲得步驟S200，通過(guò)對(duì)混合物施加磁場(chǎng)來(lái)從含有自磁顆粒分離之目標(biāo)蛋白的目標(biāo)蛋白洗脫溶液中獲得除磁顆粒之外的含有目標(biāo)蛋白的溶液。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中洗滌除目標(biāo)蛋白之外的雜質(zhì)的所述洗滌步驟S150和移除除連接有目標(biāo)蛋白之磁顆粒以外的混合物的所述移除步驟S170順序地進(jìn)行一次或更多次。
11.權(quán)利要求9所述的方法`，其中含有目標(biāo)蛋白的溶液的所述獲得步驟S200包括將含有目標(biāo)蛋白的溶液注入蛋白質(zhì)貯存管442-3。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述磁顆粒是與鎳離子偶聯(lián)的磁顆粒。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103827137SQ201280041689
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月26日
【發(fā)明者】樸翰浯, 趙俞相, 鄭俊鎬, 韓指元, 金楠鎰 申請(qǐng)人:株式會(huì)社百奧尼