本發(fā)明屬于創(chuàng)新藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，同時還涉及一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的制備方法，以及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新藥創(chuàng)新起源于先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)，而基于結(jié)構(gòu)的理性藥物設(shè)計是發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物的有效方法。在結(jié)構(gòu)多樣的藥效團中，具有廣泛藥理活性的五元唑雜環(huán)酮—繞丹寧環(huán)已成為藥物化學(xué)的優(yōu)勢骨架而被廣泛用于新藥分子化學(xué)骨架的構(gòu)建。同時，以1-取代-6-氟-喹啉-4-酮-3-羧酸為優(yōu)勢骨架的抗菌氟喹諾酮藥物，因其作用靶點—拓撲異構(gòu)酶也是抗腫瘤藥物的重要作用靶標，可將其抗菌活性轉(zhuǎn)化為抗腫瘤活性。但如何進行結(jié)構(gòu)修飾優(yōu)化，促進其向成藥性方向的發(fā)展是目前氟喹諾酮抗腫瘤藥物研究面臨的新挑戰(zhàn)。有幸的是，研究發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮C-3羧基并非是抗腫瘤活性所必需的藥效團，以C-3酰氨基為連接鏈搭載另一抗腫瘤活性的藥效團，可實現(xiàn)不同藥效團活性的疊加，并發(fā)現(xiàn)了具有抗腫瘤活性的候選化合物。結(jié)合繞丹寧與芳香醛縮合的繞丹寧α，β不飽和酮衍生物具有廣泛的藥理活性，尤其在抗腫瘤先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)中受到關(guān)注。然而，氟喹諾酮骨架與繞丹寧骨架相拼合構(gòu)建的不飽和酮酰胺結(jié)構(gòu)類化合物目前尚未見報道。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，具有抗腫瘤的作用和功效，同時提供一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的制備方法。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如通式(I)所示：
Ar為苯環(huán)或取代苯環(huán)或呋喃環(huán)或吡啶環(huán)。該類化合物為以下的具體結(jié)構(gòu)的化合物：
本發(fā)明的一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的制備方法，以式(II)所示的洛美沙星為原料制備而成，
具體制備步驟如下：
1)將式(II)所示的洛美沙星與甲酸和甲醛發(fā)生哌嗪的甲基化反應(yīng)制得式(III)所示N-甲基洛美沙星；
具體操作步驟為：將式(II)所示的洛美沙星(50g,142.0mmol)溶于85％的甲酸(300mL)和37％的甲醛(17.3g,214.0mmol)混合溶劑中，回流反應(yīng)6小時。減壓蒸除溶劑，加水(300mL)溶解，用活性炭(2.0g)回流脫色1小時。過濾，濾液用濃氨水調(diào)中性。放置析出固體，過濾，去離子水洗滌3次。干燥，得黃色結(jié)晶式(III)，產(chǎn)率87.6％，mp 228～230℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:15.52(1H,s,CONH),8.87(1H,s,2-H),7.89(1H,d,5-H),4.56(2H,q,NCH2CH3),3.55～3.18(7H,m,piperazine-H),2.28(3H,s,N-CH3),1.44～1.32(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C18H21F2N3O3:365.38[M]+；Found:366[M+H]+。
2)將式(III)所示的N-甲基洛美沙星與水合肼發(fā)生肼解反應(yīng)制得式(IV)所示N-甲基洛美沙星酰肼；
具體操作步驟為：N-甲基洛美沙星(20.0g，57.0mmol)與85％水合肼(50mL)和無水乙醇(100mL)的混合物回流反應(yīng)24小時。放置冷卻至室溫，濾集固體，用無水乙醇重結(jié)晶，得黃色結(jié)晶式(IV)，產(chǎn)率63.7％，mp 224～226℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.36(1H,s,CONH),8.85(1H,s,2-H),7.88(1H,d,5-H),4.53(2H,q,NCH2CH3),4.56(2H,s,NH2),3.57～3.15(7H,m,piperazine-H),2.32(3H,s,N-CH3),1.31～1.45(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C18H23F2N5O2:379.41[M]+；Found:380[M+H]+。
2)將式(IV)所示C-3酰肼化合物與雙-(羧甲基)三硫代碳酸酯于水中回流反應(yīng)12小時，放置室溫，氨水堿化，過濾，收集產(chǎn)生的固體，用無水乙醇重結(jié)晶，制得式(V)所示的N-甲基洛美沙星(繞丹寧)酰胺中間體。
具體操作步驟為：N-甲基洛美沙星酰肼(10.0g，26.0mmol)與雙-(羧甲基)三硫代碳酸酯(7.2g，31.0mmol)在水(300mL)回流反應(yīng)至原料消失(TLC檢測，V氯仿：V甲醇＝5:1)。冷卻室溫，用濃氨水堿化至pH 8.0～9.0，放置冷卻至室溫。濾集產(chǎn)生的固體，干燥。粗品用無水乙醇重結(jié)晶，得黃色結(jié)晶式(V)，收率62.6％，mp 225～227℃。1H NMR(400MHz,CDCl3):11.37(1H,s,CONH),8.86(1H,s,2-H),7.87(1H,d,5-H),4.55(2H,q,NCH2CH3),4.82(2H,s,SCH2),3.56～3.13(7H,m,piperazine-H),2.28(3H,s,N-CH3),1.34～1.45(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C21H23F2N5O3S2:495.57[M]+；Found:496[M+H]+。
4)將式(V)所示N-甲基洛美沙星(繞丹寧)酰胺化合物與芳香醛在堿的催化下在冰乙酸中進行縮合反應(yīng)，待反應(yīng)完全后經(jīng)處理得目標化合物如式(I)所示。
Ar為苯環(huán)或取代苯環(huán)或呋喃環(huán)或吡啶環(huán)。
目標化合物式(I)通用的合成制備操作步驟為：取1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(IV)1.0g(2.0mmol)和無水乙酸鈉0.20g(2.4mmol)溶解于15mL冰乙酸中，加入芳香醛(2.0mmol)，混合反應(yīng)物回流反應(yīng)12h。減壓蒸除溶劑，殘留物用水(20mL)溶解，加入適量的活性炭在60℃脫色0.5h，過濾。濾液用濃氨水堿化至pH 9.0，用氯仿提取(3×15mL)，合并有機相，無水硫酸鈉干燥。減壓回收溶劑至干，用乙醇-DMF(V:V＝5:1)重結(jié)晶，得淡黃色結(jié)晶物(I)。
作為進一步的改進，式V所示的N-甲基洛美沙星(繞丹寧)酰胺與芳香醛的摩爾為1:1.0～1.2。
所述的一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
所述抗腫瘤藥物為治療肝癌、胰腺癌或白血病藥物。
本發(fā)明的一種N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物基于藥效團的拼合原理，將二氟喹諾酮、酰胺及繞丹寧α，β-不飽和酮等不同藥效團間的有效的組合，進而構(gòu)建了N-甲基洛美沙星(繞丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，實現(xiàn)了不同結(jié)構(gòu)藥效團的互補和活性的疊加，從而達到了增效降毒的效果，可作為全新結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物開發(fā)。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
實施例1
1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-1)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為苯基。
該化合物的制備方法為：以苯甲醛(0.25g,2.4mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得目標淡黃色結(jié)晶物(I-1),產(chǎn)率62.4％，m.p.231～233℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.36(1H,s,CONH),8.87(1H,s,2-H),8.06(s,1H,CH＝),7.87(1H,d,5-H),7.73～7.28(5H,m,5H,Ph-H),4.56(2H,q,NCH2CH3),3.55～3.07(7H,m,piperazine-H),2.26(3H,s,N-CH3),1.33～1.46(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C28H27F2N5O3S2:583.68[M]+；Found:584[M+H]+。
實施例2
1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對甲氧基苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-2)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為對甲氧基苯基。
該化合物的制備方法為：以對甲氧基苯甲醛(0.28g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得目標淡黃色結(jié)晶物(I-2),產(chǎn)率68.5％，m.p.226～228℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.38(1H,s,CONH),8.89(1H,s,2-H),8.12(s,1H,CH＝),7.88～7.83(3H,m,5-H and Ph-H),7.52(2H，d,Ph-H),4.57(2H,q,NCH2CH3),3.87(3H,s,OCH3),3.57～3.13(7H,m,piperazine-H),2.28(3H,s,N-CH3),1.35～1.48(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C29H29F2N5O4S2:613.79[M]+；Found:614[M+H]+。
實施例3
1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-[2-硫代-5-(3,4-二氧亞甲基)苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-3)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為3，4-(二氧亞甲基)基苯基。
該化合物的制備方法為：以3,4-二氧亞甲基苯甲醛(0.3g,2.0mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得目標淡黃色結(jié)晶物(I-3),產(chǎn)率75.3％，m.p.235～237℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.38(1H,s,CONH),8.92(1H,s,2-H),8.15(s,1H,CH＝),7.93～7.62(4H,m,5-H and Ph-H),6.33(2H,s,OCH2O),4.56(2H,q,NCH2CH3),3.56～3.15(7H,m,piperazine-H),2.31(3H,s,N-CH3),1.37～1.50(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C29H27F2N5O5S2:627.69[M]+；Found:628[M+H]+。
實施例4
1-乙基-6，8-氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-[2-硫代-5-(3,4,5-三甲氧甲基)苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基]-酰胺(I-4)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為3，4，5-三甲氧亞甲基苯基。
該化合物的制備方法為：以3,4,5-三甲氧基苯甲醛(0.43g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結(jié)晶目標物(I-4),產(chǎn)率72.8％，m.p.226～228℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.44(1H,s,CONH),8.95(1H,s,2-H),8.23(s,1H,CH＝),7.95(1H,d,1H,5-H),7.76(2H,s,Ph-H),4.62(2H,q,NCH2CH3),3.87,3.93(2s,9H,3×OCH3),3.57～3.18(7H,m,piperazine-H),2.33(3H,s,N-CH3),1.41～1.55(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C31H33F2N5O6S2:673.76[M]+；Found:674[M+H]+。
實施例5
1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對氟苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-5)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為對氟苯基。
該化合物的制備方法為：以對氟苯甲醛(0.30g,2.4mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結(jié)晶目標物(I-5),產(chǎn)率76.2％，m.p.235～237℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.42(1H,s,CONH),8.91(1H,s,2-H),8.22(s,1H,CH＝),7.87～7.76(3H,m,5-H and Ph-H),7.63(2H,d,Ph-H),4.58(2H,q,NCH2CH3),3.60～3.15(7H,m,piperazine-H),2.34(3H,s,N-CH3),1.36～1.51(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C28H26F3N5O3S2:601.67[M]+；Found:602[M+H]+。
實施例6
1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對硝基苯甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-6)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為對硝基苯基。
該化合物的制備方法為：以對硝基苯甲醛(0.30g,2.0mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結(jié)晶目標物(I-6),產(chǎn)率70.5％，m.p.236～238℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.46(1H,s,CONH),9.06(1H,s,2-H),8.31(1H,s,CH＝),8.16(1H,d,5-H),7.78(2H,d,Ph-H),4.62(2H,q,NCH2CH3),3.65～3.17(7H,m,piperazine-H),2.36(3H,s,N-CH3),1.41～1.57(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C28H26F2N6O5S2:628.68[M]+；Found:629[M+H]+。
實施例7
1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-吡啶-4-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-7)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為4-吡啶基。
該化合物的制備方法為：以吡啶-4-甲醛(0.24g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結(jié)晶目標物(I-7),產(chǎn)率63.2％，m.p.243～245℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.51(1H,s,CONH),9.11(1H,s,2-H),8.87(2H,d,Py-H),8.76(2H,d,Py-H),8.34(1H,s,CH＝),8.17(1H,d,5-H),4.64(2H,q,NCH2CH3),3.68～3.23(7H,m,piperazine-H),2.38(3H,s,N-CH3),1.43～1.58(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C27H26F2N6O3S2:584.67[M]+；Found:585[M+H]+。
實施例8
1-乙基-6，8-二氟-7-(3,4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-呋喃-2-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-8)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為2-呋喃基。
該化合物的制備方法為：以呋喃-2-甲醛(0.21g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結(jié)晶目標物(I-8),產(chǎn)率57.8％，m.p.234～236℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.48(1H,s,CONH),9.08(1H,s,2-H),8.28(1H,s,CH＝),8.15(1H,d,5-H),7.76～6.92(3H,m,furan-H),4.61(2H,q,NCH2CH3),3.66～3.15(7H,m,piperazine-H),2.36(3H,s,N-CH3),1.40～1.56(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C26H25F2N5O4S2:573.65[M]+；Found:574[M+H]+。
實施例9
1-乙基-6，8-二氟-7-(3，4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-(2-硫代-5-對羧基苯基-2-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-9)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為4-羧基苯基。
該化合物的制備方法為：以對羧基苯甲醛(0.33g,2.2mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結(jié)晶目標物(I-9),產(chǎn)率60.3％，m.p.227～229℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:15.56(1H,brs,1H,COOH),11.61(1H,s,CONH),9.22(1H,s,2-H),8.43(2H,d,Ph-H),8.36(s,1H,CH＝),8.21(1H,d,5-H),7.87(2H,d,Ph-H),4.67(2H,q,NCH2CH3),3.70～3.25(7H,m,piperazine-H),2.41(3H,s,N-CH3),1.45～1.63(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C29H27F2N5O5S2:627.69[M]+；Found:628[M+H]+。
實施例10
1-乙基-6，8-二氟-7-(3，4-二甲基-哌嗪-1-基)-喹啉-4(1H)-酮-3-羧酸(2-硫代-5-對磺酰胺基苯基-2-甲叉基-噻唑烷-4-酮-3-基)-酰胺(I-10)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
即式I中的Ar為4-磺酰胺基苯基。
該化合物的制備方法為：以對氨磺酰基苯甲醛(0.37g,2.0mmol)替代芳香醛，依照上述的目標物(I)的通用制備方法，得淡黃色結(jié)晶目標物(I-10),產(chǎn)率68.0％，m.p.246～248℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.64(1H,s,CONH),9.23(1H,s,2-H),8.45(2H,d,Ph-H),8.38(1H,s,CH＝),8.24(1H,d,1H,5-H),7.88(2H,d,Ph-H),7.75(2H,s,NH2),4.68(2H,q,NCH2CH3),3.68～3.23(7H,m,piperazine-H),2.42(3H,s,N-CH3),1.44～1.61(6H,m,2×CH3)；MS(m/z):Calcd.for C28H28F2N6O5S3:662.76[M]+；Found:663[M+H]+。
試驗例
一、實施例1-10提供的一種N-甲基洛美沙星(饒丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物的體外抗腫瘤活性測定
1、供試樣品
以實施例1-10提供的一種N-甲基洛美沙星(饒丹寧不飽和酮)酰胺類衍生物，及經(jīng)典抗腫瘤TOPO抑制劑10-羥基喜樹堿(HC)和洛美沙星(LMF)為供試樣品，共12種，其中HC和LMF為對照組，實施例1-10樣品為實驗組；
實驗癌細胞株分別為人肝癌Hep-3B細胞、人胰腺癌Panc-1細胞和人白血病HL60細胞株均購買自中國科學(xué)院上海細胞庫。正常細胞采用VERO非洲綠猴腎細胞，購買于上海通派生物科技有限公司。
2、測定方法
測定方法的具體步驟為：
(1)首先將上述12種供試樣品分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配制成1.0×10-2mol·L-1濃度的儲備液，之后用質(zhì)量百分比濃度為10％的小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將儲備液稀釋成具有5個濃度梯度(0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μmol·L-1)的工作液；
取對數(shù)生長期的人肝癌Hep-3B細胞、人胰腺癌Panc-1細胞和人白血病HL60細胞及VERO細胞株，以每孔6000個細胞接種于96孔板，隨后分別加入上述12種樣品的具有5個濃度梯度的工作液，培養(yǎng)48小時后每孔加入5g·L–1MTT(噻唑藍)溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后加入100μL質(zhì)量百分比濃度為10％的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，再培養(yǎng)24小時，然后用酶標儀在570nm波長處測定各自的吸光度(OD)值；
(3)按下述所示公式計算不同濃度的供試樣品對癌細胞的抑制率，
癌細胞抑制率＝[(1－實驗組OD值)/對照組OD值]×100％，
然后以供試樣品的各濃度的對數(shù)值對各濃度對應(yīng)的癌細胞抑制率作線性回歸，得到劑量-效應(yīng) 方程，從所得劑量-效應(yīng)方程計算出各供試樣品對實驗癌細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)；每個數(shù)據(jù)平行測定三次，求其平均值，結(jié)果見表1所示。
表1各供試樣品的抗腫瘤活性(IC50)
從表1可以看出，實施例1-10提供的化合物對實驗3種癌細胞的抑制活性顯著強于母體化合物N-甲基洛美沙星的活性，尤其是部分化合物對人胰腺癌Panc-1細胞的活性強于對照羥喜樹堿的活性，其IC50值已達到微摩爾濃度。更有意義的是，實施例1-10提供的化合物對VERO細胞顯示出較低的毒性，具有成藥性的潛力。因此，按照藥物開發(fā)的一般途徑是先進行常規(guī)的抗腫瘤體外篩選，然后進行針對性的研究，所以本發(fā)明的化合物具有強的抗腫瘤活性和較低的毒性，可通過與人體可接受的酸成鹽或與藥用載體混合制備抗腫瘤藥物。